CN112577794A - 一种无影胶黏取膜富集细菌的制片方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无影胶黏取膜富集细菌的制片方法及其应用。本发明提供的制片方法包括用无影胶把滤膜上富集的细菌黏取到玻片上进行制片的步骤。该方法通过过滤把细菌富集在滤膜表面，过滤后在滤膜上染色，再用无影胶将滤膜上已染色的细菌黏取出来，有效避免了滤膜因不能洗脱染色液而导致无法观察细菌的问题，为细菌镜检提供一种新的制片方法。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种无影胶黏取膜富集细菌的制片方法及其应用。
背景技术
对细菌进行涂片染色制片并镜检是医学检验中诊断细菌感染性疾病的常用手段，也是生物学研究中区分不同类型细菌的重要手段。染色的目的是借助于一种或多种染料，使细菌内结构分别着不同的颜色，这样在显微镜下能清楚地观察细胞内部结构，作出正确判断。
但传统的涂片染色存在诸多缺点，比如：1、涂片的质量受人为因素影响较大，涂片的厚薄难以控制，容易影响镜检的结果；2、样本复杂时杂质较多，会影响细菌着色和结果观察，如痰液、血液、髓液等；3、染色过程需要对玻片反复冲洗，一些固定不牢的细菌会被冲走，造成假阴性；4、滴加染色液和洗脱时间等依靠操作者的经验，随意性较大，不能定量，难以重复；5、开放式的操作方式会使操作人员暴露于危险之中。因此近几年出现了一些先富集细菌再进行染色制片的方法，其中滤膜过滤富集能有效地把细菌截留在膜上，达到良好的富集效果。但滤膜过滤富集细菌也存在一些问题，如滤膜染色后难以脱色影响镜检效果，甚至无法直接镜检。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种对膜富集细菌进行制片的方法。
本发明提供的对膜富集细菌进行制片的方法包括用无影胶将富集在滤膜上的细菌黏取到玻片上进行制片的步骤。
上述方法中，所述细菌为已染色细菌。所述染色的方法可为现有技术中常规的用于细菌检测的染色方法，如抗酸染色法、荧光染色法或革兰氏染色法等。
所述方法包括如下步骤：
1)用吸水纸在富集有已染色细菌的滤膜的背面吸干所述滤膜的水份，得到吸干水份的滤膜；
2)在玻片上滴加无影胶，得到滴有无影胶的玻片；
3)将所述吸干水份的滤膜水平置于所述滴有无影胶的玻片上，使所述滤膜上富集有已染色细菌的一面与所述玻片上滴有无影胶的一面相接触，并在所述玻片的另一面对无影胶进行固化，得到固化后的玻片；
4)撕去所述固化后的玻片上的滤膜。
上述方法中，所述2)中，在玻片的中间位置上滴加3-5滴无影胶，使玻片上形成直径大小约为25mm的圆形胶膜。
上述方法中，所述3)中，所述固化的方法为用紫外固化灯在所述玻片的另一面进行照射。
进一步的，所述照射的波长可为365-420nm；所述照射的时间可为20-60s。
更进一步的，所述照射的波长可为380nm；所述照射的时间可为30s。
本发明的另一个目的是提供无影胶或上述方法的新用途。
本发明提供了无影胶在对膜富集细菌进行制片中的应用。
本发明还提供了无影胶在制备对膜富集细菌进行制片的产品中的应用。
本发明还提供了上述方法在检测待测样本中细菌中的应用。
本发明的最后一个目的是提供一种检测待测样本中细菌的方法。
本发明提供的检测待测样本中细菌的方法包括如下步骤：
(1)采用滤膜过滤法富集待测样本中的细菌，使所述待测样本中的细菌截留在滤膜上，得到富集细菌的滤膜；
(2)在所述富集细菌的滤膜上对细菌进行染色，得到富集已染色细菌的滤膜；
(3)按照上述方法对滤膜上已染色细菌进行制片与镜检。
上述方法中，所述染色的方法可为现有技术中常规的用于细菌检测的染色方法，如抗酸染色法、荧光染色法或革兰氏染色法等。
上述应用或方法中，所述待测样本可为痰液、血液或髓液等。在本发明的一个具体实施例中，所述待测样本为菌液。
本发明提供了一种对膜富集细菌进行制片的方法，该制片方法包括用无影胶把滤膜上富集的细菌黏取到玻片上进行制片的步骤。该方法通过过滤把细菌富集在滤膜表面，过滤后在滤膜上染色，再用无影胶将滤膜上已染色的细菌黏取出来，有效避免了滤膜因不能洗脱染色液而导致无法镜检观察细菌的问题，为细菌镜检提供一种新的制片方法。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、无影胶黏取膜富集细菌的制片方法
1、对滤膜过滤富集的细菌进行染色，染色后取出滤膜，用吸水纸在滤膜截留细菌面的背面吸干滤膜的水份，得到吸去水份的滤膜。
2、完成步骤1后，准备干净的玻片(76mm×26mm)，在玻片的中间位置上滴加三到五滴无影胶(非凡力，货号为uv-50)，形成直径大小约为25mm的圆形胶膜，得到滴有无影胶的玻片。
3、完成步骤2后，将吸去水份的滤膜截留细菌面向下水平置于滴有无影胶的玻片上，在玻片的另一面用波长为380nm的紫外固化灯(博视乐BSL1001紫外灯)照射30s，进行固化。
4、完成步骤3后，慢慢撕去滤膜，将玻片无影胶面向上置于显微镜下，往中间滴加镜油，对染色细菌进行镜检。
实施例2、无影胶黏取膜富集细菌的制片方法在抗酸染色法镜检滤膜过滤富集细菌中的应用
一、本发明方法(实验组)
1、待测菌液的制备
配制梯度浓度的卡介苗(BCG)菌溶液：3×105条/mL、3×104条/mL、3×103条/mL、3×102条/mL、3×101条/mL。
2、细菌的滤膜过滤富集
将孔径大小为0.4μm的PVDF膜装入可换膜针头式过滤器(可换膜针头式过滤器型号为millipore SX0002500，购自millipore公司)的中间位置，得到带有滤膜的过滤器。
将步骤1制备的不同浓度的菌液分别加入到带有滤膜的过滤器中进行负压抽滤(Agela负压SPE装置)，使菌液通过滤膜，细菌被滤膜截留，得到富集细菌的过滤器。
3、染色
1)向富集细菌的过滤器中加入初染液(购自珠海贝索，主要成分为石碳酸复红)，浸泡滤膜1-20min，负压抽滤干净。
2)向富集细菌的过滤器中加入洗脱液(购自珠海贝索，成分为酸性酒精)，浸泡滤膜1-5min，负压抽滤干净。
3)向富集细菌的过滤器中加入复染液(购自珠海贝索，主要成分为亚甲基蓝)，浸泡滤膜1-5min，负压抽滤干净。
4、制片与镜检
取出过滤器中的滤膜，按照实施例1的步骤1-4中的方法进行制片与镜检。
二、直接涂片法(对照组)
1、吸取100μL菌液滴加在玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死细菌并使其粘附固定。
2、待冷却后放置在染色架上，滴加初染液(购自珠海贝索，主要成分为石碳酸复红)，盖满菌膜，染色20min。
3、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4、滴加洗脱液(购自珠海贝索，成分为酸性酒精)，布满菌膜，脱色1min。
5、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去标本上剩余的水。
6、滴加复染液(购自珠海贝索，主要成分为亚甲基蓝)，盖满菌膜，复染1min。
7、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水，自然干燥或烘箱烘干。
8、往菌膜中间滴加镜油，置于显微镜下观察染色细菌。
三、两种方法的镜检结果比较
本发明的方法和直接涂片法的抗酸染色法镜检抗酸菌的结果如表1所示。与现有技术中常规的直接涂片法相比，本发明方法的灵敏度明显提高。说明本发明方法可用于抗酸菌过滤后的收集及镜检，能有效避免细菌在滤膜上直接观察带来的影响。
表1、抗酸染色法镜检抗酸菌的结果
| 抗酸菌浓度/mL | 3×10<sup>5</sup>条 | 3×10<sup>4</sup>条 | 3×10<sup>3</sup>条 | 3×10<sup>2</sup>条 | 3×10<sup>1</sup>条 | 0条 |
| 本发明方法 | ++++ | +++ | ++ | + | + | - |
| 直接涂片法 | + | - | - | - | - | - |
注：“-”代表阴性；“+”代表3～9个抗酸菌/300视野；“++”代表1～9个抗酸菌/10视野；“+++”代表1～9个抗酸菌/1视野；“++++”代表≥10个抗酸菌/1视野。
实施例3、无影胶黏取膜富集细菌的制片方法在革兰氏染色法镜检滤膜过滤富集细菌中的应用
一、本发明方法(实验组)
1、待测菌液的制备
配制梯度浓度的革兰氏阳性菌溶液(链球菌溶液)：3×106条/mL、3×105条/mL、3×104条/mL、3×103条/mL、3×102条/mL。
配制梯度浓度的革兰氏阴性菌溶液(大肠杆菌溶液)：3×106条/mL、3×105条/mL、3×104条/mL、3×103条/mL、3×102条/mL。
2、细菌的滤膜过滤富集
将孔径大小为0.4μm的PVDF膜装入可换膜针头式过滤器(可换膜针头式过滤器型号为millipore SX0002500，购自millipore公司)中，得到带有滤膜的过滤器。
将步骤1制备的不同浓度的菌液分别加入到带有滤膜的过滤器中进行负压抽滤(Agela负压SPE装置)，使菌液通过滤膜，细菌被滤膜截留，得到富集细菌的过滤器。
3、染色
(1)向富集细菌的过滤器中加入初染液(购自珠海贝索，主要成分为草酸铵结晶紫染)，浸泡滤膜1min，负压抽滤干净。
(2)向富集细菌的过滤器中加入无菌水，负压抽滤干净。
(3)向富集细菌的过滤器中加入媒染染液(购自珠海贝索，主要成分为碘-碘化钾)，浸泡滤膜1min，负压抽滤干净。
(4)向富集细菌的过滤器中加入洗脱液(购自珠海贝索，成分为乙醇(95％)或丙酮酸)，浸泡滤膜30s，负压抽滤干净。
(5)向富集细菌的过滤器中加入复染液(购自珠海贝索，成分为蕃红染液或者沙黄)，浸泡滤膜30s，负压抽滤干净。
4、制片与镜检
染色后从过滤器中取出滤膜，按照实施例1的步骤1-4中的方法进行制片与镜检。
二、直接涂片法(对照组)
1、取适量菌液置于玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。
2、待冷却后放置在染色架上，滴加初染液(购自珠海贝索，主要成分为草酸铵结晶紫)，盖满菌膜，染色1min。
3、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4、滴加媒染染液(购自珠海贝索，主要成分为碘-碘化钾)，布满菌膜，浸泡玻片1min，负压抽滤干净。
5、滴加洗脱液(购自珠海贝索，成分为乙醇(95％)或丙酮酸)，布满菌膜，脱色30s。
6、滴加复染液(购自珠海贝索，成分为蕃红染液或者沙黄)，盖满菌膜，复染30s。
7、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水，自然干燥或烘箱烘干。
8、往菌膜中间滴加镜油，置于显微镜下观察染色细菌。
三、两种方法的镜检结果比较
本发明的方法和直接涂片法的革兰氏染色法镜检抗酸菌的结果如表2所示。与现有技术中常规的直接涂片法相比，本发明方法的灵敏度明显提高。说明本发明的方法可用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌过滤后的收集及镜检，能有效避免细菌在滤膜上直接观察带来的影响。
表2、革兰氏染色法镜检细菌的结果
注：“-”代表阴性；“+”代表3～9个细菌/300视野；“++”代表1～9个细菌/10视野；“+++”代表1～9个细菌/1视野；“++++”代表≥10个细菌/1视野。
Claims (10)
1.一种对膜富集细菌进行制片的方法，包括用无影胶将富集在滤膜上的细菌黏取到玻片上进行制片的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细菌为已染色细菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)用吸水纸在富集有已染色细菌的滤膜的背面吸干所述滤膜的水份，得到吸干水份的滤膜；
2)在玻片上滴加无影胶，得到滴有无影胶的玻片；
3)将所述吸干水份的滤膜水平置于所述滴有无影胶的玻片上，使所述滤膜上富集有已染色细菌的一面与所述玻片上滴有无影胶的一面相接触，并在所述玻片的另一面对无影胶进行固化，得到固化后的玻片；
4)撕去所述固化后的玻片上的滤膜。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述2)中，在玻片上滴加3-5滴无影胶。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述3)中，所述固化的方法为用紫外固化灯在所述玻片的另一面进行照射。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述照射的波长为365-420nm；
所述照射的时间为20-60s。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括镜检的步骤。
8.无影胶在对膜富集细菌进行制片中的应用；
或，无影胶在制备对膜富集细菌进行制片的产品中的应用；
或，权利要求要求1-7任一所述的方法在检测待测样本中细菌中的应用。
9.一种检测待测样本中细菌的方法，包括如下步骤：
(1)采用滤膜过滤法富集待测样本中的细菌，使所述待测样本中的细菌截留在滤膜上，得到富集细菌的滤膜；
(2)在所述富集细菌的滤膜上对细菌进行染色，得到富集有已染色细菌的滤膜；
(3)按照权利要求1-7任一所述方法对滤膜上已染色细菌进行制片与镜检。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述染色的方法为抗酸染色法、荧光染色法或革兰氏染色法。
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2019
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