CN115232790B - 花粉微粒、制备方法和使用其的生物功能材料及用途 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种花粉微粒的制造方法，该方法包括：步骤1：对花粉进行脱脂：将花粉与蛋白变性剂(不包括酸和碱)混合，然后进行清洗以除去花粉颗粒中所含的蛋白质和脂质；步骤2：对脱脂后的花粉进行磺酸化处理；步骤3：清洗上述步骤2)所得的花粉，干燥。基于由本发明方法得到的花粉所制备的生物功能材料，在保证对肿瘤细胞较高的捕获率的前提下，提高了处理效率，极大的缩短了花粉处理的时间，可以满足实验室、医疗机构等对CTCs的捕获和检测需求，尤其是可以高效捕获生物样本中的CTCs，不受生物样本中其他细胞干扰。

Description

花粉微粒、制备方法和使用其的生物功能材料及用途
技术领域
本发明涉及一种生物检测领域的生物功能材料及其制造方法，尤其涉及用于捕获生物体中存在的循环肿瘤细胞的生物功能材料及其制造方法和用途。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTCs，circulating tumor cell)是指从原发或继发肿瘤脱落进入外周血循环系统的肿瘤细胞。由于CTCs具备转移和侵袭能力，因此可以被转运到远端组织，从血管中或淋巴系统中再渗出，适应新的微环境，最终形成新的转移灶。这些由于诊疗操作或机体自发导致的进入外周血循环系统的CTCs的数目，可以间接反映体内的肿瘤状态，在肿瘤早期筛查、辅助分期、个性化用药、预后评估及复发转移预警等过程中具有重要指导意义。
但血液中CTCs的含量极低，因此对CTCs的捕获和检测技术的特异性和灵敏度有很高的要求。以往，CTCs的主要分离方法主要有物理法和免疫化学技术两种：物理法，即利用CTCs与血液中正常细胞的尺寸、密度等差异，采用差相分离富集技术(阴性富集法)和差异化分选技术(微孔过滤法和微流控芯片)对CTCs进行富集和捕获；免疫化学技术，即基于抗原-抗体相互作用的原理，对相应抗原进行定位和定向，代表性应用为CellSearchTM。尽管这些方法都有一定的CTCs捕获效率，但也存在各种不足，如材料制备较为复杂、操作步骤繁琐、捕获率不高或富集时间较长等。
最新研究表明，可以利用细胞的生物学行为对CTCs进行捕获与分离。其原理是：CTCs与具有特定微纳结构的表面接触后，会伸出伪足产生黏附行为，从而增强细胞和材料表面的相互作用，进而被捕获。具有均匀碳骨架的花粉由于其大孔容量、高表面积和独特的三维网络结构而被应用于各种领域。
专利文献1(CN201910608647.5)公开了一种制备中空植物花粉的方法，将花粉在甲醇和水的混合溶液中浸泡1～3小时后，在高温氮气氛围(200～500℃)下煅烧2～4小时，得到中空碳骨架花粉颗粒。该专利文献中的处理方法是在高温惰气直接碳化处理花粉，该方法得到的花粉孔径很较小，所制成的中空碳骨架颗粒结构单一，其仅仅是为了负载Ag以成为微胶囊在具有芳香气味的同时还具有广谱抗菌性能。
专利文献2(CN201910284121.6)公开了一种利用花粉空壳制备方法，该花粉微粒的制备方法包括3步，首先用丙酮作为脱脂剂处理花粉颗粒，随后将脱脂花粉加入强碱溶液(NaOH)中，最后将碱处理的花粉加入浓硫酸中进行酸洗，经过乙醇清洗后烘干，得到具有特定结构的花粉微粒。该花粉微粒可用于CTCs的捕获，在不修饰抗体的情况下即可达到90％的捕获率。该专利文献的花粉空壳制备方法使用强酸或强碱对花粉进行前处理，然后使用浓硫酸磺酸化处理，这些花粉的处理条件苛刻，为了除去花粉结构中的蛋白质等，其处理时间极长，且花粉结构极易受损，此外，花粉的磺酸化程度不高导致体系内杂质过多，而且体系中使用的强酸或强碱对环境不友好。
发明内容
本发明要求保护一种花粉微粒的制造方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：对花粉进行脱脂：将花粉与蛋白变性剂(不包括酸和碱)混合，然后进行清洗以除去花粉颗粒中所含的蛋白质和脂质，
步骤2：对脱脂后的花粉进行磺酸化处理，
步骤3：清洗上述步骤2)所得的花粉，干燥。
2.根据权利要求1前述的花粉微粒的制造方法，其中，前述蛋白变性剂包括尿素、盐酸胍、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶、异硫氰酸胍、氯化钙、硫氰酸钾、十六烷基三甲基溴化铵、Triton。
3.根据上述1的花粉微粒的制造方法，其中，前述花粉为选自源自莲科、金粟兰科、八角科、菊科、十字花科、五味子科、山茶科中的一种或多种植物的花粉微粒。
4.根据上述1的花粉微粒的制造方法，其中，前述尿素溶液的浓度为1～10mol/L，优选为2～8mol/L，进一步优选为3～8mol/L，特别优选为4～8mol/L；所使用的盐酸胍溶液的浓度为1～10mol/L，优选为2～8mol/L，进一步优选为2～6mol/L，特别优选为3～6mol/L；所使用的SDS溶液的浓度为0.05～5(w/v，即0.5～50g/L)，进一步优选为0.05～1％(w/v，即0.5～10g/L)，特别优选为0.1～1％(w/v，即1～10g/L)。。
5.根据上述1的花粉微粒的制造方法，其中，前述步骤1中，在将花粉与蛋白变性剂混合的同时进行搅拌，搅拌时间为1～8小时。
6.根据上述1的花粉微粒的制造方法，其中，前述步骤2中，前述磺酸化处理使用磺酸化剂，前述磺酸化剂包括浓硫酸(包括发烟硫酸)、氯磺酸、三氧化硫、氨基磺酸、亚硫酸盐、硫酰氯、3-氯-2-羟基-1-丙烷磺酸、聚苯乙烯磺酸。
7.根据上述1的花粉微粒的制造方法，其中，前述步骤2中，在进行磺酸化处理的同时进行搅拌，搅拌时间为1～5小时。
8.一种花粉微粒，其是通过上述1～7任一项的制造方法制成的。
9.根据上述8的花粉微粒，其特征在于，该花粉微粒包括上表层、下表层、孔和支撑柱，在前述上表层和所述下表层上具有孔，前述上表层的孔径范围为50nm～800nm，前述上表层的孔间距范围为50nm～2000nm，前述支撑柱直径范围为50nm～500nm，前述支撑柱高度范围为100nm～1000nm。
10.一种生物功能材料，其中，该芯片包括基底和功能区，前述功能区包含上述8～9的花粉微粒。
11.一种将上述10的生物功能材料用于捕获与检测生物体中的循环肿瘤细胞(CTCs)的用途。
有益的效果
本发明的花粉微粒制备方法不使用强酸或强碱，对环境友好，在保证对肿瘤细胞较高的捕获率的前提下，提高了处理效率，极大的缩短了花粉处理的时间。且基于由本发明方法得到的花粉所制备的生物功能材料的捕获率高，可以满足实验室、医疗机构等对CTCs的捕获和检测需求，尤其是可以高效捕获生物样本中的CTCs，不受生物样本中其他细胞干扰。
附图说明
图1为未经处理的花粉微粒结构的扫描电镜照片。
图2为本发明实施例1中得到的花粉微粒结构的扫描电镜照片。
图3为本发明实施例4中得到的花粉微粒结构的扫描电镜照片。
图4为本发明实施例4中得到的花粉微粒的表层测剖面的扫描电镜照片。
图5为本发明对比例4中得到的花粉微粒结构的扫描电镜照片。
附图标记说明：
1:上表层；2:下表层；3:孔；4:支撑柱。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本发明的“蛋白变性剂”是指，使得蛋白质发生变性作用的试剂。该变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。例如，该试剂可以使得蛋白质的二级或三级结构发明改变，这种改变既可以是使得原有蛋白质的内容物发生确实，也可以是使得原有蛋白质的结构发明破坏，最终使得蛋白质的生物活性丧失，或者改变其理化性质。本发明的“蛋白变性剂”不包括强酸和强碱等。
本发明涉及一种花粉微粒的制造方法，对该方法包括的前述步骤进行说明：
以下对步骤1进行说明。
步骤1：对花粉进行脱脂：将花粉与蛋白变性剂混合，然后进行清洗以除去花粉颗粒中所含的蛋白质和脂质。具体地，
上述花粉的种类没有特别限制，只要能够通过脱脂和后处理产生本发明的花粉微粒即可。该花粉为选自源自莲科、金粟兰科、八角科、菊科、十字花科、五味子科、山茶科中的一种或多种植物的花粉微粒，作为具体的实施方式，本发明的花粉微粒选自菊花花粉、油菜花花粉、蒲公英花粉、莲花粉、茶花粉等，但不限于此，本领域技术人员会根据实际需要对具体花粉种类进行适当的选择。
上述蛋白变性剂并没有特别限制，只要能够使花粉中含有的蛋白的内部结构和性质发生改变即可，该蛋白变性剂例如尿素、盐酸胍、十二烷基硫酸钠(以下也称“SDS”)、蛋白酶、异硫氰酸胍、氯化钙、硫氰酸钾、十六烷基三甲基溴化铵、Triton，但并不限于这些。优选为选自尿素、盐酸胍和十二烷基硫酸钠中的一种。具体地，例如，作为蛋白变性剂可以仅使用尿素、盐酸胍或SDS，也可以使用选自尿素、盐酸胍、SDS中两种以上的混合物，但并不限于此。
上述蛋白变性剂的浓度没有特别限制，例如，所使用的尿素溶液的浓度为1～10mol/L，优选为2～8mol/L，进一步优选为3～8mol/L，特别优选为4～8mol/L；所使用的盐酸胍溶液的浓度为1～10mol/L，优选为2～8mol/L，进一步优选为2～6mol/L，特别优选为3～6mol/L；所使用的SDS溶液的浓度为0.05～5％，进一步优选为0.05～1％，特别优选为0.1～1％。
在将花粉与上述蛋白变性剂混合之后，优选进行进一步搅拌使其混合均匀，搅拌方式可以是磁力搅拌等任一种方式；搅拌时间没有特别限制，只要能使花粉与蛋白变性剂均匀混合即可，可以为1h～8h，进而可以为2h～8h，具体可以为1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h。
花粉颗粒中所含的蛋白质和脂质分布于花粉颗粒的外表层和内部，本发明中所谓的“除去”的蛋白质或脂质，是指既可以除去分布于花粉颗粒的外表层(上表层和下表层)的蛋白质或脂质，也可以指除去分布于花粉颗粒内部的蛋白质或脂质，为了实现本发明的目标花粉颗粒，首先要除去分布于花粉颗粒的外表层(上表层和下表层)的蛋白质或脂质，当然在实际工艺中也不排除同时除去了分布于花粉颗粒内部的蛋白质或脂质。
在将花粉与蛋白变性剂充分混合之后，对花粉进行回收，并且为了进一步去除蛋白变性剂和脂质等杂质，需要进一步对回收的花粉进行清洗。
作为清洗上述花粉的有机溶剂，没有特别限制，只要能够溶解并除去花粉中剩余的杂质即可，可以使用乙醇、丙酮、三氯化碳、N,N-2甲基甲酰胺、辛烷、乙酸乙酯、甲醇，优选为乙醇。
作为一种实施方式，将花粉颗粒分散于尿素溶液中，磁力搅拌，将花粉颗粒滤出以回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除尿素。最后用乙醇继续清洗花粉，去除花粉颗粒中的脂质。
为了更好地除去花粉中的脂质等，可以对初始原料花粉进行前处理，作为该前处理方式，例如，先将花粉均匀分散在水溶液中，然后将溶液进行加热。为了使该花粉更均匀分散在水溶液中，可以通过搅拌器等搅拌装置进行搅拌，还可以通过超声波等处理方式来进行；前述加热的温度并没有特别限定，作为一个优选的方式，可以将花粉溶液煮沸。
作为一种实施方式，将花粉分散在水溶液中，然后进行超声波处理，将超声处理后的花粉溶液加热直至煮沸。
以下对步骤2和步骤3进行进一步说明。
步骤2：对脱脂后的花粉进行磺酸化处理；步骤3：清洗上述步骤2)所得的花粉，干燥。具体地，
上述磺酸化处理可以使用磺酸化剂，该磺酸化剂的种类没有特别限制，具体可列举例如，浓硫酸(包括发烟硫酸)、氯磺酸、三氧化硫、氨基磺酸、亚硫酸盐、硫酰氯、3-氯-2-羟基-1-丙烷磺酸、聚苯乙烯磺酸等，但不限于此，只要能够将氢原子/羟基被磺酸基取代，或在原本材料表面使用高分子引入磺酸基即可。优选边进行处理边搅拌，使得花粉充分磺化。搅拌优选为磁力搅拌，对于搅拌的时间没有特别限制，优选为1-5h，例如为1h、2h、3h、4h、5h。该磺酸化处理的温度没有特别限定，可以在室温下进行，也可以提高处理的温度，例如在高于室温的条件下进行，具体地。处理温度提高至40～80℃，进一步优选为60～80℃，当温度提升时，可以更有利于磺酸化处理的进行，从而可以提高孔隙率，从而提升捕获率。
在进行上述磺酸化处理之后，对花粉进行清洗，并将该花粉颗粒滤出，得到目标的花粉颗粒。对该目标的花粉颗粒进行干燥，干燥的条件没有特别限制，在不有损花粉颗粒结构的范围内可以进行控制，可以采取冷冻干燥、减压干燥、自然风干、高温干燥等。高温干燥时该温度范围可以为60～120℃，进一步优选100～120℃，进而优选为105～120℃。
作为一种实施方式，将经过蛋白变性剂处理后的花粉颗粒分散于浓硫酸中，磁力搅拌，得到花粉溶液。通过用纯化水反复清洗目标花粉直至中性，用砂芯漏斗将目标花粉颗粒滤出，得到经碳化的花粉颗粒，然后在高温下进行烘干，得到终产物。
本发明还提供了一种花粉微粒，该花粉微粒是通过如上述的制造方法制成的。
本发明使用蛋白变性剂对花粉进行处理，与以往的处理剂(强碱、有机溶剂等)相比，在保证了高捕获率的前提下，大大节省了处理时间，其机理尚未明确，但发明人认为可能是如下原因：花粉的空间结构极为复杂，在花粉的外表层结构以及内部结构中存在大量蛋白质和脂质，为了得到目标的花粉结构，从而捕获更多的肿瘤细胞，需要尽量将这些蛋白质和脂质除去又不能破坏天然花粉原有的骨架结构，所以除去这些物质是极为困难的，尽管除去这些蛋白质和脂质的物质可能会有很多。在整个处理工序当中，首先需要打开花粉外表层孔隙。理论上讲，更剧烈的处理条件应该导致更高的处理效率(即蛋白被溶解，从花粉壳脱落)，也就是说，强碱性溶液(例如NaOH溶液)或许导致蛋白加速变性，在蛋白溶液中可能会如此。但在本发明中，花粉蛋白附着在花粉壳上，其具有一定的空间结构和相互作用。强碱性溶液对蛋白的作用是首先破坏其空间结构，然后破坏其肽键，使之碎裂成寡肽或氨基酸，随之从花粉壳上脱落。而蛋白变性剂则是破坏蛋白质的氢键，使其失去空间结构，直接变成多肽链的一级结构，依靠蛋白本身的极性溶解在水中，直接从花粉壳上脱落。因此，本发明的蛋白变性剂在此场景下的应用反而提高了处理效率，极大缩短了处理时间。
在显微镜下观察所得花粉的结构，通过扫描电镜照片可以清晰地看到在花粉微粒表层分布有若干孔。进而选取其中少量花粉微粒样品，将该花粉微粒样品在扫描电子显微镜下放大4万倍拍照，随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，该微粒具备如下参数：微粒直径、上表层的孔径、上表层的孔间距、支撑柱直径、支撑柱高度。例如如说明书附图4所示，1为颗粒的上表层，2为颗粒的下表层，3为颗粒表层中存在的孔，4为支撑上表层与下表层并位于上表层与下表层之间的支撑柱。
图1为未经处理的花粉(天然菊花花粉)微粒结构的扫描电镜照片，从图1可以看出，未经本发明的制造方法处理的花粉，颗粒外表呈现多个凸起状，在表层几乎看不到孔，这是菊花花粉微粒的天然结构。
本发明的制造方法得到的花粉微粒，微粒直径范围为10-50μm；上表层的孔径范围为50nm～800nm，上表层的孔间距范围为50nm～2000nm，支撑柱直径范围为50nm～500nm，支撑柱高度范围为100nm～1000nm。
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率为40％～70％，优选为45％～65％。
其中，上述孔隙率的计算方式如下：
孔隙率＝(x/N)×100％(式1)
其中，x代表孔面积；N代表视野面积。
本发明还提供一种生物功能材料，该生物功能材料的样式并没有特别限定，可以例如芯片、吸附柱、微球、磁珠等，作为具体的一种实施方式，该生物功能材料可以是一种芯片，其用于捕获癌细胞(可以是CTCs)，该芯片包括基底和功能区，该功能区包含通过本发明的方法制备的花粉微粒。该基底的材质包括但不限于硅片、金属、高分子材料等，通过将包含本发明的花粉微粒的功能区与基底结合，从而可以用于捕获或检测例如CTCs。对于该结合的具体方式没有特别限定，可以列举例如将花粉微粒喷涂、粘附或滴加等方式与基底结合，但不限于此。
本发明进而提供一种将本发明的生物功能材料用于捕获与检测生物材料中的循环肿瘤细胞的用途。作为生物材料并没有任何限制，例如包括但不限于血液、尿液、淋巴液、脑脊液、胸水、腹水等。通过所捕获或检测到CTCs的数目，可以帮助判断病情病程、辅助诊断、提供用药指导等。
实施例
实施例1
本实施例选用的花粉微粒为天然菊花花粉，以购买于中科院细胞库的人乳腺癌细胞(MCF-7)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系做进一步的阐述和验证，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
将50g花粉分散于400mL水中，超声5min(300W,40kHz)，一边搅拌，一边用单层医用纱布滤出滤渣，并将滤渣再次用100mL水过滤，获得花粉颗粒溶液。
然后将上述花粉溶液煮沸30min，冷却后吸去溶液上层浮沫，再用砂芯漏斗将花粉颗粒滤出，得到花粉颗粒。
将上述花粉颗粒分散于100mL 2mol/L尿素溶液中，磁力搅拌4h。再用砂芯漏斗将花粉颗粒滤出，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除尿素。最后用乙醇继续清洗花粉，去除花粉颗粒中的脂质。
将上述尿素处理后的脱脂花粉颗粒分散于50mL浓硫酸中，磁力搅拌5h，得到花粉溶液。用纯化水反复清洗所得花粉至中性，用砂芯漏斗将目标花粉颗粒滤出，得到目标花粉颗粒。
105℃高温烘干，回收。
2.目标花粉结构表征
附图2为实施例1得到的目标花粉结构的扫描电镜照片，可以清晰地看到在所得花粉微粒表层分布若干孔。选取少量上述目标花粉微粒，将该样品在扫描电子显微镜下放大4万倍拍照，随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，得到该微粒参数如下：
微粒直径：19-25μm，平均值22μm(该平均值为加权平均值，以下也同样)
上表层的孔径范围：160-320nm，平均值：218nm
上表层的孔间距范围：149-1956nm，平均值：1256nm
支撑柱直径范围：96-207nm，平均值：158nm
支撑柱高度范围：435-683nm，平均值：574nm
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率为41％。
其中，上述孔隙率的计算方式如下：
孔隙率＝(x/N)×100％(式1)
其中，x代表孔面积；N代表视野面积。
3.细胞捕获实验
首先，将上述目标花粉微粒以喷涂法固载到硅片上制备捕获芯片。
然后，取MCF-7细胞悬液100μL，用细胞计数器计数并计算其浓度。吸取一定量的上述细胞悬液，用DMEM细胞培养基稀释至1×105个细胞/mL。
将上述捕获芯片放入细胞培养板中，然后将稀释后的细胞悬液1mL滴加在捕获芯片表面，置于细胞培养箱中孵育，捕获时间为60min。
捕获结束后，将捕获有癌细胞的芯片表面用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液固定捕获的癌细胞30min，并使用DAPI水溶液(10μg/mL)进行染色30min。
使用荧光显微镜拍照，随机选取20张不同视野下的荧光照片，用Image-J软件对捕获到的细胞进行计数，计算捕获率。
捕获率的计算方法如下：
捕获率＝[(x/Ax)/(N/A)]×100％(式2)
其中，x代表上述荧光照片中癌细胞的捕获数量；Ax代表上述荧光照片视野大小；因此x/Ax表示实际捕获的细胞密度；N代表细胞的总投放量(本实施例中为1×105个细胞/mL)；A代表芯片总面积(本实施例中为2cm2)；因此N/A表示投放细胞的密度。
通过式2计算捕获率，在本实施例中，目标花粉芯片对MCF-7的捕获率为73％。
实施例2
实施例2选用的花粉微粒和细胞模型与实施例1相同，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
除以下工序以外，该步骤中的其他工艺条件等与实施例1相同：
将上述花粉颗粒分散于100mL 3mol/L尿素溶液中，分别磁力搅拌4h、6h、8h、12h。之后将花粉-尿素溶液离心或抽滤，弃上清，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除尿素。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
2.目标花粉结构表征
结构表征过程如前所述与实施例1相同，得到该微粒参数如下表1：
表1花粉微粒结构在3M尿素及不同时长下的处理结果
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率分别为50％、55％、56％、56％。
3.细胞捕获实验
捕获实验条件如前所述与实施例1相同，并通过上述式2计算捕获率。分别在不同尿素溶液处理时长下(4h、6h、8h、12h)进行，其捕获结果分别为84％、88％、90％、91％。结果表明，在本实施例中，提高尿素浓度，并增加处理时长，可以得到孔隙率更大的目标花粉结构，目标花粉芯片对MCF-7的捕获率也有所提高。其中，当处理方法为3M尿素处理花粉6h以上时，花粉结构的孔隙率达到55％以上(分别为55％、56％、56％)，捕获芯片的捕获率达到88％以上(分别为88％、90％、91％)。
实施例3
实施例3选用的花粉微粒和细胞模型与实施例1相同，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
除以下工序以外，该步骤中的其他工艺条件等与实施例1相同：
将上述花粉颗粒分散于100mL 4mol/L尿素溶液中，磁力搅拌4h。之后将花粉-尿素溶液离心或抽滤，弃上清，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除尿素。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
2.目标花粉结构表征
结构表征过程如前所述与实施例1相同，得到该微粒参数如下：
微粒直径：22μm
上表层的孔径范围：140-325nm，平均值：216nm
上表层的孔间距范围：197-658nm，平均值：316nm
支撑柱直径范围：124-195nm，平均值：204nm
支撑柱高度范围：499-814nm，平均值：547nm
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率为55％。
3.细胞捕获实验
捕获实验条件如前所述与实施例1相同，并通过上述式2计算捕获率。在本实施例中，目标花粉芯片对MCF-7的捕获率为91％。结果表明，当尿素浓度进一步提升至4mol/L，处理后的花粉孔径更大，上表层的孔间距范围进一步缩小，孔分布更均匀。
实施例4
实施例4选用的花粉微粒和细胞模型与实施例1相同，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
除以下工序以外，该步骤中的其他工艺条件等与实施例1相同：
将上述花粉颗粒分散于100mL 6mol/L尿素溶液中，磁力搅拌4h。之后将花粉-尿素溶液离心或抽滤，弃上清，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除尿素。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
2.目标花粉结构表征
结构表征过程如前所述与实施例1相同，附图3为实施例4所得的花粉结构电镜图，附图4为实施例4所得花粉表层侧剖面的电镜图，从附图3和附图4可以清晰观察到所得花粉上表层的孔与双层结构，该双层结构包括上表层和下表层，以及连接该上表层与下表层并起到支撑作用的支撑柱，该上表层具有多个孔。得到该微粒参数如下：
微粒直径：22μm
上表层的孔径范围：138-296nm，平均值：205nm
上表层的孔间距范围：189-700nm，平均值：234nm
支撑柱直径范围：137-236nm，平均值：205nm
支撑柱高度范围：356-705nm，平均值：538nm
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率为55％。
3.细胞捕获实验
捕获实验条件如前所述与实施例1相同，并通过上述式2计算捕获率。在本实施例中，目标花粉芯片对MCF-7的捕获率为90％。结果表明，当尿素浓度进一步提升至6mol/L，处理后的花粉孔径更大，孔分布更均匀。
实施例5
实施例5选用的花粉微粒和细胞模型与实施例1相同，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
除以下工序以外，该步骤中的其他工艺条件等与实施例1相同：
将上述花粉颗粒分散于100mL 8mol/L尿素溶液中，磁力搅拌4h。之后将花粉-尿素溶液离心或抽滤，弃上清，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除尿素。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
将上述尿素处理后的脱脂花粉颗粒分散于50mL浓硫酸中，反应条件分别为室温搅拌5h、室温搅拌4h、室温搅拌3h、室温搅拌2h、60℃搅拌2h、60℃搅拌1h，得到花粉溶液。用纯化水反复清洗所得花粉至中性，用砂芯漏斗将目标花粉颗粒滤出，得到目标花粉颗粒。
2.目标花粉结构表征
结构表征过程如前所述与实施例1相同，得到该微粒参数如下表2：
表2花粉微粒结构在不同时间和温度的浓硫酸条件下的处理结果
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率分别为57％、56％、55％、46％、55％、50％。
3.细胞捕获实验
捕获实验条件如前所述与实施例1相同，并通过上述式2计算捕获率。在本实施例中，不同条件下处理的目标花粉芯片对MCF-7的捕获率为92％、92％、90％、80％、89％、88％。当尿素浓度进一步提升至8mol/L，与实施例3、4相比，孔隙率和捕获效率大致相当。而改变浓硫酸处理条件时，室温下处理5h、4h、3h时，花粉孔隙率为55％以上，捕获率也能保持在90％以上；当室温处理2h时，花粉孔隙率下降(为46％)，捕获率下降(为80％)；提高浓硫酸处理的温度，即60℃处理2h时，花粉孔隙率为55％，捕获率为89％，此时该方案处理时间最短，仅为6.5h。
实施例6
实施例6选用的花粉微粒和细胞模型与实施例1相同，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
除以下工序以外，该步骤中的其他工艺条件等与实施例1相同：
将上述花粉颗粒分散于100mL 1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L盐酸胍溶液中，磁力搅拌4h。之后将花粉-盐酸胍溶液离心或抽滤，弃上清，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除盐酸胍。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
2.目标花粉结构表征
结构表征过程如前所述与实施例1相同，得到该微粒参数如下表1：
表3花粉微粒结构在不同浓度盐酸胍的处理结果
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率分别为37％、40％、45％、51％、53％、52％。
3.细胞捕获实验
捕获实验条件如前所述与实施例1相同，分别并通过上述式2计算捕获率。在不同盐酸胍浓度下(1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L)，其捕获结果分别为65％、80％、89％、91％、91％、91％。结果表明，使用盐酸胍处理花粉，也能得到和尿素处理花粉相同的结果，随着盐酸胍浓度增加，花粉上表层孔径增大、孔隙率增加，芯片的捕获效率也随之提升。当盐酸胍浓度增加到3mol/L以上时，芯片捕获效率大幅提升，且处理时间大大缩短。
实施例7
实施例7选用的花粉微粒和细胞模型与实施例1相同，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
除以下工序以外，该步骤中的其他工艺条件等与实施例1相同：
将上述花粉颗粒分散于100mL 2mol/L盐酸胍溶液中，磁力搅拌6h、8h、12h。之后将花粉-盐酸胍溶液离心或抽滤，弃上清，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除盐酸胍。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
2.目标花粉结构表征
结构表征过程如前所述与实施例1相同，得到该微粒参数如表4：
表4花粉微粒结构在2M浓度盐酸胍的不同时长的处理结果
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率分别为45％、53％、54％。
3.细胞捕获实验
捕获实验条件如前所述与实施例1相同，并通过上述式2计算捕获率。在2M浓度盐酸胍的不同时长的处理下(6h、8h、12h)，其捕获结果分别为87％、91％、91％。在本实施例中，增加盐酸胍的处理时长，可以得到孔隙率更大的目标花粉结构，目标花粉芯片对MCF-7的捕获率也有所提高。其中，当处理方法为2M盐酸胍处理花粉8h以上时，花粉结构的孔隙率达到53％以上，捕获芯片的捕获率达到91％，且处理时间大大缩减。
实施例8
实施例8选用的花粉微粒和细胞模型与实施例1相同，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
除以下工序以外，该步骤中的其他工艺条件等与实施例1相同：
将上述花粉颗粒分散于100mL 6mol/L盐酸胍溶液中，磁力搅拌4h。之后将花粉-盐酸胍溶液离心或抽滤，弃上清，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除盐酸胍。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
将上述盐酸胍处理后的脱脂花粉颗粒分散于50mL浓硫酸中，反应条件分别为室温搅拌4h、室温搅拌3h、室温搅拌2h、60℃搅拌2h、60℃搅拌1h，得到花粉溶液。用纯化水反复清洗所得花粉至中性，用砂芯漏斗将目标花粉颗粒滤出，得到目标花粉颗粒。
2.目标花粉结构表征
结构表征过程如前所述与实施例1相同，得到该微粒参数如表5：
表5花粉微粒结构在浓硫酸不同条件下的处理结果
表5花粉微粒结构在浓硫酸不同条件下的处理结果
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率为54％、52％、44％、55％、51％。
3.细胞捕获实验
捕获实验条件如前所述与实施例1相同，并通过上述式2计算捕获率。在本实施例中，不同条件下处理的目标花粉芯片对MCF-7的捕获率为92％、90％、82％、90％、88％。在使用最高盐酸胍浓度(6mol/L)条件下，改变浓硫酸处理条件时，室温下处理4h、3h时，花粉孔隙率为52％以上(分别为54％、52％)，捕获率也能保持在90％以上；当室温处理2h时，花粉孔隙率下降(为44％)，捕获率下降(为82％)；当提高浓硫酸处理的温度，即60℃处理2h时，花粉孔隙率为55％，捕获率达到90％，此时该方案处理时间最短，仅为8.5h。
实施例9
实施例9选用的花粉微粒和细胞模型与实施例1相同，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
除以下工序以外，该步骤中的其他工艺条件等与实施例1相同：
将上述花粉颗粒分散于100mL SDS溶液(0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、1％)中，磁力搅拌4h。之后将花粉-盐酸胍溶液离心或抽滤，弃上清，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除盐酸胍。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
2.目标花粉结构表征
结构表征过程如前所述与实施例1相同，得到该微粒参数如表6：
表6花粉微粒结构在不同浓度盐酸胍的处理结果
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率分别为36％、39％、48％、52％、53％、53％。
3.细胞捕获实验
捕获实验条件如前所述与实施例1相同，并通过上述式2计算捕获率。在不同SDS浓度(0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、1％)处理后，其捕获结果分别为60％、62％、84％、91％、91％、92％。使用SDS处理花粉，也能得到和尿素与盐酸胍处理花粉相同的结果，随着SDS浓度增加，花粉上表层孔径增大、孔隙率增加，芯片的捕获效率也随之提升。当SDS浓度增加到0.1％以上时，芯片捕获效率与现有技术(对比例1)相比，大致相当并略有提升，且处理时间大大缩短。
实施例10
实施例10选用的花粉微粒和细胞模型与实施例1相同，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
除以下工序以外，该步骤中的其他工艺条件等与实施例1相同：
将上述花粉颗粒分散于100mL SDS溶液(0.05％)中，磁力搅拌6h、8h、12h。之后将花粉-盐酸胍溶液离心或抽滤，弃上清，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除盐酸胍。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
2.目标花粉结构表征
结构表征过程如前所述与实施例1相同，得到该微粒参数如表7：
表7花粉微粒结构在浓度为0.05％的SDS溶液中不同时长的处理结果
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率分别为49％、52％、53％。
3.细胞捕获实验
捕获实验条件如前所述与实施例1相同，并通过上述式2计算捕获率。在SDS浓度为0.05％处理不同时长(6h、8h、12h)后，其捕获结果分别为88％、91％、91％。在本实施例中，增加SDS的处理时长，可以得到孔隙率更大的目标花粉结构，目标花粉芯片对MCF-7的捕获率也有所提高。其中，当处理方法为SDS浓度0.05％、处理花粉8h以上时，花粉结构的孔隙率达到52％以上(分别为52％、53％)，捕获芯片的捕获率分别达到91％，与对比例1的捕获率相当甚至略优，但实验时间大大缩减，缩减了7倍以上。
实施例11
实施例11选用的花粉微粒和细胞模型与实施例1相同，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
除以下工序以外，该步骤中的其他工艺条件等与实施例1相同：
将上述花粉颗粒分散于100mL SDS溶液(1％)中，磁力搅拌4h。之后将花粉-盐酸胍溶液离心或抽滤，弃上清，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除盐酸胍。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
将上述盐酸胍处理后的脱脂花粉颗粒分散于50mL浓硫酸中，反应条件分别为室温搅拌4h、室温搅拌3h、室温搅拌2h、60℃搅拌2h、60℃搅拌1h，得到花粉溶液。用纯化水反复清洗所得花粉至中性，用砂芯漏斗将目标花粉颗粒滤出，得到目标花粉颗粒。
2.目标花粉结构表征
结构表征过程如前所述与实施例1相同，得到该微粒参数如表8：
表8花粉微粒结构在浓硫酸不同条件下的处理结果
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率为55％、52％、48％、54％、50％。
3.细胞捕获实验
捕获实验条件如前所述与实施例1相同，并通过上述式2计算捕获率。在本实施例中，不同条件下处理的目标花粉芯片对MCF-7的捕获率为90％、90％、79％、92％、89％。在使用最高SDS浓度(1％)条件下，改变浓硫酸处理条件时，室温下处理4h、3h时，花粉孔隙率为52％以上(分别为55％、52％)，捕获率也能保持在90％以上；当室温处理2h时，花粉孔隙率下降(为48％)，捕获率下降(为79％)；当提高浓硫酸处理的温度，即60℃处理2h时，花粉孔隙率为54％，捕获率也提高至92％，此时该方案处理时间最短，仅为8.5h；但进一步降低处理时间为1h时，花粉孔隙率和捕获率略有下降，但仍能满足实际需求。
对比例1
本实施例选用的花粉微粒为天然菊花花粉，以购买于中科院细胞库的人乳腺癌细胞(MCF-7)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系做进一步的阐述和验证，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
将50g花粉微粒加入1L丙酮中，搅拌24h，过滤后得到脱脂花粉。
将上述脱脂花粉加入到1L NaOH(10％)溶液中，搅拌12h，过滤并清洗花粉，烘干花粉。
将烘干后的上述花粉加入浓硫酸(70％)中，搅拌72h，过滤并用去离子水清洗花粉3遍，再用乙醇清洗花粉3遍，常温条件下真空烘干花粉。
2.目标花粉结构表征
得到花粉微粒结构参数如下：
上表层孔径范围：55-436nm平均值：118nm
上表层的孔间距范围：75-290nm平均值：190nm
支撑柱直径范围：110-235nm平均值：189nm
支撑柱高度范围：425-718nm平均值：545nm
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率分别为49％。
3.细胞捕获实验
分别将上述目标花粉微粒制成捕获芯片，细胞捕获实验过程与前述实施例相同，并使用上述式2计算捕获率。在该方法处理后的花粉芯片其捕获结果为90％，但该对比例的总计处理时间极长，为108h。
对比例2
本实施例选用的花粉微粒为天然菊花花粉，以购买于中科院细胞库的人乳腺癌细胞(MCF-7)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系做进一步的阐述和验证，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
将50g花粉分散于400mL水中，超声5min(300W,40kHz)，一边搅拌，一边用单层医用纱布滤出滤渣，并将滤渣再次用100mL水过滤，获得花粉颗粒溶液。
然后将上述花粉溶液煮沸30min，冷却后吸去溶液上层浮沫，再用砂芯漏斗将花粉颗粒滤出，得到花粉颗粒。
用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
将上述处理后的脱脂花粉颗粒分散于50mL浓硫酸中，反应条件为室温搅拌5h、72h、96h，得到花粉溶液。用纯化水反复清洗所得花粉至中性，用砂芯漏斗将目标花粉颗粒滤出，得到目标花粉颗粒。
105℃高温烘干，回收。
2.目标花粉结构表征
各选取少量上述目标花粉微粒，将该样品在扫描电子显微镜下放大4万倍拍照，随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，得到参数分别为：
(1)浓硫酸处理5h的花粉微粒
上表层孔径范围：50-378nm平均值：87nm
上表层的孔间距范围：192-2603nm平均值：1576nm
支撑柱直径范围：106-182nm平均值：175nm
支撑柱高度范围：372-662nm平均值：478nm
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率为35％。
(2)浓硫酸处理72h的花粉微粒
上表层孔径范围：55-388nm平均值：102nm
上表层的孔间距范围：192-1195nm平均值：976nm
支撑柱直径范围：119-203nm平均值：175nm
支撑柱高度范围：388-656nm平均值：516nm
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率为38％。
(3)浓硫酸处理96h的花粉微粒
破碎，无法保持完整花粉结构。
3.细胞捕获实验
分别将上述目标花粉微粒制成捕获芯片，细胞捕获实验过程如前所述，并使用上述式2计算捕获率。在该方法处理后的花粉芯片其捕获结果分别为65％和72％。该方法未使用如本发明的蛋白变性剂处理花粉，而是直接使用浓硫酸处理花粉，所得花粉的孔隙率低且捕获率低。尽管试图将浓硫酸处理时间从5h提升至72h，其孔隙率仍低于40％，所得芯片的捕获率也低，远低于如本发明的经蛋白变性剂处理后的花粉。此外，如果处理时间过长(96h)，不仅无助于提高对MCF-7的捕获率，还会导致花粉完整结构被破坏，变成碎片。
对比例3
本实施例选用的花粉微粒为天然菊花花粉，以购买于中科院细胞库的人乳腺癌细胞(MCF-7)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系做进一步的阐述和验证，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
将50g花粉分散于400mL水中，超声5min(300W,40kHz)，一边搅拌，一边用单层医用纱布滤出滤渣，并将滤渣再次用100mL水过滤，获得花粉颗粒溶液。
然后将上述花粉溶液煮沸30min，冷却后吸去溶液上层浮沫，再用砂芯漏斗将花粉颗粒滤出，得到花粉颗粒。
将上述花粉颗粒分散于100mL 8mol/L尿素溶液中，磁力搅拌4h。之后将花粉-尿素溶液离心或抽滤，弃上清，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除尿素。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
将上述尿素处理后的脱脂花粉在70℃下烘干12h，然后在300℃下在马弗炉中空气环境下加热6h(升温速率10℃/min)，接着，将加热后的微粒在700℃管式炉中加热2h，然后在氩气七分钟升温(升温速率10℃/min)，得到目标花粉颗粒。
回收花粉颗粒。
2.目标花粉结构表征
各选取少量上述目标花粉微粒，将该样品在扫描电子显微镜下放大4万倍拍照，随机选取20张不同视野下的照片，可以看到表面孔径较小、孔隙率低，几乎观察不到双层结构。通过nanomeasure软件进行测量，得到的参数如下：
上表层孔径范围：60-422nm平均值：120nm
上表层的孔间距范围：192-2623nm平均值：1666nm
通过Image-J软件计算该目标花粉微粒的孔隙率为30％。
3.细胞捕获实验
分别将上述目标花粉微粒制成捕获芯片，细胞捕获实验过程与前述实施例相同，并使用上述式2计算捕获率。使用上述方法处理后的花粉，其所制备的芯片对癌细胞的捕获率为58％。该对比例尽管使用尿素去除花粉表面蛋白，但之后采用高温碳化的方法代替浓硫酸处理法对花粉进行处理，得到的花粉孔径较小，孔隙率低，且无法获得花粉颗粒外壳的双层结构，捕获率极低。
对比例4
本实施例选用的花粉微粒为天然菊花花粉，以购买于中科院细胞库的人乳腺癌细胞(MCF-7)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系做进一步的阐述和验证，包括以下步骤：
1.制备用于捕获CTCs的目标花粉微粒
将50g花粉分散于400mL水中，超声5min(300W,40kHz)，一边搅拌，一边用单层医用纱布滤出滤渣，并将滤渣再次用100mL水过滤，获得花粉颗粒溶液。
然后将上述花粉溶液煮沸30min，冷却后吸去溶液上层浮沫，再用砂芯漏斗将花粉颗粒滤出，得到花粉颗粒。
将上述花粉颗粒分散于100mL 8mol/L尿素溶液、6mol/L盐酸胍溶液、1％浓度的SDS溶液中，磁力搅拌4h。再用砂芯漏斗将花粉颗粒滤出，回收花粉，并用大量水洗涤花粉颗粒，以去除尿素。最后用乙醇继续清洗花粉，以去除花粉颗粒中的脂质。
将上述尿素处理后的脱脂花粉颗粒分散于50mL正磷酸(85％)中，磁力搅拌5h，得到花粉溶液。用纯化水反复清洗花粉至中性，用砂芯漏斗将花粉颗粒滤出，得到花粉颗粒。
105℃高温烘干，回收。
2.目标花粉结构表征
各选取少量上述花粉微粒，将该样品在扫描电子显微镜下放大4万倍拍照，随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，得到参数为：
(1)尿素处理
上表层孔径范围：52-431nm 平均值：110nm
上表层的孔间距范围：89-2603nm 平均值：1331nm
支撑柱直径范围：119-243nm 平均值：195nm
支撑柱高度范围：421-725nm 平均值：526nm
(2)盐酸胍处理
上表层孔径范围：50-438nm 平均值：107nm
上表层的孔间距范围：92-2006nm 平均值：1257nm
支撑柱直径范围：108-223nm 平均值：186nm
支撑柱高度范围：399-665nm 平均值：506nm
(3)SDS处理
上表层孔径范围：66-398nm 平均值：99nm
上表层的孔间距范围：88-1995nm 平均值：1066nm
支撑柱直径范围：119-235nm 平均值：189nm
支撑柱高度范围：421-725nm 平均值：536nm
通过Image-J软件计算该花粉微粒的孔隙率分别为42％、45％、46％。附图5为该对比例中经尿素和磷酸法处理的花粉结构的电镜图。
3.细胞捕获实验
分别将上述花粉微粒制成捕获芯片，细胞捕获实验过程与前述实施例相同，并使用上述式2计算捕获率。在该方法处理后的花粉芯片其捕获结果分别为62％、66％、68％。此对比例用正磷酸替换浓硫酸，得到的花粉结构与对比例1相似，只是孔隙率略小，但捕获率远低于对比例1和本发明的其他实施例中的捕获率。
实施例12
捕获芯片在生物样本中的CTCs捕获与检测
(1)在血液中捕获MCF-7细胞
取5mL新鲜抗凝血，向血液中加入外周血单核细胞分离液，利用密度梯度离心法分离外周血单核细胞，得到外周血单核细胞悬浮液，细胞浓度为0.8×106个细胞/mL。取MCF-7细胞悬浮液100μL，用细胞计数器计数并计算其浓度，向外周血单核细胞悬浮液中分别加入不同数量(100、150、200、250、300、400、500、600、1000个细胞/mL)的癌细胞。
分别使用实施例4制备的芯片A(4mol/L尿素处理)、实施例6中制备的芯片B(4mol/L盐酸胍处理)和实施例9中制备的芯片C(0.1％SDS处理)按照上述捕获方法在血液中捕获MCF-7细胞。其捕获率分别如下表9所示。
表9捕获芯片在血液中对癌细胞的捕获率
结果表明，本发明所制备的芯片A、B、C在血液中不同MCF-7细胞数量的情况下捕获率均可达到90％以上，这表明该方法制备的目标花粉结构微粒在不同癌细胞投放量的情况下，均可以实现从外周血中高效的捕获癌细胞。
(2)在血液中捕获CTCs
捕获芯片的预处理。将上述捕获芯片A、B、C分别置于1mL浓度为1％的BSA-PBS溶液中孵育3h。
CTCs捕获。从医院取12mL癌症患者血液样本(患者知情且自愿)于抗凝管中，使用前反复颠倒摇匀。各取4mL血液样本，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀，冰上放置15min。裂红结束后将样本离心(450×g，10min)，弃上清，使用细胞培养基对下层细胞进行重悬，并计数。将上述细胞浓度稀释至1×105个细胞/mL。取1mL上述重悬稀释样本滴加在芯片上，于37℃培养60min。
CTCs检测。吸去上述样本中的上清，用4％多聚甲醛固定芯片上的细胞，室温15min。随后吸去多聚甲醛，用PBS清洗芯片，使用浓度为1％的BSA-PBS溶液封闭1h。用PBST(0.1％)清洗芯片，再用PBS清洗芯片。加入一抗，本实施例使用的是抗CK抗体，本领域技术人员可以想到使用其他抗体，37℃孵育1h。PBST和PBS清洗芯片，加入相应二抗孵育，37℃孵育1h。PBST和PBS清洗芯片，使用DAPI染色，室温孵育15min。最后通过荧光显微镜观察，统计符合癌细胞染色特征的细胞，并统计芯片上癌细胞数目。
对全部芯片的全部表面进行观察，芯片A、B、C分别在1号患者的血样中共捕获CTCs5、5、4个/4mL。
对全部芯片的全部表面进行观察，芯片A、B、C分别在2号患者的血样中共捕获CTCs3、3、3个/4mL。
对全部芯片的全部表面进行观察，芯片A、B、C分别在3号患者的血样中共捕获CTCs1、1、2个/4mL。
(3)在脑脊液中捕获CTCs
此实验中生物样本为脑脊液，生物样本来自不同患者(确诊癌症并伴随脑转移)(患者知情且自愿)。除了脑脊液的处理方法无需经过裂红和稀释外，其他操作方法同上。
A芯片在1号患者的脑脊液中捕获CTCs 40个，平均10个/mL。经过一段时间的治疗后，再次检测，A芯片在1号患者的脑脊液中捕获CTCs 8个，平均2个/mL。
B芯片在2号患者的脑脊液中捕获CTCs 98个，平均25个/mL。
C芯片在3号患者的脑脊液中捕获CTCs 20个，平均5个/mL。
(4)在淋巴液中捕获CTCs
此实验中生物样本为淋巴液，生物样本来自不同癌症确诊患者(患者知情且自愿)。取淋巴液1mL，将样本离心(450×g，10min)，弃上清，使用细胞培养基对下层细胞进行重悬，并计数。将上述细胞浓度稀释至1×105个细胞/mL。其他操作方法同上。
A芯片在1号患者的淋巴液中捕获CTCs 3个，平均3个/mL。
B芯片在2号患者的淋巴液中捕获CTCs 2个，平均2个/mL。
C芯片在3号患者的淋巴液中捕获CTCs 5个，平均5个/mL。
(5)在胸水中捕获CTCs
此实验中生物样本为胸水，生物样本来自不同癌症确诊患者(患者知情且自愿)。取胸水4mL，无需稀释。其他操作方法同上。
A芯片在1号患者的胸水中捕获3个/4mL。
B芯片在2号患者的胸水中捕获2个/4mL。
C芯片在3号患者的胸水中捕获1个/4mL。
(6)在腹水中捕获CTCs
此实验中生物样本为腹水，生物样本来自不同癌症确诊患者(患者知情且自愿)。取腹水4mL，无需稀释。其他操作方法同上。
A芯片在1号患者的腹水中捕获3个/4mL。
B芯片在2号患者的腹水中捕获2个/4mL。
C芯片在3号患者的腹水中捕获1个/4mL。
产业上的可利用性
本发明涉及一种生物检测领域的生物功能材料及其制造方法，尤其涉及用于捕获循环肿瘤细胞的生物功能材料及其制造方法和用途。所使用的方法比现有技术环保、不使用碱液，并大大缩短处理时间。所制备的目标花粉微粒可用于高效捕获不同生物样本中的CTCs，并提供检测到的CTCs数目，帮助医生判断患者病情病程、转移倾向、指导用药等。
上面结合附图对本申请的实施例进行了描述，但是本申请并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本申请的启示下，在不脱离本申请宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，均属于本申请的保护之内。

Claims (8)

1.一种花粉微粒的制造方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤1：对花粉进行脱脂：将花粉与蛋白变性剂混合，然后进行清洗以除去花粉颗粒中所含的蛋白质和脂质，
步骤2：对脱脂后的花粉进行磺酸化处理，
步骤3：清洗上述步骤2)所得的花粉，干燥，
其中，所述蛋白变性剂为尿素、盐酸胍或十二烷基硫酸钠，
所述尿素的溶液浓度为1～10mol/L，所述盐酸胍的溶液浓度为1～10mol/L，所述十二烷基硫酸钠的溶液浓度为0.5～50g/L，
所述磺酸化剂为浓硫酸。
2.根据权利要求1所述的花粉微粒的制造方法，其中，所述花粉为选自源自莲科、金粟兰科、八角科、菊科、十字花科、五味子科、山茶科中的一种或多种植物的花粉微粒。
3.根据权利要求1所述的花粉微粒的制造方法，其中，所述尿素的溶液浓度为2～8mol/L；所述盐酸胍的溶液浓度为2～8mol/L；所述十二烷基硫酸钠的溶液浓度为0.5～10g/L。
4.根据权利要求3所述的花粉微粒的制造方法，其中，所述尿素的溶液浓度为3～8mol/L；所述盐酸胍的溶液浓度为2～6mol/L；所述十二烷基硫酸钠的溶液浓度为1～10g/L。
5.根据权利要求4所述的花粉微粒的制造方法，其中，所述尿素的溶液浓度为4～8mol/L。
6.根据权利要求1所述的花粉微粒的制造方法，其中，所述步骤1中，在将花粉与蛋白变性剂混合的同时进行搅拌，搅拌时间为1～8小时。
7.根据权利要求1所述的花粉微粒的制造方法，其中，所述步骤2中，在进行磺酸化处理的同时进行搅拌，搅拌时间为1～5小时。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的制造方法在制备用于捕获与检测生物体中的循环肿瘤细胞的生物功能材料中的用途。
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Citations (2)

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CN110104610A (zh) * 2019-04-10 2019-08-09 大连理工大学 一种花粉结构微粒及其制备方法和用途
CN111067944A (zh) * 2020-01-10 2020-04-28 洛阳师范学院 一种花粉纳米多孔微球及其制备方法与应用

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Title
Chemical Treatment Method for Obtaining Clean and Intact Pollen Shells of Different Species;Pedro Gonzalez-Cruz等;ACS Biomater. Sci. Eng.;第4卷;第2319-2329页 *

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