CN111103424A - 一种用于检测人体的尿液标本中肿瘤细胞的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明首先提供一种用于检测人体的尿液标本中肿瘤细胞的检测试剂盒，所述试剂盒包括过滤膜、细胞固定物和常规染色用的染料，所述过滤膜的滤孔为穿透膜厚度方向的直孔道，且滤孔的孔径为5～20微米，过滤膜的厚度为30微米以下，所述细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛，所述染料中包含苏木素。本发明所述试剂盒耗时短，检测速度快，可以用于快速病理检测；且检测步骤简单，尿液样品不需要繁琐的前期预处理；以及样品处理量大，提高检出率，减少假阴性。

Description

一种用于检测人体的尿液标本中肿瘤细胞的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞的检验检测领域，具体涉及一种用于检测人体的尿液标本中肿瘤细胞的检测试剂盒。

背景技术

在人体患有肾癌和膀胱癌等泌尿系统癌症时，人体的尿液标本中可能会含肿瘤细胞。如何快速、有效、准确地判断这些尿液标本中是否含恶性肿瘤细胞，具有十分重要的临床意义。现有广泛使用的尿液中肿瘤细胞的检测方法一般为：收集尿液标本，离心后取细胞沉淀，固定包埋成石蜡块保存，切片染色在显微镜下找恶性肿瘤细胞。此方法步骤过多，耗时长(3-7天)，对数量极少的肿瘤细胞容易漏诊。

专利CN201721589654公开了一种膀胱癌胶体金免疫检测试剂盒，所述检测试剂盒包括试纸条、上样垫、金标垫以及吸水纸，所述试纸条的上样端的上方叠置所述上样垫、金标垫，试纸条的另一端上叠置所述吸水纸，所述试纸条的底面结合有PVC底板；所述试纸条上靠近所述上样端设有检测线，靠近所述吸水纸的一端设有质控线；所述标金垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体ABC71，所述检测线上包被有AG-CD71抗原。该专利的检测试剂能够高效检测膀胱癌患者尿液中的肿瘤细胞，灵敏度高，特异性强，方便快捷，成本低廉，节省患者就医费用。但利用吸水纸来吸取尿液中的肿瘤细胞，使得该试剂盒对应的方法对膀胱癌患者的检出率大受限制，因此该试剂盒难以得到普及推广。

因此，本领域需要提供一种新的用于检测人体的尿液标本中肿瘤细胞的检测试剂盒。

发明内容

我们开发了一种基于膜过滤技术快速富集肿瘤细胞的方法用于快速分离富集诊断尿液标本中的肿瘤细胞。其原理为通过膜过滤技术直接分离尿液标本中的细胞，其中红细胞和白细胞被去除(如果有的话)，上皮细胞、间皮细胞和肿瘤细胞等体积较大的细胞被牢固的吸附固定在过滤膜上。整个过滤过程一步完成，无需前期处理步骤，过滤完成后过滤膜可以进行各种下游染色(如HE染色即苏木精—伊红染色，巴氏染色，免疫组化染色)。

因此，本发明首先提供一种用于检测人体的尿液标本中肿瘤细胞的检测试剂盒，所述试剂盒包括过滤膜、细胞固定物和常规染色用的染料，所述过滤膜的滤孔为穿透膜厚度方向的直孔道，且滤孔的孔径为5～20微米，过滤膜的厚度为30微米以下，所述细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛，所述染料中包含苏木素。

本发明中，所述过滤膜的直孔道是指膜上的通孔为垂直膜面的垂直孔道或倾斜孔道，该滤孔不是弯曲孔道或无规孔道。

在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括过滤器，所述过滤器包括过滤柱和用于控制液体流动的阀门。

在一种具体的实施方式中，所述过滤膜为径迹蚀刻膜，且所述径迹蚀刻膜的厚度为25微米以下，优选20微米以下，更优选15微米以下。

本发明中，过滤膜的厚度过厚则容易堵塞孔道。在现有技术中包含规整直孔道且厚度够薄的过滤膜中，径迹蚀刻膜是最合适的，而光刻膜的厚度很难达到这个要求。

在一种具体的实施方式中，所述过滤膜为孔径均匀且孔径在7～9微米的径迹蚀刻膜。

在一种具体的实施方式中，所述试剂盒还包括用于封片的浓度为20～60wt％的甘油。

在一种具体的实施方式中，所述细胞固定物为细胞固定液，且所述细胞固定液为浓度为2.5～20wt％的多聚甲醛溶液或浓度为4～50wt％的甲醛溶液。

本发明还提供一种如上所述试剂盒的应用，包括先使用过滤膜过滤尿液，再在尿液液面降低至仍然保持在过滤膜的膜面上方时加入生理盐水继续过滤，加入生理盐水继续过滤的次数为一次或多次，然后在尿液与生理盐水的混合液液面降低至仍然保持在过滤膜的膜面上方时加入呈液态的细胞固定物，将过滤膜上的细胞固定，细胞固定物固定细胞的时间为1分钟以上，优选3～60分钟，更优选5～20分钟，然后将细胞已经固定好的过滤膜从过滤器中取出，再对过滤膜使用所述染料染色后送镜检。

在一种具体的实施方式中，继续过滤以便将包含细胞固定液、尿液和生理盐水的混合液全部流动至过滤膜下方，再从过滤器中取出膜上细胞已经固定好的过滤膜。

本发明至少具备如下有益效果：

1、耗时短，检测速度快，可以用于快速病理检测。

2、步骤简单，尿液样品不需要繁琐的前期预处理。

3、视野干净，更有利于在显微镜下观察，排除干扰。该分离过程尤其对常规染色法来说非常重要。

4、样品处理量大，提高检出率，减少假阴性。

5、所有待检测细胞，均匀地分布于一个平面膜上，不需要传统的从石蜡块中切片后显微镜下观察。对于阳性细胞很少的标本可以大大提高检测效率和灵敏度。

6、本发明的试剂盒中包含细胞固定物，且细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛，且在使用所述试剂盒中的细胞固定物时，具体以浓度为2.5～20wt％的多聚甲醛溶液或浓度为4～50wt％的甲醛溶液为细胞固定液，结合特定的细胞固定方法，即过滤膜上的肿瘤细胞在未被完全固定之前保持不直接与空气接触，即固定前的细胞保持处在液体环境中。这使得本发明所述试剂盒和相应的操作方法能成功固定过滤膜上的肿瘤细胞，用于镜检。

7、对于本发明所述试剂盒的应用来说，为了保持肿瘤细胞在固定之前处于液体中，发明人之前使用显微镜对过滤膜上的肿瘤细胞进行在线监测，但这毕竟大幅增加了装置设备的复杂程度和操作难度。而本发明中却保持肿瘤细胞处在液体环境时，即在过滤尚未完结之前就将固定液倒入过滤器中，待肿瘤细胞在过滤膜上的液体环境中完全固定后，再将剩余的液体滤掉和将过滤膜取出，使得本发明能高效和精准地检测到标本中的肿瘤细胞。

附图说明

图1为实施例1所示的疑似膀胱癌患者尿液采用常规染色法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图，其中的染色剂为苏木素。

图2为实施例1中厚度为12微米的径迹蚀刻膜截留肿瘤细胞的原理示意图。

图3为对比例1中厚度为32微米的径迹蚀刻膜无法截留肿瘤细胞的原理示意图。

具体实施方式

以下结合附图进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不以实施例为准。

实施例1

本实施例为尿液中癌细胞的检测。检测患者尿液中是否有癌细胞，用于判断患者是否患有尿路上皮癌，包括上尿路的肾盂、输尿管癌，以及下尿路的膀胱癌。一般很难有其它恶性肿瘤能转移到尿液中。所以对尿液的过滤膜检测来说，一般使用常规染色法检测出尿液中是否有癌细胞即可，而无需做免疫组化染色确定相应的肿瘤细胞来源或分型。

如果尿液中检测到恶性肿瘤细胞，则一定是癌。如果尿液中没有检测到恶性肿瘤细胞，则不一定患者没有癌。因为，人体每天都是不断的产生尿液并排泄掉，也有一部分尿路上皮癌患者其肿瘤细胞并不脱落至尿液中，因此，在对尿液检测中无肿瘤细胞只是代表该次尿液标本无肿瘤细胞。和膀胱镜活检相比，活检是取患者的膀胱肿块送检，是判断良恶性的金标准，但是该检测方法是痛苦的和有创的。另外，对于上尿路的肾盂、输尿管癌目前没有很好的手术前活检手段进行检测。因此，本发明提供了一种十分快捷、方便、无创的尿路上皮癌检测方法，非常适用于肾盂、输尿管癌、膀胱癌的大规模筛查以及辅助诊断。使用本发明所述试剂盒检测到恶性细胞基本可以确诊患者患有尿路上皮恶性肿瘤；如果使用本发明所述试剂盒并未检测到尿液中含肿瘤细胞，则还需要参考其它检测结果判断。

以疑似膀胱癌患者尿液中癌细胞的检测为例，其具体步骤如下：

1.组装膜过滤装置，过滤器中设置一张径迹蚀刻膜(膜厚度为12微米±1微米，孔径为8微米±1微米)作为过滤膜，过滤器上面连接针筒用于存储过滤样品，下端连三通阀用于开关过滤装置，排气后关闭三通阀，加入3ml生理盐水湿润管壁。

2.将尿液标本加入针筒中，打开三通阀，使尿液缓慢过滤。过滤时要确保不能让液体完全流尽，液面不能低于过滤膜，以免截留在过滤膜上的肿瘤细胞破裂。

3.过滤中加入生理盐水清洗管壁，直至滤液澄清。在此过程中仍然需要确保不能让液体完全流尽，液面不能低于过滤膜，以免截留在过滤膜上的肿瘤细胞破裂。例如尿液液面保持在过滤膜的膜面上方10mm以上时，不需要加入生理盐水。而当尿液液面或尿液与生理盐水的混合液的液面降低至过滤膜的膜面上方10mm以下时，需要加入生理盐水。每个尿液标本大概使用生理盐水清洗3～4次，使得尿液标本得到完全的过滤。

4.即将过滤完成时加入固定液4％多聚甲醛过滤固定，共加入约10ml多聚甲醛，使得截留在过滤膜上的肿瘤细胞充分固定。在固定步骤完成之前，依然应避免过滤装置中进入空气，即不能让过滤器的膜面上方的液体完全流尽，液面不能低于过滤膜。

5.室温充分固定5min后取出过滤膜，此时过滤膜上的肿瘤细胞已经固定完成，固定完成后过滤器中的液体可以流尽，此时对肿瘤细胞不会有影响，肿瘤细胞不会再破碎。将取出的过滤膜置于六孔板中，于摇床上PBST(磷酸盐吐温缓冲液)洗5min×3次。

在固定并冲洗过滤膜后，后续步骤为染色步骤。对于尿液标本来说，一般使用常规染色法做一张过滤膜即可，如巴氏染色或苏木素染色。以下是巴氏染色步骤。

6.加巴氏染色试剂盒核染剂5分钟，然后加入温自来水中返蓝五分钟。

7.加入浆染剂染色5分钟，滤纸沿膜边吸干。

8.加入增色剂中增色20秒，且不要洗的条件下直接使用40％甘油封片观察。

如果将上述步骤6～8替换为如下步骤6B，则为苏木素染色步骤。

6B.对一张已经固定和清洗的过滤膜加入苏木素染色液染色5分钟，然后加入温自来水中返蓝五分钟。使用40％甘油封片观察。

图1为对实施例1所示的疑似膀胱癌患者尿液采用常规染色法染色进行膜过滤检测恶性肿瘤细胞的检测结果图，其中的染色剂为苏木素。从图1的尿液标本检测结果可见，过滤膜上部分细胞的细胞核大，具体如见两个圆圈标记处，异型性明显，可以判断为恶性肿瘤细胞。根据这个检测结果就基本可以判断患者为肾癌或膀胱癌，而不太可能是其他转移癌。当然，也可以对该尿液标本进一步做膜过滤和免疫组化染色实验来确诊。

本发明中过滤的尿液标本在过滤器的过滤柱中的初始高度可以任意选择，例如可以是1～5cm高或10～20cm高，等等。当然，标本量太大时，过滤时间相应长，且需要使用的冲洗用生理盐水的冲洗次数也更多。而当标本量太小时，可能难以保持液体没过过滤膜的膜面，另外也可能因标本量太少而未过滤截留到肿瘤细胞。在本发明的过滤操作中，一般全程使用生理盐水冲洗3～5次，首先当标本高度从20cm降低到10mm时不需加生理盐水冲洗，在标本高度降低到一定高度例如10mm时，关闭过滤器上的三通阀，加入生理盐水，进行第一次冲洗过滤。保持过滤膜处在液体(待检尿液标本与生理盐水的混合液)中，向液体中加入固定剂。此前一定不要把过滤膜捞出，以免膜上的肿瘤细胞受到压力而破裂。

对比例1

本实施例为尿液中癌细胞的检测。对比例1中的检测方法与实施例1相似，但将实施例1中的径迹蚀刻膜的厚度由12微米±1微米更改为32微米±1微米。实验结果显示，在该厚度的过滤膜上截留到肿瘤细胞的概率大幅度降低。

而若将实施例1中的径迹蚀刻膜的厚度由12微米±1微米更改为25微米±1微米。实验结果显示，在该厚度的过滤膜上可以截留肿瘤细胞，但截留到的肿瘤细胞的数量变少或者截留到肿瘤细胞的概率变低。进一步的实验发现，径迹蚀刻膜的厚度越大，则过滤膜能截留到肿瘤细胞的概率越低。该实验中，具体使用申请人在先的专利申请CN201811172818.6中公开的一种可以在显微镜下使用的过滤装置来观察。具体地，当膜厚度即过滤孔的长度小于过滤目的细胞(肿瘤细胞)的直径时，细胞会变形成双凸哑铃样结构牢牢的固定卡死在过滤膜的过滤孔里(图2)，要形成这种结构，膜孔的大小和膜孔的长度均需要小于等于过滤的目的细胞。一旦形成双凸哑铃样结构，细胞会十分牢固的被固定在膜孔中，即使施加各种外力也很难洗脱，如反向冲洗，反向离心(离心力高达4000g)，脱水后冲洗等。而当膜的厚度增加至明显超过目的细胞时，细胞会变形直接通过过滤孔(图3)，而不会形成双凸哑铃样结构被固定在过滤膜上。

从上述实施例和对比例的比对可知，若想得到能准确判断鉴别尿液中是否存在肿瘤细胞的检测试剂盒，本发明中包含对尿液过滤的过滤膜、用于细胞固定的细胞固定物以及特定厚度的过滤膜，这几个条件缺一不可。甚至本发明中还必须采用在液体中固定细胞的特殊细胞固定方法。

因PBST和生理盐水均为实验室的常见试剂，因而本发明所述试剂盒中并不包括这两种组分，这两种组分若加入试剂盒中反而会使得试剂盒的运输和保存等工作都变得不方便。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于检测人体的尿液标本中肿瘤细胞的检测试剂盒，所述试剂盒包括过滤膜、细胞固定物和常规染色用的染料，所述过滤膜的滤孔为穿透膜厚度方向的直孔道，且滤孔的孔径为5～20微米，过滤膜的厚度为30微米以下，所述细胞固定物中包含甲醛和/或多聚甲醛，所述染料中包含苏木素。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括过滤器，所述过滤器包括过滤柱和用于控制液体流动的阀门。

3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述过滤膜为径迹蚀刻膜，且所述径迹蚀刻膜的厚度为25微米以下，优选20微米以下，更优选15微米以下。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述过滤膜为孔径均匀且孔径在7～9微米的径迹蚀刻膜。

5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于封片的浓度为20～60wt％的甘油。

6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述细胞固定物为细胞固定液，且所述细胞固定液为浓度为2.5～20wt％的多聚甲醛溶液或浓度为4～50wt％的甲醛溶液。

7.一种如权利要求1～6中任意一项所述试剂盒的应用，其特征在于，先使用过滤膜过滤尿液，再在尿液液面降低至仍然保持在过滤膜的膜面上方时加入生理盐水继续过滤，加入生理盐水继续过滤的次数为一次或多次，然后在尿液与生理盐水的混合液液面降低至仍然保持在过滤膜的膜面上方时加入呈液态的细胞固定物，将过滤膜上的细胞固定，细胞固定物固定细胞的时间为1分钟以上，优选3～60分钟，更优选5～20分钟，然后将细胞已经固定好的过滤膜从过滤器中取出，再对过滤膜使用所述染料染色后送镜检。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，在固定反应完成后，继续过滤以便将包含细胞固定液、尿液和生理盐水的混合液全部流动至过滤膜下方，再从过滤器中取出膜上细胞已经固定好的过滤膜。

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