CN115803603A - 一种用于样品制备的主动微流控装置 - Google Patents

一种用于样品制备的主动微流控装置 Download PDF

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Abstract

该方法用于在微流控装置中制备样品。所提供的微流控装置具有与第二储存器流体连通的第一储存器，该第二储存器与引流单元流体连通并与其相邻，引流单元具有设置在其中的第一吸收构件。第一储存器包含第一液体，该第一液体通过连接第一储存器和第二储存器的毛细管截止阀保持在第一储存器中。第二储存器具有设置在其中的样品支架。包含物质的第二液体被添加到第二储存器中。第二液体接触第一液体和第一吸收构件。第一吸收构件吸收第二液体和第一液体。物质附着在样品支架上。

Description

一种用于样品制备的主动微流控装置
技术领域
本发明总体上涉及一种装置和方法，该装置和方法用于一致且独立于用户地制备微粒或细长纤维状样品，例如微粒、纳米颗粒和/或微米/纳米尺寸的纤维，以用于使用显微镜或其他检查技术的后续分析。这对于透射电子显微镜(TEM)或扫描电子显微镜(SEM)的应用尤其有用。
背景技术
一致的、独立于用户的和可重复的样品制备方法是客观分析微米级和纳米级颗粒(如病毒颗粒、病毒样颗粒、蛋白质、蛋白质复合物、纤维、输送囊泡、药物和无机颗粒)液体样品所必需的。
例如，修饰的病毒载体通常用于基因治疗应用。确定样品中感染性与非感染性颗粒和碎片/其他物质的比例，提供了关于最终基因治疗产品的质量和功效以及上游开发过程的宝贵信息。
SEM(扫描电子显微镜)和nsTEM(负染色剂透射电子显微镜)应用是临床诊断装置，其中SEM和nsTEM用于检测和分析传染性物质，例如病毒，用于诊断目的。此外，SEM和nsTEM广泛用于疫苗、药物和材料的研究、开发、质量控制中的生物和无机颗粒和材料的表征。与化学和生物化学表征技术相比，SEM/nsTEM的主要优势在于可以直接观察关注的样品。这使得有可能确定例如细胞形态或鉴定致病生物的病毒家族。在nsTEM中，图像对比度是通过重金属染色剂溶液(乙酸铀酰、磷钨酸等)实现的)来包埋和保存关注的颗粒。
在2003年SARS流行期间证明了TEM作为鉴定传染病中病毒病原体的第一筛选工具的价值，其中诊断TEM首次表明致病病毒是冠状病毒家族的成员。考虑到由于全球化的贸易和旅行，埃博拉、寨卡或SARS-COV2等新出现的传染性病原体有能力在洲际层面上迅速传播，以及由于全球政治舞台的不稳定而导致的生物恐怖袭击的风险，很明显，获得高效的TEM分析是我们应急制备、管理和民防的一个重要部分。这是对TEM常规临床应用及其在药物开发和生产中的工艺设计和质量控制的补充。
当使用TEM成像时，染色剂比样品中的颗粒散射更多的电子。这导致图像中的颗粒在暗背景上看起来很亮，分辨率在几纳米的数量级。传统上，TEM网格是按照手动制备协议制备的。这包括将3μl-5μl的样品液体移至TEM网格上，然后根据样品让其吸附约10秒-60秒。然后用吸收纸从网格上手工吸去多余的样品。吸干样品后，立即将3μl-5μl染色剂水溶液加入网格中。
然后将多余的染色剂吸干，理想的情况是留下一层均匀的染色剂液体薄层或薄膜覆盖在被吸附的样品上。该薄膜待干燥。膜包埋了用于TEM成像的样品，并防止其脱水。染色剂也增加了对比度。一个问题是这种手动程序高度依赖于操作者的技能，这影响了制备的一致性并导致不可靠的结果。手动步骤和最终吸收的时间不一致通常是TEM网格制备不良的原因。
尝试获得一致的nsTEM样品制备的可选方法采用触针印刷技术，其中移液机器人自动将液体分配到TEM网格上。这些方法与手动制备相比具有一些优势，例如减少液体体积和自动化的可能性。然而，它们需要特殊的仪器，并且明显比手动制备方案更复杂和耗时。
此外，已经描述了用于nsTEM网格制备的微流控装置。TEM网格被限制在微流控通道中，并且用于样品制备的液体处理由外部压力泵控制。虽然这比手动制备提高了制备的一致性，但是该方法比手动操作需要明显更多的液体体积。它还需要特殊的装置，并且需要用户控制每个制备步骤的时间，这使得制备方法不可靠和不一致。
在时间和资源有限的情况下，如药物生产、材料合成和常规临床诊断中的开发和质量控制，要实现使用电子显微镜的可行性，必须克服几个障碍。如上所述，制备样品进行分析的专家任务极其复杂。这使得TEM技术的使用成为仅限于少数专家的技术。具有基本实验室技能的人可以在一个月内学会一种样品制备方法，但要掌握它需要大约10年时间，同时仍然会产生显著的专家可变性。这意味着即使是该领域的专家也无法产生一致的结果而不产生不希望的变化。
样品制备通常根据标准化程序进行。首先，将样品提供到样品支架上(在TEM的情况下是直径约为3mm的金属网格)，并让其粘附到样品支架上。在下一步中，去除多余的样品溶液，并立即添加染色剂以保护颗粒和/或增加对比度。在负染色剂TEM的情况下，这种染色剂是重金属盐溶液。然后去除多余的染色剂。通过用滤纸吸干来去除多余的液体/染色剂。去除过量液体后的额外清洗步骤有时在加入样品后和加入染色剂前进行。可选地，液体的添加可以通过将网格浸入液体的液滴中来完成。这些步骤通常由仪器操作员手动执行，因此结果很大程度上取决于操作员持续执行正确程序的能力。
此外，无论操作者多么一致和熟练，也不可能始终如一地控制不同制备步骤在颗粒上产生的力。这会影响制备样品的质量，并限制后续分析结果的可靠性。
如上所述，过去已经提出了一些自动或半自动的制备方法。他们依靠机器人分配器、使用特殊装置的微流控或连接到移液装置的特殊样品架。机器人分配器只需要很少的样品量，但却依赖于高度专业化的装置。基于微流控的样品制备方法可实现更一致的制备，但同样依赖于特殊装置(特殊的网格架和外部压力泵)，并且需要比手动制备大10倍的样品体积。还提出了一种使用特殊移液管尖端的方法，该移液管尖端具有保持网格的袋/狭缝。这种基于mprep(手动制备)的方法也需要较大的样品量，并涉及手动计时步骤。此外，液体在网格的两侧被冲洗，这增加了制备质量差的风险。
发明内容
因此，需要一种更加可靠和一致的nsTEM样品制备方法。本发明提供了上述问题的解决方案，没有与手动制备相关的用户偏差和一致性问题，并且没有与常规自动化方法相关的质量、大样品体积、昂贵和特殊装置的缺点。
更具体地说，本发明的装置和方法为随后的成像和分析提供了一致的目标(独立于用户)和可重复的亚可见颗粒样品制备。本发明的方法基于微流控技术与可溶解膜的结合，可溶解膜充当延迟阀和吸收膜。它全部内置于一次性样品制备装置或卡中，因此不需要任何特殊装置或大量样品。不同的液体以一定的延迟和速度以连续的方式流过网格，该延迟和速度由可溶解的膜和吸收膜(过滤器)的设计来限定。
这种组合允许高度自动化的程序，其中不同的样品制备液体以受控和明确限定的方式在样品网格上自动冲洗。一旦用户添加了样品液体，整个网格制备过程是自驱动的、独立的或自动的，因为各种液体通过本发明的装置自动驱动，不需要任何额外的输入，依靠毛细管作用力和其他表面张力效应。应当理解，染色剂液体和样品液的使用仅仅是用于本发明装置的合适液体的说明性例子。根据需要，可以使用多种其他液体。用户交互减少到仅仅在以非时间敏感的方式将染色剂预加载到装置的特定位置之后添加样品液体。样品的添加触发了用预先添加或预先存储在卡/装置中的液体(例如染色剂)在样品网格上的一系列冲洗步骤。当自动制备完成后，操作人员只需将正确制备的样品网格转移到TEM或SEM显微镜中，甚至将卡本身转移到SEM或光学显微镜中。
本发明的装置优选构成或实现为一次性纸基套件，包括用于添加液体的储存器和吸收膜，其中装载样品的网格是预先安装的或由用户添加的。在预安装网格的情况下，用户输入仅包括移取染色剂(除非染色剂已预装载)，然后将样品液体移至装置中的不同储存器。最后一种液体的添加触发自动制备过程的开始，其中微流控力驱动两种液体(即，染色剂和样品液体)在网格上流动，并且其中可溶解阀控制该过程的定时。网格可以涂有或覆盖有薄的碳层，允许样品液体中的颗粒吸附或粘附在该碳层上，直到引流或单元中的可溶解膜溶解，使得颗粒保留在网格上，并随后被染色剂液体包埋，如下面详细解释的。
更具体地，本发明的自动微流控装置优选用于显微镜样品制备。应该理解，在装置中使用叠层仅仅是一个说明性的例子，本发明的装置不限于使用叠层。可以使用任何其他制造方法，例如模制。
本发明的微流控装置具有第一储存器，该第一储存器优选包括第一液体或向其中添加第一液体。第一液体由第一储存器中的毛细管截止阀保持。第二储存器与第一储存器流体连通。第二储存器具有第二液体和设置在其中的样品支架。第二储存器具有限定在其中的入口开口。引流单元(draining unit)邻近第二储存器。引流单元与第二储存器流体连通。引流单元具有设置在其中的第一吸收构件。
在本发明的可选实施例中，微流控装置具有限定在其中的通道，并且第一储存器通过该通道与第二储存器流体连通。
在本发明的另一个实施例中，通道延伸到第二储存器的边缘。
在本发明的另一个可选实施例中，样品支架具有第一宽度，并且开口具有基本上类似于第一宽度的宽度。
在本发明的可选实施例中，引流或吸收单元具有设置在其中的可溶解膜，该可溶解膜位于第一吸收构件下方。
在本发明的另一实施例中，引流单元具有位于可溶解膜下方的第二吸收构件，使得可溶解膜设置在第一吸收构件和第二吸收构件之间。
在本发明的又一个实施例中，第一储存器是包含染色剂液体的预载染色剂储存器。
在本发明的可选实施例中，毛细管截止阀中的第一液体在通道的边缘和另一表面边缘之间延伸。
在本发明的另一个实施例中，第一吸收构件是第一过滤器或纸，第二吸收构件是第二过滤器或纸。
在本发明的另一个实施例中，可溶解膜是基于聚乙烯醇(PVA)的膜。
在本发明的另一个实施例中，样品支架是用于负染色剂透射电子显微镜制备的网格。
在本发明装置的一个可选实施例中，第一液体是染色剂。
在又一实施例中，该装置在第一储存器的上游具有附加储存器。
在本发明的装置的另一实施例中，引流单元具有位于第二吸收构件下方的第二可溶解构件，以及位于第二可溶解构件下方的第三吸收构件。
在可选实施例中，引流单元具有限定在其中的排气口。
在又一可选实施例中，引流单元具有第二可溶解构件和设置在第一可溶解构件下方的第三吸收构件。
本发明的方法用于在微流控装置中制备样品。提供了一种微流控装置，其具有与第二储存器流体连通的第一储存器，该第二储存器与其中设置有第一吸收构件的引流单元流体连通并邻近该引流单元。第一储存器包含第一液体，该第一液体通过连接第一储存器和第二储存器的毛细管截止阀保持在第一储存器中。第二储存器具有设置在其中的样品支架。包含物质(substances)的第二液体被添加到第二储存器中。第二液体接触第一液体和第一吸收构件。第一吸收构件吸收第二液体和第一液体。附着在样品支架上的物质。
在可选方法中，引流单元在第一吸收构件的上游设置有可溶解的膜。在第一吸收构件吸收第一和第二液体之前，第二液体或第一液体溶解可溶解膜。
在另一个方法中，当第二液体或第一液体溶解可溶解膜时，物质附着到样品支架。
在又一方法中，将第一液体保持在第一储存器中的毛细管截止阀在将第二液体添加到第二储存器之前防止第一液体流入第二储存器。
在另一个方法中，第一液体的一部分包埋粘附于样品支架的物质。
在又一方法中，毛细管截止阀设置有将第一储存器与第二储存器分开的边缘，以及将第一液体保持在第一储存器中的边缘。
在另一方法中，可溶解膜设置在第一吸收构件的下游，第二吸收构件设置在可溶解膜的下游，第一吸收构件吸收第二液体并允许第二液体与可溶解构件接触。
在又一方法中，在可溶解膜已经溶解之后，第二吸收构件吸收第二液体和第一液体。
在另一个方法中，第二液体在与保持在毛细管截止阀中的第一液体接触时破坏第一液体的表面张力。
在又一个方法中，溶解可溶解膜所需的时间周期控制物质附着到样品支架的允许时间周期。
在另一个方法中，第二液体在第一液体之前接触吸收构件。
在另一个方法中，第一液体的第一部分在样品支架上干燥。
在可选方法中，第一液体的一部分在样品支架上形成液体膜，其中液体膜具有小于1mm但大于10nm的膜厚度。
在另一个方法中，样品支架在环境温度和50％相对湿度下在三分钟内干燥。
在另一个方法中，第一液体的体积在0.1μl-50μl之间。
在又一种方法中，第二液体的体积在0.1μl-50μl之间。
在本发明的可选方法中，该方法用于在微流控装置中制备样品。提供了一种微流控装置，其具有与第二储存器流体连通的第一储存器，该第二储存器与其中设置有第一吸收构件的引流单元流体连通并邻近该引流单元。第一储存器包含第一液体。第一液体通过连接第一和第二储存器的毛细管截止阀保持在第一储存器中。微流控装置的使用者将样品支架添加到第二储存器中。用户将包含物质的第二液体添加到第二储存器中。在从第二储存器中取出样品支架之前，用户等待至少20秒的等待时间。在等待期间，第二液体接触第一液体和第一吸收构件。在等待期间，第一吸收构件吸收第二液体和第一液体。在等待期间，物质附着在样品支架上。在等待期结束时，用户从第二储存器中取出样品支架。
在另一个方法中，引流单元设有位于第一吸收构件的上游的可溶解膜以及第二液体在等待期间溶解可溶解构件。
在另一个方法中，第一液体在样品支架上形成膜并包埋粘附在样品支架上的物质。
在另一个方法中，膜在样品支架上干燥。
附图说明
现在参考附图，通过示例的方式描述本发明，其中：
图1A是本发明的装置的正视横截面侧视图，示出了样品添加；
图1B是本发明的装置的正视截面侧视图，示出了时间-控制的样品吸附；
图1C是本发明的装置的正视截面侧视图，示出了过量样品和染色剂的自动引流；
图1D是本发明的装置的正视横截面侧视图，示出了在移除网格之前的膜干燥；
图2A是图1A所示装置的俯视图；
图2B是图1B所示装置的俯视图；
图2C是图1C所示装置的俯视图；
图2D是图1D所示装置的俯视图；
图3是本发明的装置的示意性剖视图；
图4是图3所示装置的示意性俯视图；
图5是本发明的装置的俯视图；
图6是显示本发明的五种不同装置的微流控计时结果的示意图；
图7是说明显示本发明的组分平均溶解时间的测量的示意图；
图8是说明本发明的225个图像中五个网格、每个网格五个网格方块和每个网格方块九个图像的示意图；
图9A是通过使用本发明的装置制备的TEM网格的放大视图；
图9B是与图9A中标记的区域尺寸相同的样品区域的放大视图；
图9C是与图9B中标记的区域尺寸相同的样品区域的放大视图；
图10A是通过使用本发明的装置制备的来自第一网格的图像的例子；
图10B是通过使用本发明的装置制备的来自第二网格的图像的例子；
图10C是通过使用本发明的装置制备的来自第三网格的图像的例子；
图10D是通过使用本发明的装置制备的来自第四网格的图像的例子；
图10E是通过使用本发明的装置制备的来自第五网格的图像的例子；
图11是本发明每个网格上颗粒的平均直径和颗粒数量的示意图；
图12是示出了每个网格五个图像的手动子集测试的结果以及真阳性和假阳性的比率的表格；
图13是本发明装置的示意性剖视图；
图14是图13所示装置的俯视图；
图15是本发明装置的第一可选实施例的横截面侧视图；
图16是本发明装置的第二可选实施例的横截面侧视图；
图17A是蛋白酶体在第一放大倍率下的图像(显示了200nm的长度)；
图17B是图17A所示蛋白酶体在第二放大倍率下的图像(显示了100nm的长度)；
图17C是蛋白质(WPI)原纤维在第一放大倍率下的图像(显示了1μm的长度)；
图17D是WPI原纤维在第二放大倍率下的图像(显示了200nm的长度)；
图18是本发明的装置的第四可选实施例的正视示意剖视图；
图19是本发明的装置的第五可选实施例的正视示意剖视图；和
图20是本发明的装置的第六可选实施例的剖视图。
具体实施方式
本发明的毛细管驱动的微流控装置在此用于样品制备，其需要与常规手动程序相同的小液体体积，并且需要最少的用户交互。更具体地说，样品支架优选是网格，例如TEM网格。用户只需启动自动样品制备过程，等待约一分钟，然后提取准备在TEM或SEM显微镜中成像的TEM网格。本发明的自动过程通常需要可被样品液体溶解的膜，例如用于水基样品液体的PVA(聚乙烯醇)膜，其自动控制样品吸附和引流过量液体的时间。下面通过比较微流控TEM网格制备事件的时间和持续时间来展示五个微流控装置的微流控一致性。此外，对于使用三种不同厚度的水溶性膜(12μm、24μm、36μm)的15个装置，解释了时间延迟的可调节性。以AAV(腺相关病毒)颗粒为样品，甲胺钒酸盐(Methylamine Vanadate)为染色剂，通过对五个自动制备的TEM网格成像来检查样品制备的一致性。
提取形态学信息如平均颗粒尺寸的颗粒检测脚本(script)在每个网格45个显微图像上运行，以研究图像是否适合自动图像分析。本发明的装置也可以用于制备用于TEM研究的蛋白质样品和纤维，并且可以使用其他染色剂。
本发明的装置适应手动程序的样品制备步骤，并用自动化和毛细管驱动的微流控事件代替用户交互。该装置优选地但不是必须地设计成一次性使用，并且不需要特殊的仪器。
图1A-1D示出了在本发明的装置中自动TEM网格制备事件的概念顺序。图1A显示了添加样品的步骤如何触发自动制备过程。
更具体地，装置200具有邻近样品储存器或网格室204的染色剂储存器202。样品储存器邻近引流或吸收单元206。染色剂储存器202容纳或包含染色剂液体208。优选地，染色剂液体208在使用前预先装载。样品储存器204包含样品液体210，其包括待分析的物质214，例如物体、分子或颗粒。颗粒可以是病毒或病毒样颗粒或任何其他类型的纤维状或颗粒状生物或无机物体。
当样品液体210被施加到样品储存器204中时，液体210覆盖样品支架216，例如TEM网格，并连接到样品支架或网格216上游的预装载的染色剂208，并连接到位于网格216下游的引流或吸收单元206中的吸收纸或过滤器218。样品液体210和引流单元206中的吸收单元之间的接触开始了时间控制的样品吸附步骤(如图1B所示)。当样品液体210被放置或添加到样品储存器204中时，样品液体210与引流单元206的第一吸收单元218(例如第一吸收纸/过滤纸)接触。引流单元206具有位于第一吸收单元218下方的可溶解阀或膜220。样品液体210覆盖TEM网格216，同时将第一吸收纸218与诸如第二吸收纸/过滤纸222的第二吸收单元分离的可溶解阀220关闭。阀220关闭，直到它被第一吸收构件218吸收的液体溶解。溶解可溶解阀或膜220所花费的时间是本发明的关键步骤，因为在此期间，样品液体210中的颗粒214被允许附着到网格216或被网格216吸附。
如图1C所示，一旦阀220溶解，过量的样品液体210和染色剂液体208被两个吸收单元(吸收纸/过滤纸218和222)自动引流或吸收。颗粒214粘附到网格216上或被网格216吸附。剩余的薄染色剂膜224覆盖或包埋网格216上的颗粒214，并在膜224包埋样品颗粒214时干燥(如图1D所示)。然后，网格216制备好用于成像，并且可以通过剥离翼片226并用例如一对镊子提取网格216来容易地取回。
图2A-2D是显示相应框架的装置的俯视图。
装置200的关键部件在图3所示的截面图和图4所示的俯视图中示出。图5示出了本发明制造的装置的俯视图。
如上所述，本发明的微流控装置200由液体(染色剂)储存器202、第二液体(样品)储存器或网格室204和引流单元206组成。染色剂储存器202的关键功能是容纳染色剂液体208，直到用户添加包括最终与染色剂液体208接触的颗粒214(在图1A-1D中最佳示出)的样品液体210，如下面详细描述的。
关键的使能特征是毛细管截止阀或液体锁定(pinning)机构，例如锁定边缘228，如图3所示，其将染色剂储存器202与网格室204分开。毛细管截止阀或机构可以是疏水表面区域和/或几何结构，其中表面张力防止液体超出疏水区域和/或几何结构。优选地，几何截止阀是通道横截面在通道或部分通道的流动方向上的突然分叉(例如边缘)。在优选实施例中，毛细管截止阀位于通道的边缘，并终止于第二储存器开始的地方。只要在第二储存器处有阻止第一液体流入第二储存器的边缘，就不必有通道。如果边缘远离第二储存器，则存在在第一液体和第二液体之间形成气泡的风险，使得两种液体之间不能建立接触。非常重要的是，第一液体容易接近第二液体，从而两种液体可以连接，并且第一液体的表面张力被破坏。
本发明的液体锁定机构的一个目的是将液体限制在一个与第二储存器连接(流体连通)的储存器中。由于染色剂液体208和下侧230之间的表面张力，染色剂液体208被锁定在锁定边缘228处或者被锁定边缘228保持，并且被保持到第一层压部分232的亲水下侧230。
优选地，锁定机构228是边缘，更具体地是形成在层压板252的水平底表面231和垂直侧壁233之间的尖锐边缘(例如90度的边缘)，该边缘朝向层压板253延伸并且在将网格216保持在适当位置的胶带254下方。在锁定边缘228和下侧230之间延伸的表面234处的表面张力将染色剂液体208保持在染色剂液体储存器202中的适当位置，使得表面234和第一层压部分232在锁定边缘228上延伸。表面张力是由表面附近的分子间力引起的，导致表面膜的明显存在和表面上的毛细管现象。液体的表面倾向于收缩，并具有类似于伸展的弹性膜的性质。因此，锁定边缘228、亲水下侧230和表面234中的表面张力的组合使得能够通过添加样品液体210来启动自动样品制备过程。
网格室204具有限定在翼片叠层240的前边缘238和叠层部分232的后边缘242之间的样品入口开口236。染色剂储存器202具有限定在第二层压部分246的后边缘244和第一层压部分232的前边缘248之间的入口开口203。优选地，第一和第二叠层部分232、246和翼片叠层240是同一叠层的一部分，以使装置200的制造更容易。
网格室204包含网格216，例如TEM网格，并且连接到网格216上游的染色剂储存器202并与其流体连通。网格室204还连接到网格216下游的引流单元206并与其流体连通。优选地，毛细管力驱动液体侧向朝向并进入引流单元206。更具体地，网格室204经由限定在染色剂储存器202的叠层232和底部叠层252之间的通道250与染色剂储存器202流体连通。
网格216通过低粘性粘合层压板254固定在背面网格周边，使得网格216可移除地保持在层压板254上。在网格216下方形成腔256，以确保没有液体到达网格216的背面或下侧，否则会导致TEM成像伪像。
网格室204的顶部或开口用作样品入口236，并确保在引流(吸干)过量液体后快速干燥薄染色剂膜。开口236略小于TEM网格216的长度，因为第一层压部分232及其后边缘242在网格216上延伸。类似地，翼片部分240及其前边缘238在网格216上延伸。这在顶部亲水层或层压部分232、240和网格216之间留下了重叠。该重叠确保样品液体210与预装载的染色剂液体208和引流单元206可靠地连接。
引流单元206优选地由两个吸收单元或滤纸单元218和222纸单元以及水溶性阀/膜(例如PVA膜220)的堆叠形成，该水溶性阀/膜将两个吸收单元或构件218、222彼此分开。第一和第二吸收构件可以是任何合适的多孔基质，其提供对液体的良好吸收，例如纸，即纤维素，以及棉纤维、硝化纤维和玻璃纤维。第一或顶部吸收构件218的一个功能是确保引流单元和第二储存器中的第二液体之间的良好接触。第二吸收构件222的一个功能是当可溶解膜220已经溶解时，确保液体从第一和第二储存器适当流动并进入第二吸收构件。优选地，两种液体按顺序流过样品支架或TEM网格216，使得样品液体210首先流过样品支架并与第一吸收构件218接触，随后与染色剂液体208接触，使得一部分染色剂液体208保留在样品支架上并包埋样品液体210的物质或物体。该原理适用于本发明的所有实施例，即使该装置仅具有一个吸收构件或者该吸收构件位于诸如PVA膜的可溶解膜的下游。PVA特别适用于本发明的范围，因为生物样品通常在水溶液中制备。顶部纸单元218在网格室204和PVA层220之间提供稳定的连接。纸单元218与样品储存器或网格室204流体连通。位于顶部纸单元218上方的排气口264确保没有空气被截留，空气会阻碍引流过程。使用气密膜时，排气口是重要特征。
本发明的一个重要方面是PVA层220的溶解时间控制已经放置在TEM网格216上的样品液体210的吸附时间。当PVA层220被样品的液体210溶解并且液体到达第二吸收(纸)单元222时，引流或吸收步骤被触发。第二吸收(纸)单元222的高毛细管(引流)力导致快速吸收包含在装置200中的液体体积210和208。在样品制备完成后，可以剥离翼片部分240以收集网格216。除了网格收集之外，翼片部分240可以允许用户在制备过程之前引入选择的网格。
图5是本发明的装置200的制造版本的俯视图。
图6是示意图400，示出了本发明的五种不同装置(装置编号1-5)的测试结果。该视图显示了相对于添加包含颗粒的样品液体，在不同时间的染色剂预加载。更具体地说，它显示了五个不同装置的微流控计时结果和预装载染色剂的时间，即染色剂和样品添加之间的时间段、吸附时间、引流/吸收时间和每个装置的干燥时间。如上所述，自动TEM网格制备在时间0开始，并由样品添加触发。在1号装置中加入样品(例如样品液体210)之前约40秒加入染色剂。在2号装置中加入样品前约20秒、3号装置中约60秒、4号装置中约40秒和5号装置中加入样品液体前约50秒加入染色剂。尽管用于预加载染色剂直到添加样品液体的时间段402、404、406、408、410在20秒至60秒之间变化，但是完成吸附、引流和干燥步骤的时间段412对于所有五个装置来说大致相同。预加载步骤之后的步骤总共略长于20秒。因此，吸附时间段与被吸收在第一吸收介质(例如纸)中的样品液体溶解可溶解膜(PVA膜)所花费的时间相同。这意味着相对于添加或预装载染色剂的时间，添加样品液体的时间并不重要，这使得添加样品液体的用户更容易进行该过程。
图7是示意图420，显示了溶解厚度分别为12μm、24μm和36μm的三种不同的可溶解膜220a、220b、220c所需的时间。膜220a需要约15秒来溶解，膜220b需要约90秒，膜220c需要超过180秒来溶解。
图8是示出具有五个网格432、434、436、438和440的成像方案的示意图430，其中每个网格有五个网格方块442，每个网格正方形442有九个图像444，这导致总共225个图像446。
图9A是由本发明的装置制备的TEM网格的示例放大图600，包括第一部分602。图9B是相对于图9A中的视图600放大倍率更高的视图604，包括第二部分606，其尺寸与图9A所示的视图600中的部分602标记的尺寸相同。同样，图9C是相对于图9B中的视图604放大倍率更高的视图608，其尺寸与图9B所示的视图604的部分606相同。
图10A是来自第一网格432、612的图像610的例子，该图像是通过使用本发明的装置和方法制备的。图像610包括或描绘了诸如病毒颗粒的颗粒614。类似于图10A，图10B是来自第二网格434、618的图像616的例子，该图像是通过使用本发明的装置和方法制备的。图像616包括颗粒620，例如病毒颗粒。图10C是来自第三网格436、624的图像622的例子，该图像是通过使用本发明的装置和方法制备的。图像622包括颗粒626，例如病毒颗粒。图10D是来自第四网格438、630的图像628的例子，该图像是通过使用本发明的装置和方法制备的。图像628包括或描绘了颗粒632。图10E是来自第五网格440、636的图像634的例子，该图像是通过使用本发明的装置和方法制备的。图像634包括或描绘了颗粒638，例如病毒颗粒或任何其他合适的颗粒。
图11是通过使用本发明的装置和方法制备的每个网格上的颗粒平均直径和颗粒数量的图表640；
图12是表格642，示出了每个网格五个图像的手动子集测试的结果以及真阳性和假阳性的比率；
图13是本发明的微流控装置100的剖视图。应当注意，装置100不是由层压材料制成的。装置100基本上类似于装置200，并且适用于装置100的一切也适用于装置200，反之亦然。装置100具有微流控平台，该微流控平台具有流体连通的液体储存器、吸收单元和可溶解膜，该可溶解膜用作具有延迟阀的时间控制液体引流。样品支架116，这里图示为TEM网格，位于样品储存器104的底部。染色剂储存器102具有入口开口143，该入口开口143限定在装置的后部141的前端和装置的中部132的后端之间。优选地，如果使用层压技术构造该装置，部分140、132和141是同一层压材料的一部分，这使得制造装置100更容易。
样品储存器104具有限定在叠层或部分132和叠层或部分140之间的入口开口145。样品储存器104在上游(在一侧)通过在样品储存器104和上游染色剂储存器102之间延伸的微流控通道150连接到染色剂储存器102并与之流体连通。应当理解，通道150可以仅在通道150的端部的一部分处具有锁定边缘或间断，使得例如侧壁不具有任何边缘。在内表面的上侧也可以有通道的边缘，从而在通道的末端有两个相对的边缘。
优选地，通道150被限定在第一层压部分或区段132的亲水下侧130和染色剂储存器102的底面131之间。底面131延伸到锁定边缘128。液体108和下侧130之间的毛细管作用力以及表面134的表面张力将液体108保持在染色剂储存器102中，并防止液体108流入样品储存器104。换句话说，锁定边缘128防止添加到染色剂液体储存器102的液体108(例如染色剂液体)流入样品储存器104。
样品储存器104在下游(相对于染色剂储存器102的上游连接的相对侧)连接到第一过滤器或吸收介质158并与其流体连通，第一过滤器或吸收介质158通过可溶解的膜、隔膜或阀162与第二过滤器或吸收介质160分开。第一过滤器158也连接到排气口164。排气口164用作潜在截留空气和气体的紧急出口，否则这些空气和气体会阻碍液体108、110流入第一和第二过滤器158、160并被其吸收。
参考图14，在完成网格制备后，在从样品储存器102移除样品网格116之前，从装置100移除可移除的翼片126。
图15示出了装置300，其基本上类似于图13所示的装置100，但是包括附加的储存器302和附加的可溶解膜或隔膜(film or membrane)或阀320以及附加的吸收单元322。这里仅描述装置100和装置300之间的主要区别。当额外的液体以顺序和时间控制的方式在网格116上冲洗时，使用装置300。附加液体储存器302被放置在染色剂或第二储存器102的上游，并通过通道304与染色剂或第二储存器102流体连通和连接，通道304被限定在储存器302的底表面306和层压部分或区段310的亲水下侧308之间。在储存器302和102之间，存在第二锁定边缘312，其防止上游储存器302中的液体314流入染色剂储存器102、303。液体314以与储存器102中的液体108相同的方式保持在储存器302中的适当位置，即通过对亲水下侧308的毛细管作用力和通过表面316中的表面张力。
储存器的顺序对应于液体流过网格116的顺序。也就是说，如果液体是样品、洗涤液、染色剂，那么应该将染色剂液体添加到上游储存器302中。洗涤液应该被添加到中间或第二储存器102中，该中间或第二储存器102在添加时连接到上游储存器302中的液体。样品液体应该被添加到网格116顶部的第一储存器104中，该第一储存器104在添加时连接到洗涤液305和染色剂314的上游液体链，并且下游连接到引流单元318。
引流单元318具有吸收构件(滤纸)158、160和可溶解膜162，并且位于样品储存器104的下游。引流单元318具有附加的可溶解膜320和另一个过滤器或吸收构件322，以示出如何控制附加液体的定时。第一可溶解膜158的厚度决定了添加到样品储存器104的第一液体110在网格116的顶部停留或停留多长时间，即允许样品液体110和颗粒114附着到网格116多长时间。第二过滤器160应该足够大以吸收和储存对应于样品液体110体积的液体量。一旦液体110到达第二可溶解膜或隔膜320，网格116上的液体流动停止，直到膜320已经溶解，并且在具有3种液体的该设置中的最后过滤器322通过吸收所有三种液体110、108/305和314的所有体积而将第二液体108、305和第三液体314拉到网格116上。
图16示出了装置380，其包括图13和15所示装置的修改，并示出了如何修改引流单元384中的滤纸382的形状，以控制液体的流速。装置380中的其他一切都与装置100和300的组件相同。窄而薄的滤纸或具有颈部386的滤纸382降低了网格116上的流速，而宽而厚的过滤器提高了流速。
图18-19分别示出了装置700、800的可选实施例，除了引流或吸收单元706、806分别不同于引流或吸收单元106之外，它们实际上与图13所示的装置100相同。优选地，引流单元706仅具有一个第一吸收构件758，但没有可溶解膜或第二吸收构件，如图13所示。装置700的操作基本上类似于装置100的操作，因为第一和第二储存器中的液体在合适的时间段内被吸收构件758吸收，使得样品液体中的颗粒有足够的时间粘附到网格116上，如参照装置100、200详细解释的。
类似地，装置800基本上类似于装置100，除了引流单元806具有可溶解膜862和第一吸收构件858。引流单元806在可溶解膜862和第二储存器104之间不具有吸收构件，使得可溶解构件862与第二液体直接接触，而第二液体在与可溶解构件接触以开始溶解可溶解膜862之前不必穿过吸收构件。除了吸收单元706、806与吸收单元106相比的不同之外，装置700、800的所有其他特征和方法步骤与上面详细描述的装置100、200相同。
图20是装置900的另一个实施例，其基本上类似于图13所示的装置100，除了它在引流或吸收单元906中具有毛细管通道958，而不是第一吸收构件158。通道958中的毛细管力将第二液体110从第二储存器104推入通道958，使得液体110与可溶解膜162接触以溶解该膜，如结合装置100和200详细描述的。
在操作中，本发明的方法包括以下步骤：提供连接到具有预安装的网格216的网格室或样品液体储存器204并与其流体连通的染色剂储存器202。储存器204又连接到引流单元206，并与引流单元206流体连通。染色剂液体208被添加到包含在储存器202中的染色剂液体储存器202中，直到用户将包括颗粒214的样品液体210添加到样品液体储存器204中。
这一关键特征是通过毛细管截止阀或锁定机构实现的，这里是位于通道250末端的边缘228的形式，其将染色剂储存器202与网格室204分开。染色剂液体208由于毛细管作用力而被锁定在锁定边缘228处，使得液体208粘附到下侧230并延伸越过锁定边缘228，并且表面234处的表面张力防止液体208流入网格室204，尽管在染色剂液体储存器202和样品储存器或网格室204之间存在经由通道250的流体连通。以这种方式将染色剂液体208保持在染色剂储存器202内部的事实使得能够通过将包括颗粒214的样品液体210添加到样品储存器204中来启动样品制备过程。添加液体210的量使得液体210与表面234接触，以破坏锁定边缘228和下侧230之间的液体208的表面张力。当表面234的表面张力被破坏时，两种液体210、208被连接，液体在界面处仅轻微混合。当包括颗粒214的样品液体210从装置200上方经由开口236被添加到网格室204时，液体210也流入并连接到样品储存器204下游的引流单元206。通过其添加样品液体210和颗粒214的开口236略小于网格216的宽度，以使样品液体210可靠地连接到染色剂液体208和吸收单元206。位于网格216下方的腔257确保没有液体流动和附着到网格216的错误侧，并且干扰制备的质量。
引流单元206具有两个吸收单元(例如滤纸)218和222以及位于两个过滤器218、222之间的可溶性PVA膜220。顶部过滤器218通过吸收液体210确保样品液体210可靠地连接到PVA膜220，使得液体从过滤器218的顶侧行进到与可溶解膜220接触的过滤器218的底部。
顶部过滤器上方的排气口264用作潜在截留空气的紧急出口，否则截留空气会阻塞样品液体210和引流单元206之间的连接。样品液体210流过顶部过滤器218，并且在与PVA膜或层220接触时溶解PVA层220，使得液体可以流入位于过滤器218下方的过滤器222。样品液体210溶解PVA层220所花费的时间是关键的，因为它控制了允许样品液体210中的颗粒214附着和吸附到网格216中的时间。一旦PVA层220溶解，液体210接着流入并连接到底部过滤器222，该过滤器吸收装置200中的所有液体210、208。过滤器或吸收构件222首先吸收样品液体210，然后吸收染色剂液体208。底部过滤器222因此对应于手动吸收步骤。网格216上的开口236(通过该开口添加样品液体210和颗粒214)现在确保了在两个吸收构件或过滤器218、222已经引流/吸收了所有过量液体210、208之后剩余的薄染色剂膜224的快速干燥。最后，翼片226可以从装置200上剥离，以提供对网格216的容易访问，网格216容易从装置200中提取，用于例如ns-TEM装置中的后续成像。
如果需要以连续的方式添加更多的液体，例如在染色剂液体314被添加到样品液体110之前的清洗步骤中的洗涤液305，则可以添加经由通道304连接到中间储存器303并与中间储存器303流体连通并且被锁定边缘312分隔开的另一个储存器302，如结合图15所示和所述。然后，在将染色剂液体314添加到最上游的储存器302之后，应当将洗涤液305添加到中间的储存器303。如果需要控制额外液体(此处为洗涤液305)的培养时间，可将额外的可溶膜层320和滤纸322添加到引流单元318。
流过网格116的速度可以通过引流单元中滤纸的形状和厚度来控制。较少数量的可用吸收介质(即过滤器/纸)或较低的过滤器毛细管作用(也称为芯吸速率)导致较慢的流动/引流，反之亦然。例如：在可溶性膜之后的薄、窄且长的过滤器导致较慢的液体流动和引流速度。
代替添加一滴预混合的染色剂溶液，构成染色剂的盐可以在染色剂储存器102的底部干燥，然后当制备染色剂储存器和网格时，仅将水或另一种溶剂/缓冲剂添加到储存器102中。然后，当添加溶剂以产生染色剂液体208时，染色剂盐溶解。
在添加样品液体之前，可以将亲水化液体如阿辛蓝(Alcian-Blue)冲洗过网格，而不是将亲水化网格添加到制备组件试剂盒中。以这种方式，染色剂和样品液体被装载在网格室102和302上游的两个分开的储存器中，(在图15中最佳示出)这两个分开的储存器通过微流控通道304和150连接，但是通过锁定边缘128和312保持分开。然后，将网格亲水化液体直接添加到网格室104中的网格116上，以开始液体流过网格116的顺序，即，开始网格制备过程。
本发明方法的另一种用途是将其用于在网格116顶部受控沉积基质。除了仅使用一种液体，即物质，并且将其添加到网格室104之外，应用与上述相同的方法。例如，可以允许诸如蜘蛛丝的纤维在添加到网格116上的样品(基质)液滴上的空气-液体界面中聚合。当可溶层162溶解时，蜘蛛丝轻轻地落在EM网格上，同时滤纸160引流该装置。布置在网格顶部的纤维网络(在这种情况下是蜘蛛丝)然后充当基质，迫使后来添加的蛋白质在随后的单个颗粒在(冷冻或负染色剂)TEM中重建之前以随机取向放置在网格上。将蛋白质直接添加到网格116通常会导致蛋白质将其自身定向在优选的方向上(即，当被拉长和/或变平时放下)，这限制了在重建中可以实现的分辨率。
实验
如上所述，本发明的微流控装置由几层不同的材料组成，特别是如图3所示，其由以下制成：亲水性片材(C型激光打印透明胶片(Type C laser printing transparency)，施乐(Xerox)，Elmstock，英国(UK))、胶带1(64620，德莎(Tesa)，诺德施泰特(Norderstedt)，德国(Germany))和胶带2(300LSE，3M，VWR，斯潘加
Figure BDA0004042217410000161
瑞典(Sweden))。使用低粘性胶带(思高
Figure BDA0004042217410000162
928，3M，亚马逊(Amazon)，科布伦茨(Koblenz)，德国)来固定400网孔TEM网格(01754-F，特德佩拉公司(Ted Pella Inc.)，雷丁(Redding)，加利福尼亚州(CA))，其是具有连续碳膜的方华(formvar)涂层铜网格。奥斯龙(Ahlstrom)238级和222级(奥斯龙过滤有限责任公司(Ahlstrom Filtration LLC)，霍利泉山(Mt.Holly Springs)，宾夕法尼亚州(PA))分别用作引流或吸收单元中的吸收纸1和吸收纸2。可溶性膜或隔膜/阀由粒状PVA(360627，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO))制成。AAV(腺相关病毒)颗粒，血清型2(AAV2)封装有用巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)表达，物料浓度为1×1013gc/mL(CV10004-50UL，AMS生物技术有限公司(AMS Biotechnology Ltd.)，阿宾登(Abingdon)，英国)用作样品。
用磷酸盐缓冲盐水(DPBS(-/-)14190-094，赛默飞(Thermo-Fisher)，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)将AAV样品稀释至浓度为1x1012gc/mL。26S蛋白酶体(#：E-350，波士顿生化公司(BostonBiochem)，剑桥(Cambridge)，马萨诸塞州(MA))用作代表大球状蛋白复合物的测试样品。含有来自乳清蛋白分离物(WPI)16的蛋白原纤维的样品，初始浓度为40mg/ml，由瑞典斯德哥尔摩皇家理工学院应用物理化学分部(Division of Applied PhysicalChemistry at the Royal Institute of Technology in Stockholm,Sweden)赠予。
钒
Figure BDA0004042217410000171
溶液中的2％甲胺钒酸盐(#2011-5ML，Nanoprobes，亚普汉克(Yaphank)，纽约(NY))和溶液中的2％乙酸铀酰(#2240-2，EMS公司(Electron MicroscopySciences)，哈特菲尔德(Hatfield)，宾夕法尼亚州)用作染色剂。食用色素染料(EAN–码(EAN-codes)：5701073064665和5701073064672，欧特家博士(Dr.Oetker)，库珀(Coop)，索尔纳(Solna)，瑞典)的水溶液被用作样品和染色剂的模型。
每个装置都是使用层压技术制造的，其中装置是通过堆叠几层不同的材料形成的，如前所述。图3中的横截面显示了不同的层。这些层的名称、商标和厚度如下：
Figure BDA0004042217410000172
使用切割绘图仪(CE6000，图技(Graphtec America Inc.)，尔湾(Irvine)，加利福尼亚州)构造粘合剂和亲水性片材。
PVA膜或隔膜由20wt％的粒状PVA的水溶液制成。使用薄膜涂布器(4340，易高(Elcometer)，曼彻斯特(Manchester)，英国)将PVA膜均匀地转移到层压袋(3385694，欧迪办公(Office Depot)，芬洛(LA Venlo)，荷兰(Netherlands))中，并在室温下干燥。使用具有1μm刻度的测厚仪(2109L公制千分表(2109L Metric Dial Gauge)，三丰(Mitutoyo)，乌普兰斯韦斯比(Upplands
Figure BDA0004042217410000173
)，瑞典)测量最终的PVA膜厚度。
使用层压机(Heat Seal Pro H600，GBC，北布鲁克(Northbrook)，伊利诺伊州(IL))在85℃将PVA膜层压到吸收纸2上。纸-PVA层压材料在使用前保持在80％相对湿度的湿度室中30分钟。
用激光切割机(VLS 2.30，通用激光系统(Universal Laser Systems)，维也纳(Vienna)，澳大利亚(Austria))切割纸材料，包括纸-PVA层压材料。结构化后，使用定位销组装各层，并在室温下层压。为了改善颗粒粘附，在完全组装本发明的微流控装置之前，用PELCO easiGlowTM(91000s-230，特德佩拉公司，雷丁，加利福尼亚州)在氧等离子体中对TEM网格进行辉光放电。图5示出了完全组装的制造装置。该装置的尺寸为6x12mm2。该装置在辉光放电TEM网格后一小时内使用。
本发明的微流控装置的一个重要特征是它被设计成最小化用户交互。为了证明自动装置操作和微流控一致性，评估了六个装置。使用五种装置，以AAV颗粒作为样品，以
Figure BDA0004042217410000181
作为染色剂。来自这五个装置的网格用于收集TEM图像，用于对总共225个图像进行自动图像分析。为了更好地观察自动装置的各个制备步骤，一个装置使用彩色染料溶液。蓝色染料溶液和黄色染料溶液分别用作样品和染色剂的模型。首先，通过染色剂入口将5μl染色剂液体加入染色剂储存器中。然后，通过将5μl样品添加到样品储存器或网格室的样品入口来触发自动TEM网格制备机制。
所有装置的TEM网格制备序列用帧速为每秒50帧的照相机记录。为了分析装置性能和自动制备步骤的一致性，手动获取每个步骤的时间间隔。加入染色剂和加入样品液体(包括颗粒)之间的时间被限定为染色剂预加载时间。
为了证明染色剂储存器的坚固性，即染色剂限制而不泄漏，染色剂和样品添加之间的时间在20秒-60秒之间变化，其中染色剂液体通过在锁定边缘和亲水性表面下侧之间延伸的表面，即毛细管力和表面张力保持在适当的位置。如图1A-1D所示，添加样品后的微流控TEM网格制备步骤包括样品吸附、引流/吸收和膜干燥。作为本发明方法的关键方面，样品在TEM网格上的吸附时间对应于并等于PVA膜的溶解时间。它被限定为纸1润湿和开始吸收事件之间的时间。PVA层的厚度为10μm。吸收时间是引流/吸收事件开始和结束之间的间隔。吸收事件的开始被限定为液体第一次移动到引流单元中的时刻。吸收事件的终点被限定为当大部分液体被引流单元引流，在TEM网格上留下薄的染色剂膜的时刻。在此之后，干燥间隔开始并持续，直到网格上剩余的染色剂膜在视觉上变干。
总的来说，对于许多不同类型的样品，TEM成像是一种强大的可视化技术。然而，不同样品所需的样品吸附时间不同。其主要原因是样品吸附取决于样品和TEM网格碳表面之间的相互作用。因此，需要具有不同吸附时间的装置来满足不同的样品要求。
本发明的微流控装置的另一个关键因素是水溶性PVA膜的溶解时间，其自动控制装置的定时，对应于网格上样品(即包埋在染色剂中的颗粒的膜或层)的样品吸附时间。
为了证明样品在网格上吸附时间的可调性，制造并研究了具有三种不同厚度的水溶性膜(12μm、24μm和36μm)的微流控装置。在影响溶解时间的参数(例如温度、相对湿度)中，可溶解膜的厚度是最容易调整和调节的参数之一。24μm和36μm的PVA厚度通过堆叠多层12μm的PVA片材并在85℃下用层压机将它们层压到PVA片材下面的纸2上来实现。纸-PVA层压材料在使用前保持在80％相对湿度的湿度室中30分钟。分别使用5μl蓝色染料溶液和5μl黄色染料溶液作为样品和染色剂的模型，对15个装置(每个膜厚度5个装置)的吸附时间进行了评估。
为了评估样品制备质量，在五个自动制备的TEM网格上进行TEM成像，其中AAV颗粒作为样品，
Figure BDA0004042217410000191
作为染色剂。选择
Figure BDA0004042217410000192
是因为它没有放射性，不像常用的乙酸铀酰，可以在普通实验室处理。对于所有五个网格，研究了AAV是否成功吸附到TEM网格并充分包埋在染色剂中。用16μm至500nm的视野(FOV)检查了不同放大倍数的AAV颗粒。成像在MiniTEMTM显微镜(Vironova AB，斯德哥尔摩，瑞典)上进行，工作电压为25kV。
为了研究获得的TEM图像是否对自动图像分析有用，将颗粒检测脚本应用于五个自动制备的网格的TEM图像。根据图8所示的成像方案，总共收集了225幅图像。在低放大倍数下，用户手动选择五个不相邻的网格方块。然后，在2μm的FOV下，每个网格正方形获得9个高放大率图像，导致每个网格45个图像。在该放大倍数下，一个像素代表大约1nm，通常可以看到每个图像的多个颗粒，并且AAV的形态通常是可见的。网格1、网格4和网格5在同一台显微镜上成像，而网格2和网格3在第二台显微镜上成像。颗粒检测脚本应用于所有225幅图像。AAV有一个呈圆形的二十面体衣壳，预计直径为20nm-25nm。然而，该脚本被设计为检测AAV颗粒周围的染色剂包膜，以便颗粒看起来比实际的病毒大小更大。因此，颗粒检测脚本被设置为检测直径范围在24nm到32nm之间的圆形物体。从自动图像分析中，获得每个网格中检测到的颗粒数量，其中每个检测到的颗粒由其位置和尺寸表征。
为了量化颗粒检测结果，在25个图像的子集上进行手动颗粒检测，每个TEM网格随机选择五个图像。手动计算颗粒数，并与检测脚本的结果进行比较。这样做是为了找到真阳性和假阳性的比率，这两者都是检测脚本性能的重要度量。
nsTEM通常用作结构生物学的生物样品(如蛋白质复合物)制备过程中的质量控制。为了研究微流控装置在更广泛的应用中的潜在用途和不同的染色剂，制备蛋白酶体并成像，作为较大的球状蛋白复合物，和来自WPI的蛋白原纤维，作为丝状蛋白。所使用的微流控装置中的PVA膜具有15μm的厚度，对应于大约35秒的溶解时间。对于蛋白酶体和原纤维，分别使用乙酸铀酰和
Figure BDA0004042217410000201
的储备溶液。
如上所述，TEM网格制备顺序如图2A-2D所示。为了便于观察，使用有色染料溶液代替样品和染色剂溶液。第一步显示了预装载的染色剂208(黄色染料溶液)如何包含在染色剂储存器202中，以及样品210、214(蓝色染料溶液)如何被添加(在图2A中最佳示出。在第二步中，只要PVA膜或阀门关闭，包括颗粒214的样品210就覆盖TEM网格(如图2B所示)。当PVA膜或阀门溶解时，染色剂和样品液体被吸干(如图2C所示)。最后，大部分液体包含在引流介质(吸收过滤器/纸)中，包括包埋其中的颗粒在内的染色剂膜干燥(如图2D所示)。与之前报告的微流控TEM网格制备相比，通过提供由水溶性PVA膜控制的自动微流控操作，减少了用户交互。此外，在液体体积与手动制备方案一样小的情况下，液体消耗显著降低。
为了证明微流控的一致性，在使用AAV作为样品和
Figure BDA0004042217410000202
作为染色剂的五个装置上，就微流控事件的时间和持续时间分析视频记录。图6显示了四个样品制备步骤中的每一个的时间间隔的条形图。结果表明，不管预加载时间的长短，所有随后的步骤，包括吸附、引流/吸收和干燥，对于这五种装置都接近相同。这表明，无论染色剂预加载时间如何，在添加样品之前，染色剂储存器都可靠地容纳染色剂。五个装置的平均吸附时间为10.6s±0.3s，相当于CV为3％。这表明本发明的微流控装置的高度一致的自动时间控制。平均引流/吸收时间为0.8秒±0.1秒，对应的CV为12.5％。虽然CV看起来很高，但绝对偏差很低，这证实了本发明装置的微流控一致性。干燥步骤不会突然结束，这使得很难通过观看视频来测量准确的干燥间隔。然而，观察到所有的TEM网格在一分钟内视觉上是干燥的。通过网格室中网格面积大小的顶部开口，能够实现可靠和快速的干燥。
结果表明，尽管用户输入很少，但本发明的微流控装置按预期工作。不考虑染色剂预加载时间，五个装置在样品添加后的自动装置操作接近相同，这证明了高的微流控一致性。
为了证明对应于PVA溶解时间的样品吸附时间的可调性，在本发明的微流控装置中测试了三种不同厚度(12μm、24μm和36μm)的水溶性PVA膜。图7显示了吸附时间的测量结果。PVA膜的溶解时间随着PVA膜厚度的增加而增加。对于12μm、24μm和36μm厚度的PVA膜，平均溶解时间分别为14.4秒±0.9秒(n＝5)、89.9秒±12.0秒(n＝5)和191.6秒±20.3秒(n＝5)。结果表明，可以通过改变PVA膜的厚度来容易地调节吸附时间。溶解时间的变化随着PVA膜厚度的增加而增加。这可能是由于不同装置之间PVA膜厚度的微小差异。然而，该变化足够低，可以得出结论，吸附时间可以通过本发明的PVA层的设计来控制。
五个自动制备的TEM网格的TEM成像使得评估样品制备质量成为可能。图9A-9C示出了具有三个FOV的放大系列：16μm、2μm和500nm。在最大的FOV(16μm)，AAV颗粒显示为暗点。中级FOV(2μm)显示了更高层次的细节。这些颗粒看起来是明亮的圆形物体，被带有径向褪色染色剂梯度的暗环所环绕。这个系列中最小的FOV(500nm)具有最高的细节水平，并提供了AAV颗粒的特写镜头。
图10A-10E显示了来自五个网格(FOV2μm)中的每一个的一个示例性图像。发现所有五个TEM网格在网格上的染色剂膜中包含良好包埋的颗粒，可见为被深色染色剂包膜包围的亮点。色斑包膜外观的变化可能是由于色斑厚度的局部变化造成的。此外，TEM网格的厚度变化，例如由碳膜的局部不均匀性引起的厚度变化，会导致图像暗度的变化。总的来说，来自五个微流控装置的结果显示了具有良好包埋的AAV颗粒的TEM网格的一致制备。
为了进一步证明样品制备的一致性，收集了225个TEM图像并进行自动颗粒检测。颗粒检测脚本在所有225幅图像中检测到5171个颗粒。每个网格有45幅图像，平均包含1034±65个颗粒，对应的CV为6％。这表明在五个独立制备的TEM网格上分布着可重复且一致的AAV颗粒。使用自动颗粒检测的结果，提取颗粒的检测尺寸。
图11是曲线图640，示出了每个网格中检测到的颗粒的平均颗粒直径。使用了两种不同的显微镜，尽管校准可能略有不同，但每个网格的平均颗粒尺寸都在其他样品的误差范围内。所有检测到的颗粒的平均尺寸为28nm±2nm(n＝5171)，相当于CV为7％。这种低变化意味着，不管网格如何，所有检测到的颗粒都具有相似的检测尺寸。AAV颗粒的真实尺寸为20nm-25nm，但由于染色剂包层的原因，在nsTEM中成像时会显得更大。检测脚本被设计成在污点层(即在实际颗粒之外)描绘和测量颗粒。因此，检测到的颗粒尺寸完全在预期的尺寸范围内。
在25个图像的子集中的手动颗粒检测的结果允许量化自动检测结果。图12总结了子集测试的结果。手动计数在子集中产生605个颗粒。自动颗粒脚本正确地找到了这些颗粒中的557个(真阳性)，这对应于92％的成功率。该脚本发现了29个不正确的对象(假阳性)，相当于4.9％。在真阳性率超过90％而假阳性率约为5％的情况下，可以得出结论，图像和自动样品制备对于简单的自动化图像分析具有足够的质量。
为了扩大应用范围，制备了蛋白酶体和来自WPI的蛋白质纤维并成像。呈现在图17A-17D中的这两个样品500、502的结果揭示了蛋白质在TEM网格上的均匀分布，具有适于TEM研究的良好包埋区域。图17A-17B显示了265个蛋白酶体在两种不同放大倍数下的图像500。可以观察蛋白酶体的俯视图504和侧视图506。图17C-17D显示了WPI原纤维508在两种不同放大倍数下的图像。蛋白酶体样品的分析(最佳显示于图17A-17B)显示，单个蛋白酶体可以被清楚地识别，并且结构特征如亚单位的细节可以被区分。在图像上可以观察到不同的投影，俯视图显示为圆形颗粒，侧视图显示为矩形。WPI原纤维的分析(在图17C-17D中最佳示出)允许观察和表征各种长度的界限分明的单个原纤维。总的来说，形态学观察与用常规手动nsTEM制备的类似样品的报道数据一致。这两种蛋白质样品的制备不需要进一步调整微流控装置，因此证明了该方法的通用性和稳定性。
下面是本发明的方法在该领域的另一种可能的应用，它需要一种改进的装置。nsTEM样品制备的可能应用实例是免疫金标记(immunogold-labelling)，其中需要在样品上冲洗四种液体。制备步骤的顺序是：
1)已经附着有样品的网格被添加到装置上；
2)允许第一抗体附着在网格上(如上所述作为样品液体直接添加到网格上)；
3)一旦结合发生，封闭液体被冲洗过网格(例如BSA＝牛血清白蛋白，或奶粉)；
4)然后，连接到金颗粒的第二抗体被冲洗以结合并因此标记第一抗体位置；和
5)最后，未结合的金颗粒在最后的洗涤步骤中被洗掉。
总之，已经介绍了用于自动TEM样品制备的本发明的毛细管驱动的一次性装置。为了避免操作者的偏见和容易出错的手动步骤，本发明的装置被设计成最小化用户交互。关键的设计元素是结合了水溶性阀门或PVA膜和吸收膜的染色剂和样品储存器。这些关键元素使得能够仅通过一次非关键的用户交互来启动自动TEM网格制备。已经证明了微流控性能和样品制备质量的装置一致性。具有接近相同的TEM网格制备顺序的五个微流控装置显示了微流控性能的一致性。样品制备的一致性由五个TEM网格证明，它们都显示出良好包埋的AAV颗粒。自动化颗粒检测的结果进一步突出了这种制备的一致性。从具有超过90％的真阳性和大约5％的假阳性的子集测试中，可以得出结论，图像和自动样品制备对于图像分析来说具有足够的质量。两种蛋白质样品的额外制备证明了微流控装置对于更广泛应用的多功能性。此外，通过改变水溶性阀或PVA膜的厚度，证明了微流控事件的时间的可调节性。这允许考虑不同的样品吸附要求。考虑到TEM样品制备需要不同的染色剂时间，本发明的装置可以通过第二引流单元来扩展。总之，本发明所展示的微流控装置提供了一种有希望的、有效的和可靠的解决方案，以减轻与手动TEM网格制备中的人为不一致性相关的问题。
本发明的蒸发装置是重要的，并且样品支架暴露于空气中以进行适当的蒸发。另一方面是开口的宽度和样品支架的宽度应该大致相同。样品支架正上方的湿度条件高于开口外部(即装置上方)的湿度。在样品支架上的液体样品的液体边界处，湿度为100％，而装置外部的环境空气中的相对湿度较低，这促进了染色剂层中的液体通过开口蒸发。应该理解的是，第一液体可以在不使用边缘的情况下保持在第一储存器中。两种液体可以在不使用边缘的情况下连接，但是例如在其中一个液滴上施加压力。然而，该边缘阻止第一液体流入第二储存器。这是因为边缘在两个储存器之间的通道中是不连续的，并且毛细管作用力沿着通道壁的行进被阻止。诸如染色剂液体的第一液体可以保持在第一储存器即染色剂储存器中，而不使用边缘。锁定边缘将染色剂液体保持在原位，即在将液体添加到样品储存器时阻止染色剂液体流入样品储存器。第一液体在边缘和亲水性上表面之间的膨胀(凸出)是有益的，但不是必需的。它使装置更加稳健。
还应该理解，没有必要使用毛细管作用力来将第一液体保持在第一储存器中。该装置优选但非必须地具有从第一储存器到第二储存器的通道。优选地，两个储存器应该流体连通，并且第一液体应该保持在第一储存器中。第一液体在第一储存器中的这种限制优选地但不是必须地基于毛细管作用力和/或表面张力，当第二液体被添加并连接到第一液体时，这种毛细管作用力和/或表面张力容易被打破。与第二储存器和吸收单元相比，第一储存器不必处于更高的高度。所有三个单元可以位于相同高度的公共表面上。
优选地，可溶解构件决定样品颗粒吸附在样品支架上的时间，但是这也可以通过使用以不同速率吸收流体的不同过滤器来调整。例如，小而窄的过滤器会降低吸收率。微通道中的引流也可以起到延迟机制和引流速度控制的作用。可能还需要具有最小速度或一定的延迟时间，以给样品颗粒足够的时间附着到样品支架或网格上。当引流第一液体(染色剂)时，为了留下染色剂层，可能还需要具有高速度。如果第一液体的引流太慢，将会引流太多的染色剂，使得颗粒不受保护。这导致低质量的制备。应该注意的是，尽管可溶解的膜或膜延迟了液体流动，并且一旦膜溶解，流动速率相当快，与非常慢的恒定流动速率相反。
虽然已经根据优选的组合物和实施例描述了本发明，但是应当理解，在不脱离所附权利要求的精神和范围的情况下，可以对其进行某些替换和改变。

Claims (20)

1.一种在微流控装置(100、200)中制备样品的方法，包括：
提供一种微流控装置(100、200),其具有与第二储存器(104、204)流体连通的第一储存器(102、202),所述第二储存器(104、204)与引流单元(106、206)流体连通并与其相邻，所述引流单元(106、206)具有设置在其中的第一吸收构件(158、218、858),所述第一储存器(102、202)包含第一液体(108、208),所述第一液体(108、208)通过毛细管截止阀(228、230)保持在第一储存器(102、202)中，所述毛细管截止阀(228、230)连接第一储存器和第二储存器，所述第二储存器(104、204)具有设置在其中的样品支架(116、216)；
将包含物质(114、214)的第二液体(110、210)添加到第二储存器(104、204)；
所述第二液体(110、210)接触第一液体(108、208)和第一吸收构件(158、218、858)；
所述第一吸收构件(158、218、858)吸收第二液体(110、210)和第一液体(108、208)；和
所述物质(114、214)粘附到样品支架(116、216)上。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤:提供引流单元(106、206)，所述引流单元(106、206)具有位于第一吸收构件(858)的上游的可溶解膜(862)，在第一吸收构件(858)吸收第一液体和第二液体之前，第二液体(104、204)溶解可溶解膜(862)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括当第二液体(104、204)溶解可溶解膜(162、220)时，所述物质(114、214)附着到样品支架件(116、216)的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：在将第二液体(110、210)添加到第二储存器(104、204)之前，将第一液体(108、208)保持在第一储存器(102、202)中的毛细管截止阀(228、230)防止第一液体(108、208)流入第二储存器(104、204)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括步骤：第一液体(108、208)的一部分包埋粘附到样品支架(116、216)的物质(114、214)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：为毛细管截止阀(228、230)提供将第一储存器(102、202)与第二储存器(104、204)分开的边缘(228)，所述边缘(228)将第一液体(108、208)保持在第一储存器(102、202)中。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：提供位于第一吸收构件(158、218)的下游的可溶解膜(162、220)和位于可溶解膜(162、220)的下游的第二吸收构件(160、222)，第一吸收构件(158、218)吸收第二液体(110、210)并且允许第二液体(110、210)与可溶解构件(162、220)接触。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：在所述可溶解膜(162、220)已经溶解之后，所述第二吸收构件(160、222)吸收所述第二液体(110、210)和所述第一液体(108、208)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：第二液体(110、210)在与保持在毛细管截止阀(228、230)中的第一液体(108、208)接触时破坏第一液体(108、208)的表面张力。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：溶解所述可溶解膜(162、220)所需的时间段控制所述物质(114、214)附着到所述样品支架(116、216)的允许时间段。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：第二液体(110、210)在第一液体(108、208)之前接触吸收构件(158、218)。
12.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：在样品支架(116、216)上干燥第一液体(108、208)的第一部分。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括第一液体的一部分在样品支架(116、216)上形成液体膜(224)，其中所述液体膜(224)具有小于1mm的膜厚度。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品支架(116、216)在环境温度和50％相对湿度下在三分钟内干燥。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一液体(108、208)的体积在0.1μl-50μl之间。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二液体(110、210)的体积在0.1μl-50μl之间。
17.一种在微流控装置中制备样品的方法，包括：
提供一种微流控装置(100、200),其具有与第二储存器(104、204)流体连通的第一储存器(102、202),所述第二储存器(104、204)与引流单元(106、206)流体连通并与其相邻，所述引流单元(106、206)具有设置在其中的第一吸收构件(158、218、858),所述第一储存器(102、202)包含第一液体(108、208),所述第一液体(108、208)通过毛细管截止阀(228、230)保持在第一储存器(106、206)中，所述毛细管截止阀(228、230)连接第一储存器和第二储存器；
微流控装置(100、200)的用户将样品支架(116、216)添加到第二储存器(104、204)中；
用户将包含物质(114、214)的第二液体(110、210)添加到第二储存器(104、204)；
用户在从第二储存器(104、204)移除样品支架(116、216)之前等待至少20秒的等待时间；
在等待时间期间，第二液体(110、210)接触第一液体(108、208)和第一吸收构件(158、218、858)；
在等待时间期间，第一吸收构件(158、218、858)吸收第二液体(110、210)和第一液体(108、208)；
在等待时间期间，物质(114、214)粘附到样品支架(116、216)上；和
在等待时间结束时，用户从第二储存器(104、204)移除样品支架(116、216)。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：提供引流单元(106、206)，所述引流单元(106、206)具有位于所述第一吸收构件(858)的上游的可溶解膜(862)，以及在所述等待时间溶解所述可溶解构件(862)的第二液体(110、210)。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：第一液体(108、208)在样品支架(116、216)上形成膜(224)和包埋粘附到样品支架(116、216)的物质(114、214)。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法还包括以下的步骤：在所述样品支架(116、216)上干燥所述膜(224)。
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