CN112574863A - 一种基于双层膜过滤的细菌检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于双层膜过滤的细菌检测方法。本发明的检测方法包括如下步骤：先将待测样本通过含有由不同孔径滤膜构成的双层过滤膜的过滤器过滤，使细菌富集在滤膜表面，然后再在双层过滤膜上进行染色和细菌检测。本发明的方法不仅免去反复冲洗的步骤，不会造成细菌损失，也能避免操作人员多次接触涂片，造成风险。本发明的方法可用于抗酸染色法检测抗酸菌、革兰氏染色法鉴别细菌及其他染色法。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种基于双层膜过滤的细菌检测方法。
背景技术
对细菌进行涂片染色制片并镜检是医学检验中诊断细菌感染性疾病的常用手段，也是生物学研究中区分不同类型细菌的重要手段。染色的目的是借助于一种或多种染料，使细菌内结构分别着不同的颜色，这样在显微镜下能清楚地观察细胞内部结构，作出正确判断。染色的物理作用是利用毛细管现象，渗透、吸收和吸附作用，使染料的色素颗粒牢固地跟细菌结合，并使其显色；染色的化学作用是渗入细菌的染料与其相应的物质起化学反应。临床上常用的染色法有抗酸染色法、荧光染色法和革兰氏染色法。
传统的涂片染色方法是先使样本中的细菌通过火焰加热法、冷冻干燥法或化学法等粘附固定在玻片上，然后滴加染液对细菌进行着色，最后清洗染液滴加镜油于显微镜下镜检。传统的涂片染色法的优点在于仪器设备需要少、成本低，但有以下缺点：1、涂片的质量受人为因素影响较大，涂片的厚薄难以控制，容易影响镜检的结果；2、样本复杂时杂质较多，会影响细菌着色和结果观察，如痰液、血液、髓液等；3、染色过程需要对玻片反复冲洗，一些固定不牢的细菌会被冲走，造成假阴性；4、滴加染色液和洗脱时间等依靠操作者的经验，随意性较大，不能定量，难以重复；5、开放式的操作方式会使操作人员暴露于危险之中。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于富集待测样本中细菌的过滤器。
本发明提供的用于富集待测样本中细菌的过滤器为含有双层过滤膜的可换膜过滤器，所述双层过滤膜由上层过滤膜和下层过滤膜组成，所述上层过滤膜和所述下层过滤膜叠加放置(上层过滤膜和下层过滤膜紧贴着)，且所述上层过滤膜位于所述下层过滤膜上方；
所述上层过滤膜为大孔径滤膜；
所述下层过滤膜为小孔径滤膜。
上述过滤器中，所述滤膜为PVDF膜、PC膜或不锈钢网。
所述大孔径滤膜的孔径可为5-12μm；
所述小孔径滤膜的孔径可为0.1-1.0μm。
在本发明的一个具体实施例中，所述大孔径滤膜为PVDF膜，所述大孔径滤膜的孔径为5μm；所述小孔径滤膜为PC膜，所述小孔径滤膜的孔径为0.8μm。
上述过滤器中，所述可换膜过滤器可为现有技术中的常用可换膜过滤器，如可换膜针头式过滤器。在本发明的一个具体实施例中，所述可换膜过滤器为可换膜针头式过滤器，所述可换膜针头式过滤器是millipore公司的产品，型号为millipore SX0002500，滤膜直径为25mm。
本发明的另一个目的是提供上述用于富集待测样本中细菌的过滤器的制备方法。
本发明提供的用于富集待测样本中细菌的过滤器的制备方法包括如下步骤：将上述大孔径滤膜和小孔径滤膜叠加放置，且所述大孔径滤膜位于所述小孔径滤膜上方，得到双层过滤膜；然后将所述双层过滤膜共同装入上述可换膜过滤器(中间位置)中，得到所述过滤器。
上述过滤器或按照上述方法制备的过滤器在富集待测样本中细菌或在检测待测样本中细菌中的应用均属于本发明的保护范围。
本发明还有一个目的是提供一种富集待测样本中细菌的方法。
本发明提供的富集待测样本中细菌的方法包括用上述过滤器或按照上述方法制备的过滤器富集待测样本中细菌的步骤。
本发明最后一个目的是提供一种检测待测样本中细菌的方法。
本发明提供的检测待测样本中细菌的方法包括如下步骤：按照上述富集待测样本中细菌的方法富集待测样本中的细菌；采用染色法对所述细菌进行染色，实现细菌检测。
上述方法中，所述染色法可为抗酸染色法、荧光染色法或革兰氏染色法。
上述方法或过滤器或应用中，所述待测样本可为痰液、血液、髓液或菌液(如链球菌溶液、大肠杆菌溶液)等。在本发明的一个具体实施例中，所述待测样本为痰液或菌液。
为了达到减少人为因素影响、染色过程定量、富集细菌提高灵敏度、涂片染色定量重复的目的，本发明提供了一种基于双层膜过滤的细菌检测方法。本发明的检测方法包括如下步骤：先将细菌通过由不同孔径滤膜构成的双层过滤膜过滤，使细菌富集在滤膜表面，然后再在双层过滤膜上进行染色和细菌检测。本发明的方法不仅免去反复冲洗的步骤，不会造成细菌损失，也能避免操作人员多次接触涂片，造成风险。本发明的方法可用于抗酸染色法检测抗酸菌、革兰氏染色法鉴别细菌及其他染色法。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的痰碱性消化液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：4％(质量分数)氢氧化钠、2.6％(质量分数)柠檬酸钠、0.5％(质量分数)氯化钠。
实施例1、一种基于双层膜过滤的抗酸染色法镜检抗酸菌的方法
本实施例中的痰液样本来源于经诊断为结核病患者的痰液。分别采用本发明的基于双层膜过滤的抗酸染色法镜检抗酸菌和直接涂片法检测痰液样本中的抗酸菌。
一、基于双层膜过滤的抗酸染色法镜检抗酸菌(实验组)
1、样本的消化处理
将痰液样本和痰碱性消化液等体积混匀，室温消化30min，得到消化产物。
2、消化产物的过滤
(1)将孔径较大(5μm)的PVDF膜和孔径较小(0.8μm)的PC膜叠加放置，由上至下依次为孔径较大(5μm)的PVDF膜和孔径较小(0.8μm)的PC膜，得到双层过滤膜，然后将双层过滤膜装入可换膜针头式过滤器(可换膜针头式过滤器型号为millipore SX0002500，购自millipore公司)的中间位置，得到带有双层过滤膜的过滤器。
(2)将消化产物加入到带有双层过滤膜的过滤器中进行负压抽滤(Agela负压SPE装置)，使样本通过两层滤膜，大颗粒杂质被上层孔径较大的滤膜截留，细菌被下层孔径较小的滤膜截留，得到富集细菌的过滤器。
3、抗酸染色法镜检抗酸菌
抗酸染色法检测抗酸菌，具体步骤如下：
(1)直接向富集细菌的过滤器中加入初染液(购自珠海贝索，主要成分为石碳酸复红)，浸泡滤膜1-20min，负压抽滤干净。
(2)向富集细菌的过滤器中加入洗脱液(购自珠海贝索，成分为酸性酒精)，浸泡滤膜1-5min，负压抽滤干净。
(3)向富集细菌的过滤器中加入复染液(购自珠海贝索，主要成分为亚甲基蓝)，浸泡滤膜1-5min，负压抽滤干净。
(4)从过滤器中取出下层孔径较小的滤膜，截留细菌面向上置于玻片上，往中间滴加镜油，显微镜下观察染色细菌。
二、直接涂片法(对照组)
直接涂片法检测抗酸菌，具体步骤如下：
1、挑取适量痰液样本置于玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。
2、待冷却后放置在染色架上，滴加初染液(购自珠海贝索，主要成分为石碳酸复红)，盖满痰膜，染色20min。
3、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4、滴加洗脱液(购自珠海贝索，成分为酸性酒精)，布满痰膜，脱色1min。
5、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去标本上剩余的水。
6、滴加复染液(购自珠海贝索，主要成分为亚甲基蓝)，盖满痰膜，复染1min。
7、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水，自然干燥或烘箱烘干。
8、往菌膜中间滴加镜油，置于显微镜下观察染色细菌。
三、两种方法检测结果比较
本发明的基于双层膜过滤的抗酸染色法镜检抗酸菌(实验组)和直接涂片法镜检抗酸菌(对照组)的检测结果如表1所示。结果表明：本发明的基于双层膜过滤的抗酸染色法镜检抗酸菌的最低检测限比现有技术中的直接涂片法低，说明本发明方法的灵敏度更高。
表1、本发明的基于双层膜过滤的抗酸染色法和直接涂片法镜检抗酸菌的检测结果
| 抗酸菌浓度/mL | 3×10<sup>6</sup>条 | 3×10<sup>5</sup>条 | 3×10<sup>4</sup>条 | 3×10<sup>3</sup>条 | 3×10<sup>2</sup>条 | 0条 |
| 本发明方法 | ++++ | +++ | ++ | + | - | - |
| 直接涂片法 | + | + | - | - | - | - |
注：“-”代表阴性；“+”代表3～9个抗酸菌/300视野；“++”代表1～9个抗酸菌/10视野；“+++”代表1～9个抗酸菌/1视野；“++++”代表≥10个抗酸菌/1视野。
实施例2、一种基于双层膜过滤的荧光染色法镜检抗酸菌的方法
本实施例中的痰液样本来源于经诊断为结核病患者的痰液。分别采用本发明的基于双层膜过滤的荧光染色法镜检抗酸菌和直接涂片法检测待测样本中的抗酸菌。
一、基于双层膜过滤的荧光染色法镜检抗酸菌(实验组)
1、样本的消化处理
将痰液样本和痰碱性消化液等体积混匀，室温消化30min，得到消化产物。
2、消化产物的过滤
(1)将孔径较大(5μm)的PVDF膜和孔径较小(0.8μm)的PC膜叠加放置，由上至下依次为孔径较大(5μm)的PVDF膜和孔径较小(0.8μm)的PC膜，得到双层过滤膜，然后将双层过滤膜装入可换膜针头式过滤器(可换膜针头式过滤器型号为millipore SX0002500，购自millipore公司)的中间位置，得到带有双层过滤膜的过滤器。
(2)将消化产物加入到带有双层过滤膜的过滤器中进行负压抽滤(Agela负压SPE装置)，使样本通过两层滤膜，大颗粒杂质被上层孔径较大的滤膜截留，细菌被下层孔径较小的滤膜截留，得到富集细菌的过滤器。
3、荧光染色法镜检抗酸菌
荧光染色法镜检抗酸菌，具体步骤如下：
(1)直接向富集细菌的过滤器中加入初染液(购自珠海贝索，主要成分为金胺O)，浸泡滤膜1-20min，负压抽滤干净。
(2)向富集细菌的过滤器中加入洗脱液(购自珠海贝索，成分为酸性酒精)，浸泡滤膜1-5min，负压抽滤干净。
(3)向富集细菌的过滤器中加入复染液(购自珠海贝索，主要成分为高锰酸钾)，浸泡滤膜1-5min，负压抽滤干净。
(4)从过滤器中取出下层孔径较小的滤膜，截留细菌面向上置于玻片上，往中间滴加镜油，荧光显微镜下观察染色细菌。
二、直接涂片法(对照组)
直接涂片法检测抗酸菌，具体步骤如下：
1、挑取适量痰液置于玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。
2、待冷却后放置在染色架上，滴加初染液(购自珠海贝索，主要成分为金胺O)，盖满痰膜，染色20min。
3、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4、滴加洗脱液(购自珠海贝索，成分为酸性酒精)，布满痰膜，脱色1min。
5、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去标本上剩余的水。
6、滴加复染液(购自珠海贝索，主要成分为高锰酸钾)，盖满痰膜，复染1min。
7、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水，自然干燥或烘箱烘干。
8、往菌膜中间滴加镜油，置于荧光显微镜下观察染色细菌。
三、两种方法检测结果比较
本发明的基于双层膜过滤的荧光染色法镜检抗酸菌(实验组)和直接涂片法镜检抗酸菌(对照组)的方法的检测结果如表2所示。结果表明：本发明的基于双层膜过滤的荧光染色法镜检抗酸菌的最低检测限比现有技术中的直接涂片法低，说明本发明方法的灵敏度更高。
表2、本发明的基于双层膜过滤的荧光染色法和直接涂片法镜检抗酸菌的检测结果
| 抗酸菌浓度/mL | 3×10<sup>5</sup>条 | 3×10<sup>4</sup>条 | 3×10<sup>3</sup>条 | 3×10<sup>2</sup>条 | 3×10<sup>1</sup>条 | 0条 |
| 本发明方法 | ++++ | +++ | ++ | + | - | - |
| 直接涂片法 | ++ | + | - | - | - | - |
注：“-”代表阴性；“+”代表3～9个抗酸菌/300视野；“++”代表1～9个抗酸菌/10视野；“+++”代表1～9个抗酸菌/1视野；“++++”代表≥10个抗酸菌/1视野。
实施例3、一种基于双层膜过滤的革兰氏染色法镜检细菌的方法
待测菌液：革兰氏阳性菌溶液(链球菌溶液)：3×106条/mL、3×105条/mL、3×104条/mL、3×103条/mL、3×102条/mL；革兰氏阴性菌溶液(大肠杆菌溶液)：3×106条/mL、3×105条/mL、3×104条/mL、3×103条/mL、3×102条/mL。
分别采用本发明的基于双层膜过滤的革兰氏染色法镜检细菌和直接涂片法检测待测菌液中的细菌。
一、基于双层膜过滤的革兰氏染色法镜检细菌(实验组)
1、待测菌液的过滤
(1)将孔径较大(5μm)的PVDF膜和孔径较小(0.8μm)的PC膜叠加放置，由上至下依次为孔径较大(5μm)的PVDF膜和孔径较小(0.8μm)的PC膜，得到双层过滤膜，然后将双层过滤膜装入可换膜针头式过滤器(可换膜针头式过滤器型号为millipore SX0002500，购自millipore公司)的中间位置，得到带有双层过滤膜的过滤器。
(2)将待测菌液分别加入到带有双层过滤膜的过滤器中进行负压抽滤(Agela负压SPE装置)，使样本通过两层滤膜，大颗粒杂质被上层孔径较大的滤膜截留，细菌被下层孔径较小的滤膜截留，得到富集细菌的过滤器。
2、革兰氏染色法镜检细菌
革兰氏染色法镜检细菌，具体步骤如下：
(1)直接向富集细菌的过滤器中加入初染液(购自珠海贝索，主要成分为草酸铵结晶紫染)，浸泡滤膜1min，负压抽滤干净。
(2)向富集细菌的过滤器中加入无菌水，负压抽滤干净。
(3)向富集细菌的过滤器中加入媒染染液(购自珠海贝索，主要成分为碘-碘化钾)，浸泡滤膜1min，负压抽滤干净。
(4)向富集细菌的过滤器中加入脱色液(购自珠海贝索，成分为乙醇(95％)或丙酮酸)，浸泡滤膜30s，负压抽滤干净。
(5)向富集细菌的过滤器中加入复染液(购自珠海贝索，成分为蕃红染液或者沙黄)，浸泡滤膜30s，负压抽滤干净。
(6)从过滤器中取出下层孔径较小的滤膜，截留细菌面向上置于玻片上，往中间滴加镜油，显微镜下观察染色细菌。
二、直接涂片法(对照组)
直接涂片法检测革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，具体步骤如下：
1、取适量菌液置于玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。
2、待冷却后放置在染色架上，滴加初染液(购自珠海贝索，主要成分为草酸铵结晶紫)，盖满菌膜，染色1min。
3、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4、滴加媒染染液(购自珠海贝索，主要成分为碘-碘化钾)，布满菌膜，浸泡玻片1min，负压抽滤干净。
5、滴加洗脱液(购自珠海贝索，成分为乙醇(95％)或丙酮酸)，布满菌膜，脱色30s。
6、滴加复染液(购自珠海贝索，成分为蕃红染液或者沙黄)，盖满菌膜，复染30s。
7、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水，自然干燥或烘箱烘干。
8、往菌膜中间滴加镜油，置于显微镜下观察染色细菌。
三、革兰氏染色法镜检结果
本发明的基于双层膜过滤的革兰氏染色法镜检细菌(实验组)和直接涂片法镜检细菌(对照组)的方法的检测结果如表3所示。结果表明：本发明的基于双层膜过滤的革兰氏染色法检测革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的最低检测限比现有技术中的直接涂片法低，说明本发明方法的灵敏度更高。
表3、本发明的基于双层膜过滤的革兰氏染色法和直接涂片法镜检细菌的检测结果
| 阳性菌浓度/mL | 3×10<sup>6</sup>条 | 3×10<sup>5</sup>条 | 3×10<sup>4</sup>条 | 3×10<sup>3</sup>条 | 3×10<sup>2</sup>条 | 0条 |
| 本发明方法 | ++++ | +++ | ++ | + | - | - |
| 直接涂片法 | + | - | - | - | - | - |
| 阴性菌浓度/mL | 3×10<sup>6</sup>条 | 3×10<sup>5</sup>条 | 3×10<sup>4</sup>条 | 3×10<sup>3</sup>条 | 3×10<sup>2</sup>条 | 0条 |
| 本发明方法 | ++++ | +++ | ++ | + | - | - |
| 直接涂片法 | + | - | - | - | - | - |
注：“-”代表阴性；“+”代表3～9个细菌/300视野；“++”代表1～9个细菌/10视野；“+++”代表1～9个细菌/1视野；“++++”代表≥10个细菌/1视野。
Claims (10)
1.一种用于富集待测样本中细菌的过滤器，为含有双层过滤膜的可换膜过滤器，所述双层过滤膜由上层过滤膜和下层过滤膜组成，所述上层过滤膜和所述下层过滤膜叠加放置，且所述上层过滤膜位于所述下层过滤膜上方；
所述上层过滤膜为大孔径滤膜；
所述下层过滤膜为小孔径滤膜。
2.根据权利要求1所述的过滤器，其特征在于：所述滤膜为PVDF膜、PC膜或不锈钢网。
3.根据权利要求1或2所述的过滤器，其特征在于：
所述大孔径滤膜为PVDF膜；
所述小孔径滤膜为PC膜。
4.根据权利要求1-3任一所述的过滤器，其特征在于：
所述大孔径滤膜的孔径为5-12μm；
所述小孔径滤膜的孔径为0.1-1.0μm。
5.根据权利要求4所述的过滤器，其特征在于：
所述大孔径滤膜的孔径为5μm；
所述小孔径滤膜的孔径为0.8μm。
6.根据权利要求1-5任一所述的过滤器，其特征在于：所述可换膜过滤器为可换膜针头式过滤器。
7.权利要求1-6任一所述的过滤器的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1-6任一所述的大孔径滤膜和小孔径滤膜叠加放置，且所述大孔径滤膜位于所述小孔径滤膜上方，得到双层过滤膜；然后将所述双层过滤膜装入权利要求1-6任一所述的可换膜过滤器中，得到所述过滤器。
8.权利要求1-6任一所述的过滤器或按照权利要求7所述的方法制备的过滤器在富集待测样本中细菌中的应用；
或，权利要求1-6任一所述的过滤器或按照权利要求7所述的方法制备的过滤器在检测待测样本中细菌中的应用。
9.一种富集待测样本中细菌的方法，包括用权利要求1-6任一所述的过滤器或按照权利要求7所述的方法制备的过滤器富集待测样本中细菌的步骤；
或，一种检测待测样本中细菌的方法，包括如下步骤：按照权利要求9所述的富集待测样本中细菌的方法富集待测样本中的细菌；采用染色法对所述细菌进行染色，实现细菌检测。
10.根据权利要求1-6任一所述的过滤器或权利要求8所述的应用或权利要求9所述的方法，其特征在于：所述染色法为抗酸染色法或荧光染色法或革兰氏染色法。
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