KR20230066273A - 샘플 준비를 위한 자율 미세유체 장치 - Google Patents
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Abstract
상기 방법은 미세유동장치(100, 200)에서 샘플을 준비하는 것이다. 미세유체 장치(100, 200)는 내부에 배치된 제 1 흡수 부재(158, 218)를 가지는 배출 유닛(106, 206)과 유체 연통하고 이에 인접하여 제 2 저장소(104, 204)와 유체 연통하는 제 1 저장소(102, 202)를 갖는 것으로 제공된다. 제 1 저장소(102, 202)는 제 1 저장소와 제 2 저장소를 연결하는 모세관 스톱 밸브(228, 230)에 의해 제 1 저장소(102, 202)에 유지되는 제 1 액체(108, 208)를 수용한다. 제 2 저장소(104, 204)는 그 안에 배치된 샘플 지지체(116, 216)를 갖는다. 물질(114, 214)을 함유하는 제 2 액체(110, 210)가 제 2 저장소(104, 204)에 추가된다. 제 2 액체(110, 210)는 제 1 액체(108, 208) 및 제 1 흡수 부재(158, 218)와 접촉한다. 제 1 흡수부재(158, 218)는 제 2 액체(110, 210) 및 제 1액체(108, 208)를 흡수한다. 물질(114, 214)은 샘플 지지체(116, 216)에 부착된다.
Description
본 발명은 일반적으로 마이크로 입자, 나노 입자 및/또는 마이크로/나노 크기의 섬유와 같은 미립자 또는 세장형 섬유 유사 샘플의 일관되고 사용자 독립적인 준비를 위한 장치 및 방법에 관한 것으로, 현미경 또는 기타 검사 기술을 사용하여 후속 분석을 수행한다. 특히 이것은 투과 전자 현미경(TEM) 또는 주사 전자 현미경(SEM)의 응용 분야에 유용하다.
바이러스 입자, 바이러스 유사 입자, 단백질, 단백질 복합체, 섬유, 전달 소포, 의약품 및 무기 입자와 같은 마이크로 및 나노 크기 입자의 액체 샘플을 객관적으로 분석하려면 일관되고 사용자 독립적이며 반복 가능한 샘플 준비 방법이 필요하다.
예를 들어, 변형된 바이러스 벡터는 일반적으로 유전자 치료 응용 프로그램에 사용된다. 샘플 내 감염성 입자와 비 감염성 입자 및 파편/기타 물질의 비율을 결정하면 최종 유전자 치료제의 품질과 효능 및 업스트림 개발 공정에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있다.
SEM(Scanning Electron Microscopy, 주사 전자 현미경) 및 nsTEM(Negative Stain Transmission Electron Microscopy, 네거티브 스테인 투과 전자 현미경) 어플리캐이션은 진단 목적으로 SEM 및 nsTEM을 사용하여 바이러스와 같은 감염원을 검출하고 분석 하는 임상 진단 장치이다. 또한 SEM 및 nsTEM은 연구, 개발, 백신, 의약품 및 재료의 품질 관리에서 생물학적 및 무기 입자 및 재료의 특성화에 널리 사용된다. 화학적 및 생화학적 특성화 기술에 비해 SEM/nsTEM의 주요 장점은 관심 샘플을 직접 시각화할 수 있다는 것이다. 이를 통해 예를 들어 세포 형태를 결정하거나 병원성 유기체의 바이러스 계열을 식별할 수 있다. nsTEM에서 이미지 대비는 관심 입자를 포함하고 보존하는 중금속 스테인 용액(우라닐 아세테이트, 인텅스텐산 등)을 통해 달성된다.
전염병에서 바이러스 병원체를 식별하기 위한 제 1 스크리닝 도구로서의 TEM의 가치는 2003년 SARS 전염병 동안 진단 TEM이 원인 바이러스가 코로나바이러스 계열의 구성원임을 처음으로 표시한 동안 입증되었다. 에볼라, 지카 또는 SARS-COV2와 같은 신종 감염원이 세계화된 무역 및 여행의 결과로 대륙간 수준에서 빠르게 확산될 수 있는 능력과 세계 정치 현장의 불안정으로 인한 생물테러 공격의 위험을 고려하여, 효율적인 TEM 분석에 대한 액세스가 비상 대비, 관리 및 민방위의 중요한 부분임이 분명한다. 이것은 TEM의 일상적인 임상 사용과 의약품 개발 및 생산의 공정 설계 및 품질 관리에 대한 사용에 추가된다.
TEM을 사용하여 이미지화할 때 스테인은 샘플의 입자보다 더 많은 전자를 산란시킨다. 그 결과 입자가 몇 나노미터 수준의 해상도로 어두운 배경에서 밝게 나타나는 이미지가 생성된다. 일반적으로 TEM 그리드는 수동 준비 프로토콜에 따라 준비된다. 여기에는 샘플 액체 3-5μl를 TEM 그리드에 피펫팅한 다음 시편에 따라 약 10-60초 동안 흡수시키는 것이 포함된다. 과잉 샘플은 흡수지를 사용 하여 그리드에서 수동으로 제거 된다. 샘플을 블로팅한 직후 3-5 μl의 염색 수용액을 그리드에 추가한다.
그런 다음 과도한 스테인을 이상적으로 제거하여 흡수된 표본을 덮고 있는 스테인 액체의 균일한 얇은 층 또는 얇은 필름을 남긴다.이 얇은 필름을 건조시킨다. 필름은 TEM 이미징을 위해 시편을 내장하고 탈수로부터 시편을 보호한다. 스테인은 또한 대비를 증가시킨다. 한 가지 문제는이 수동 절차가 준비 일관성에 영향을 미치고 신뢰할 수 없는 결과를 초래하는 작업자의 기술에 크게 의존한다는 것이다. 수동 단계와 최종 블로팅의 일관성 없는 타이밍은 종종 잘못된 TEM 그리드 준비의 원인이다.
일관된 nsTEM 샘플 준비를 얻기 위한 대체 방법은 피펫팅 로봇이 액체를 TEM 그리드에 자동으로 분배하는 접촉 핀 인쇄 기술을 사용한다. 이러한 접근 방식은 액체 부피 감소 및 자동화 가능성과 같은 수동 준비에 비해 몇 가지 이점이 있다. 그러나 그들은 특별한 장비가 필요하고 수동 준비 프로토콜보다 훨씬 더 복잡하고 시간이 많이 걸린다.
또한, nsTEM 그리드 준비를 위한 미세 유체 장치가 설명되었다. TEM 그리드는 미세유체 채널에 국한되며 샘플 준비를 위한 액체 처리는 외부 압력 펌프에 의해 제어된다. 이렇게 하면 수동 준비에 비해 준비 일관성이 향상되지만이 접근법은 수동 절차보다 훨씬 더 많은 액체 부피를 필요로 한다. 또한 특수 장비가 필요하며 준비 방법을 신뢰할 수 없고 일관성이 없게 만드는 모든 준비 단계의 타이밍을 사용자가 제어해야 한다.
합성 및 일상적인 임상 진단과 같이 시간과 자원이 제한된 상황에서 전자 현미경을 사용하는 타당성에 도달하기 위해 극복해야 하는 몇 가지 장애물이 있다. 위에서 지적한 바와 같이, 분석을 위해 샘플을 준비하는 전문적인 작업은 매우 복잡하다. 이것은 TEM 기술의 사용을 소수의 전문가에게 제한된 정교한 기술(craftsmanship)로 만든다. 샘플 준비 방법은 기본적인 실험실 기술이 있는 사람의 경우 한 달 이면 배울 수 있지만 숙달하는 데는 여전히 상당한 전문적 변동성을 나타내면서 약 10년이 걸린다. 즉, 해당 분야의 전문가라도 바람직하지 않은 변동성 없이 일관된 결과를 생성할 수 없다.
샘플 준비는 일반적으로 표준화된 절차에 따라 수행된다. 먼저 샘플을 샘플 지지체(TEM의 경우 직경이 약 3mm인 금속 격자임)에 공급하고 샘플 지지체에 부착되도록 둔다. 다음 단계에서는 과잉 샘플 용액을 제거하고 입자를 보호하고/하거나 대비를 높이기 위한 스테인을 즉시 추가한다. 음성 염색 TEM의 경우이 염색은 중금속 염 용액이다. 그런 다음 과도한 스테인이 제거된다. 과도한 액체/스테인 제거는 여과지로 닦아서 수행된다. 샘플을 추가한 후 스테인을 추가하기 전에 과도한 액체를 제거한 후 추가 세척 단계를 수행하는 경우가 있다. 또는 그리드를 액체 방울에 담그면 액체를 추가할 수 있다. 이러한 단계는 일반적으로 기기 작업자가 수동으로 수행하므로 결과는 올바른 절차를 일관되게 수행하는 작업자의 능력에 크게 좌우된다.
또한 작업자가 얼마나 일관되고 숙련되었는지에 관계없이 다양한 준비 단계가 입자에 가하는 힘을 일관되게 제어하는 것은 불가능하다. 이것은 준비된 샘플의 품질에 영향을 미치고 후속 분석 결과의 신뢰성을 제한한다.
위에서 지적한 바와 같이 과거에는 일부 자동 또는 반자동 준비 방법이 제안되었다. 로봇 디스펜서, 특수 장비를 사용하는 미세유체학 또는 파이펫팅 장치에 연결된 특수 샘플 홀더에 의존한다. 로봇 디스펜서는 소량의 샘플만 필요로 하지만 대신 고도로 전문화된 장비에 의존한다. 미세유체 기반 샘플 전처리 방식은 보다 일관된 전처리를 제공하지만 다시 특수 장비(특수 그리드 홀더 및 외부 압력 펌프)에 의존하고 수동 전처리에 비해 약 10배 더 큰 샘플 부피가 필요하다. 그리드를 고정하는 포켓/슬릿이 있는 특수 피펫 팁을 사용하는 방법도 제안되었다. 이런 mprep 기반 접근 방식은 또한 더 많은 양의 샘플이 필요하며 수동 타이밍 단계를 포함한다. 또한 액체는 그리드 양쪽에서 플러시되어 품질이 좋지 않은 준비의 위험이 증가한다.
따라서 보다 안정적이고 일관된 nsTEM 샘플 준비 방법이 필요하다. 본 발명은 수동 준비와 관련된 사용자 편향 및 일관성 문제 없이, 그리고 종래의 자동화 접근법과 관련된 품질, 많은 샘플 부피, 값비싸고 특수한 장비의 결점 없이 전술한 문제에 대한 해결책을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 장치 및 방법은 후속 이미지화 및 분석을 위한 가시 이하 입자 샘플의 일관된 목적(사용자 독립적) 및 재현 가능한 준비를 제공한다. 본 발명의 방법은 지연 밸브 및 흡수막으로 작용하는 용해성 필름과 결합된 미세유체 기술을 기반으로 한다. 모두 일회용 샘플 준비 장치 또는 카드에 내장된으므로 특별한 장비나 대량의 샘플이 필요하지 않다. 서로 다른 액체는 용해성 필름과 흡수막(필터)의 설계에 의해 정의되는 특정 지연과 속도로 순차적인 방식으로 그리드 위로 흐른다.
상기 조합을 통해 서로 다른 샘플 준비 액체가 제어되고 잘 정의된 방식으로 샘플 그리드 위로 자동으로 플러시되는 고도로 자동화된 절차가 가능하다.
사용자가 샘플 액체를 추가하면 다양한 액체가 모세관력 및 기타 표면 장력 효과에 따라 추가 입력 없이 본 발명의 장치를 통해 자동으로 구동되기 때문에 전체 그리드 준비 공정이 자체 구동, 자체 포함 또는 자동으로 진행된다. 스테인 및 샘플 액체의 사용은 단지 본 발명의 장치에 사용되는 적절한 액체의 예시적인 예임을 이해해야 한다. 필요에 따라 다양한 다른 액체를 사용할 수 있다. 사용자 상호 작용은 시간에 민감하지 않은 방식으로 장치의 특정 위치에 스테인을 사전 로드한 후 샘플 액체를 추가하는 것으로 축소된다. 샘플을 추가하면 카드/장치에 미리 추가되거나 미리 저장된 액체(예: 스테인)가 있는 샘플 그리드에 대한 일련의 세척 단계가 트리거된다. 자동 준비가 완료되면 작업자는 올바르게 준비된 샘플 그리드를 TEM 또는 SEM 현미경으로 옮기거나 카드 자체를 SEM 또는 광학 현미경으로 옮긴다.
본 발명의 장치는 바람직하게는 액체를 추가하기 위한 용기 및 흡수막으로 구성되고 샘플이 로딩되는 그리드가 사전 장착되거나 사용자에 의해 추가되는 일회용 페이퍼 기반 키트를 구성하거나 실현된다. 미리 장착된 그리드의 경우 사용자 입력은 스테인을 파이펫팅한 다음(스테인이 사전 로드되지 않은 경우) 샘플 액체를 장치의 다른 용기로 옮기는 것으로 구성된다. 마지막 액체를 추가하면 미세 유체의 힘이 그리드를 통해 두 액체(즉, 스테인 및 샘플 액체)의 흐름을 구동하고 용해성 밸브가 공정의 타이밍을 제어하는 자율 준비 공정의 시작을 트리거한다. 그리드는 얇은 탄소층으로 코팅되거나 덮일 수 있으며, 이 층에 샘플 액체의 입자가 배출구 또는 유닛의 용해성 멤브레인이 용해될 때까지 흡수 또는 부착될 수 있어, 입자가 그리드에 남아 있고 이후에 하기에 자세히 설명된 대로 스테인 액체에 함유되도록 한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 자율 미세유체 장치는 바람직하게는 현미경 샘플 준비를 위한 것이다. 장치에서 라미네이트의 사용은 단지 예시적인 예이고 본 발명의 장치는 라미네이트를 사용하는 것으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 성형과 같은 다른 제조 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 미세유동장치는 바람직하게는 제 1 액체를 포함하거나 제 1액체가 추가되는 제 1 저수조를 갖는다. 제 1 액체는 제 1 저장소의 모세관 스톱 밸브에 의해 유지된다. 제 2 저장소는 제 1 저장소와 유체 연통한다. 제 2 저장소는 제 2 액체 및 그 안에 배치된 샘플 지지체를 갖는다. 제 2 저장소는 내부에 정의된 입구 개구를 갖는다. 배출 장치는 제 2 저장소에 인접해 있다. 배출 유닛은 제 2 저장소와 유체 연통하고 있다. 배출 유닛은 내부에 배치된 제 1 흡수 부재를 갖는다.
본 발명의 대안적인 실시예에서, 미세유체 장치는 내부에 정의된 채널을 갖고 제 1 저장소는 채널을 통해 제 2 저장소와 유체 연통한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 채널은 제 2 저장소에서 에지까지 연장된다.
본 발명의 다른 대안적인 실시예에서, 샘플 지지체는 제 1 폭을 갖고 개구는 제 1 폭과 실질적으로 유사한 폭을 갖는다.
본 발명의 대안적인 실시예에서, 배출 또는 블로팅 유닛은 제 1 흡수 부재 아래에 내부에 배치된 용해성 멤브레인을 갖는다.
본 발명의 다른 실시예에서, 배출 유닛은 용해성 멤브레인이 제 1 흡수 부재와 제 2 흡수 부재 사이에 배치되도록 용해성 멤브레인 아래에 위치하는 제 2 흡수 부재를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 제 1 저장소는 스테인 액체를 함유하는 사전 로드된 스테인 저장소이다.
본 발명의 대안적인 실시예에서, 모세관 스톱 밸브의 제 1 액체는 채널의 에지와 다른 표면 에지 사이에서 연장된다.
본 발명의 다른 실시예에서, 제 1 흡수 부재는 제 1 필터 또는 페이퍼가고 제 2 흡수 부재는 제 2 필터 또는 페이퍼가다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 용해성 멤브레인은 폴리-비닐-알코올(PVA)에 기초한 필름이다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 샘플 지지체는 네거티브 스테인 투과 전자현미경 준비를 위한 그리드이다.
본 발명의 장치의 대안적인 실시예에서, 제 1 액체는 스테인이다.
또 다른 실시예에서, 장치는 제 1 저장소 상류에 추가 저장소를 갖는다.
본 발명의 장치의 다른 실시예에서, 배출 유닛은 제 2 흡수 부재 아래에 제 2 용해성 부재를 갖고, 제 2 용해성 부재 아래에 제 3 흡수 부재를 갖는다.
대안적인 실시예에서, 배출 유닛은 내부에 정의된 통기 개구를 갖는다.
또 다른 실시예에서, 배출 유닛은 제 2 용해성 부재 및 제 1 용해성 부재 아래에 배치된 제 3 흡수 부재를 갖는다.
본 발명의 방법은 미세유체 장치에서 샘플을 준비하기 위한 것이다. 내부에 배치된 제 1 흡수 부재를 갖는 배출 유닛과 유체 연통하고 그에 인접하여 제 2 저장소와 유체 연통하는 제 1 저장소를 갖는 미세유체 장치가 제공 된다. 제 1 저장소는 제 1 저장소와 제 2 저장소를 연결하는 모세관 스톱 밸브에 의해 제 1 저장소에 유지되는 제 1 액체를 포함한다. 제 2 저장소에는 샘플 지지체가 배치된다. 물질을 포함하는 제 2 액체가 제 2 저장소에 추가된다. 제 2 액체는 제 1 액체 및 제 1 흡수 부재와 접촉한다. 제 1 흡수 부재는 제 2 액체 및 제 1 액체를 흡수한다. 상기 물질은 샘플 지지체에 달라붙는다.
대안적인 방법에서, 배출 유닛에는 제 1 흡수 부재의 상류에 용해성 멤브레인이 제공된다. 제 2 액체 또는 제 1 액체는 제 1 흡수 부재가 제 1 및 제 2 액체를 흡수하기 전에 용해성 멤브레인을 용해시킨다.
또 다른 방법에서, 제 2 액체 또는 제 1 액체가 용해성 멤브레인을 용해하는 동안 물질이 샘플 지지체에 부착된다.
또 다른 방법에서, 모세관 스톱 밸브는 제 1 저장소에 제 1 액체를 보유하고 제 2 액체를 제 2 저장소에 추가하기 전에 제 1 액체가 제 2 저장소로 흐르는 것을 방지한다.
다른 방법에서, 물질을 함유하는 제 1 액체의 일부가 샘플 지지체에 부착된다.
또 다른 방법에서, 모세관 스톱 밸브에는 제 1 저장소를 제 2 저장소로부터 분리하는 에지 및 제 1 저장소에 제 1 액체를 보유하는 에지가 제공된다.
다른 방법에서, 용해성 멤브레인은 제 1 흡수 부재의 하류에 제공되고, 용해성 멤브레인의 하류에 제 2 흡수 부재가 제공되며, 제 1 흡수 부재는 제 2 액체를 흡수하고 제 2 액체가 용해성 부재와 접촉하게 한다.
또 다른 방법에서, 제 2 흡수 부재는 용해성 멤브레인이 용해된 후 제 2 제 1 액체 및 제 1 제 2 액체를 흡수한다.
다른 방법에서, 제 2 액체는 모세관 스톱 밸브에 유지된 제 1 액체와 접촉시 제 1 액체의 표면 장력을 파괴한다.
또 다른 방법에서, 물질이 샘플 지지체에 부착되는 허용 시간을 제어하는 용해성 멤브레인을 용해시키는 데 필요한 시간이 필요하다.
다른 방법에서, 제 2 액체는 제 1 액체 전에 흡수 부재와 접촉한다.
또 다른 방법에서, 제 1 액체의 제 1 부분은 샘플 지지체 상에서 건조된다.
대안적인 방법에서, 제 1 액체의 일부는 샘플 지지체 상에 액막을 형성하고, 여기서 액막은 1 mm 미만 10 nm 초과의 멤브레인 두께를 갖는다.
또 다른 방법에서, 샘플 지지체는 주변 온도 및 50% 상대 습도에서 3분 이내에 건조된다.
다른 방법에서, 제 1 액체는 0.1-50 ㎕의 부피를 갖는다.
또 다른 방법에서, 제 2 액체는 0.1-50 ㎕의 부피를 갖는다.
본 발명의 대안적인 방법에서, 상기 방법은 미세유체 장치에서 샘플을 준비하는 것이다. 내부에 배치된 제 1 흡수 부재를 갖는 배출 유닛과 유체 연통하고 그에 인접하여 제 2 저장소와 유체 연통하는 제 1 저장소를 갖는 미세유체 장치가 제공된다. 제 1 저장소는 제 1 액체를 포함한다. 제 1 액체는 제 1 저장소와 제 2 저장소를 연결 하는 모세관 스톱 밸브에 의해 제 1 저장소에 유지된다. 샘플 지지체를 제 2 저장소에 추가하는 미세유체 장치 사용자. 사용자가 물질을 포함하는 제 2 액체를 제 2 저장소에 추가한다. 사용자는 제 2 저장소에서 샘플 지지체를 제거하기 전에 최소 20초의 대기 시간을 기다린다. 대기 기간 동안, 제 2 액체는 제 1 액체 및 제 1 흡수 부재와 접촉한다. 대기 기간 동안, 제 1 흡수 부재는 제 2 액체 및 제 1 액체를 흡수한다. 대기 기간 동안 샘플에 달라붙는 물질이 지원된다. 대기 기간이 끝나면 사용자가 제 2 저장소에서 샘플 지지체를 제거한다.
다른 방법에서, 배출 유닛에는 제 1 흡수 부재의 상류에 용해성 멤브레인이 제공되고 대기 기간 동안 용해성 부재를 용해하는 제 2 액체가 제공된다.
또 다른 방법에서, 제 1 액체는 샘플 지지체 상에 필름을 형성하고 샘플 지지체에 부착된 물질을 함유한다.
또 다른 방법은 샘플 지지체에서 필름을 건조하는 것이다.
본 발명은 이제 첨부된 도면을 참조하여 예로서 설명된다:
도 1A는 샘플 추가를 보여주는 본 발명의 장치의 측단면도;
도 1B는 시간 제어된 샘플 흡수를 보여주는 본 발명의 장치의 측단면도;
도 1C는 과도한 샘플 및 스테인의 자동 배출을 보여주는 본 발명의 장치의 측단면도;
도 1D는 그리드 제거 전의 필름 건조를 보여주는 본 발명의 장치의 측단면도;
도 2A는 도 1A에 도시된 장치의 평면도;
도 2B는 도 1B에 도시된 장치의 평면도;
도 2C는 도 1C에 도시된 장치의 평면도;
도 2D는 도 1D에 도시된 장치의 평면도;
도 3은 본 발명의 장치의 개략적인 단면도;
도 4는 도 3에 도시된 장치의 개략적인 평면도;
도 5는 본 발명의 장치의 평면도;
도 6은 본 발명의 5개의 상이한 장치에 대한 미세유체 타이밍 결과를 보여주는 개략도;
도 7은 본 발명의 성분의 평균 용해 시간을 나타내는 측정을 도시하는 개략도;
도 8은 5개의 격자, 격자당 5개의 격자 사각형 및 격자 사각형당 9개의 이미지가 본 발명의 225개의 이미지를 생성하는 개략도;
도 9A는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 TEM 그리드의 확대도;
도 9B는 도 9A에 표시된 영역과 동일한 크기의 샘플 영역의 확대도;
도 9C는 도 9B에 표시된 영역과 동일한 크기의 샘플 영역의 확대도;
도 10A는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 제 1 그리드로부터의 이미지의 예시;
도 10B는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 제 2 그리드로부터의 이미지의 예시;
도 10C는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 제 3 그리드로부터의 이미지의 예시;
도 10D는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 제 4 그리드로부터의 이미지의 예시;
도 10E는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 제 5 그리드로부터의 이미지의 예시;
도 11은 본 발명의 각 그리드 상의 입자의 평균 직경 및 입자 수의 개략도;
도 12는 그리드당 5개의 이미지 및 참 및 거짓 포지티브의 비율을 사용한 수동 서브세트 테스트의 결과를 나타내는 표;
도 13은 본 발명의 장치의 개략적인 단면도;
도 14는 도 13에 도시된 장치의 평면도;
도 15는 본 발명의 장치의 제 1 대안 실시예의 측단면도;
도 16은 본 발명의 장치의 제 2 대안 실시예의 측단면도;
도 17A는 프로테아좀의 제 1 배율 이미지(길이 200nm);
도 17B는 도 17A에 나타낸 프로테아좀의 제 2 배율 이미지(길이 100nm);
도 17C는 단백질(WPI) 피브릴의 1차 배율 이미지(길이 1㎛);
도 17D는 제 2 배율에서 WPI 피브릴의 이미지(길이 200 nm);
도 18은 본 발명의 장치의 제 4 대안 실시예의 개략 단면도;
도 19는 본 발명의 장치의 제 5 대안 실시예의 개략 단면도; 및
도 20은 본 발명의 장치의 제 6 대안 실시예의 단면도.
도 1B는 시간 제어된 샘플 흡수를 보여주는 본 발명의 장치의 측단면도;
도 1C는 과도한 샘플 및 스테인의 자동 배출을 보여주는 본 발명의 장치의 측단면도;
도 1D는 그리드 제거 전의 필름 건조를 보여주는 본 발명의 장치의 측단면도;
도 2A는 도 1A에 도시된 장치의 평면도;
도 2B는 도 1B에 도시된 장치의 평면도;
도 2C는 도 1C에 도시된 장치의 평면도;
도 2D는 도 1D에 도시된 장치의 평면도;
도 3은 본 발명의 장치의 개략적인 단면도;
도 4는 도 3에 도시된 장치의 개략적인 평면도;
도 5는 본 발명의 장치의 평면도;
도 6은 본 발명의 5개의 상이한 장치에 대한 미세유체 타이밍 결과를 보여주는 개략도;
도 7은 본 발명의 성분의 평균 용해 시간을 나타내는 측정을 도시하는 개략도;
도 8은 5개의 격자, 격자당 5개의 격자 사각형 및 격자 사각형당 9개의 이미지가 본 발명의 225개의 이미지를 생성하는 개략도;
도 9A는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 TEM 그리드의 확대도;
도 9B는 도 9A에 표시된 영역과 동일한 크기의 샘플 영역의 확대도;
도 9C는 도 9B에 표시된 영역과 동일한 크기의 샘플 영역의 확대도;
도 10A는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 제 1 그리드로부터의 이미지의 예시;
도 10B는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 제 2 그리드로부터의 이미지의 예시;
도 10C는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 제 3 그리드로부터의 이미지의 예시;
도 10D는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 제 4 그리드로부터의 이미지의 예시;
도 10E는 본 발명의 장치를 사용하여 준비된 제 5 그리드로부터의 이미지의 예시;
도 11은 본 발명의 각 그리드 상의 입자의 평균 직경 및 입자 수의 개략도;
도 12는 그리드당 5개의 이미지 및 참 및 거짓 포지티브의 비율을 사용한 수동 서브세트 테스트의 결과를 나타내는 표;
도 13은 본 발명의 장치의 개략적인 단면도;
도 14는 도 13에 도시된 장치의 평면도;
도 15는 본 발명의 장치의 제 1 대안 실시예의 측단면도;
도 16은 본 발명의 장치의 제 2 대안 실시예의 측단면도;
도 17A는 프로테아좀의 제 1 배율 이미지(길이 200nm);
도 17B는 도 17A에 나타낸 프로테아좀의 제 2 배율 이미지(길이 100nm);
도 17C는 단백질(WPI) 피브릴의 1차 배율 이미지(길이 1㎛);
도 17D는 제 2 배율에서 WPI 피브릴의 이미지(길이 200 nm);
도 18은 본 발명의 장치의 제 4 대안 실시예의 개략 단면도;
도 19는 본 발명의 장치의 제 5 대안 실시예의 개략 단면도; 및
도 20은 본 발명의 장치의 제 6 대안 실시예의 단면도.
본 발명의 모세관 구동 미세유체 장치는 종래의 수동 절차와 동일한 작은 액체 부피를 필요로 하고 최소한의 사용자 상호작용을 필요로 하는 샘플 준비를 위해 여기에 제시된다. 보다 구체적으로, 샘플 지지체는 바람직하게는 TEM 그리드와 같은 그리드이다. 사용자는 자율 샘플 준비 공정을 시작하고 약 1분 동안 기다린 다음 TEM 또는 SEM 현미경에서 이미징할 준비가 된 TEM 그리드를 추출하기만 하면 된다. 본 발명의 자동 공정은 일반적으로 샘플 흡수 및 과도한 액체의 배출을 위한 시간을 자동으로 제어하는 수성 샘플 액체용 PVA(폴리비닐 알코올) 필름과 같은 샘플 액체에 의해 용해되는 필름을 필요로 한다. 5개의 미세 유체 장치에 대한 미세 유체 일관성은 미세 유체 TEM 그리드 준비 이벤트의 타이밍과 기간을 비교하여 아래에 설명된다. 또한 수용성 필름의 3가지 두께(12μm, 24μm, 36μm)를 사용하는 15개의 장치에 대해 시간 지연의 조정 가능성을 설명한다. 샘플 준비 일관성은 AAV(Adeno-associated virus) 입자를 샘플로, Methylamine Vanadate를 스테인으로 사용하여 5개의 자율적으로 준비된 TEM 그리드를 이미징하여 검사한다.
평균 입자 크기와 같은 형태학적 정보를 추출하는 입자 감지 스크립트를 그리드당 45개의 현미경 이미지에서 실행하여 이미지가 자동 이미지 분석에 적합한지 여부를 조사했다. 본 발명의 장치는 또한 TEM 조사를 위한 단백질 샘플 및 섬유를 준비하는 데 사용될 수 있으며 다른 스테인이 사용될 수 있다.
본 발명의 장치는 수동 절차의 샘플 준비 단계를 채택하고 사용자 상호 작용을 자동화된 모세관 구동 미세 유체 이벤트로 대체한다. 장치는 바람직하지만 반드시 그럴 필요는 없으며 일회용으로 설계 되고 특별한 기구가 필요하지 않다.
도 1A-1D는 본 발명의 장치에서 자율 TEM 그리드 준비 이벤트의 개념적 순서를 도시한다. 도 1A는 샘플을 추가하는 단계가 자율 준비 공정을 트리거하는 방법을 도시한다.
더 구체적으로, 장치(200)는 샘플 저장소 또는 그리드 챔버(204)에 인접한 스테인 저장소(202)를 가지고 있다. 샘플 저장소는 배출 또는 블로팅 유닛(206)에 인접한다. 스테인 저장소(202)는 스테인 액체(208)를 보유하거나 포함한다. 액체(208)는 사용 전에 미리 적재된다. 샘플 저장소(204)는 분석될 물체, 분자 또는 입자와 같은 물질(214)을 포함하는 샘플 액체(210)를 수용한다. 입자는 바이러스 또는 바이러스 유사 입자 또는 기타 유형의 섬유질 또는 미립자 생물학적 또는 무기 물체일 수 있다.
샘플 액체(210)가 샘플 저장소(204)에 적용될 때, 액체(210)는 TEM 그리드와 같은 샘플 지지체(216)를 덮고 샘플 지지체 또는 그리드(216)의 상류에 사전 로드된 스테인(208)과 그리드(216)의 하류에 위치한 배출 또는 블로팅 유닛(206)의 압지 또는 필터(218)에 연결된다. 샘플 액체(210)와 배출 유닛(206)의 흡수 유닛 사이의 접촉은 시간 제어 샘플 흡수 단계를 시작한다(도 1B에 도시된 바와 같음). 샘플 액체(210)가 샘플 저장고(204)에 침전되거나 추가될 때, 샘플 액체(210)는 배출 유닛(206)의 제 1 흡수 유닛(218)(예를 들어, 제 1 블로팅/여과지)과 접촉하게 된다. 배출 유닛(206)은 제 1 흡수 유닛(218) 아래에 위치한 용해성 밸브 또는 멤브레인(220)을 갖는다. 액체(210)는 TEM 그리드(216)를 덮는 한편, 제 1 압지(218)를 제 2 압지/여과지(222)와 같은 제 2 흡수 유닛으로부터 분리하는 용해성 밸브(220)가 폐쇄된다. 밸브(220)는 제 1 흡수 부재(218)에 의해 흡수된 액체에 의해 용해될 때까지 폐쇄된다. 분해 가능한 밸브 또는 멤브레인(220)을 용해시키는 데 걸리는 시간은이 시간 동안 입자(214)가 샘플 액체(210)는 그리드(216)에 부착되거나 흡수될 수 있다.
일단 밸브(220)가 용해되면, 샘플 액체(210)와 스테인 액체(208) 모두의 초과량은 도 1C에 도시된 바와 같이 2개의 흡수 유닛, 블로팅/여과지(218 및 222)에 의해 자율적으로 배출되거나 제거된다. 입자(214)는 그리드(216)에 부착되거나 그리드(216)에 의해 흡수된다. 남아있는 얇은 스테인 필름(224)은 그리드(216) 상의 입자(214)를 커버하거나 함유하고 필름(224)이 샘플 입자(214)를 함유하는 동안 건조된다(도 1D에 도시됨). 그리드(216)는 이미징을 위해 준비되고 플랩(226)을 벗겨내고 예를 들어 한 쌍의 핀셋으로 그리드(216)를 추출함으로써 쉽게 회수될 수 있다.
도 2A-2D는 대응하는 프레임을 보여주는 장치의 평면도이다.
장치(200)의 주요 구성요소는 도 3에 도시된 단면도와 도 4에 도시된 평면도에 도시된다. 도 5는 본 발명의 제조된 장치의 평면도를 도시한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 미세유체 장치(200)는 액체(스테인) 저장소(202), 제 2 액체(샘플) 저장소 또는 그리드 챔버(204) 및 배출 유닛(206)으로 구성된다. 스테인 저장소(202)의 핵심 기능은 사용자가 하기에 설명된 바와 같이 결국 스테인 액체(208)와 접촉하게 되는 입자(214)(도 1A-1D에 가장 잘 도시됨)를 포함하는 샘플 액체(210)를 추가할 때까지 스테인 액체(208)를 포함하는 것이다.
핵심 가능 기능은 그리드 챔버(204)에서 스테인 저장소(202)를 분리하는 도 3에 표시된 피닝 에지(pinning edge)(228)와 같은 모세관 스톱 밸브 또는 액체 피닝 메커니즘이다. 모세관 스톱 밸브 또는 메커니즘은, 액체가 소수성 영역 및/또는 기하학적 구조를 벗어나는 것을 방지하는 소수성 표면 영역 및/또는 기하학적 구조일 수 있다. 바람직하게는, 기하학적 스톱 밸브는 채널 또는 채널의 일부의 유동 방향으로 채널 단면(예를 들어, 에지)의 갑작스러운 분기점이다.
바람직한 실시예에서, 모세관 스톱-밸브는 채널의 에지에 위치하고 제 2 저장소가 시작되는 곳에서 끝난다. 제 1 액체가 제 2 저장소로 흐르는 것을 막는 에지가 제 2 저장소에 있는 한 채널을 가질 필요는 없다. 에지가 제 2 저장소에서 떨어져 있는 경우 제 1 액체와 제 2 액체 사이에 기포가 형성되어 두 액체 사이의 접촉이 설정될 수 없는 위험이 있다. 두 액체가 연결될 수 있고 제 1 액체의 표면 장력이 깨질 수 있도록 제 1 액체가 제 2 액체에 쉽게 접근할 수 있는 것이 매우 중요하다.
제 2 저장소와 (유체 연통으로) 연결된 하나의 저장소에 액체를 가두는 것이다. 스테인 액체(208)는 피닝 에지(228)에 고정되거나 이에 의해 유지되고 스테인 액체(208)와 밑면(230) 사이의 표면 장력으로 인해 제 1 라미네이트 부분(232)의 친수성 밑면(230)에 유지된다. 바람직하게는, 피닝 메커니즘(228)은 특히 90도 에지와 같은 날카로운 에지이며, 라미네이트(253)를 향해 및그리드(216)를 제자리에 유지하는 접착 테이프(254) 아래로 연장되는 라미네이트(252)의 수평 바닥 표면(231)과 수직 측벽(233) 사이에 형성된 에지, 특히 90도 에지와 같은 예리한 에지이다. 피닝 에지(228)와 밑면(230) 사이에서 연장되는 표면(234)에서의 표면 장력은 스테인 액체(208)를 스테인 저장소(202)의 제자리에 유지하여 표면(234) 및 제 1 라미네이트 부분(232)이 피닝 에지(228) 위로 연장되도록 한다. 표면 필름의 명백한 존재와 표면의 모세관 현상으로 이어지는 표면 근처의 분자간 힘에 의해 발생한다. 액체의 표면은 수축하는 경향이 있으며 늘어난 탄성 멤브레인과 유사한 특성을 가지고 있다. 피닝 에지(228), 친수성 밑면(230) 및 표면(234)의 표면 장력의 조합은 따라서 샘플 액체(210)의 추가에 의해 자동 샘플 준비 공정이 개시될 수 있게 한다.
그리드 챔버(204)는 플랩 라미네이트(240)의 전방 에지(238)와 라미네이트 부분(232)의 후방 에지(242) 사이에 한정된 샘플 입구 개구(236)를 갖는다. 바람직하게는, 제 1 및 제 2 라미네이트 부분(232, 246) 및 플랩 라미네이트(240)는 장치(200)의 제조를 용이하게 하기 위해 동일한 라미네이트의 일부이다.
그리드 챔버(204)는 TEM 그리드와 같은 그리드(216)를 포함하고 그리드(216) 상류의 스테인 저장소(202)에 연결되어 유체 연통한다. 그리드 챔버(204)는 또한 그리드 하류의 배출 유닛(206)에 연결되어 유체 연통한다. 바람직하게는, 모세관력은 액체를 배출 유닛(206)을 향해 측면으로 이동시킨다. 특히, 그리드 챔버(204)는 라미네이트(232)와 스테인 저장소(202)의 하부 라미네이트(252) 사이에 형성된 채널(250)을 통해 스테인 저장소(202)와 유체 연통한다.
그리드(216)가 라미네이트(254)에 제거 가능하게 유지되도록 상기 그리드(216)는 후면 그리드 둘레에서 점착성이 낮은 접착 라미네이트(254)에 의해 고정된다. 공동(256)은 그리드(216) 아래에 형성되어 액체가 그리드(216)의 후면 또는 밑면에 도달하지 않도록 하며, 그렇지 않으면 TEM 이미징 아티팩트를 유발할 수 있다.
그리드 챔버(204)의 상부 또는 개구는 샘플 입구(236)의 역할을 하고 과도한 액체를 배출(블롯팅)한 후 얇은 스테인 필름의 빠른 건조를 보장한다. 개구(236)는 제 1 라미네이트 부분(232)과 그 후방 에지(242)가 그리드(216) 위로 연장되기 때문에 TEM 그리드(216)의 길이보다 약간 작다. 유사하게, 플랩 부분(240)과 그 전방 에지(238)는 그리드(216) 위로 연장된다. 이것은 상부 친수성 층 또는 라미네이트 부분(232, 240)과 그리드(216) 사이의 오버랩을 남긴다. 상기 오버랩은 샘플 액체(210)가 사전 로드된 스테인 액체(208) 및 배출 유닛(206)과 확실하게 연결되도록 보장한다.
배출 유닛(206)은 바람직하게는 2개의 흡수 유닛 또는 여과지 유닛(218 및 222) 페이퍼 유닛의 스택 및 2개의 흡수 유닛 또는 부재(218, 222)를 서로 분리하는 PVA 필름(220)과 같은 수용성 밸브/멤브레인으로 형성된다. 제 1 및 제 2 흡수 부재는 페이퍼, 즉 셀룰로오스뿐만 아니라 면 섬유, 니트로셀룰로오스 및 유리 섬유와 같은 액체의 양호한 흡수를 제공하는 임의의 적합한 다공성 매트릭스일 수 있다. 제 1 또는 상부 흡수 부재(218)의 하나의 기능은 배출 유닛과 제 2 저장소 내의 제 2 액체 사이의 양호한 접촉을 보장하는 것이다. 제 2 흡수 부재(222)의 한 기능은 용해성 멤브레인(220)이 용해되었을 때 제 1 및 제 2 저장소로부터 제 2 흡수 부재로의 액체의 적절한 흐름을 보장하는 것이다. 바람직하게는, 2개의 액체는 샘플 액체(210)가 먼저 샘플 지지체 위로 흐르고 제 1 흡수 부재(218)와 접촉한 다음 스테인 액체(208)와 접촉하도록 샘플 지지체 또는 TEM 그리드(216) 위로 순서대로 흐르므로 스테인 액체(208)는 샘플 지지체에 남아 샘플 액체(210)의 물질 또는 물체를 함유한다. 상기 원리는 장치가 하나의 흡수 부재만 갖거나 흡수 부재가 PVA 필름과 같은 용해성 멤브레인. PVA는 생물학적 표본이 전형적으로 수용액에서 제조되기 때문에 본 발명의 범위에 특히 적합하다. 상부 페이퍼 유닛(218)은 그리드 챔버(204)와 PVA 층(220) 사이의 안정적인 연결을 제공한다. 페이퍼 유닛(218)은 샘플 저장소 또는 그리드 챔버(204)와 유체 연통한다. 배출 과정을 막을 수 있는 공기가 갇히지 않도록 한다. 벤트는 기밀 멤브레인을 사용할 때 중요한 특징이다.
본 발명의 중요한 양태는 PVA 층(220)의 용해 시간이 TEM 그리드(216) 상에 증착된 샘플 액체(210)의 흡수 시간을 제어한다는 것이다. 배출 또는 블로팅 단계는 PVA 층(220)이 용해될 때 트리거된다. 샘플의 액체(210)에 의해 액체는 제 2 흡수(페이퍼) 유닛(222)에 도달한다. 제 2 흡수(페이퍼) 유닛(222)의 높은 모세관(배출) 힘은 샘플에 포함된 액체 부피(210 및 208)의 빠른 흡수를 유도한다. 샘플 준비가 완료된 후, 플랩 부분(240)은 그리드(216)를 수집하기 위해 벗겨질 수 있다. 그리드 수집 외에, 플랩 부분(240)은 사용자가 준비 절차 전에 선택의 그리드를 도입하도록 허용할 수 있다.
도 5는 본 발명의 장치(200)의 제조된 버전의 평면도이다.
도 6은 본 발명의 5개의 다른 장치(장치 번호 1-5)의 테스트 결과를 나타내는 개략도(400)이다. 상기 도면은 입자를 포함하는 샘플 액체의 추가와 관련하여 서로 다른 시간에 스테인의 사전 로드를 도시한다. 특히, 5개의 서로 다른 장치에 대한 미세유체 타이밍 결과와 사전 로드된 스테인에 대한 시간, 즉 스테인과 샘플 추가 사이의 시간, 흡수 시간, 배출/블로팅 시간 및 각 장치의 건조 시간을 도시한다. 자율 TEM 그리드 준비는 위에서 자세히 설명한 대로 샘플 추가와 함께 시간 0에서 시작하고 샘플 추가에 의해 트리거된다. 스테인은 장치 번호 1에서 샘플(샘플 액체(210)과 같은)을 추가하기 약 40초 전에 추가된다(예: 샘플 액체 210). 상기 스테인은 장치 2번에 샘플을 추가하기 약 20초전, 장치 3번에서 약 60초전, 장치 4번에서 약 40초전 및 장치 5번에서 샘플 액체를 추가하기 약 50초전에 추가된다. 샘플 액체를 추가할 때까지 스테인을 사전 적재하는 기간(402, 404, 406, 408, 410)은 20초에서 60초 사이로 다양하지만, 흡수, 배출 및 건조 단계를 완료하는 기간(412)은 약 5개 장치 모두 동일한다. 사전 로드 단계 이후의 단계는 모두 총 20초보다 약간 더 길다. 따라서 흡수 시간은 1차 흡수 매체(예: 페이퍼)에 흡수된 샘플 액체가 용해성 멤브레인(PVA 필름)을 용해하는 데 걸리는 시간과 동일하다. 이는 샘플 액체를 추가하는 사용자가 더 쉽게 공정을 수행할 수 있도록 스테인이 추가되거나 사전 로드된 시간과 관련하여 샘플 액체가 추가될 때 시간이 중요하지 않음을 의미한다.
도 7은 두께가 각각 12㎛, 24㎛ 및 36㎛인 3개의 상이한 용해성 멤브레인(220A, 220B, 220C)을 용해시키는 데 필요한 시간을 나타내는 개략도(420)이다. 멤브레인(220A)은 용해하는 데 약 15초가 필요하고, 멤브레인(220B)은 약 90초가 걸리며, 멤브레인(220C)은 용해하는 데 180초 이상이 필요하다.
도 8은 총 225개의 이미지(446)를 생성하는 그리드당 5개의 그리드 정사각형(442) 및 그리드 정사각형(442)당 9개의 이미지(444)를 갖는 5개의 그리드(432, 434, 436, 438 및 440)를 갖는 이미징 체계를 보여주는 개략도(430)이다.
도 9A는 본 발명의 장치에 의해 준비된 TEM 그리드의 제 1 부분(602)을 포함 하는 예시적인 확대도(600)이다. 도 9B는 도 9A에 도시된 뷰(600)의 부분(602) 마크와 동일한 크기의 제 2 부분(606)을 포함하는, 도 9A의 뷰(600)에 비해 더 높은 배율의 뷰(604)이다. 동일한 방식으로, 도 9C는 도 9B에 도시된 뷰(604)의 부분(606)과 동일한 크기의, 도 9B의 뷰(604)에 비해 더 높은 배율의 뷰(608)이다.
도 10A는 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 준비된 제 1 그리드(432, 612)로부터의 이미지(610)의 예이다. 이미지(610)는 바이러스 입자와 같은 입자(614)를 포함하거나 묘사한다. 도 10A와 유사하게, 도 10B는 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 준비된 제 2 그리드(434, 618)로부터의 이미지(616)의 예이다. 이미지(616)는 바이러스 입자와 같은 입자(620)를 포함한다. 도 10C는 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 준비된 제 3 그리드(436, 624)로부터의 이미지(622)의 예이다. 이미지(622)는 바이러스 입자와 같은 입자(626)를 포함한다. 도 10D는 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 준비된 제 4 그리드(438, 630)로부터의 이미지(628)의 예이다. 이미지(628)는 입자 (632)를 포함하거나 묘사한다. 도 10e는 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 준비된 제 5 그리드(440, 636)로부터의 이미지(634)의 예이다. 이미지(634)는 바이러스 입자 또는 임의의 다른 적합한 입자와 같은 입자(638)를 포함하거나 묘사한다.
도 11은 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 제조된 각 그리드 상의 입자의 평균 직경 및 입자 수의 그래프(640)이다.
도 12는 그리드당 5개의 이미지와 참 및 거짓 포지티브의 비율을 사용한 수동 서브세트 테스트의 결과를 나타내는 표(642)이다.
도 13은 본 발명의 미세유동장치(100)의 단면도이다. 장치(100)는 라미네이트로 제조되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 장치(100)는 장치(200)와 실질적으로 유사하고 장치(100)에 적용되는 모든 것은 장치(200)에도 적용되며 그 반대도 마찬가지이다. 장치(100)는 유체 연통하는 액체 저장소, 흡수 유닛 및 지연 밸브로 시간 제어 액체 배출로 작용하는 용해성 필름을 갖는 미세유체 플랫폼을 갖는다. 여기에서 TEM 그리드로 예시된 샘플 지지체(116)는 샘플 저장소(104)의 바닥에 위치 한다. 스테인 저장소(102)는 장치의 후방 섹션(141)의 전방 단부와 장치의 중간 섹션(132)의 후방 단부 사이에 정의된 입구 개구(143)를 가진다. 바람직하게는, 장치가 라미네이트 기술을 사용하여 구성되는 경우, 섹션(140, 132 및 141)은 동일한 라미네이트의 일부이므로 장치(100)를 더 쉽게 제조할 수 있다.
샘플 저장소(104)는 라미네이트 또는 섹션(132)과 라미네이트 또는 섹션(140) 사이에 정의된 입구 개구(145)를 갖는다. 샘플 저장소(104)는 샘플 저장소 (104)와 상류 스테인 저장소(102) 사이에 연장되는 미세유체 채널(150)을 통해 스테인 저장소(102)에 연결되고 유체 소통하는 상류(한 쪽에서)이다. 채널(150)은 채널(150) 단부의 일부에서만 피닝 에지 또는 불연속부를 가질 수 있어서, 예를 들어 측벽이 어떠한 에지도 가지지 않는다는 것을 이해해야 한다. 채널의 단부에 두 개의 반대쪽 에지가 있도록 내부 표면의 상부 측면에 채널의 에지가 있을 수도 있다.
바람직하게는, 채널(150)은 제 1 라미네이트 부분 또는 섹션(132)의 친수성 밑면(130)과 스테인 저장소 (102)의 바닥 표면(131) 사이에 한정된다. 바닥 표면(131)은 피닝 에지(128)까지 연장된다. 액체(108)와 밑면(130) 사이의 모세관력과 표면(134)의 표면 장력은 액체(108)를 스테인 저장소(102)에 유지하고 액체(108)가 샘플 저장소(104)로 흐르는 것을 방지한다. 즉, 피닝 에지(128)는 스테인 저장소(102)에 추가된 스테인 액체와 같은 액체(108)가 샘플 저장소(104)로 흐르지 않도록 한다.
샘플 저장소(104)는 용해성 필름, 멤브레인 또는 밸브(162)에 의해 제 제 2 필터 또는 흡수 매체(160)로부터 분리되는 제 1 필터 또는 흡수 매체(158)에 연결되고 유체 연통하는 하류(스테인 저장소(102)에 대한 상류 연결부에 대해 반대측에 있음)에 있다. 제 1 필터(158)는 또한 벤트(164)에 연결된다. 벤트(164)는 액체(108, 110)가 제 1 및 제 2 필터(158, 160)로 흡수되는 것을 방해할 잠재적으로 갇힌 공기 및 가스를 위한 비상구 역할을 한다.
도 14를 참조하면, 제거 가능한 플랩(126)은 그리드 준비 완료 시 샘플 저장소(102)로부터 샘플 그리드(116)를 제거하기 전에 장치(100)로부터 제거된다.
도 15는 도 13에 도시된 장치(100)와 실질적으로 유사하지만 추가 저장소(302) 및 추가 용해성 필름 또는 멤브레인 또는 밸브(320) 및 추가 흡수 유닛(322)을 포함하는 장치(300)를 도시한다. 오직 장치(100) 및 장치(300) 간의 주요 차이점만이 여기서 설명된다. 장치(300)는 추가적인 액체가 순차적이고 시간 제어된 방식으로 그리드(116) 위로 플러싱될 때 사용된다. 추가 액체 저장소(302)는 스테인 또는 제 2 저장소(102)의 상류에 배치되고 저장소(302)의 바닥 표면(306)과 라미네이트 부분 또는 섹션의 친수성 밑면(308) 사이에 정의된 채널(304)을 통해 스테인과 유체 연통하고 연결된다. 저장소(302, 102) 사이에는 상류 저장소(302)의 액체(314)가 스테인 저장소(102, 303)로 흐르는 것을 방지하는 제 2 피닝 에지(312)가 있다. 액체(314)는 저장소(102) 내의 액체(108)와 동일한 방식으로 즉 친수성 밑면(308)에 대한 모세관력 및 표면(316) 내의 표면 장력에 의해 저장소(302)에서 제자리에 유지된다.
저장소의 순서는 액체가 그리드(116) 위로 흐르는 순서에 해당한다. 즉, 액체가 샘플, 세척, 스테인인 경우 스테인 액체는 상류 저장소(302)에 추가되어야 한다. 세척액은 추가시 상류 저장소(302)에 연결되는 중간 또는 제 2 저장소(102)에 추가되어야 한다. 샘플 액체는 그리드(116) 상단의 제 1 저장소(104)에 추가되어야 하며, 추가 시 세척액(305)의 상류 액체 트레인에 연결되고 스테인(314) 및 다하류는 배출 유닛(318)에 연결된다.
배출 유닛(318)은 흡수 부재(여과지)(158, 160) 및 용해성 필름(162)을 가지며 샘플 저장소(104)의 하류에 위치한다. 배출 유닛(318)은 추가적인 용해성 필름(320) 및 다른 필터 또는 흡수 부재(322)를 가지며 추가 액체의 타이밍을 제어할 수 있다. 제 1 용해성 필름(158)의 두께는 샘플 저장소(104)에 추가된 제 1 액체(110)가 그리드(116)의 상부에 얼마나 오래 앉착되거나 머무르는지, 즉 샘플 액체(110) 및 입자(114)가 그리드(116)에 부착하도록 허용되는 기간을 결정한다. 제 2 필터(160)는 샘플 액체(110)의 부피에 해당하는 양의 액체를 흡수하고 저장할 수 있을 만큼 충분히 커야 한다. 액체(110)가 제 2 용해성 필름 또는 멤브레인(320)에 도달하면 그리드(116) 위의 액체 흐름은 필름(320)은 용해었고, 3개의 액체를 갖는 상기 셋업의 마지막 필터(322)는 3개의 액체(110, 108/305 및 314) 모두의 부피를 모두 흡수함으로써 그리드(116) 위로 제 2 액체(108, 305) 및 제 3 액체(314)를 끌어당긴다.
도 16은 도 13 및 도 15에 도시된 장치의 변형을 포함하는 장치(380)를 도시하고 액체의 유속을 조정하기 위해 배출 유닛(384) 내의 여과지(382)의 형상이 어떻게 변경될 수 있는지를 예시한다. 장치(380)의 다른 모든 것은 장치(100 및 300)의 구성 요소와 동일하다. 좁고 얇은 여과지 또는 목(386)이 있는 여과지(382)는 그리드(116) 위의 흐름 속도를 늦추는 반면 넓고 두꺼운 필터는 흐름 속도를 증가시킨다.
도 18-19는 각각 배출 또는 블로팅 유닛(706, 806)이 배출 또는 블로팅 유닛(106)과 다르다는 점을 제외하고는 도 13에 도시된 장치(100)와 사실상 동일한 장치(700, 800)의 대안적인 실시예를 각각 도시한다. 바람직하게는 도 13에 도시된 바와 같이, 배출 유닛(706)은 단지 하나의 제 1 흡수 부재(758)를 갖지만 용해성 멤브레인 또는 제 2 흡수 부재는 갖지 않는다. 장치(700)의 작동은 제 1 및 제 2 저장소의 액체가 장치(100, 200)를 참조하여 상세히 설명된 바와 같이 샘플 액체의 입자가 그리드(116)에 부착할 충분한 시간이 있도록 적절한 기간 동안 흡수 부재(758)에 의해 흡수된다는 점에서 장치(100)의 작동과 실질적으로 유사하다.
유사하게, 장치(800)는 배출 유닛(806)이 용해성 멤브레인(862) 및 제 1 흡수 부재(858)를 갖는다는 점을 제외하고는 장치(100)와 실질적으로 유사하다. 배출 유닛(806)은 용해성 멤브레인(862)과 제 2 저장소(104) 사이에 흡수 부재를 갖지 않는다. 용해성 부재(862)는 용해성 멤브레인(862)을 용해하기 시작하기 위해 용해성 부재와 접촉하기 전에 흡수 부재를 통과해야 하는 제 2 액체 없이 제 2 액체와 직접 접촉하게 된다. 배출 유닛(706)의 차이점을 제외하고, 806은 배출 장치(106)와 비교하여 장치(700, 800)의 모든 다른 특징 및 방법 단계는 위에서 자세히 설명한 장치(100, 200)와 동일하다.
도 20은 제 1 흡수 부재(158) 대신 배출 또는 블로팅 유닛(906)에 모세관 채널(958)을 갖는 것을 제외하고는 도 13에 도시된 장치(100)와 실질적으로 유사한 장치(900)의 또 다른 실시예이다. 채널(958)은 장치(100 및 200)와 관련하여 상세히 설명된 바와 같이 액체(110)가 용해성 멤브레인(162)과 접촉하여 멤브레인을 용해시키도록 제 2 저장소(104)로부터 채널(958)로 제 2 액체(110)를 밀어낸다.
작동 시, 본 발명의 방법은 사전 장착된 그리드(216)를 갖는 그리드 챔버 또는 샘플 액체 저장소(204)에 연결되어 유체 연통하는 스테인 저장소(202)를 제공하는 단계를 포함한다. 사용자가 입자(214)를 포함하는 샘플 액체(210)를 샘플 액체 저장소(204)에 추가할 때까지 저장소(202)에 포함된 스테인 저장소(202)에 스테인 액체(208)가 추가된다.
상기 핵심 기능은 모세관 스톱 밸브 또는 피닝 메커니즘을 통해 활성화되며 여기서는 그리드 챔버(204)에서 스테인 저장소(202)를 분리하는 채널(250)의 끝에 위치한 에지(228)의 형태이다. 스테인 액체(208)는 피닝에서 피닝된다. 액체(208)가 밑면(230)에 부착되고 피닝 에지(228) 위로 연장되고 표면(234)에서의 표면 장력이 액체(208)가 그리드 챔버(204)로 흐르는 것을 방지하도록 모세관력으로 인한 에지(228) 스테인 액체(208)가 이러한 방식으로 스테인 저장소(202) 내부에 유지된다는 사실은 입자(214)를 포함하는 샘플 액체(210)를 스테인 저장소(202)에 추가함으로써 샘플 준비 공정이 시작될 수 있게 한다. 액체(210)는 액체(210)가 표면(234)과 접촉하여 액체(208)의 표면 장력을 깨뜨리는 양으로 추가된다. 피닝 에지(228)와 밑면(230) 사이. 표면(234)의 표면 장력이 파괴될 때, 2개의 액체(210, 208)는 계면에서 액체의 약간의 혼합만으로 연결된다. 입자(214)를 포함하는 샘플 액체(210)가 장치(200) 위에서 개구(236)를 통해 그리드 챔버(204)에 추가되면, 액체(210)도 샘플 저장소(204)의 하류에 있는 배출 유닛(206)으로 흘러들어가 연결된다. 샘플액(210)과 입자(214)가 추가되는 구멍(236)은 샘플액(210)이 스테인 액체(208)와 블로팅 유닛(206)에 확실하게 연결되도록 그리드(216)의 폭보다 약간 작다. 그리드(216) 아래에 위치한 공동(257)은 액체가 흐르지 않고 그리드(216)의 잘못된 면에 부착되어 준비 품질을 방해하지 않도록 한다.
배출 유닛(206)은 2개의 흡수 유닛(여과지와 같은)(218 및 222) 및 2개의 필터(218, 222) 사이에 위치한 가용성 PVA 필름(220)을 갖는다. 상부 필터(218)는 액체(210)를 흡수하여 액체가 필터(218)의 상부측으로부터 용해성 필름(220)과 접촉하는 필터(218)의 하부로 이동함으로써 샘플 액체(210)가 PVA 필름(220)에 확실하게 연결되도록 한다.
상부 필터 위의 벤트(264)는 잠재적으로 갇힌 공기를 위한 비상구 역할을 하며, 그렇지 않으면 샘플 액체(210)와 배출 유닛(206) 사이의 연결을 차단할 수 있다. 샘플 액체(210)는 상부 필터(218)를 통해 흐르고 PVA와 접촉할 때 흐른다. 필름 또는 층(220)은 액체가 필터(218) 아래에 위치한 필터(222)로 흐를 수 있도록 PVA 층(220)을 용해시킨다.
샘플 액체(210)가 PVA 층(220)을 용해하는 데 걸리는 시간은 샘플 액체(210) 내의 입자(214)가 그리드(216)에 부착되어 흡수되도록 허용되는 시간을 제어하기 때문에 중요하다. 일단 PVA 층(220)이 용해되면, 액체(210)는 장치(200)의 모든 액체(210, 208)를 흡수하는 하부 필터(222)로 흘러들어가 연결된다. 필터 또는 흡수 부재(222)는 먼저 샘플 액체(210)를 흡수한 다음 스테인 액체(208)를 흡수한다. 하부 필터(222) 따라서 수동 블로팅 단계에 해당한다. 샘플 액체(210) 및 입자(214)가 추가된 그리드(216) 위의 개구(236)는 이제 2개의 흡수 부재 또는 필터(218, 222)에 의한 배출/블로팅 후에 남아 있는 얇은 스테인 필름(224)의 빠른 건조를 보장한다. 마지막으로, 플랩(226)은 장치(200)에서 벗겨져 예를 들어 ns-TEM 장치에서의 후속 이미징을 위해 장치(200)로부터 쉽게 추출되는 그리드(216)에 대한 용이한 접근을 제공할 수 있다.
더 많은 액체를 순차적으로 추가해야 하는 경우, 예를들어 스테인(314)이 ㅅ샘플 액체(110)에 추가되기 전에 세척 단계에서 세척 액체(305)를 추가할 필요가 있는 경우, 도 15와 관련하여 도시되고 설명된 바와 같이, 채널(304)을 통해 중간 저장소(303)에 연결되어 유체 소통하고 피닝 에지(312)에 의해 분리되는 다른 액체 저장소(302)가 추가될 수 있다. 세척액(305)은 그 후 가장 상류측에 스테인액(314)이 추가된 후 중간 저장소(303)에 추가되어야 한다. 추가 액체(여기서는 세척액(305))의 인큐베이션 시간이 제어될 필요가 있는 경우, 용해성 필름(320) 및 여과지(322)의 추가 층이 배출 유닛(318)에 추가될 수 있다.
그리드(116) 위의 흐름 속도는 배출 장치에 있는 여과지의 모양과 두께에 의해 제어될 수 있다. 사용 가능한 흡수 매체(예: 필터/페이퍼)의 양이 적거나 필터의 모세관 현상(위킹 속도라고도 함)이 낮으면 흐름/배출가 느려지고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 예를 들어, 용해성 필름 뒤의 얇고 좁고 긴 필터는 액체 흐름과 배출 속도를 느리게 한다.
미리 혼합된 스테인 용액의 액적을 추가하는 대신, 스테인을 구성하는 염을 스테인 저장통(102)의 바닥에서 건조시킨 다음 물 또는 다른 용해제/완충제를 저장통(102)에 추가 하여 스테인 저장통을 준비할 수 있으며, 그리드. 스테인 염은 스테인 액체(208)를 생성하기 위해 용해제가 추가될 때 용해된다.
프렙 어셈블리 키트에 친수성 그리드를 추가하는 대신 샘플 액체를 추가하기 전에 Alcian-Blue와 같은 친수성 액체를 그리드 위로 흘릴 수 있다. 이러한 방식으로, 스테인 및 샘플 액체는 마이크로유체 채널(304 및 150)을 통해 연결되지만 피닝 에지(128 및 312)를 통해 분리된 그리드 챔버(102 및 302)(도 15에 가장 잘 도시됨)의 상류에 있는 두 개의 별도 저장소에 로드된다. 그리드 친수화 액체는 그 후 그리드 챔버(104)의 그리드(116)에 직접 추가되어 그리드(116) 위로 흐르는 일련의 액체를 시작한다. 즉, 그리드 준비 공정을 시작한다.
본 발명의 방법의 대안적인 용도는 그리드(116)의 상부에 매트릭스의 제어된 증착을 위해 사용하는 것이다. 단 하나의 액체, 즉 기판이 사용된다는 점을 제외하고는 전술한 것과 동일한 방법이 적용되며, 예를 들어, 거미줄과 같은 섬유는 그리드(116) 상에 추가된 샘플(기판)의 액적 상의 공기-액체 계면에서 중합되도록 허용될 수 있다. 가용성 층 (162)이 용해되면 거미줄이 EM 그리드 위로 부드럽게 떨어지고 여과지(160)가 장치에서 배출된다. 그리드 상단에 배치된 섬유 네트워크(이 경우 거미줄)는 매트릭스 역할을 하여 나중에 추가되는 단백질을 그리드에 임의의 방향으로 배치한 후 후속 단일 입자 재구성(저온 또는 음성 염색) TEM. 단백질을 그리드(116)에 직접 추가하는 것은 종종 단백질이 바람직한 배향(즉, 신장 및/또는 평평할 때 눕힘)으로 그 자체를 배향하게 하여 재구성에서 달성될 수 있는 분해능을 제한한다.
실험
전술한 바와 같이, 본 발명의 미세유동 장치는 특히 예를 들어 도 3에 나타낸 바와 같이 상이한 재료의 여러 층으로 구성되며, 친수성 시트(C형 레이저 인쇄 투명 필름, Xerox, Elmstock, 영국), 접착 테이프 1(64620, Tesa, Norderstedt, ㄷ도독일) 및 접착 테이프 2(300LSE, 3M, VWR, Spanga, 스웨덴)로 제작되었다. 저점착 접착 테이프(Scotch® 928, 3M, Amazon, Koblenz, 독일)를 사용하여 연속 탄소 필름이 있는 formvar 코팅 구리 그리드인 400 메쉬 TEM 그리드 (01754-F, Ted Pella Inc., Redding, CA)를 고정했다.
Ahlstrom 등급 238 및 222(Ahlstrom Filtration LLC, Mt. Holly Springs, PA)는 각각 배수 또는 블로팅 장치에서 흡수지 1 및 흡수지 2로 사용되었다. 가용성 필름 또는 멤브레인/밸브는 세분화된 PVA(360627, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 제작되었다. AAV(아데노 관련 바이러스) 입자, 1x10 13 gc/mL의 스톡 농도(CV10004-50UL, AMS Biotechnology Ltd., Abingdon, UK)를 샘플로 사용하였다.
AAV 샘플을 인산염 완충 식염수(DPBS(-/-) 14190-094, Thermo-Fisher, Uppsala, Sweden)로 1x10 12 gc/mL의 농도로 희석했다. 26S 프로테아솜(#: E-350, BostonBiochem, Cambridge, MA)을 큰 구형 단백질 복합체를 나타내는 시험 샘플로 사용하였다. 초기 농도가 40mg/ml인 WPI(분리 유청 단백질) 16의 단백질 원섬유를 포함하는 샘플은 스웨덴 스톡홀름에 있는 왕립 기술 연구소의 응용 물리 화학과에서 기증한 것이다.
NanoVan®, 용액 중 2% 메틸아민 바나데이트(#2011-5ML, Nanoprobes, Yaphank, NY) 및 용액 중 우라닐 아세테이트 2%(#2240-2, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)를 스테인으로 사용했다. 식용 색소 염료(EAN 코드: 5701073064665 및 5701073064672, Dr.Oetker, Coop, Solna, Sweden)의 수용액을 샘플 및 염색용 모델로 사용했다.
각 장치는 앞서 설명한 바와 같이 여러 층의 서로 다른 재료를 적층하여 장치를 형성하는 라미네이션 기술을 사용하여 제작되었다. 도 3의 단면은 다른 레이어를 도시한다. 이러한 층의 명칭, 상표명 및 두께는 다음과 같다.
명칭 상표명 두께 [μm]
친수성 시트 C형 레이저 인쇄 투명도, Xerox 100
접착 테이프 1 64620, 테사 170
접착 테이프 2 300LSE, 3M 50
저점착성 접착제 스카치® 928, 3M 30
페이퍼 1 알스트롬 등급 238 340
페이퍼 2 알스트롬 등급 222 830
접착제와 친수성 시트는 커팅 플로터(CE6000, Graphtec America Inc., Irvine, CA)를 사용하여 구조화되었다.
PVA 필름 또는 멤브레인은 과립형 PVA 20wt%의 수용액으로 제작되었다. 박막 어플리케이터(4340, Elcometer, Manchester, UK)를 사용하여 PVA 필름을 라미네이팅 파우치(3385694, Office Depot, LA Venlo, Netherlands)로 균일하게 옮기고 실온에서 건조시켰다. 최종 PVA 필름 두께는 눈금이 1㎛인 두께 게이지(2109L Metric Dial Gauge, Mitutoyo, Upplands Vasby, Sweden)를 사용하여 측정하였다.
PVA 필름을 라미네이터(Heat Seal Pro H600, GBC, Northbrook, IL)를 사용하여 85℃에서 흡수지 2에 라미네이팅하였다. 페이퍼-PVA 라미네이트는 사용하기 30분 전까지 상대습도 80%의 습도 챔버에 보관하였다.
페이퍼-PVA 라미네이트를 포함하는 페이퍼 재료는 레이저 절단기(VLS 2.30, Universal Laser Systems, Vienna, Austria)로 절단하였다. 구조화 후, 정렬 핀을 사용하여 레이어를 조립하고 실온에서 라미네이팅하였다. 개선된 입자 접착을 위해, TEM 그리드는 본 발명의 미세유체 장치를 완전히 조립하기 전에 PELCO easiGlow™(91000S-230, Ted Pella Inc., Redding, CA)를 사용하여 산소 플라즈마에서 글로우 방전되었다. 완전히 조립된 제작 장치가 그림 5에 나와 있다. 장치의 치수는 6 x 12 mm 2 이다. 장치는 TEM 그리드를 글로우 방전한 후 1시간 이내에 사용되었다.
본 발명의 미세유동장치의 중요한 특징 중 하나는 사용자 상호작용을 최소화하도록 설계되었다는 점이다. 자율 장치 작동 및 미세 유체 일관성을 입증하기 위해 6개의 장치를 평가했다. 샘플로 AAV 입자와 스테인으로 NanoVan®과 함께 5개의 장치가 사용되었다.이 5개 장치의 그리드는 총 225개의 이미지에 대한 자동 이미지 분석을 위해 TEM 이미지를 수집하는 데 사용되었다. 자율 장치의 개별 준비 단계를 더 잘 시각화하기 위해 하나의 장치가 색상 염료 용액과 함께 사용되었다. 청색염료용액과 황색염료용액을 각각 샘플과 염색용 모델로 사용하였다. 먼저 스테인액 5μl를 스테인 주입구를 통해 스테인 저장소에 추가했다. 그런 다음 샘플 저장소 또는 그리드 챔버의 샘플 입구에 5μl의 샘플을 추가 하여 자율 TEM 그리드 준비 메커니즘을 트리거했다.
모든 장치의 TEM 그리드 준비 시퀀스는 초당 50프레임의 프레임 속도로 카메라로 기록되었다. 자율 준비 단계의 장치 성능과 일관성을 분석하기 위해 각 단계의 시간 간격을 수동으로 얻었다. 스테인 추가와 샘플 액체(입자 포함)의 추가 사이의 시간을 스테인 사전 로딩 시간으로 정의했다.
스테인 저장소의 견고성, 즉 누출 없이 스테인을 가두는 것을 입증하기 위해 스테인과 샘플 추가 사이의 시간을 20-60초 사이로 변경했다. 여기서 스테인 액체는 피닝 에지와 밑면 사이에 연장된 표면에 의해 제자리에 유지되었다. 친수성 표면, 즉 모세관력과 표면 장력. 도 1A 내지 1D에서, 샘플 추가 후 미세유체 TEM 그리드 준비 단계는 샘플 흡수, 배출/블로팅 및 박막 건조를 포함한다. 본 발명의 방법의 중요한 측면은 TEM 그리드 상의 샘플의 흡수 시간이 PVA 필름의 용해 시간에 상응하고 동일하다는 것이다. 페이퍼 1의 젖음과 블로팅 이벤트의 시작 사이의 시간으로 정의되었다. PVA 층 두께는 10㎛였다. 블로팅 시간은 배출/블로팅 이벤트의 시작과 종료 사이의 간격이다. 블로팅 이벤트의 시작은 액체가 배출 장치로 처음 이동하는 순간으로 정의된다. 블로팅 이벤트의 끝은 TEM 그리드에 얇은 스테인 필름을 남기고 배출 장치에 의해 대량의 액체가 배출되는 순간으로 정의된다. 그 후, 건조 간격이 시작되어 그리드에 남아 있는 스테인의 얇은 필름이 시각적으로 건조될 때까지 지속된다.
일반적으로 TEM 이미징은 다양한 유형의 샘플에 대한 강력한 시각화 기술이다. 그러나 필요한 샘플 흡수 시간은 샘플마다 다르다. 그 주된 이유는 샘플 흡수가 샘플과 TEM 그리드의 탄소 표면 사이의 상호작용에 의존하기 때문이다. 따라서 다양한 샘플 요구 사항을 설명하기 위해 흡수 시간이 다른 장치가 바람직하다.
본 발명의 미세유체 장치의 또 다른 핵심 요소는 장치의 타이밍을 자율적으로 제어하고 그리드에서 샘플(즉, 스테인에 내장된 입자의 필름 또는 층)의 샘플 흡착 시간에 해당하는 수용성 PVA 필름의 용해 시간이다.
그리드에서 샘플의 흡수 시간 조정 가능성을 입증하기 위해 세 가지 두께의 수용성 필름(12 μm, 24 μm 및 36 μm)을 가진 미세 유체 장치를 제작하고 조사했다. 용해 시간에 영향을 미치는 매개변수(예: 온도, 상대 습도) 중에서 용해성 필름의 두께는 조정 및 조정하기 가장 쉬운 매개변수 중 하나이다. 24μm 및 36μm의 PVA 두께는 12μm PVA 시트의 여러 층을 적층하고 라미네이터로 85°C에서 PVA 시트 아래의 페이퍼 2에 라미네이팅하여 달성되었다. 페이퍼-PVA 라미네이트는 사용하기 30분 전까지 상대습도 80%의 습도 챔버에 보관하였다. 흡수시간은 샘플 5μl, 황색염료 5μl를 샘플로 하여 막두께당 5개씩 15개 소자, 스테인용으로 흡수시간을 평가하였다.
샘플 준비 품질을 평가하기 위해 AAV 입자를 샘플로, NanoVan®을 스테인으로 사용하여 5개의 자율적으로 준비된 TEM 그리드에서 TEM 이미징을 수행했다. NanoVan®은 일반적으로 사용되는 우라닐 아세테이트(Uranyl Acetate)와 달리 방사성이 없고 일반 실험실에서 처리할 수 있기 때문에 선택되었다. 5개 그리드 모두에 대해 AAV가 TEM 그리드에 성공적으로 흡수되었고 스테인에 충분히 내장되었는지 여부를 조사했다. 16μm에서 500nm 사이의 시야(FOV)로 다양한 배율 수준의 AAV 입자를 검사했다. 이미징은 작동 전압이 25kV인 MiniTEM™ 현미경(Vironova AB, 스웨덴 스톡홀름)에서 수행되었다.
획득한 TEM 이미지가 자동 이미지 분석에 유용한지 여부를 조사하기 위해 자율적으로 준비된 5개의 그리드의 TEM 이미지에 입자 감지 스크립트를 적용했다. 총 225개의 이미지가 그림 8에 표시된 이미징 방식에 따라 수집되었다. 낮은 배율에서 사용자는 5개의 인접하지 않은 격자 사각형을 수동으로 선택했다. 그런 다음 2μm의 FOV에서 그리드 정사각형당 9개의 고배율 이미지를 획득하여 그리드당 45개의 이미지를 얻었다. 픽셀이 약 1nm를 나타내는이 배율에서는 일반적으로 이미지당 다수의 입자를 볼 수 있으며 AAV의 형태는 일반적으로 볼 수 있다. 그리드 1, 그리드 4 및 그리드 5는 동일한 현미경에서 이미지화되었으며 그리드 2 및 그리드 3은 제 2 현미경에서 이미지화되었다. 입자 탐지 스크립트는 모든 225개의 이미지에 적용되었다. AAV는 20면체 캡시드가 둥글고 예상 직경이 20~25nm이다. 그러나 스크립트는 입자가 실제 바이러스 크기보다 크게 나타나도록 AAV 입자 주변의 스테인 봉투를 감지하도록 설계되었다. 따라서 입자 감지 스크립트는 24nm에서 32nm의 직경 범위 내에서 둥근 물체를 감지하도록 설정되었다. 자동화된 이미지 분석을 통해 그리드당 감지된 입자의 수를 얻었으며 감지된 각 입자는 위치와 크기로 특징지어진다.
그리드 당 무작위로 선택된 5개의 이미지를 사용하여 25개의 이미지 하위 집합에서 수동 입자 검출을 수행했다. 입자의 수를 수동으로 세고 감지 스크립트의 결과와 비교했다. 이는 탐지 스크립트의 성능에 대한 중요한 척도인 참 및 거짓 포지티브의 비율을 찾기 위해 수행되었다.
nsTEM은 구조 생물학을 위한 단백질 복합체와 같은 생물학적 표본을 준비하는 동안 품질 관리로 일상적으로 사용된다. 더 넓은 적용과 다양한 스테인을 위한 미세유체 장치의 잠재적인 사용을 조사하기 위해, 프로테아좀을 준비하고 더 큰 구형 단백질 복합체로 이미지화하고 WPI의 단백질 피브릴을 사상 단백질로 이미지화했다. 사용된 미세유체 장치의 PVA 필름은 약 35초의 용해 시간에 해당하는 15μm의 두께를 가졌다. 프로테아좀과 피브릴의 경우 각각 우라닐 아세테이트(Uranyl Acetate)와 NanoVan®의 원액을 사용했다.
상술한 바와 같이, TEM 그리드 준비 순서는 2A-2D에 도시된다. 가시성을 위해 샘플 및 염색 용액 대신 유색 염료 용액을 사용했다. 제 1 단계는 사전 로드된 스테인(208)(노란색 염료 용액)이 어떻게 스테인 저장소 (202)에 포함되고 샘플(210, 214)(파란색 염료 용액)이 추가되는지를 도시한다(도 2A에 가장 잘 도시됨). 제 2 단계에서 샘플(210) 입자를 포함하여 214는 PVA 필름 또는 밸브가 닫혀 있는 한 TEM 그리드를 덮는다(도 2B에 가장 잘 표시됨). PVA 필름 또는 밸브가 용해되면 스테인 및 샘플 액체가 얼룩진다(도 2C에 가장 잘 표시됨). 마지막으로, 대부분의 액체는 배출 매체(블로팅 필터/페이퍼)에 포함되고 그 안에 묻힌 입자를 포함하는 스테인 필름이 건조된다(도 2D에 가장 잘 표시됨). 이전에 보고된 미세 유체 TEM 그리드 준비와 비교하여 수용성 PVA 필름에 의해 제어되는 자율적인 미세 유체 작동을 제공함으로써 사용자 상호 작용이 감소되었으며, 수동 준비 프로토콜만큼 작은 액체 부피로 훨씬 더 낮은 액체 소비가 입증되었다.
미세유체 일관성을 입증하기 위해 샘플로 AAV를 사용하고 스테인으로 NanoVan®을 사용하는 5개의 장치에서 미세유체 이벤트의 타이밍 및 지속 시간과 관련하여 비디오 기록을 분석했다. 도 6은 4개의 샘플 준비 단계 각각에 대한 시간 간격이 있는 막대 차트를 나타낸다. 결과는 스테인 사전 로드 시간의 길이에 관계없이 흡수, 배출/블로팅 및 건조를 포함한 모든 다음 단계가 5개 장치에 대해 거의 동일한다는 것을 도시한다. 이것은 스테인 저장소가 스테인 사전 로드 시간에 관계없이 샘플이 추가될 때까지 안정적으로 스테인을 포함하고 있음을 도시한다. 5개의 장치에 대한 평균 흡수 시간은 10.6 ± 0.3초이며 CV는 3%에 해당한다. 이는 본 발명의 미세유체 장치의 매우 일관된 자율적 시간 제어를 나타낸다. 평균 배출/블로팅 시간은 0.8 ± 0.1초이며 CV는 12.5%에 해당한다. CV가 높은 것처럼 보이지만 절대 편차는 낮고 본 발명의 장치의 미세 유체 일관성을 확인한다. 건조 단계가 갑자기 종료되지 않아 동영상을 보고 정확한 건조 간격을 측정하기 어렵다. 그러나 모든 TEM 그리드가 시각적으로 1분 이내에 건조되는 것이 관찰되었다. 그리드 챔버의 그리드 영역 크기 상단 개구로 인해 안정적이고 빠른 건조가 가능하다.
그 결과 본 발명의 미세유동장치는 최소한의 사용자 입력 에도 불구하고 의도한 대로 동작함을 알 수 있다. 스테인 사전 로드 시간에 관계없이 샘플 추가 후 자동 장치 작동은 높은 미세 유체 일관성을 나타내는 5개의 장치에 대해 거의 동일하다.
PVA 용해 시간에 해당하는 샘플 흡수 시간의 조절성을 입증하기 위해 수용성 PVA 필름의 세 가지 두께(12μm, 24μm 및 36μm)를 본 발명의 미세유체 장치에서 시험하였다. 도 7은 흡수 시간의 측정 결과를 나타낸다. PVA 필름의 용해 시간은 PVA 필름 두께에 따라 증가한다. PVA 필름의 12 μm, 24 μm 및 36 μm 두께의 경우 평균 용해 시간은 14.4 ± 0.9 s(n=5), 89.9 ± 12.0 s(n=5) 및 191.6 ± 20.3 s(n=5)이다. 각기. 결과는 PVA 필름 두께를 변경하여 흡수 시간을 쉽게 조정할 수 있음을 도시한다. 용해 시간의 변화는 PVA 필름 두께가 증가함에 따라 증가한다. 이것은 서로 다른 장치 사이의 PVA 필름 두께의 작은 차이 때문일 수 있다. 그러나, 변동은 흡수 시간이 본 발명의 PVA 층의 설계에 의해 제어될 수 있다는 결론을 내릴 만큼 충분히 낮다.
5개의 자율적으로 준비된 TEM 그리드의 TEM 이미징을 통해 샘플 준비 품질을 평가할 수 있었다. 도 9A-9C는 16㎛, 2㎛ 및 500nm의 3개의 FOV를 갖는 확대 시리즈를 도시한다. 가장 큰 FOV(16μm)에서 AAV 입자는 어두운 점으로 나타난다. 중간 FOV(2μm)는 더 높은 수준의 디테일을 도시한다. 입자는 방사형으로 희미해지는 스테인 그라데이션이 있는 어두운 고리로 둘러싸인 밝고 둥근 개체로 표시된다. 이 시리즈에서 가장 작은 FOV(500nm)는 최고 수준의 세부 정보를 제공하며 AAV 입자의 클로즈업 뷰를 제공한다.
도 10A-10E는 5개의 그리드(FOV 2㎛) 각각으로부터 하나의 예시적인 이미지를 도시한다. 5개의 TEM 그리드 모두 그리드의 스테인 필름에 잘 박힌 입자를 포함하고 있으며 어두운 스테인 봉투로 둘러싸인 밝은 점으로 보이다. 스테인 외피 모양의 변화는 스테인 두께의 국부적 변화로 인한 것일 수 있다. 또한, 예를 들어 탄소 필름의 국부적 비균질성에 의해 야기되는 TEM 그리드의 두께 변화는 이미지 음영의 변화를 초래할 수 있다. 전반적으로, 5개의 미세 유체 장치의 결과는 AAV 입자가 잘 내장된 TEM 그리드의 일관된 준비를 보여주었다.
샘플 준비 일관성을 추가로 입증하기 위해 225개의 TEM 이미지를 수집하고 자동 입자 검출을 수행했다. 입자 감지 스크립트는 225개 이미지 모두에서 5171개의 입자를 감지했다. 45개의 이미지가 있는 모든 그리드에는 6%의 CV에 해당하는 평균 1034 ± 65개의 입자가 포함된다. 이것은 5개의 독립적으로 준비된 TEM 그리드에 걸쳐 재현 가능하고 일관된 AAV 입자 확산을 나타낸다. 자동 입자 검출 결과를 이용하여 검출된 입자의 크기를 추출하였다.
도 11은 각각의 그리드에서 검출된 입자에 대한 평균 입자 직경을 나타내는 그래프(640)이다. 두 개의 다른 현미경이 사용되었으며 보정이 약간 다를 수 있지만 각 그리드의 평균 입자 크기는 다른 샘플의 오차 막대 내에 있다. 검출된 모든 입자의 평균 크기는 28 ± 2nm(n=5171)이며 CV는 7%에 해당한다. 이런 낮은 변동은 그리드에 관계없이 감지된 모든 입자의 감지된 크기가 유사함을 의미한다. AAV 입자의 실제 크기는 20?25 nm이지만 스테인 외피로 인해 nsTEM에서 이미지화할 때 더 크게 나타난다. 탐지 스크립트는 스테인 층, 즉 실제 입자 외부에 있는 입자의 윤곽을 잡고 측정하도록 설계되었다. 따라서 감지된 입자 크기는 예상 크기 창 내에 있다.
25개 이미지의 하위 집합에서 수동 입자 감지 결과를 통해 자동 감지 결과를 정량화할 수 있었다. 도 12는 하위 집합 테스트 결과를 요약한 것이다. 수동 계산 결과 하위 집합에서 605개의 입자가 생성되었다. 자동화된 입자 스크립트는 이러한 입자 중 557개를 올바르게 찾았으며(진정성), 이는 92%의 성공률에 해당한다. 스크립트는 4.9%에 해당하는 올바르지 않은(거짓 포지티브) 개체 29개를 발견했다. 90% 이상의 참 포지티브와 약 5%의 거짓 포지티브로 이미지와 자율 샘플 준비가 간단한 자동 이미지 분석에 충분한 품질을 가지고 있다는 결론을 내릴 수 있다.
적용 범위를 넓히기 위해 WPI의 프로테아좀과 단백질 피브릴을 준비하고 이미지화했다. 이들 2개의 샘플(500, 502)의 결과는 도 1 및 도 2에 제시된다. 도 17A-17D는 TEM 조사에 적합한 잘 함유된 영역을 갖는 TEM 그리드 상의 단백질의 균일한 퍼짐을 나타낸다. 도 17A-17B는 2개의 상이한 배율에서 265개의 프로테아좀의 이미지(500)를 도시한다. 프로테아솜의 평면도(504) 및 측면도(506)를 관찰할 수 있다. 도 17C-17D는 두 가지 다른 배율에서 WPI 피브릴(508)의 이미지를 도시한다. 프로테아좀 표본의 분석(도 17A-17B에 가장 잘 나타남)은 개별 프로테아좀이 명확하게 식별될 수 있고 서브유닛의 세부사항과 같은 구조적 특징이 구별될 수 있음을 도시한다. 평면도는 원형 입자로 나타나고 측면도는 직사각형으로 나타나는 이미지에서 다양한 투영을 관찰할 수 있다. WPI 피브릴(도 17C-17D에 가장 잘 나타나 있음)의 분석은 다양한 길이의 잘 정의된 개별 피브릴의 관찰 및 특성화를 가능하게 한다. 전반적으로, 형태학적 관찰은 종래의 수동 nsTEM으로 제조된 유사한 샘플의 보고된 데이터와 일치한다. 이 두 단백질 샘플의 준비는 미세 유체 장치의 추가 조정이 필요하지 않았으므로 방법의 다양성과 견고성을 입증했다.
아래는 수정된 장치를 필요로 하는 본 발명의 방법에 대한 분야의 또 다른 가능한 적용예이다. 가능한 nsTEM 샘플 전처리 적용 사례는 4개의 액체를 샘플 위로 플러싱해야 하는 이뮤노골드 라벨링이다. 준비 단계의 순서는 다음과 같다.:
1)샘플이 이미 부착된 그리드가 장치에 추가된다;
2)1차 항체는 그리드에 부착되도록 허용된다(따라서 위의 설명에서 샘플 액체로 그리드에 직접 추가됨);
3)결합이 발생하면 차단 액체가 그리드 위로 흘러내린다(예: BSA = 소혈청 알부민 또는 건조 우유);
4) 그런 다음 금 입자에 연결된 제 2 항체가 플러시되어 1차 항체 위치에 결합하여 표시된다;
5) 마지막으로, 결합되지 않은 금 입자는 마지막 세척 단계에서 세척된다.
요약하면, 자동 TEM 샘플 준비를 위한 본 발명의 모세관 구동 일회용 장치가 제시되었다. 조작자 편향 및 오류가 발생하기 쉬운 수동 단계를 피하기 위해, 본 발명의 장치는 사용자 상호 작용을 최소화하도록 설계되었다. 주요 설계 요소는 수용성 밸브 또는 PVA 필름 및 흡수막과 결합된 스테인 및 샘플 저장소이다. 이러한 핵심 요소를 통해 하나의 중요하지 않은 사용자 상호 작용만으로 자율적인 TEM 그리드 준비를 시작할 수 있다. 미세 유체 성능과 샘플 준비 품질 모두에 대한 장치 일관성이 입증되었다. 미세유체 성능의 일관성은 거의 동일한 TEM 그리드 준비 시퀀스를 가진 5개의 미세유체 장치에 의해 나타났다. 샘플 준비 일관성은 모두 잘 내장된 AAV 입자를 나타내는 5개의 TEM 그리드에 의해 입증되었다. 이 준비 일관성은 자동 입자 감지 결과에 의해 더욱 강조되었다. 90% 이상의 진양성 및 약 5%의 위양성으로 구성된 하위 집합 테스트에서 이미지와 자율 샘플 준비가 이미지 분석에 충분한 품질을 유지한다는 결론을 내렸다. 두 단백질 샘플의 추가 준비는 더 넓은 범위의 적용을 위한 미세유체 장치의 다양성을 입증했다. 또한 수용성 밸브 또는 PVA 필름의 두께를 변경하여 미세 유체 이벤트의 타이밍 조정 가능성을 입증했다. 이를 통해 다양한 샘플 흡수 요구 사항을 설명할 수 있다. 다른 염색 시간이 필요한 TEM 샘플 준비를 설명하기 위해 현재의 장치는 제 2 배출 장치로 확장할 수 있다. 결론적으로, 본 발명의 입증된 미세유체 장치는 수동 TEM 그리드 준비에서 인간의 불일치와 관련된 문제를 완화하기 위한 유망하고 효과적이며 신뢰할 수 있는 솔루션을 제시한다.
본 발명의 증발 배치는 중요하며 샘플 지지체가 적절한 증발을 위해 공기에 노출되는 것이 중요하다. 또 다른 양태는 개구의 너비와 샘플 지지체의 너비가 거의 같아야 한다는 것이다. 샘플 지지체 바로 위의 습도 조건은 개구 외부, 즉 장치 위의 습도보다 높다. 샘플 지지체에 있는 액체 샘플의 액체 경계에서 습도는 100%인 반면 장치 외부 대기의 상대 습도는 더 낮아 개구를 통해 스테인층의 액체 증발을 촉진한다. 제 1 액체는 에지를 사용하지 않고 제 1 저장소에 보유될 수 있음을 이해해야 한다. 두 액체는 에지를 사용하지 않고 연결할 수 있지만 예를 들어 액체 방울 중 하나에 압력을 가하면 된다. 그러나 에지는 제 1 액체가 제 2 저장소로 흐르는 것을 막는다. 이는 에지가 두 저장소 사이의 채널에서 불연속이고 채널 벽을 따라 모세관력의 이동이 중지되기 때문이다. 스테인 액체와 같은 제 1 액체는 에지를 사용하지 않고 제 1 저장소, 즉 스테인 저장소에 보관될 수 있다. 피닝 에지는 스테인 액체를 제자리에 유지한다. 즉, 샘플 저장소에 액체를 추가하는 동안 스테인 액체가 샘플 저장소로 흐르는 것을 중지한다. 에지와 친수성 상부 표면 사이의 제 1 액체의 팽창(팽창)은 유익하지만 반드시 필요한 것은 아니다. 그것은 장치를 더 견고하게 만든다.
제 1 저장소에 제 1 액체를 유지하기 위해 모세관력을 사용할 필요가 없다는 것을 이해해야 한다. 상기 장치는 반드시 그런 것은 아니지만 바람직하게는 제 1 저장소에서 제 2 저장소로 가는 채널을 갖는다. 바람직하게는, 2개의 저장소는 유체 연통되어야 하고 제 1 액체는 제 1 저장소에 유지되어야 한다. 제 1 저장소에서 제 1 액체의 이러한 제한은 제 2 액체가 추가되고 제 1 액체에 연결될 때 쉽게 파괴되는 모세관력 및/또는 표면 장력에 기초하는 것이 바람직하지만 반드시 그럴 필요는 없다. 제 1 저장소가 제 2 저장소 및 블로팅 유닛에 비해 더 높은 고도에 있을 필요는 없다. 세 장치 모두 동일한 높이의 공통 표면에 위치할 수 있다.
바람직하게는, 분해 가능한 부재는 샘플 지지체에 대한 샘플 입자의 흡수 타이밍을 결정하지만 이것은 또한 상이한 속도로 유체를 흡수하는 상이한 필터를 사용함으로써 조정될 수 있다. 예를 들어 작고 좁은 필터는 흡수 속도를 늦춘다. 마이크로 채널의 배출는 지연 메커니즘 및 배출 속도 제어 역할을 할 수도 있다. 또한 샘플 입자가 샘플 지지체 또는 그리드에 부착할 수 있는 충분한 시간을 제공하기 위해 최소 속도 또는 특정 지연 시간이 필요할 수 있다. 스테인 층을 남기기 위해 제 1 액체(스테인)를 배출할 때 고속이 필요할 수도 있다. 제 1 액체의 배출가 너무 느리면 너무 많은 스테인이 배출되어 입자가 보호되지 않은 상태로 남게 된다. 이로 인해 품질이 좋지 않은 준비가 이루어진다. 용해성 멤브레인 또는 필름이 액체 흐름을 지연시키고 일단 멤브레인이 용해되면 유속은 매우 느린 일정한 유속과 달리 매우 빠르다.
본 발명이 바람직한 구성 및 구현예에 따라 설명되었지만, 다음 청구범위의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 특정 대체 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
Claims (20)
- 미세유동장치(100, 200)에서 샘플을 준비하는 방법에 있어서,
내부에 배치된 제 1 흡수 부재(158, 218, 858)를 갖는 배출 유닛(106, 206)과 유체 연통하고 그에 인접하여 제 2 저장소(104, 204)와 유체 연통하는 제 1 저장소(102, 202)를 갖는 미세유체 장치(100, 200)를 제공하는 단계, 제 1 저장소(102, 202)는 제 1 액체(108, 208)를 함유하고, 제 1 액체(108, 208)는 제 1 및 제 2 저장소를 연결하는 모세관 스톱 밸브(228, 230)에 의해 제 1 저장소(102, 202)에 유지되며, 제 2 저장소(104, 204)는 내부에 샘플 지지체(116, 216)가 배치되고;
물질(114, 214)을 함유하는 제 2 액체(110, 210)를 제 2 저장소(104, 204)에 추가하는 단계를 포함하고,
제 2 액체(110, 210)는 제 1 액체(108, 208) 및 제 1 흡수 부재(158, 218, 858)와 접촉하고;
제 1 흡수부재(158, 218, 858)는 제 2 액체(110, 210) 및 제 1 액체(108, 208)를 흡수하며; 및
물질(114, 214)은 샘플 지지체(116, 216)에 부착되는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1항에 있어서, 제 1 흡수 부재(858)의 상류에 용해성 멤브레인(862)을 갖는 배출 유닛(106, 206)을 제공하는 단계를 더 포함하고, 제 2 액체(104, 204)는, 제 1 흡수 부재(858)가 제 1 및 제 2 액체를 흡수하기 전에 용해성 멤브레인(862)을 용해시키는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 제 2 액체(104, 204)가 용해성 멤브레인(162, 220)을 용해시키는 동안 물질(114, 214)이 샘플 지지체(116, 216)에 부착되는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 모세관 스톱 밸브(228, 230)가 제 1 액체(108, 208)를 제 1 저장소(102, 202)에 유지하는 단계를 더 포함하여 제 1 액체(108, 208)가)가 제 2 액체(110, 210)를 제 2 저장소(104, 204)에 추가하기 전에 제 2 저장소(104, 204)로 흘러 들어가는 것을 방지하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 샘플 지지체 (116, 216)에 부착된 물질(114, 214)을 함유하는 제 1 액체(108, 208)의 일부 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 제 1 저장소(102, 202)를 제 2 저장소(104, 204)로부터 분리하는 에지(228)를 모세관 스톱 밸브(228, 230)에 제공하는 단계를 추가로 포함하고, 에지(228)는 제 1 저장소(102, 202)에 제 1 액체(108, 208)를 보유하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 제 1 흡수 부재(158, 218) 하류에 용해성 멤브레인(162, 220)을 제공하고 용해성 멤브레인 하류에 제 2 흡수 부재(160, 222)를 제공하는 단계를 추가로 포함하고, 제 1 흡수부재(158, 218)는 제 2 액체(110, 210)를 흡수하여 제 2 액체(110, 210)가 용해성 부재(162, 220)에 접촉되도록 하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 용해성 멤브레인(162, 220) 후에 상기 제 2 흡수 부재가 제 2 액체(110, 210) 및 상기 제 1 액체(108, 208)를 흡수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 방법은 모세관 스톱 밸브(228, 230)에 유지된 상기 제 1 액체(108, 208)와 접촉시 상기 제 2 액체(110, 210)가 상기 제 1 액체(108, 208)의 표면 장력을 파괴하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 물질(114, 214)이 샘플 지지체(116, 216))에 부착되도록 허용된 시간을 제어하는 용해성 멤브레인(162, 220)을 용해시키는 데 필요한 시간의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 제 2 액체(110, 210)가 제 1 액체(108, 208) 전에 흡수 부재(158, 218)와 접촉하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 샘플 지지체(116, 216) 상에서 제 1 액체(108, 208)의 제 1 부분을 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 샘플 지지체(116, 216) 상에 액체 필름(224)을 형성하는 제 1 액체의 일부를 추가로 포함하고, 여기서 액체 필름(224)은 1 mm 미만의 필름 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 샘플 지지체(116, 216)는 주변 온도 및 50% 상대 습도에서 3분 이내에 건조되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1 액체(108, 208)는 0.1-50 ㎕의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 제 2 액체(110, 210)의 부피가 0.1-50 ㎕인 것을 특징으로 하는 방법.
- 미세유체 장치에서 샘플을 준비하는 방법에 있어서,
내부에 배치된 제 1 흡수 부재(158, 218, 858)를 갖는 배출 유닛(106, 206)과 유체 연통하고 그에 인접하여 제 2 저장소(104, 204)와 유체 연통하는 제 1 저장소(102, 202)를 갖는 미세유체 장치(100, 200)를 제공하는 단계, 제 1 저장소(102, 202)는 제 1 액체(108, 208)을 수용하고, 제 1 액체(108, 208)는 제 1 및 제 2 저장소를 연결하는 모세관 스톱 밸브 (228, 230)에 의해 제 1 저장소(102, 202)에 유지되고;
미세유동 장치(100, 200)의 사용자가 샘플 지지체(116, 216)를 제 2 저장소(104, 204)에 추가하는 단계;
사용자가 물질(114, 214)을 함유하는 제 2 액체(110, 210)를 제 2 저장소(104, 204)에 추가하는 단계;
사용자가 제 2 저장소(104, 204)에서 샘플 지지체(116, 216)를 제거하기 전에 적어도 20초의 대기 기간을 대기하는 단계;
대기 기간 동안, 제 2 액체(110, 210)가 제 1 액체(108, 208) 및 제 1 흡수 부재(158, 218, 858)에 접촉하는 단계;
상기 대기 기간 동안 상기 제 1흡수부재(158, 218, 858)가 제 2액체(110, 210) 및 제 1액체(108, 208)를 흡수하는 단계;
대기 기간 동안 물질(114, 214)이 샘플 지지체(116, 216)에 부착되는 단계; 및
대기 기간이 끝날 때 사용자가 제 2 저장소(104, 204)에서 샘플 지지체(116, 216)를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 17항에 있어서, 제 1 흡수 부재(858)의 상류에 용해성 멤브레인(862)을 갖는 배출 유닛(106, 206)을 제공하고 대기 기간 동안 제 2 액체(110, 210)가 용해성 부재(862)를 용해하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17항에 있어서, 제 1 액체(108, 208)가 샘플 지지체(116, 216) 상에 필름(224)을 형성하고 샘플 지지체(116, 216)에 부착된 물질(114, 214)을 함유하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19항에 있어서, 샘플 지지체(116, 216) 상에서 필름(224)을 건조시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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