CN112316751A - 一种循环肿瘤细胞的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分离技术领域,涉及一种循环肿瘤细胞的高效分离方法,即膜分离法。其核心涉及一种用于临床医学中循环肿瘤细胞分离的亲水性分离膜的制备,将制得的分离膜放置于一自制膜分离组件实现循环肿瘤细胞的分离。本发明以多孔膜为支撑体,甘草酸为分散剂,聚丙烯酰胺为膜材料,通过加入交联剂进行醛胺缩合反应使得制得的分离膜具有亲水性,且该分离膜难溶于水因而具有很好的稳定性,通过该速率可控的抽滤方法制得的分离膜孔径分布均匀。依据尺寸筛分原理,可实现循环肿瘤细胞的高效分离。
Description
技术领域
本发明属于分离技术领域,具体涉及一种用于临床医学中循环肿瘤细胞的分离方法。
背景技术
癌症是世界上最普遍的疾病之一,也是一个非常主要的健康问题。由于癌症的高致死率,每年都有很多人死于癌症。癌症转移是目前公认的主要死亡原因,循环肿瘤细胞(CTCs)在肿瘤转移中起到了关键性的作用。循环肿瘤细胞即人体外周血中肿瘤细胞的统称,由于自发原因或诊疗原因,少数循环肿瘤细胞从原发肿瘤的病灶脱落到血液中,并通过血液循环系统扩散到不同器官成为转移灶,大大增加了癌症患者的死亡率。由于循环肿瘤细胞和原发肿瘤细胞具有相同的特性和构型,因此从血液中分离循环肿瘤细胞,并将其进行体外培养,观察,在临床医学和生物化学领域都极具价值。分离循环肿瘤细胞的一大难点在于它在病人血液中的含量非常少。就目前来说,循环细胞分离技术大致可以分为两个方面:化学法和物理法。其中,化学法依赖生物标记物和抗体来识别循环肿瘤细胞并对其进行分离,但是由于肿瘤细胞的遗传不稳定性,大多数情况下很难甚至不可能找到相关特异性识别分子与标记物。物理法利用细胞的物理特性,如细胞大小,形状,变形性等来区分血细胞和循环肿瘤细胞,这种方法不需标记特异性物质,且分离效率高,分离纯度高。在这些物理分离技术中,膜分离技术作为一种绿色分离技术,分离过程可控可设计,反应耗能低,成本低,操作简单,易于和其他技术相结合,因此在循环肿瘤细胞的分离中具有巨大的潜在应用价值。
发明内容
本发明针对现有循环肿瘤细胞分离技术中存在的效率低的问题提出一种新型的循环肿瘤细胞的分离方法,即膜分离法。该分离膜的制备工艺简单、成本较低并具有很好的应用价值。
为了达到上述目的,本发明是采用下述的技术方案实现的:
一种循环肿瘤细胞的分离方法,即膜分离法。该分离膜的制备使用多孔膜为支撑体,甘草酸为分散剂,聚丙烯酰胺为膜材料,通过加入交联剂进行反应制得。
作为优选,循环肿瘤细胞分离膜的制备过程如下:
步骤1:铸膜液的配制
将甘草酸与去离子水混合后加热溶解至溶液澄清;加入交联剂并搅拌均匀;然后边搅拌边加入聚丙烯酰胺;加热后静置使得溶液完全混合均匀;
步骤2:基底支撑体的预处理
将大孔径多孔支撑体用去离子水和乙醇轮流超声处理若干次,去除支撑体上的残留杂质;
步骤3:在支撑体上抽滤制膜
抽滤条件下,使铸膜液缓慢滴落在支撑体上。
作为优选,步骤1中铸膜液中甘草酸浓度为0.02-20mg/ml,交联剂浓度为0.1-40mg/ml,聚丙烯酰胺浓度为0.001-16mg/ml。
作为优选,交联剂可以为戊二醛、正硅酸四乙酯、十六烷基硅氧烷中的一种。
作为优选,支撑体为陶瓷,PVDF,PTFE,PP,尼龙N66微孔支撑体中的任意一种,与抽滤装置滤芯部分恰好贴合,孔径为1-10μm。
作为优选,利用所制得的膜片进行循环肿瘤细胞的分离过程如下:
使用抽滤装置对循环肿瘤细胞进行分离。该装置示意图如1所示:上部为培养容器,用于盛放包含待分离细胞的培养液;中部为分离区,包含所制得的膜片;下部为收集容器,用于收集分离过后的培养液。基于以上装置,依据尺寸筛分原理,运用所制膜片对循环肿瘤细胞进行筛分截留。
与现有技术相比,本发明的优点和积极效果在于:
相比化学标记法,依据尺寸筛分原理的膜分离法对循环肿瘤细胞的分离更高效。本发明以多孔膜为支撑体,甘草酸为分散剂,聚丙烯酰胺为膜材料,通过加入交联剂进行反应使得制得的分离膜具有亲水性,且制得的分离膜难溶于水因而具有很好的稳定性,用此抽滤方法制得的膜孔径分布均匀。依据尺寸筛分原理,可实现循环肿瘤细胞的高效分离。
附图说明
图1为循环肿瘤细胞分离装置示意图。
图2为实施例1中制备的分离膜的扫描电镜图。
各附图标记为:1. 培养容器,2. 膜片放置区 3. 收集容器。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面结合具体实施例对本发明中核心的分离膜制作过程做进一步说明。需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是,本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施,因此,本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
实施例1
一种循环肿瘤细胞分离膜,具体操作步骤如下:
1)称取适量甘草酸加入100ml去离子水中,配制得到浓度为0.02mg/ml的甘草酸溶液,在80℃烘箱中加热溶解至澄清后加入戊二醛混合均匀,配制得到戊二醛的浓度为0.2mg/ml的溶液,最后在搅拌的条件下向混合溶液中加入聚丙烯酰胺,使得溶液中聚丙烯酰胺浓度为0.001mg/ml,得到铸膜液。
2)利用孔径为8μm的网格状尼龙作为支撑体,分别用去离子水和乙醇轮流各超声处理3次,去除支撑体上的残留杂质。将支撑体放置于抽滤装置上(放滤纸的位置),倒入铸膜液开始抽滤,铸膜液滴落完成后继续抽滤1min后停止抽滤操作。抽滤结束后,在40℃下烘干2小时,得到分离膜。
通过扫描电镜表征发现所制备的分离膜孔径大小约为6μm。进一步分离富含循环肿瘤细胞的溶液,得到分离效率为95.7%。对膜的亲水性进行接触角测试,测得的接触角为57.4°。
实施例2
一种循环肿瘤细胞分离膜,具体操作步骤如下:
1)称取适量甘草酸加入100ml去离子水中,配制得到离子浓度为20mg/ml的甘草酸溶液,在80℃烘箱中溶解至澄清后加入正硅酸四乙酯混合均匀,配制的正硅酸四乙酯的浓度为36mg/ml,最后在搅拌的条件下向混合溶液中加入聚丙烯酰胺,浓度为16mg/ml。
2)在清洗后的孔径为8μm的陶瓷支撑体上进行抽滤。铸膜液滴落完成后继续抽滤1min后停止抽滤操作,抽滤结束后,在45℃下烘干1.5小时,得到分离膜。
通过扫描电镜表征发现所制备的分离膜孔径大小约为5.6μm。进一步分离富含循环肿瘤细胞的溶液,得到分离效率为95.2%。对膜的亲水性进行接触角测试,测得的接触角为63.2°。
实施例3
一种循环肿瘤细胞分离膜,具体操作步骤如下:
1)称取适量甘草酸加入100ml去离子水中,配制得到离子浓度为8mg/ml的甘草酸溶液,在80℃烘箱中溶解至澄清后加入十六烷基硅氧烷混合均匀,配制的浓度为10mg/ml,最后在搅拌的条件下向混合溶液中加入聚丙烯酰胺,浓度为1.2mg/ml。
2)在清洗后的孔径为8μm的PTFE支撑体上进行抽滤,铸膜液滴落完成后继续抽滤1min后停止抽滤操作,抽滤结束后,在42℃下烘干3小时,得到分离膜。
通过扫描电镜表征发现所制备的分离膜孔径大小约为5.5μm。进一步分离富含循环肿瘤细胞的溶液,得到分离效率为95.8%。对膜的亲水性进行接触角测试,测得的接触角为62.6°。
实施例4
一种循环肿瘤细胞分离膜,具体操作步骤如下:
1)称取适量甘草酸加入100ml去离子水中,配制得到离子浓度为8mg/ml的甘草酸溶液,在80℃烘箱中溶解至澄清后加入戊二醛混合均匀,配制的浓度为8mg/ml,最后在搅拌的条件下向混合溶液中加入聚丙烯酰胺,浓度为0.8mg/ml。
2)在清洗后的孔径为8μm的网格状尼龙支撑体上进行抽滤,铸膜液滴落完成后继续抽滤1min后停止抽滤操作,抽滤结束后,在40℃下烘干2小时,得到分离膜。
通过扫描电镜表征发现所制备的分离膜孔径大小约为5.1μm。进一步分离富含循环肿瘤细胞的溶液,得到分离效率为96.3%。对膜的亲水性进行接触角测试,测得的接触角为64.5°。
对比例1
铸膜液中未加入交联剂。
本对比例具体操作步骤如下:
1)取一定量甘草酸加入100ml去离子水中,配制得到浓度为8mg/ml的甘草酸溶液,放入温度为80℃的烘箱中溶解至澄清后,以500转的转速用磁力搅拌器在边搅拌的条件下边加入聚丙烯酰胺,使得溶液中的聚丙烯酰胺浓度为0. 8mg/ml。
2)在清洗后的孔径为8μm的网格状尼龙支撑体上进行抽滤,铸膜液滴落完成后继续抽滤1min后停止抽滤操作,抽滤结束后,在40℃下烘干2小时,得到分离膜。
本实施例为对比例,铸膜液中未加入交联剂。通过纯水通量测试发现:本实施例所得的循环肿瘤细胞分离膜的分离层在抽水过程中便完全溶解,不可完成分离循环肿瘤细胞过程。
对比例2
铸膜液中未加入甘草酸。
具体操作步骤如下:
1)取一定量戊二醛加入100ml去离子水中,配制浓度为8mg/ml的戊二醛溶液,在80℃烘箱中溶解至澄清后,在搅拌的条件下加入聚丙烯酰胺,使得溶液中聚丙烯酰胺浓度为0.8mg/ml。
2)在清洗后的孔径为8μm的网格状尼龙支撑体上进行抽滤,铸膜液滴落完成后继续抽滤1min后停止抽滤操作,抽滤结束后,在40℃下烘干2小时,得到分离膜。
通过纯水通量测试以及冷场发射扫描电镜表征发现该分离膜部分溶解,结合宏观上该分离膜呈现颜色不均匀的状态,推测与铸膜液混合不均匀有关。
同时初步推测甘草酸的加入使得铸膜液更易混合均匀,戊二醛的加入可以通过交联作用改善亲水性物质甘草酸和聚丙烯酰胺的溶解性。
细胞分离验证性试验。
将实施例1-4中得到的分离膜进行循环肿瘤细胞分离试验和膜的性能验证试验。本验证试验采用如图1所示的抽滤装置进行,其具体结构包括培养容器1。本验证例中该容器为中空的圆柱体结构,也可以采用长方体结构,正方体结构或者多棱柱体。本实施例中该培养容器1的材质为亚克力材质,也可以采用其他的透明的生物相容性好的材料,利于细胞培养。在该培养容器1下方放置一收集容器3,便于收集过滤后的细胞培养液。培养容器1和收集容器3之间为膜片放置区2,用于放置所制备的分离膜,其结构可以根据膜的大小或者分离要求来设计,只要具有一定强度,能支撑膜,且能够使得分离液在压力差的作用下通过分离膜,实现真空抽滤装置抽滤后的分离操作即可。
A.循环肿瘤细胞分离试验
具体操作步骤:将所制备的分离膜放置在分离区2处,然后将荧光染色后的循环肿瘤细胞倒入培养容器1中,利用制备得到的分离膜对富含循环肿瘤细胞的溶液进行分离,用显微镜(20×)对分离前滴在载玻片上的溶液,以及分离后富含循环肿瘤细胞的分离膜拍照并观察计数。结果如表1所示。
表1实施例1-4制得的膜对循环肿瘤细胞分离率检测结果
B.分离膜稳定性试验
具体操作步骤:将制备的膜片剪取1cm×1cm的尺寸浸泡在水溶液中,一个月后,观察膜片是否溶解。浸泡后的膜表面很好地被润湿了,但不溶解,形态不改变。说明该分离膜具有良好的亲水性,且在水溶液中稳定性好,可以长期使用。
C.分离膜的亲水性试验
具体操作步骤为:将制备的分离膜剪取1cm×1cm的尺寸贴在玻璃板上,进行接触角测试。
结果如表2所示。
表2实施例1-4制得的分离膜接触角检测结果
结论:通过分析以上测试表征结果,可以得知本发明制得的循环肿瘤细胞分离膜亲水性好,而且分离膜难溶于水,具有较高的稳定性,同时对循环肿瘤细胞具有较高的分离效率。
D.实施例1制得的循环肿瘤细胞分离膜微观拍摄试验。
将实施例1中制得的循环肿瘤细胞分离膜进行电镜拍摄,如图2。从图2中可以看出膜孔径大小约为5.0μm,且分布均匀。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域,但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (8)
1.一种循环肿瘤细胞的分离方法,其特征在于,采用膜分离技术进行分离。
2.根据权利要求1所述循环肿瘤细胞的分离方法,其特征在于:含循环肿瘤细胞的细胞培养液在压力差作用下依据尺寸筛分原理被分离膜截留,实现循环肿瘤细胞的分离。
3.一种循环肿瘤细胞分离膜,其特征在于,使用多孔膜作为支撑体,甘草酸为分散剂,聚丙烯酰胺为膜材料,通过加入交联剂进行反应制得。
4.权利要求3所述循环肿瘤细胞分离膜的制备方法,其特征在于,制备步骤如下:
步骤1:铸膜液的配制
将甘草酸与去离子水混合后加热溶解至溶液澄清;加入交联剂并搅拌均匀;然后边搅拌边加入聚丙烯酰胺;继续加热至溶液完全混合均匀;
步骤2:基底支撑体的预处理
将大孔径多孔支撑体用去离子水和乙醇轮流超声处理若干次,去除支撑体上的残留杂质;
步骤3:在支撑体上抽滤制膜
在抽滤条件下,使铸膜液缓慢滴落,在支撑体上抽滤成膜,烘干,得到分离膜。
5.根据权利要求4所述循环肿瘤细胞分离膜的制备方法,其特征在于,步骤1铸膜液中的甘草酸浓度为0.02-20mg/ml,交联剂浓度为0.1-40mg/ml,聚丙烯酰胺浓度为0.001-16mg/ml。
6.根据权利要求4所述循环肿瘤细胞分离膜的制备方法,其特征在于,交联剂为戊二醛,正硅酸四乙酯,十六烷基硅氧烷中的任意一种。
7.根据权利要求4所述循环肿瘤细胞分离膜的制备方法,其特征在于,支撑体为陶瓷,PVDF,PTFE,PP,尼龙N66多孔支撑体中的任意一种,孔径为1-10μm。
8.根据权利要求4所述循环肿瘤细胞分离膜的制备方法,其特征在于,步骤3中烘干温度为40-65℃,烘干时间为1-4h。
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Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110152107A1 (en) * | 2005-04-29 | 2011-06-23 | University Of Rochester | Drug Screening Via Nanpore Silicon Filters |
CN102423644A (zh) * | 2011-08-15 | 2012-04-25 | 中科院广州化学有限公司 | 一种疏水多孔复合膜及其制备方法与应用 |
CN104168985A (zh) * | 2012-03-02 | 2014-11-26 | 沙特阿拉伯石油公司 | 用于将芳族化合物与非芳族化合物分离的促进输送膜 |
CN108404689A (zh) * | 2018-04-28 | 2018-08-17 | 青岛大学 | 一种氧化石墨烯/聚丙烯酰胺复合过滤薄膜及其制备与应用 |
CN108722206A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-02 | 同济大学 | 一种抗污染自清洁型GO/ZnO-PVDF薄膜及其制备方法 |
CN109701396A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-05-03 | 天津科技大学 | 一种滤除染料分子的纳米纤维晶滤膜的制备方法 |
CN110404418A (zh) * | 2019-08-05 | 2019-11-05 | 刘山明 | 一种抗菌超滤膜及其制备方法 |
CN111733072A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-10-02 | 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 | 一种循环肿瘤细胞筛选分离装置及方法和应用 |
-
2020
- 2020-10-29 CN CN202011182238.2A patent/CN112316751A/zh active Pending
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110152107A1 (en) * | 2005-04-29 | 2011-06-23 | University Of Rochester | Drug Screening Via Nanpore Silicon Filters |
CN102423644A (zh) * | 2011-08-15 | 2012-04-25 | 中科院广州化学有限公司 | 一种疏水多孔复合膜及其制备方法与应用 |
CN104168985A (zh) * | 2012-03-02 | 2014-11-26 | 沙特阿拉伯石油公司 | 用于将芳族化合物与非芳族化合物分离的促进输送膜 |
CN108404689A (zh) * | 2018-04-28 | 2018-08-17 | 青岛大学 | 一种氧化石墨烯/聚丙烯酰胺复合过滤薄膜及其制备与应用 |
CN108722206A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-02 | 同济大学 | 一种抗污染自清洁型GO/ZnO-PVDF薄膜及其制备方法 |
CN109701396A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-05-03 | 天津科技大学 | 一种滤除染料分子的纳米纤维晶滤膜的制备方法 |
CN110404418A (zh) * | 2019-08-05 | 2019-11-05 | 刘山明 | 一种抗菌超滤膜及其制备方法 |
CN111733072A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-10-02 | 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 | 一种循环肿瘤细胞筛选分离装置及方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
胡良硕等: "膜滤过分离肿瘤细胞技术简介", 《现代肿瘤医学》 * |
闫宁等: "循环肿瘤细胞分离液路控制系统分析优化", 《传感器与微系统》 * |
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