CN107923821A - 观察标本制作用细胞保持基材保持件及包括其的套件以及观察标本的制作方法 - Google Patents

观察标本制作用细胞保持基材保持件及包括其的套件以及观察标本的制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可简便地进行细胞保持基材的装卸的观察标本的制作用细胞保持基材保持件及细胞保持基材套件，并提供能够同时解决细胞剥离、干燥、立体性的消失这三个问题、而且能够用光学显微镜充分地观察细胞器的观察标本的制作方法。所述细胞保持基材保持件包括：(一)支撑板(1)，其具有细胞保持基材配置部(12)，所述细胞保持基材配置部(12)具有可通水的窗部；以及(二)夹持用板(2)、(3)，其具有可通水的窗部，并可与所述支撑板(1)配合地将细胞保持基材(9)夹持固定于细胞保持基材配置部(12)，且可拆卸。所述细胞保持基材套件(10)包括所述细胞保持基材保持件、和细胞保持基材(9)。在所述方法中，利用无机纤维集合体捕获细胞，并直接实施湿固定、染色、及利用折射率与无机纤维的折射率相同的封固剂的封固。

Description

观察标本制作用细胞保持基材保持件及包括其的套件以及观 察标本的制作方法
技术领域
本发明涉及：能够在出于对细胞实施各种染色并利用显微镜(光学、荧光)进行观察的目的而制作的观察标本的制作中使用的细胞保持基材保持件及包括其的套件、以及观察标本的制作方法，更详细而言，涉及：实施了在细胞诊(细胞诊断)中实施的病理染色中的、湿固定和其后的使用染色槽的染色(巴氏染色、PAS染色、阿尔新蓝染色等)的观察标本的制作方法。
背景技术
该领域主要用于癌的诊断，并按下述步骤实施：由采集自患者的细胞制作观察标本，具有细胞诊断士、细胞诊断专门医、病理专门医等资格的人进行镜检，检出异常细胞(异型细胞)。此外，该领域主要在医院等医疗机构实施，需要每天制作并检查大量的检体(观察标本、镜检标本)。
细胞诊根据细胞的采集方法分类，包括有：对混入有剥离的细胞的体液进行采集的剥离细胞诊(痰、尿、胸水、腹水、心包液、脑脊液、胆汁等)；将刷子、棉棒等插入体内并擦过病变部从而采集细胞的脱落细胞诊(子宫颈部或子宫体部、支气管、胆管、胰管等)；将细针刺入病变部并进行吸取从而采集细胞的穿刺吸取细胞诊(乳腺、甲状腺、淋巴结、肝脏等)等，将这些采集的细胞涂抹于观察用基板(载玻片)，制作观察标本。向载玻片的涂抹多以将细胞分散于液体的状态进行，在采集的状态不是体液等液状的情况下，有时在分散于固定液体后进行涂抹(液状化检体细胞诊)。
“细胞染色”除了该领域以外还存在多种领域。根据制作而成的观察标本的使用目的(完成度)不同，染色方法、试剂、器具、设备也完全不同。染色的目的例如可列举出：将组织根据细胞种类不同染成不同颜色，从而明确各自的位置(例：免疫组织染色)；以细胞具有的一些标记、形态学特征为基础，只要利用装置能够检出目的细胞的数目、染色强度即可(例：高内涵筛选、流式细胞术)；前述的目的中，利用人眼进行观察(例：血细胞计数器的细胞计数)；将细胞内外的目标物质染色，从而观察位置(例：荧光显微镜观察)；观察细胞器的形状、颜色(例：细胞诊)；进一步详细观察到乃至细胞器内部结构(例：电子显微镜观察)，但在该领域中，通过光学显微镜下的观察来进行观察，要求以能够充分观察细胞器的观察倍率(大约200～400倍)，取得能够判别细胞器的形状、染色的颜色及浓淡的观察影像。
此外，由于所提供的细胞试样的状态、使用的试剂的性质、需要的标本的完成度等原因，在该领域的迄今为止的通常的观察标本制作工序中，需要没有在其它染色领域中进行过的、如下所述的独特的作业工序。
涂抹
是将所提供的细胞试样涂敷于观察用基板(载玻片)的操作。包括直接涂敷于载玻片的方法(拉片法、推片法、离心直接涂抹法等)、在利用过滤器捕获细胞后转移至载玻片的方法(过滤器法)。前者的拉片法、推片法虽然简便，但是难以涂抹于狭窄的范围，并且由于在推片所使用的玻璃侧也附着有细胞，因此细胞密度变薄，存在观察操作时必须观察较大范围这样的问题。此外，由于后者的过滤器法无法将捕获的所有细胞转移到载玻片，因此存在细胞损失的问题，此外存在因转移操作时的压力而导致细胞形状变性这样的问题。
湿固定
是浸渍于试剂(固定液)进行固定以避免涂抹后的细胞变性的操作。在该领域中湿固定是重要的，若细胞干燥变性，则染色性发生变化，对诊断产生影响。通常，涂抹至载玻片的细胞必须在几秒内进行湿固定。因此，难以同时涂抹大量的检体。此外，在涂抹中使用设备的离心直接涂抹法、过滤器法存在下述问题：在从设备、载玻片架上取出期间、还有过滤器法的转移操作的期间会晾干。另外另外，刚刚涂抹后的细胞容易从载玻片剥离，若浸渍于固定液，则也存在导致大量细胞从载玻片剥离这样的问题。在细胞具有块状的堆叠性的情况下，就更加难以将它们保持于载玻片。为了解决该剥离的问题，也有施加防细胞剥离涂层(硅烷涂层等)的载玻片的方案，但实际上并未获得充分的效果。此外，为了同时解决剥离、干燥的问题，提出了喷射或滴下具有保湿性的固定液而涂覆细胞与载玻片的方法。然而，由于在喷射固定液的瞬间也会引起细胞的剥离，并且保湿成分(PEG等)涂覆细胞，因此存在使细胞的染色性发生变化、对诊断产生影响这样的新问题。
染色(包括溶剂更换、分离、显色)
通过将数片完成了涂抹及湿固定的载玻片垂直地设置于染色筐，并投入至加入有染色液等试剂的染色槽或覆盖有自来水的垫子，使其静置或出没，来进行实施。染色工序长且复杂，例如在巴氏染色的手法中进行三重染色，虽然根据实施装置不同而有些许差异，但是全部工序需要20～25个步骤左右。这是由于：除了染色之外，还包括根据染色试剂更换溶剂的工序、冲洗多余的染色液的清洗工序(分离)、以及为了进行显色而浸渍于溶液中的工序等。此外，各染色步骤的时间、在试剂中的出没次数优选以严密设定的状态实施，将细胞器等目标分别染色的该领域的染色中，获得染色的稳定性和再现性非常重要。这样，该领域的染色中，针对大量的患者检体，必需均匀快速地处理，进行具有稳定性和再现性的染色，此时，使用染色筐及染色槽是有用的。由于染色筐能够以不损伤涂抹面的方式保持多个载玻片，因而使在染色槽间的移动、出没这样的操作变得容易。此外，为了不产生染色不均匀、脱色不均匀，需要将涂抹面快速浸渍于大容量的染色液、分离液(清洗液)中，但通过利用染色筐及染色槽进行投入、出没这样的操作能够避免这样的不均匀。这样，在染色工序中，由于经过若干步骤进行与试剂的接触，因此与湿固定工序同样地，存在导致涂抹于载玻片的细胞发生剥离这样的问题。
脱水·澄澈
通过从低浓度的乙醇槽逐渐地向纯乙醇槽转移进行脱水，并最终浸渍于二甲苯槽中来实施。通过该操作使组织变得透明，成为适于镜检的标本。在澄澈中使用了溶解力强的溶剂，因此若对在过滤器法中主要使用的聚碳酸酯制薄膜上的细胞直接进行澄澈，则会引起薄膜的溶解、白浊，因此无法将薄膜用作观察用基材，需要将捕获的细胞转移至载玻片。
封固
向涂抹面投入封固剂(树脂溶解于溶剂而成)，并利用盖玻片和载玻片夹持细胞来实施。通过用封固剂密封染色后的细胞，由此能够防止镜检操作时对涂抹面的物理性冲击、显微镜照明导致的劣化、以及经时性褪色而长期保存。
观察
利用光学显微镜来实施。例如，由于在巴氏染色中需要进行核内染色质结构的观察，而在PAS染色中则需要观察颗粒的颜色，因此最低程度也需要获得200～400倍的清晰的观察影像。
在该领域中，到目前为止的通常的观察标本的制作是通过上述那样的工序来实施的。这样的使用了染色筐、染色槽的染色工序通过人工或利用自动染色装置来实施。
此外，在该领域中，以往公知的观察标本的制作是通过涂抹于载玻片来实施的。载玻片的观察性良好，细胞以稍微扩散的状态贴附于玻璃表面进行分布，因此易于观察细胞内部，且由于平坦而具有易于进行封固操作的优点。另一方面，则由于其平面的结构，在观察标本的制作工序中无法保持细胞，会引起剥离。而且缺乏保湿性，容易引起干燥导致的细胞的变性。此外，由于细胞为伸展的形状，因此存在难以检出作为癌细胞的特征的细胞形状、细胞核的立体不规则的问题。这样，迄今为止还没有能够同时解决细胞剥离、干燥、立体性的消失这三个问题、且能够用光学显微镜充分地观察细胞器的观察标本的制作方法。
另外，使用过滤器来捕获细胞并制作分析、诊断用的标本这样的方法如下所述已经提出，但是其无法解决所述技术问题。
专利文献1是一种省略了封固时的失误、熟练的技术的方法，没有公开关于过滤器的结构、种类。
专利文献2～5没有公开使用染色槽的观察标本的制作方法。此外，未实施封固工序，且未利用折射率一致的封固剂进行封固，由于曲面状的纤维表面而产生漫反射，因此，无法得到在光学显微镜下能够判别细胞器的程度的清晰的观察影像。实际上，专利文献2的实施例仅是利用荧光观察来观察具有特定的细胞表面标记的细胞的有无，此外，专利文献3的实施例仅是从低倍率的不清晰的图像中，根据细胞的外形、染色的有无来对细胞数进行计数，这样，在对捕获到纤维上的细胞进行观察时，未实施封固工序的方法无法得到该领域中所需要的完成度的观察标本。
另一方面，在利用显微镜载物台对捕获了细胞的过滤器进行观察时，优选仅将过滤器从过滤装置等中取出并设置于载玻片等薄的基板上，从而完成观察标本。理由是：必须进行封固操作，且以高倍率进行观察时物镜与观察对象的距离变短，因此需要对观察标本整体进行减薄。另外，为了防止显微镜操作时对细胞固化面的物理性损伤、显微镜照明导致的损伤、经时性褪色，可利用以甘油、液体石蜡为主成分的油状的物质、或由溶解于溶剂的树脂形成的称作封固剂的试剂进行密封来实施封固操作。由于若在封固时混入有气泡等，则观察性降低，因此以气泡不易附着、残留于封固面的方式，利用两片平坦的玻璃(载玻片、盖玻片)将细胞夹持于其中，并利用封固剂对空隙进行密封。
关于专利文献4所公开的标本夹具，记载了将能够捕获细胞的窗取出的方案，但是对于细胞捕获时的窗的固定方法、取出方法、及其机构则没有具体记载。这样，对于不能容易地仅装卸过滤器的过滤器夹具而言，无法得到该领域所需要的完成度的观察标本。
此外，在专利文献5所公开的过滤组件中，过滤器为了在细胞捕获时保持过滤器形状，而利用粘接剂粘接于框架(树脂制的框)，不能容易地装卸，若将捕获了细胞的过滤器与框架一起夹入玻璃进行封固，则不仅容易在过滤器与框架的台阶部分残留气泡，而且在封固剂干燥的同时会发生体积减少，因此会在上下的玻璃之间产生空隙、产生气泡，导致观察性恶化。而且，观察标本自身也会变厚，不能进行高倍率下的镜检。因此，虽然需要仅将过滤器从框架取出，但是该情况下，若不进行切断过滤器等繁杂的操作则不能取出，在进行该切断操作时有可能导致过滤器歪斜、固着于过滤器的细胞发生剥离。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平4-165321号公报
专利文献2：日本专利公开2012-75383号公报
专利文献3：日本专利公开2004-298158号公报
专利文献4：日本特表平11-507724号公报
专利文献5：日本特表2008-537485号公报
发明内容
(一)要解决的技术问题
因此，本发明的技术课题在于提供一种可简便地进行过滤器等细胞保持基材的装卸的细胞观察标本的制作用的细胞保持基材保持件及套件，并提供一种能够同时解决细胞剥离、干燥、立体性的消失这三个问题且能够用光学显微镜充分地观察细胞器的观察标本的制作方法。
(二)技术方案
所述技术问题能够通过本发明的下述方案解决。
[1]一种观察标本制作用细胞保持基材保持件，其包括：
(1)支撑板，其具有细胞保持基材配置部，所述细胞保持基材配置部具有可通水的窗部；以及
(2)夹持用板，其具有可通水的窗部，并可与所述支撑板配合地将细胞保持基材夹持固定于细胞保持基材配置部，且可拆卸。
[2]根据[1]的观察标本制作用细胞保持基材保持件，其中，支撑板具有细胞保持基材配置部和框架部。
[3]根据[1]或[2]的细胞保持基材保持件，其中，支撑板以隔着窗部的方式在两侧具有凹陷(优选贯通口)，夹持用板是具有可嵌装于所述两凹陷(优选贯通口)的爪的盖板。
[4]根据[2]的细胞保持基材保持件，其中，夹持用板是具有可与支撑板的框架部抵接的凸缘部的凸缘板，还包括可将支撑板的框架部和凸缘板的凸缘部夹持固定的夹子。
[5]根据[4]的细胞保持基材保持件，其中，凸缘板具有可投入检体且可与凸缘部的窗部连通的杯部。
[6]根据[5]的细胞保持基材保持件，其中，杯部可分离。
[7]根据[3]～[6]中任一项的细胞保持基材保持件，其中，包括盖板、凸缘板、和夹子。
[8]根据[1]～[7]中任一项的细胞保持基材保持件，其中，在支撑板的窗部具有能够支撑细胞保持基材的支撑部件。
[9]根据[1]～[8]中任一项的细胞保持基材保持件，其中，支撑板的形状及大小为可收纳至染色筐的长方形。
[10]根据[1]～[9]中任一项的细胞保持基材保持件，其中，支撑板和/或夹持用板具有可插入镊子前端的凹陷(优选贯通口)。
[11]根据[1]～[10]中任一项的细胞保持基材保持件，其中，任何材料均由有机树脂构成。
[12]根据[1]或[2]的细胞保持基材保持件，其中，夹持用板为可嵌装、可夹设、或可枢接于支撑板的盖板。
[13]根据[3]、[7]～[12]中任一项的细胞保持基材保持件，其中，盖板具有能够使力作用的力点部。
[14]根据[3]、[7]～[13]中任一项的细胞保持基材保持件，其中，支撑板的细胞保持基材配置部和/或盖板具有通液结构。
[15]一种观察标本制作用套件，其包括[1]～[14]中任一项的细胞保持基材保持件、和细胞保持基材。
[16]根据[15]的套件，其中，细胞保持基材为空隙率90％以上的无机纤维片。
[17]根据[15]或[16]的观察标本制作用套件，其中，将细胞保持基材安装于细胞保持基材保持件时的形状及大小为可收纳至染色筐的长方形。
[18]一种观察标本的制作方法，其利用无机纤维集合体捕获细胞，并直接实施湿固定、染色、及利用折射率与无机纤维的折射率同等的封固剂的封固。
(三)有益效果
根据本发明的[1]的细胞保持基材保持件，能够利用支撑板和夹持用板来夹持固定细胞保持基材，并且容易将细胞保持基材从支撑板取下，因此能够仅使细胞保持基材移动到载玻片上，实现稳定的封固操作，并能够使观察标本整体减薄。
根据本发明的[2]的细胞保持基材保持件，支撑板具有框架部，且能够在该框架部设置：用于可装卸地固定夹持用板的嵌入用凹陷、在回收细胞保持基材时可插入镊子前端的凹陷、能够收纳夹持用板的突出部的收纳凹陷等，而附加各种功能。
根据本发明的[3]的细胞保持基材保持件，可利用盖板的爪来进行细胞保持基材在支撑板上的固定，因此不会在细胞保持基材上作用剪切力。因此，即使使用玻璃等无机的细胞保持基材(例如，无机纤维片)也不必担心破损，而且也容易装卸细胞保持基材。此外，由于具有盖板并能够在与支撑板配合地将细胞保持基材夹持固定于细胞保持基材配置部的状态下，直接用于利用染色筐的染色工序，因此作业性优异。
根据本发明的[4]的细胞保持基材保持件，可利用夹子来进行细胞保持基材在支撑板上的固定，因此不会在细胞保持基材上作用剪切力。因此，即使使用玻璃等无机的细胞保持基材(例如，无机纤维片)也不必担心破损，而且也容易装卸细胞保持基材。
根据本发明的[5]的细胞保持基材保持件，在将细胞保持基材用作过滤器的情况下，即使为大量的液状检体，也能通过过滤进行细胞的捕获。
根据本发明的[6]的细胞保持基材保持件，由于杯部可分离，因此能够减小套件的容积。
根据本发明的[7]的细胞保持基材保持件，能够在与支撑板配合地将细胞保持基材夹持固定于细胞保持基材配置部的状态下，直接用于利用染色筐的染色工序，因此作业性优异，并且由于不会在细胞保持基材上作用剪切力，因此能够以避免细胞保持基材破损的方式装卸细胞保持基材。
根据本发明的[8]的细胞保持基材保持件，在支撑板的窗部具有能够支撑细胞保持基材的支撑部件，因此不易因细胞滤去、染色等操作所产生的水压而导致细胞保持基材破损。
根据本发明的[9]的细胞保持基材保持件，由于支撑板可收纳至染色筐，因此可适用于以往用于载玻片涂抹细胞的染色的染色筐、自动染色装置。
根据本发明的[10]的细胞保持基材保持件，由于能够使用镊子进行细胞保持基材的装卸，因此作业性良好且减少了细胞保持基材被镊子前端损伤的可能性。
根据本发明的[11]的细胞保持基材保持件，由于是由有机树脂构成，因此在细胞保持基材保持件使用后容易废弃。
根据本发明的[12]的细胞保持基材保持件，由于可利用盖板的嵌装、夹设、或枢接来进行细胞保持基材在支撑板上的固定，因此不会在细胞保持基材上作用剪切力。因此，即使使用玻璃等无机的细胞保持基材(例如，无机纤维片)也不必担心破损，而且也容易装卸细胞保持基材。此外，能够在盖板与支撑板配合地将细胞保持基材夹持固定于细胞保持基材配置部的状态下，直接用于利用染色筐的染色工序，因此作业性优异。
根据本发明的[13]的细胞保持基材保持件，盖板具有能够使力作用的力点部，通过使力作用于该力点部，能够解除盖板与支撑板的夹持固定作用，因此能够容易地装卸细胞保持基材且避免损伤。例如，若力点部为可勾住手指的突出部、或可插入手指的切口部，则能够通过使力作用于该突出部或切口部，从而解除盖板与支撑板的夹持固定作用，并容易地装卸细胞保持基材且避免损伤。
根据本发明的[14]的细胞保持基材保持件，由于细胞保持基材配置部和/或盖板具有通液结构，因此能够促进对在染色时容易产生的、由细胞保持基材的盖板与细胞保持基材配置部夹持固定的部分的残留染色液的清洗除去。因此，不易因残留染色液扩散而产生染色斑，因此显微镜下的观察性优异。
根据本发明的[15]的套件，能够利用支撑板与夹持用板将细胞保持基材夹持固定，并容易将细胞保持基材从支撑板取下，因此能够仅使细胞保持基材移动到载玻片上，实现稳定的封固操作，并能够使观察标本整体减薄。此外，在细胞保持基材由多孔片构成的情况下，不需要高价的设备、特殊的操作技巧，能够以利用重力的细胞滤去这样的一个步骤来进行浮游细胞的浓缩、在细胞保持基材上的准固化，从而制作细胞观察标本。
根据本发明的[16]的套件，细胞保持基材由无机纤维片构成，并能够将细胞固定于细胞保持基材的内部空隙，因此能够与粘接状态的细胞同样地实现浸渍于试剂的操作。此外，由于空隙率为90％以上，因此不仅易于将细胞固定于细胞保持基材的内部空隙，而且通水性优异。
根据本发明的[17]的套件，能够将细胞保持基材以安装于细胞保持基材保持件的状态收纳至染色筐，因此能够适用于以往用于载玻片涂抹细胞的染色的染色筐、自动染色装置，能够操作性良好地将细胞染色。
根据本发明的[18]的观察标本的制作方法，在刚性优异的无机纤维集合体的内部空隙稳定地保持细胞，因此能够防止细胞的剥离及立体性的消失。此外，对具有重叠性的细胞块的保持也有用。
此外，无机纤维为亲水性，无机纤维集合体具有一定程度的保水力，因此即使放置数分钟时间，细胞也不会干燥，能够实现稳定的湿固定。因此，对大量检体的同时制作、向设备适用有用。
进一步，由于可保持细胞的立体性，因此对细胞、核的立体不规则、具有重叠性的细胞块的观察也有用。
进一步，由于无机纤维集合体对用于细胞诊的试剂所包括的溶剂(乙醇、甲醇、二甲苯)显示耐药性，而能够在细胞捕获后直接用作观察用基材，进行封固，因此不需要利用使用了薄膜过滤器的以往的过滤器法进行的转移操作。因此，不用担心转移的压力导致的细胞形状的变性，并避免此时产生的细胞损失。此外，利用折射率与纤维一致的封固剂进行封固，因此能够抑制因曲面状的纤维表面而发生的漫反射，能够得到即使在光学显微镜下也能够判别细胞器的程度的清晰的观察影像。
附图说明
图1是示意性地表示本发明的过滤器套件的一个方式的立体图。
图2是表示图1所示本发明过滤器套件所包括的本发明过滤器保持件(支撑板及盖板)的一个方式的使用前状态(保持过滤器之前的状态)的代替附图的照片。
图3是表示通过图2所示的支撑板及盖板夹入过滤器来保持过滤器的状态的代替附图的照片。
图4是表示将本发明的过滤器套件的另一方式所包括的凸缘板(凸缘部与杯部一体化)与衬垫组装后的状态的代替附图的照片。
图5是表示将图1所示的本发明的过滤器套件(其中，作为凸缘板，使用图4所示的凸缘板)组装后的状态的代替附图的照片。
图6是表示本发明的过滤器套件(支撑板、盖板及过滤器)的其它方式的使用前的状态(保持过滤器之前的状态)的代替附图的照片。
图7是表示利用光学显微镜(倍率：100倍)观察实施例1的观察标本而得到的细胞影像的显微镜照片。
图8是表示利用光学显微镜(倍率：400倍)观察实施例1的观察标本而得到的细胞影像的显微镜照片。
图9是表示利用光学显微镜(倍率：100倍)观察实施例2的观察标本而得到的细胞影像的显微镜照片。
图10是表示利用光学显微镜(倍率：400倍)观察实施例2的观察标本而得到的细胞影像的显微镜照片。
图11是表示利用光学显微镜(倍率：100倍)观察比较例1的观察标本而得到的细胞影像的显微镜照片。
图12是表示利用光学显微镜(倍率：400倍)观察比较例1的观察标本而得到的细胞影像的显微镜照片。
图13是表示利用光学显微镜(倍率：100倍)观察比较例2的观察标本而得到的细胞影像的显微镜照片。
图14是表示利用光学显微镜(倍率：400倍)观察比较例2的观察标本而得到的细胞影像的显微镜照片。
具体实施方式
下面参照附图，对作为本发明的观察标本制作用细胞保持基材保持件之一的、细胞保持基材发挥过滤器作用时的浮游细胞用观察标本制作用过滤器保持件(以下，有时称为本发明的过滤器保持件)、以及作为包括该观察标本制作用细胞保持基材保持件的本发明的观察标本制作用套件之一的过滤器套件(以下，有时称为本发明套件)进行说明，其次对本发明的观察标本的制作方法进行说明。
本发明的过滤器套件包括用于捕获细胞的过滤器、以及本发明的过滤器保持件。以下，对本发明套件进行说明，但除了本发明套件包括过滤器以外，该说明可直接适用于本发明的过滤器保持件。
图1所示的本发明套件10的一个方式由支撑板1；盖板2；可构成凸缘板3的凸缘部31及杯部32；两个夹子4a、4b；衬垫5；以及过滤器9构成。
支撑板1具有过滤器配置部12，并进一步能够具有框架部13，所述过滤器配置部12具有可通水的窗部11。在窗部11可设置能够支撑过滤器9的支撑部件14。虽然图1所示的窗部11设置有X字状的支撑部件14，但是在本发明的套件中，除了X字状以外，例如也可以设置＊字状、三角形状、I字状、Y字状、二字状、格子状、网眼状等的支撑部件。
在框架部13能够设置：在隔着窗部11的两侧用于可装卸地固定盖板2的嵌入用凹陷15a、15b；用于相对于支撑板1将凸缘部31配置于规定位置的连接用孔16；可在回收过滤器9时插入镊子前端的凹陷17、能够收纳后述的盖板2的突出部24的收纳凹陷18等。另外，在图1中，可插入镊子前端的凹陷17兼作收纳凹陷18。所述嵌入用凹陷15a、15b、凹陷17、或收纳凹陷18优选如图1所示为贯通口。此外，可插入镊子前端的所述凹陷17也能够设置于夹持用板、例如盖板2、凸缘板3。
另外，可插入镊子前端的凹陷17优选以能够取出过滤器9的方式与过滤器配置部12相邻设置。这样，若在支撑板1和夹持用板任意一方都设置可插入镊子前端的所述凹陷17，则在取下夹持用板时，即使过滤器9贴附于支撑板1和夹持用板任意一方，也能够将过滤器9无损伤地取出。此外，由于能够将盖板2的突出部24收纳于收纳凹陷18，且未在过滤器保持件形成突起，因此易于如现有技术那样收纳于染色筐使用。
另外，在图1中，过滤器配置部12是与过滤器9相同的长方形状，且由具有大致相同面积的外形的凹部构成。因此，能够将过滤器9紧贴地收纳于过滤器配置部12，并能够防止过滤器9的偏移。此外，在图6中，过滤器配置部是与过滤器相同的正圆形状，且由具有大致相同面积的外形的凹部构成。因此，能够将过滤器紧贴地收纳于过滤器配置部，并能够防止过滤器的偏移。这样，过滤器配置部优选为与过滤器相同的形状、且由具有大致相同面积的外形的凹部构成。
然而，过滤器配置部也能够是以避免过滤器偏移的程度与过滤器形状不同或面积比过滤器大的凹部。该情况下，由于在过滤器配置部与过滤器之间产生空间的余裕，能够使镊子介入于过滤器配置部与过滤器之间，因此易于将过滤器无损伤地设置于过滤器配置部，并且易于将过滤器从过滤器设置部取下。例如，在正圆形状的过滤器的情况下，过滤器配置部能够由与过滤器的直径相同或者具有比过滤器的直径更大的纵向长度和横向长度的长方形状的凹部构成，且能够使镊子介入于在过滤器配置部与过滤器之间形成的空间，因此能够无损伤地装卸过滤器。
另外，在有可能因过滤器配置部为形状与过滤器不同或面积比过滤器大的凹部而使过滤器发生偏移的情况下，优选过滤器配置部以能够与过滤器的外缘局部地接触而防止过滤器的偏移的方式在能够与过滤器的外缘接触的位置具有凸部。
进一步，如图6所示，过滤器配置部12优选具有贯通孔19作为通液结构。这是由于：通过这样具有贯通孔，通液性介由该贯通孔而提高，在染色工序后的清洗工序中，由于清洗液容易到达过滤器9并在清洗后易于排液，因此容易清洗除去残留的染色液。也就是说，若在由过滤器的盖板2和过滤器配置部12夹持的部分残留有染色液，则染色液扩散会产生染色斑而导致显微镜下的观察性降低，但是由于具有所述通液结构(贯通孔19)，容易清洗除去残留的染色液，因此具有显微镜下的观察性优异的效果。
此外，虽然图6中的通液结构为贯通孔19，但是并非必须为贯通孔，也可以是设置于与过滤器相接的面并与过滤器配置部12的外缘(包括嵌入用凹陷15a、15b、凹陷17)相通的槽。在通液结构为槽的情况下，通液性介由该槽而提高，因此发挥与贯通孔时相同的作用，具有显微镜下的观察性优异的效果。
另外，如后所述，在凸缘板3的窗部35、与支撑板1的窗部11(使用盖板2时为盖板2的窗部21)之间设置能够防止漏液的衬垫5的情况下，优选所述通液结构(贯通孔19、槽等)以在细胞滤去时避免浮游状态的细胞漏出的方式位于比衬垫5所接触的位置更靠外侧。
盖板2具有可通水的窗部21，在窗部21能够设置能够支撑过滤器9的支撑部件22。作为支撑部件22的形状，例如可列举出X字状、＊字状、三角形状、I字状、Y字状、二字状、格子状、网眼状等。另外，盖板2的支撑部件22并非必须与支撑板1的支撑部件14为相同形状。
此外，在盖板2能够设置能够嵌装于支撑板1的两个嵌入用凹陷15a、15b的嵌入用爪23a、23b。如图3所示，盖板2能够与支撑板1配合地将过滤器9夹持固定于支撑板1的过滤器配置部12。即，在将过滤器9配置于支撑板1的过滤器配置部12上之后，使盖板2的嵌入用爪23a、23b与所述嵌入用凹陷15a、15b嵌装，并利用支撑板1与盖板2进行夹持，从而能够固定过滤器9。因此，不会在过滤器上作用剪切力，即使使用玻璃等无机过滤器(例如，无机纤维片)也不必担心破损。
进一步地，图1中的盖板2具有能够勾住手指的突出部24，因此通过将手指勾住突出部24并向上方牵拉，能够容易地将盖板2从支撑板1取下，能够将过滤器9无损伤地取出。尤其是在图1中，盖板2具有能够勾住手指的突出部24，而且盖板2中的一个嵌入用爪(在图1中为23a)的长度比另一个嵌入用爪(在图1中为23b)短，并且一个嵌入用爪23a与所述嵌入用凹陷15a的嵌装状态浅，因此通过将手指勾住所述突出部24并向上方牵拉，能够容易地取下盖板2，且能够将过滤器9无损伤地取出。
进一步地，盖板2的突出部24比支撑板1的收纳凹陷18小，在将盖板2安装于支撑板1的状态下，会在突出部24与收纳凹陷18之间产生空隙，因此将手指插入该空隙，且将手指勾住突出部24并向上方牵拉，能够容易地将盖板2从支撑板1取下，能够将过滤器9无损伤地取出。
该图1中的盖板2的突出部24是在盖板2的面方向上突出的力点部，但突出部也可以不是在盖板2的面方向上而是在厚度方向上突出。在这样的沿厚度方向突出的力点部的情况下，通过用手指抓住力点部并牵拉，由此能够从基于盖板2和支撑板1的夹持中释放，并且将过滤器9无损伤地取出。
此外，图1是盖板2的力点部是能够勾住手指的突出部24的方式，也可以是盖板2具有由能够插入手指的切口部构成的力点部来代替突出部24的方式。在具有切口部的情况下，通过将手指插入该切口部，且将手指勾住盖板2并向上方牵拉，由此能够从盖板2和支撑板1的夹持中释放，并且将过滤器9无损伤地取出。另外，优选该切口部从盖板2的外缘朝向窗部21方向延伸。此外，切口部可以在盖板的厚度方向上完全切开(即贯通口)，也可以部分地切开(即凹陷)。
另外，盖板2的支撑部件22优选以能够相对于在后面的染色工序中产生的来自过滤器面两方向的水压来支撑过滤器9并使作用于过滤器9的负荷分散的方式配置为不与支撑板1的支撑部件14重叠。
进一步地，如图1、图2所示，盖板2具有可插入镊子前端的凹陷27，该凹陷27在嵌入用爪23b间与窗部21接近，因此在将盖板2从支撑板1取下时，即使过滤器9贴附于盖板2，也能够无损伤地将过滤器9取出。
另外，在图1、图6中，盖板2的外形与支撑板1的过滤器配置部12的外形相当，盖板2为能够收纳至过滤器配置部12的状态。因此，能够利用过滤器配置部12和盖板2将过滤器9夹持固定，并防止过滤器9的偏移。这样，优选盖板2的外形与过滤器配置部的外形相当，盖板2能够收纳至过滤器配置部12。
此外，如前所述，在过滤器配置部12具有凸部的情况下，盖板2优选为对应的位置成为凹部，且能够收纳所述凸部。这是因为：由于能够以此方式收纳，从而能够使盖板2安装时的过滤器配置部12的厚度与框架部13为相同程度，因此易于如现有技术那样收纳至染色筐使用。
进一步地，如图6所示，优选盖板2也具有贯通孔29作为通液结构。这是由于：与支撑板1的过滤器配置部12具有贯通孔时同样地发挥作用，具有显微镜下的观察性优异的效果。
进一步地，虽然图6中的盖板2的通液结构为贯通孔29，但是并非必须为贯通孔，也可以是设置于与过滤器相接的面的与盖板外缘部相通的槽。在这种槽的情况下，通液性介由该槽而提高，因此发挥与贯通孔时相同的作用，并具有显微镜下的观察性优异的效果。
此外，与在支撑板1的过滤器配置部12具有通液结构时同样地，在如后所述那样在凸缘板3的窗部35与盖板3的窗部21之间设置能够防止漏液的衬垫5的情况下，优选所述通液结构(贯通孔29、槽等)以在细胞滤去时避免浮游状态的细胞漏出的方式位于比衬垫5接触的位置更靠外侧。
另外，支撑板1的过滤器配置部中的通液结构与盖板2中的通液结构可以相同也可以不同。例如，通液结构的形状、大小、位置、贯通孔或槽等可以相同也可以不同。然而，如图6所示，优选支撑板1的过滤器配置部中的通液结构和盖板2中的通液结构处于相对的位置。这是由于：通过以此方式处于相对的位置，从而清洗液容易到达过滤器并在清洗后易于排液，因此容易防止染色液残留且显微镜下的观察性优异。此外，虽然可以仅在支撑板1的过滤器配置部、或仅在盖板2具有通液结构，但是在双方都具有通液结构时前述的作用效果更优异。
就图1中的过滤器保持件而言，支撑板1具有隔着窗部11在长边方向上相对的两个嵌入用凹陷15a、15b，并通过嵌装盖板2的嵌入用爪23a、23b，从而能够将过滤器9夹持固定，但是，嵌装位置并非必须隔着支撑板1的窗部11在长边方向上相对。例如，也可以是隔着支撑板1的窗部11在短边方向上相对，还可以是以窗部11的中心为基准以相邻的嵌装位置所成的角度为60°、72°、90°、120°等一定角度来进行配置。
此外，图1中的方式为：支撑板1在四个位置具有参与嵌装的嵌入用凹陷，并且与之对应地，盖板具有四个嵌入用爪，但是并非必须为四个位置，只要在两个以上的位置嵌装即可。优选以能够稳定地夹持固定过滤器9的方式在3～6个位置嵌装。
进一步地，虽然图1中的过滤器保持件能够通过将盖板2的嵌入用爪23a、23b嵌装于支撑板1的两个嵌入用凹陷15a、15b而将过滤器9夹持固定，但是并非必须为能够通过嵌装将盖板2安装于支撑板1而将过滤器9夹持固定的方式。例如，也可以是如下方式：由具有可通水的窗部的盖板和具备具有可通水的窗部的过滤器配置部的支撑板构成，并将盖板配置于过滤器配置部，且能够利用与后述相同的能够夹持支撑板和盖板的薄壁夹子来进行夹设。或者，也可以是如下方式：由盖板和支撑板构成，其中，所述盖板具有可通水的窗部，并在一个端部具有枢接轴，且在另一个端部具有凸部(突起等)或凹部(贯通孔、凹陷等)，所述支撑板具备具有可通水的窗部的过滤器配置部，并在过滤器配置部的一个端部具有轴承，且在另一个端部具有凹部(贯通孔、凹陷等)或凸部(突起等)，其中，能够在一个端部将盖板的枢接轴插入并枢接于支撑板的轴承，并且能够在另一个端部将凸部与凹部嵌装。在这些方式中，也不会对过滤器9作用剪切力，因此能够无损伤地装卸过滤器。
另外，在相对于支撑板1具有可夹设的盖板或可枢接的盖板的情况下，也优选盖板具有能够勾住手指的突出部、能够用手指抓住的突出部、能够插入手指的切口部等力点部，以便容易将过滤器无损伤地取出。
支撑板1的形状及大小优选为以能够使用以往公知的染色筐及染色槽的方式可收纳至染色筐的长方形。也就是说，优选为符合以往公知的观察标本制作用载玻片的形状及大小，更具体而言，优选为纵76mm左右、横26mm左右、厚度1mm左右。此外，盖板优选为以能够使用以往公知的染色筐及染色槽的方式不从支撑板突出的形状及大小。
如图1所示，凸缘板3由凸缘部31、可投入检体且可与凸缘部31的窗部35连通的杯部32构成，且能够设计为使得凸缘部31与杯部32可分离，或如图4所示那样设计为一体成形。
图1所示的凸缘部31由在中央部具有可通水的窗部35且能够与支撑板1的框架部13抵接的凸缘33、以及能够将杯部32的内部和凸缘部31的所述窗部35可连通地连结的连结部34构成。在凸缘33，相对于支撑板1在规定的位置配置凸缘部31，因此能够在与支撑板1的连接用孔16对应的位置设置连接用突起36。
就本发明套件10而言，对于在过滤器配置部12保持有过滤器9的状态的支撑板1(优选为用盖板2固定了过滤器9的状态的支撑板1)、与凸缘板3，通过使截面コ字状的夹子4a、4b滑动，从而能够如图5所示那样，将支撑板1的框架部13、与凸缘板3的凸缘部31的凸缘33夹持固定，因此，支撑板1与凸缘板3配合而能够将过滤器9无损伤地夹持固定于过滤器配置部12。此外，能够通过使夹子4a、4b滑动来解除过滤器9的夹持固定状态，并取下凸缘板3，因此能够将过滤器9无损伤地取出。此时，若在凸缘板3的窗部35、和支撑板1的窗部11(使用盖板3时为盖板3的窗部21)之间设置能够防止漏液的衬垫5，则容易在细胞滤去时防止浮游状态的细胞的漏出。另外，作为夹子4a、4b，即使是与图5不同的能够利用弹簧施力的夹子的情况下，也能够将过滤器9无损伤地夹持固定，并能够将过滤器9无损伤地取出。此外，凸缘板3除了如图5所示那样能够利用夹子夹设的方式以外，也可以是凸缘板与支撑板能够嵌装或枢接的方式。
另外，图1、图5的套件10的凸缘板3具有杯部32，因此能够将包括细胞的液状检体大量投入至杯部32实施固化工序，但是在如利用移液管投入液状检体时那样使用少量的液状检体实施固化工序的情况下，也能够使用没有杯部32的凸缘板3。在该情况下，凸缘板3的连结部34能够发挥与杯部32相同的作用。也就是说，连结部34不会发生液状检体的横向泄露，且能够暂时地储存液状检体，并向凸缘板3的窗部35供给液状检体，使细胞固化。
此外，虽然图1所示的凸缘板3具备：具有凸缘33和连结部34的凸缘部31、以及杯部32，但是凸缘板3也可以仅由凸缘33构成。也就是说，可以没有连结部34及杯部32。在该情况下，只要凸缘板3具有能够暂时地储存液状检体的充分的厚度，窗部35就不会发生液状检体的横向泄露，且能够一边暂时储存液状检体一边对液状检体进行过滤，并使细胞固化。
另外，本发明套件可以如图1所示包括盖板2和凸缘板3两者作为夹持用板，或者，也可以仅包括任意一方。在同时使用盖板2和凸缘板3两者的情况下，以盖板2为主、凸缘板3为辅地作为夹持用板发挥功能。在仅使用盖板2或凸缘板3中任意一方的情况下，该一方作为夹持用板发挥功能。另外，在仅使用凸缘板3作为夹持用板的情况下，优选在凸缘板3的凸缘部31的窗部35设置与盖板2相同的能够支撑过滤器的支撑部件。
此外，在仅使用凸缘板3的情况下，与盖板2同样地，若在与支撑板1的过滤器配置部12相当的位置相邻地具有可插入镊子前端的凹陷，则在将凸缘板3从支撑板1取下时，即使过滤器9贴附于凸缘板3，也能够将过滤器9无不损伤地取出。进一步地，如前所述，在过滤器配置部12具有凸部的情况下，与盖板2同样地，凸缘板3优选为对应的位置成为凹部，且为能够收纳所述凸部的状态。
图1的过滤器保持件的支撑板1具有过滤器配置部12和框架部13，该框架部具有：用于将夹持用板(盖板2、凸缘板3)可装卸地固定的嵌入用凹陷15a、15b；能够在回收过滤器9时插入镊子前端的凹陷17、27；能够收纳夹持用板(盖板2、凸缘板3)的突出部24的收纳凹陷18，并且能够作为在夹持固定凸缘板3时的、夹子4a、4b的夹持固定部位进行利用，因此过滤器9的夹持固定性、装卸性、和/或染色性优异，但是支撑板1并非必须具有框架部。例如，在使用可嵌装、可夹设、或可枢接于过滤器配置部12的夹持用板(盖板2、凸缘板3)的情况下、过滤器9从过滤器配置部12突出的情况下、夹持用板(盖板2、凸缘板3)具有切口部作为力点部的情况下、和/或不使用凸缘板3的情况下，支撑板1不必具有框架部。
本发明套件所包括的过滤器9只要能够通过过滤操作捕获细胞，并能够实施之后的染色工序、封固工序等即可而没有特别限定，例如无机纤维片能够将细胞固定于过滤器的内部空隙，并能够进行浸渍于试剂的操作，因此较佳。特别是空隙率为90％以上的无机纤维片易于将细胞固定于过滤器的内部空隙，且通水性优异，因此较佳。作为这样的空隙率为90％以上的无机纤维片，例如可使用日本专利公开2010-185164号公报中记载的无机系纤维无纺布。
作为无机系纤维无纺布的构成纤维的材料，例如可列举出SiO2、Al2O3、B2O3、TiO2、ZrO2、CeO2、FeO、Fe3O4、Fe2O3、VO2、V2O5、SnO2、CdO、LiO2、WO3、Nb2O5、Ta2O5、In2O3、GeO2、PbTi4O9、L iNbO3、BaTiO3、PbZrO3、KTaO3、Li2B4O7、NiFe2O4、SrTiO3等，可以由它们中的一成分的氧化物构成，也可以由两成分以上的氧化物构成。例如，可以由SiO2-Al2O3的两成分构成。
无机系纤维无纺布的空隙率优选为91％以上，更优选为92％以上，进一步优选为93％以上，更进一步优选为94％以上。另一方面，虽然对于空隙率的上限没有特别限定，但是为了使形态稳定性优异而优选为99.9％以下。
此外，为了使无机系纤维无纺布不易因细胞滤去、染色等阶段的水压而破损且处理性优异，拉伸断裂强度优选为0.2MPa以上，更优选为0.3MPa以上，进一步优选为0.4MPa以上，更进一步优选为0.5MPa以上，更进一步优选为0.55MPa以上。该拉伸断裂强度为剪切载荷除以无机系纤维无纺布的截面积而得的商。另外，剪切载荷为以下述条件测定的值，截面积为根据测定时的试验片的宽度和厚度的积而得到的值。
产品名：小型拉伸试验机
型号：TSM-01-cre SEARCH CO.,LTD.(サーチ株式会社)制造
试验尺寸：宽5mm×长40mm
夹头间间距：20mm
拉伸速度：20mm/min.
初载荷：50mg/1d
虽然对于构成无机系纤维无纺布的纤维的平均纤维径没有特别限定，但是为了使纤维容易形成易于保持细胞的大小的孔，优选为3μm以下，更优选为2μm以下，进一步优选为1μm以下，更进一步优选为0.8μm以下。另外，虽然对于平均纤维径的下限没有特别限定，但是优选为0.01μm以上。本发明中“平均纤维径”是指50点的纤维径的算术平均值，“纤维径”是指以在映出10根以上的纤维的视野下拍摄无机系纤维无纺布而得的电子显微镜照片为基础进行测定的纤维的粗细。
虽然对于无机系纤维无纺布的平均每单位面积重量没有特别限定，但是若每单位面积重量超出必要而过高，则会导致细胞捕获工序、染色工序中的排水性变差，并容易导致捕获耗费时间、或染色不均匀，因此优选为20g/m2以下，更优选为15g/m2以下，进一步优选为10g/m2以下。另外，虽然对于平均每单位面积重量的下限没有特别限定，但是优选为1g/m2以上。本发明中的“平均每单位面积重量”是指18个试样(无机系纤维无纺布)的每单位面积重量的算术平均值，“每单位面积重量”是指对面积最大的面的面积及质量进行测定，并根据该面积和质量，换算成每1m2面积的质量的值。
虽然对于无机系纤维无纺布的平均厚度没有特别限定，但是若超出必要而过厚，则由于伴随着封固剂的干燥的体积减少，而使在观察标本内产生气泡的可能性提高，因此优选为400μm以下，更优选为300μm以下，进一步优选为200μm以下。另外，虽然对于平均厚度的下限没有特别限定，但是优选为20μm以上。本发明中的“平均厚度”是指试样(无机系纤维无纺布)的厚度的54个位置的算术平均值，“厚度”是指利用千分尺法[载荷：0.5N(测定面积：直径14.3mm)]对面积最大的面和面的长度进行测定而得的值。
虽然对于无机系纤维无纺布的平均孔径没有特别限定，但是为了容易保持直径约20μm左右的通常的细胞，优选为2～40μm，更优选为4～20μm，进一步优选为6～10μm。另外，平均孔径是指利用AS TM-F316中规定的方法得到的平均流量孔径的值，例如能够使用孔径计[Polometer、Coulter,Inc.制造]，利用平均流量点法进行测定。
优选无机系纤维无纺布的构成纤维是连续纤维。这是由于：若构成纤维为短纤维，则在染色工序中等中无机系纤维无纺布发生歪斜、或保持于无机系纤维无纺布的孔内的细胞发生移动的情况下，无机系纤维的端部可能损伤细胞，然而若是连续纤维则没有这种问题。另外，所谓“连续纤维”，是指拍摄无机系纤维无纺布的5,000倍的电子显微镜照片的情况下无法确认纤维的端部的纤维。
优选无机系纤维无纺布利用无机系粘接剂粘接。这是由于：形态稳定性优异且易于维持用于保持细胞的孔，并具有防止在各工序中过滤器发生破损的效果。特别是在无机系纤维无纺布的包括内部的整体中，若不在纤维彼此之间形成被膜而是利用粘接剂进行粘接，则在细胞捕获工序、染色工序中排水性良好，并能够抑制过滤时间的缩短、染色不均匀，因此较佳。
对于能够在本发明方法中使用的无机系纤维无纺布，能够通过公知的静电纺丝法，并优选通过将溶胶-凝胶法和中和纺丝法组合而成的静电纺丝法、例如日本专利公开2010-185164号公报中记载的制造方法来进行制造。日本专利公开2010-185164号公报中记载的制造方法包括下述工序：
(1)从包含以无机成分为主体的化合物的纺丝用无机系溶胶溶液中，利用静电纺丝法纺丝无机系凝胶状纤维的工序；
(2)照射与所述无机系凝胶状纤维相反极性的离子并使其集聚，形成凝胶状纤维网的工序；
(3)对所述凝胶状纤维网进行烧成，从而形成无机系纤维网的工序；
(4)向所述无机系纤维网的包括内部的整体供给包含以无机成分为主体的化合物的粘接用无机系溶胶溶液，并利用通气将剩余的粘接用无机系溶胶溶液除去，形成含有粘接用无机系溶胶溶液的无机系纤维网的工序；
(5)对所述含有粘接用无机系溶胶溶液的无机系纤维网进行热处理，在包括内部的整体中，形成利用无机系粘接剂粘接而成的无机系纤维无纺布的工序。
虽然对本发明的过滤器9的形状没有特别限定，但是例如可以如图1所示那样为四方形等方型形状，或是如图6所示那样为正圆等圆型形状。
作为本发明套件所包括的除了过滤器以外的部件的材料、即支撑板1、盖板2、凸缘板3、夹子4a、4b、衬垫5，只要能够捕获浮游细胞，则没有特别限定，例如可列举出有机树脂(例如，聚酰胺、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、丙烯酸、聚缩醛、聚丙烯、聚苯醚、聚苯硫醚、聚苯乙烯、聚氯乙烯、ABS树脂、AS树脂、三氟氯乙烯、1,1-二氟乙烯、全氟烷氧基氟树脂等)，从套件使用后的废弃性的观点出发，优选除了过滤器以外的部件的材料均由有机树脂构成。
本发明套件如图5所示地进行组装后，通过将欲制作观察标本的浮游细胞分散液投入杯部32，利用重力或者根据期望利用吸取进行过滤，由此能够将细胞捕获于过滤器9。捕获有细胞的过滤器9例如能够以固定于支撑板1与盖板2之间的状态，直接进入到使用染色筐及染色槽的细胞固定工序、染色工序中，在染色后将过滤器9从支撑板1取下，使其移动到载玻片上，进入封固工序。这样，若将细胞保持基材安装于细胞保持基材保持件时的形状及大小为可收纳至染色筐的长方形，则能够以将细胞保持基材安装于细胞保持基材保持件的状态收纳至染色筐，因此能够实施使用染色筐及染色槽的细胞固定工序、染色工序，能够作业性良好地将细胞染色。
以上是对作为本发明的观察标本制作用细胞保持基材保持件之一的浮游细胞用观察标本制作用过滤器保持件、以及作为包括本发明的观察标本制作用细胞保持基材保持件的本发明的观察标本制作用套件之一的过滤器套件的说明，是即对细胞保持基材发挥作为过滤器的作用时的说明，但是本发明的观察标本制作用细胞保持基材保持件、及观察标本制作用套件即使在细胞保持基材并非作为过滤器发挥作用的情况下，例如是细胞培养基材或细胞吸附基材的情况下也可使用。例如，在不使用上述那样的本发明的过滤器保持件而使用细胞培养基材或细胞吸附基材那样的细胞保持基材进行细胞在细胞保持基材上的固化工序之后，能够以利用支撑板和夹持用板(尤其是盖板)夹持了保持有细胞的细胞保持基材的状态，进入到使用染色筐、染色槽的细胞固定工序、染色工序。在该情况下，细胞保持基材能够使用具有适于利用显微镜进行的观察标本的厚度的细胞保持基材，例如能够使用玻璃基板、薄膜、或无机纤维片等。另外，将细胞固化于细胞保持基材的固化工序例如能够利用下述工序实施：在细胞培养基材上培养粘接性细胞并使其粘接的工序；在将作为上述的过滤器而使用的无机纤维片那样的、多孔质状的细胞吸附基材配置于培养容器底面以后，注入细胞分散液并静置，从而使细胞自然沉降并使其吸附的工序；或者利用细胞表面与细胞吸附基材的电荷来进行静电吸附的工序。
本发明的观察标本制作用细胞保持基材保持件及观察标本制作用套件能够用于本发明的观察标本的制作方法。
本发明的观察标本的制作方法(以下，有时称为本发明方法)可以包括使用无机纤维集合体的细胞捕获工序、湿固定工序、染色工序、澄澈工序、及封固工序。
本发明方法中的细胞捕获工序使用无机纤维集合体来捕获细胞。捕获方法只要是检体中的细胞能够以对细胞诊来说为充分的量而捕获于无机纤维集合体的方法即可，没有特别限定。
例如，通过将适当大小的无机纤维集合体贴附于在中央部设置有窗的基板的至少一方(优选一方)的表面，以完全地覆盖所述窗，由此能够制作在基板中央部形成了过滤器部的细胞捕获板，通过使检体在所述过滤器部通过(过滤)从而能够实施。或者，通过准备两片在中央部设置有窗的基板，以在它们之间夹入有适当大小的无机纤维集合体的状态将基板彼此贴附，由此能够制作在基板中央部形成了过滤器部的细胞捕获板，通过使检体在所述过滤器部通过(过滤)从而能够实施。虽然对于基板的大小、厚度没有特别限定，但是若考虑到使用以往的染色筐，则优选以观察标本制作用的载玻片为基准。
更具体而言，液体检体的情况下，直接或者用适当的液体(例如生理盐水、细胞固定液等)稀释以后滴至由无机纤维集合体构成的过滤器部的上表面，利用重力、或者根据期望利用吸取进行过滤，由此能够捕获细胞。特别是若为基于重力的过滤方法，则不易损伤细胞、且不易使细胞变性，因此较佳。液体检体的量多的情况下，通过以在过滤器部上配置了储液单元(例如，具有贯通的中空部的筒)的状态进行液体检体的过滤操作，能够捕获充分的量的细胞。此外，也可以在预先对液体检体进行离心处理而将多余的液体除去以后进行过滤操作。
检体不是液状的情况下，可以在将其分散于适当的液体(例如，生理盐水、细胞固定液等)以后，实施所述捕获操作。
作为在本发明方法中使用的无机纤维集合体，优选能够利用过滤操作捕获细胞、平坦且薄的无机纤维片。作为该无机纤维片，例如可列举出无机系纤维无纺布，其由于能够将细胞固定于过滤器的内部空隙，并能够进行浸渍于试剂的操作，因此较佳。特别是空隙率为90％以上的无机纤维无纺布易于将细胞固定于过滤器的内部空隙，且通水性优异，因此较佳。涉及能够用于本发明套件的无机系纤维无纺布的上述的说明能够直接适用于在本发明方法中能够使用的无机系纤维无纺布。
本发明方法中的湿固定工序是为了避免捕获于无机纤维集合体的细胞发生变性而将捕获有细胞的无机纤维集合体浸渍于试剂(固定液，例如95％乙醇)进行固定的工序，能够按照使用载玻片的以往公知的通常的观察标本制作方法中的湿固定操作来实施。在以往公知的观察标本制作方法中的湿固定操作中，由于已涂抹至载玻片的细胞容易干燥，因此要求在几秒内进行湿固定，但在本发明方法中，由于无机纤维集合体具有保水性，因此即使放置几分钟(例如3分钟～10分钟)，细胞也不会干燥，能够进行稳定的湿固定。
本发明方法中的染色工序是根据使用目的(检查目的)而通过能够适当选择的染色方法对完成了湿固定的捕获于无机纤维集合体的细胞进行染色的工序，能够按照使用载玻片的以往公知的通常的观察标本制作方法中的染色操作来实施。虽然在本发明方法的染色工序中不是必须使用染色筐及染色槽，但是就能够一并地处理大量的无机纤维集合体这一点而言，优选使用染色筐及染色槽。
作为在本发明方法中的染色工序中可使用的染色方法，例如可列举出巴氏染色、PAS染色、阿尔新蓝染色。
本发明方法中的澄澈工序是将完成了染色的捕获于无机纤维集合体的细胞在脱水以后浸渍于二甲苯等中而使细胞透明化的工序。能够按照使用载玻片的以往公知的通常的观察标本制作方法中的澄澈操作来实施。
本发明方法中的封固工序是利用封固剂将担载有经过染色的细胞的无机纤维集合体密封于盖玻片之下的工序。本发明方法中，使用具有与无机纤维集合体的构成纤维的折射率同等的折射率的封固剂。此处，同等是指在其折射率的±0.05的范围内。作为本发明方法能够使用的封固剂，例如能够使用Neo-Mount(注册商标)(merck#109016、折射率：1.46)、Softmount(注册商标)(Wako Pure Chemical I ndustries,Ltd.(和光纯药)#192-16301、折射率：1.50)、封固剂Ne w M·X(Matsunami Glass Ind.,Ltd.(松浪硝子工业)#FX00100、折射率：1.545)、封固剂MGK-S(Matsunami Glass Ind.,Ltd.(松浪硝子工业)#FK00100、折射率：1.545)、Multi-Mount480(Matsun ami Glass Ind.,Ltd.(松浪硝子工业)#FM48001、折射率：1.49)、Multi-Mount220(Matsunami Glass Ind.,Ltd.(松浪硝子工业)#FM22001、折射率：1.49)、marinol(MUTO PURE CHEMICALS CO.L TD(武藤化学)#20091、折射率：1.572)等。
本发明的观察标本的制作方法能够使用本发明的观察标本制作用细胞保持基材保持件及观察标本制作用套件实施。
[实施例]
以下，通过实施例对本发明具体地进行说明，但这些并不限定本发明的范围。
利用以下的实施例1及2、以及比较例1及2所示的条件，将细胞捕获或涂抹后进行固定。接着，使用巴氏/苏木精染色液(Wako P ure Chemical Industries,Ltd.(和光纯药)#168-18941)、巴氏EA100染色液(同上公司#164-18921)、巴氏OG100染色液(同上公司#161-18931)的各染色试剂，按照随附的说明书的步骤，使用染色筐及染色槽实施巴氏染色。染色后的澄澈中也按照同说明书的步骤，使用二甲苯槽实施。然后，利用市售封固剂(Softmount(注册商标)、Wako Pure Chemical Industries,Ltd.(和光纯药)、#192-16301、折射率：1.50)进行封固，制作观察标本。
《实施例1》
在对将溶胶-凝胶法与中和纺丝法组合而得到的无机系纤维网的包括内部的整体供给硅溶胶溶液并进行热处理而制造的、包括内部的整体中，将不形成被膜而是利用二氧化硅粘接剂而粘接的二氧化硅连续纤维集合体(平均每单位面积重量：7.42g/m2、平均厚度：142μm、平均孔径：7μm、平均纤维径：0.73μm、空隙率：95％、每单位面积重量的剪切载荷：0.57MPa、纤维材质的折射率：1.46)裁切成横30mm、纵26mm的长方形，利用二氧化硅连续纤维集合体覆盖开有直径20mm的孔的横76mm、纵26mm的铝板的孔，同时利用环氧树脂粘接剂粘接，制作过滤器(过滤器面：直径20mm、面积约3.1cm2)。接着，以过滤器的孔与筒的中空部介由O-型环(衬垫)连通的方式将直径20mm的筒用夹子固定。
接下来，向筒的中空部投入10mL被视为液体检体的HepG2细胞(源自人类肝癌的细胞系)的生理盐水分散液(5×104cells/mL)，利用重力进行了过滤。利用过滤器的二氧化硅连续纤维集合体捕获细胞后，立即浸渍于95％乙醇槽中，并进行了固定。
《实施例2》
与实施例1同样地将细胞捕获于二氧化硅连续纤维集合体，并于室温下放置3分钟后，浸渍于95％乙醇槽中，并进行了固定。
《比较例1》
将包含5×105cells的HepG2细胞的生理盐水离心处理除去上清液，制备细胞沉渣。利用拉片法将其涂抹于实施了防细胞剥离涂层处理的载玻片(武藤化学、#511617)的约9.3cm2的范围。涂抹后，立即浸渍于95％乙醇槽中，并进行了固定。
《比较例2》
与比较例1同样地将细胞涂抹于载玻片。于室温下放置3分钟后，浸渍于95％乙醇槽中，并进行了固定。
《比较结果》
将通过利用光学显微镜观察实施例1的观察标本(细胞捕获后，立即固定而成的观察标本)而得到的细胞影像示于图1(倍率：100倍)及图2(倍率：400倍)。
将通过利用光学显微镜观察实施例2的观察标本(细胞捕获后，于室温下放置3分钟后固定而成的观察标本)而得到的细胞影像示于图3(倍率：100倍)及图4(倍率：400倍)。
将通过利用光学显微镜观察比较例1的观察标本(细胞涂抹后，立即固定而成的观察标本)而得到的细胞影像示于图5(倍率：100倍)及图6(倍率：400倍)。
将利用光学显微镜观察比较例2的观察标本(细胞涂抹后，于室温放置3分钟后固定而成的观察标本)而得到的细胞影像示于图7(倍率：100倍)及图8(倍率：400倍)。
另外，图1～图8中，看起来是浓淡的灰色的细胞实际上被染色成蓝色。此外，图8中，由于细胞的膨化，看起来是深灰色至黑色的细胞，实际上被染色成猩红色至棕色。
1.细胞保持性
使用光学显微镜(奥林巴斯倒置显微镜IX73PI-22FL/PH)，在100倍观察下随机拍摄实施例1的观察标本的捕获面的5个位置、比较例1的观察标本的涂抹面的5个位置。在实施例1中，所有视野下均匀地观察到至少1000个以上的细胞(图1)，与之相对，在比较例1中，观察到500个左右的细胞数的视野为2个，几乎观察不到50个以下细胞，看出产生细胞剥离的视野为3个。另外，图5为观察到500个左右的细胞的显微镜照片。
2.干燥耐性
在实施例2中，即使室温放置3分钟，染色性也没有发生变化(图4)，与之相对，在比较例2中，发生了细胞的膨化，染色性变化(图8)。
3.观察性(细胞内)
在实施例1中，即使在高倍率(400倍)的观察中，也可获得能够充分地判别细胞器的观察影像(图2)。另一方面，在比较例1中，细胞稍微扩散，容易观察到细胞器。
4.观察性(立体性)
在实施例1中，维持了各个细胞的立体性及细胞间的立体位置关系(图2)。另一方面，在比较例1中，由于所有的细胞以贴附于载玻片的方式稍微扩散，因此细胞本来的立体结构消失了(图6)。
将这些结果示于表1。
[表1]
实施例1及2 比较例1及2
细胞保持性 ◎ ×
干燥耐性 ◎ ×
观察性(细胞内) ○ ◎
观察性(立体性) ◎ ×
工业可利用性
本发明的观察标本制作用的细胞保持基材保持件及细胞保持基材套件、以及观察标本的制作方法能够用于细胞诊等病理诊断及医学、药学、生命科学系等使用细胞的研究领域。
以上，按照特定的样式对本发明进行了说明，但对于本领域技术人员而言显而易见的变更方法或改良包括在本发明的范围内。
附图标记说明
10-浮游细胞用观察标本制作用过滤器套件；
1-支撑板；2-盖板；
3-凸缘板；4a、4b-夹子；
5-衬垫；9-过滤器；11-窗部；
12-过滤器配置部；13-框架部；
14-支撑部件；15a、b-嵌入用凹陷；
16-连接用孔；17-凹陷；18-收纳凹陷；
19-贯通孔(通液结构)；21-窗部；22-支撑部件；
23a、b-嵌入用爪；24-突出部；27-凹陷；
29-贯通孔(通液结构)；31-凸缘部；
32-杯部；33-凸缘；34-连结部；
35-窗部；36-连接用突起。

Claims (18)

1.一种观察标本制作用细胞保持基材保持件，其包括：
(1)支撑板，其具有细胞保持基材配置部，所述细胞保持基材配置部具有可通水的窗部；以及
(2)夹持用板，其具有可通水的窗部，并可与所述支撑板配合地将细胞保持基材夹持固定于细胞保持基材配置部，且可拆卸。
2.根据权利要求1所述的观察标本制作用细胞保持基材保持件，其特征在于，支撑板具有细胞保持基材配置部和框架部。
3.根据权利要求1或2所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，支撑板以隔着窗部的方式在两侧具有凹陷，夹持用板是具有可嵌装于所述两凹陷的爪的盖板。
4.根据权利要求2所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，夹持用板是具有可与支撑板的框架部抵接的凸缘部的凸缘板，还包括可将支撑板的框架部和凸缘板的凸缘部夹持固定的夹子。
5.根据权利要求4所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，凸缘板具有可投入检体且可与凸缘部的窗部连通的杯部。
6.根据权利要求5所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，杯部可分离。
7.根据权利要求3～6中任一项所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，包括盖板、凸缘板、和夹子。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，在支撑板的窗部具有能够支撑细胞保持基材的支撑部件。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，支撑板的形状及大小为可收纳至染色筐的长方形。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，在支撑板和/或夹持用板具有可插入镊子前端的凹陷。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，任何材料均由有机树脂构成。
12.根据权利要求1或2所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，夹持用板为可嵌装、可夹设、或可枢接于支撑板的盖板。
13.根据权利要求3或权利要求7～12中任一项所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，盖板具有能够使力作用的力点部。
14.根据权利要求3或权利要求7～13中任一项所述的细胞保持基材保持件，其特征在于，支撑板的细胞保持基材配置部和/或盖板具有通液结构。
15.一种观察标本制作用套件，其包括权利要求1～14中任一项所述的细胞保持基材保持件、和细胞保持基材。
16.根据权利要求15所述的套件，其特征在于，细胞保持基材为空隙率90％以上的无机纤维片。
17.根据权利要求15或16所述的套件，其特征在于，将细胞保持基材安装于细胞保持基材保持件时的形状及大小为可收纳至染色筐的长方形。
18.一种观察标本的制作方法，其利用无机纤维集合体捕获细胞，并直接实施湿固定、染色、及利用折射率与无机纤维的折射率同等的封固剂的封固。
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