CN106381263A - 一种循环肿瘤细胞捕获元器件及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及循环肿瘤细胞的检测技术领域，具体地说是一种循环肿瘤细胞捕获元器件，该元器件为栅栏式过滤器件，该栅栏式过滤器件为扁圆形，栅栏式过滤器件内开设有若干个相互独立的小栅栏，小栅栏的栅栏间隙为5微米；其制备方法包括以下步骤：以聚苯乙烯为材料，进行热压铸造，制备聚苯乙烯栅栏式过滤器件，该栅栏式过滤器件的栅栏过滤间隙为5微米，再通过强氧等离子体的轰击使材料表面产生均匀的纳米结构，接着用聚赖氨酸修饰上正电荷，并用层粘连蛋白处理，以用于癌细胞的分离、富集和培养，即得栅栏式过滤器件；本发明同现有技术相比，其用于分离外周血中CTCs时过滤效率更高，耗时短，过滤时细胞承受的压力更小。

Description

一种循环肿瘤细胞捕获元器件及其制备方法
[技术领域]
本发明涉及循环肿瘤细胞的检测技术领域，具体地说是一种循环肿瘤细胞捕获元器件及其制备方法。
[背景技术]
肿瘤细胞从身体内的实体肿瘤上脱落进入血液循环系统或淋巴循环系统后，我们称它们为循环肿瘤细胞(CTCs)。CTCs在外周血中数量极少，1毫升外周血中可能只有1个，而同时白细胞数量可达107个,因此高效分离捕获CTCs是项极具挑战性的工作。
目前，国内外共约有30种分离检测CTCs的技术产品，其中少数是从DNA、蛋白水平去检测CTCs，其余大部分都是直接分离检测CTCs。CTCs直接检测方法大致可分为两类：一类是基于CTCs表面分子标记物的检测，另一类是基于CTCs自身物理性质的分离检测。
第一类以哈佛大学的CTC-Chip芯片、强生公司的CellSearch全自动CTCs检测仪为代表，此类技术方法的原理是利用抗体标记的微流体芯片或磁珠与表达EpCAM的CTCs发生特异性的抗原-抗体结合反应来分离CTCs，检测的前提条件是CTCs上表达适量的EpCAM。这类方法的缺陷在于，很多肿瘤细胞不表达或弱表达EpCAM，如某些肝癌、肾透明细胞癌、皮肤鳞癌中EpCAM的表达常呈阴性；乳腺癌细胞EpCAM一般呈高表达，但小叶癌却呈无或弱表达，从而导致检测结果假阴性。目前还没有发现所有肿瘤细胞均能稳定、大量表达的特定分子标记物，所以此类方法不能分离检测患者血液标本中所有的CTCs，存在检测灵敏度较差，漏检率较高的问题。
另一类是基于CTCs物理特性的方法。其中最具代表性是利用一般肿瘤细胞的直径大于正常细胞直径，来分离检测CTCs，例如膜滤过分离技术，是在滤膜上设计了8μm的孔阵列，设想CTCs直径普遍都在10μm以上，且细胞膜弹性差，故可以把CTCs分离出来；但血液中某些正常的白细胞直径要大于8μm，有些超过10μm；不同生长阶段的CTCs，休眠期的CTCs，个别特殊肿瘤细胞，它们的直径要偏小，恶性肿瘤细胞变形性更好，完全可以在几分钟内被动挤过8微米直径的孔隙。。且在过滤过程中，细胞物理性地卡在微孔中，细胞前后两段存在巨大压力差，细胞多有破损。所以，利用肿瘤细胞物理特性来分离检测CTCs的方法受到较大的质疑。
综上所述，目前CTCs的检测技术方法均有较大的缺陷。
[发明内容]
本发明的目的就是要解决上述的不足而提供一种循环肿瘤细胞捕获元器件，该栅栏式结构的孔隙度更大，用于分离外周血中CTCs时过滤效率更高，耗时短，过滤时细胞承受的压力更小。
为实现上述目的设计一种循环肿瘤细胞捕获元器件，所述元器件为栅栏式过滤器件，所述栅栏式过滤器件为扁圆形，所述栅栏式过滤器件内开设有若干个相互独立的小栅栏，所述小栅栏的栅栏间隙为4-7微米。
作为优选，所述小栅栏的栅栏间隙为5微米。
作为优选，所述栅栏式过滤器件的直径为8mm。
作为优选，所述栅栏式过滤器件采用聚苯乙烯材料制成。
作为优选，所述小栅栏的长宽均为100μm，所述小栅栏设有5000个。
该循环肿瘤细胞捕获元器件的制备方法，包括以下步骤：
1)将聚苯乙烯注入模具中，在150℃下铸压15分钟后，缓慢冷却至室温，制得厚度为0.2mm的聚苯乙烯栅栏式过滤器件，栅栏的过滤间隙为4-7微米；
2)得到栅栏成品后，用300瓦氧等离子体处理10分钟，使其表面产生均匀的纳米结构；
3)将用氧等离子体处理后的栅栏浸泡在0.1mg/ml的聚赖氨酸溶液中24小时，用去离子水洗干净；
4)浸泡在10μg/ml的层粘连蛋白溶液中，最后将栅栏置于37℃中干燥3-4小时，即得栅栏式过滤器件。
作为优选，步骤1)中，栅栏的过滤间隙为5微米。
作为优选，步骤1)中，栅栏式过滤器件的直径为8毫米。
该栅栏式过滤器件与针头式过滤装置组装成型，用于分离外周血中循环肿瘤细胞的应用。
所述针头式过滤装置包括过滤装置本体，所述过滤装置本体顶端的血样口处连接有血样接入口，所述血样接入口与过滤装置本体顶端之间设置有密封圈，所述栅栏式过滤器件装于密封圈上，所述血样接入口与密封圈通过夹子夹为一体，所述过滤装置本体侧壁上开设有压力检测口和真空泵接口，所述压力检测口与压力检测仪相连，所述真空泵接口通过控制阀连接真空泵。
本发明同现有技术相比，提供了一种用于分离外周血中CTCs的栅栏式过滤器件，该过滤器件分离原理，不是基于肿瘤细胞大小，而是基于肿瘤细胞核大小来分离CTCs，其依据在于肿瘤细胞核大、变形性差、且形态异常，与细胞整体大小相比，肿瘤细胞核的直径变异性更小，因此，与传统的微孔阵列相比，本发明所述的栅栏式结构的孔隙度更大，使得过滤效率更高，耗时短，过滤时细胞承受的压力更小，值得推广应用。
[附图说明]
图1是传统的微孔过滤器件结构示意图；
图2是传统的微孔过滤器件外观图；
图3是本发明栅栏式过滤器件结构示意图；
图4是本发明栅栏式过滤器件外观图；
图5是本发明栅栏式过滤器件组装后用于外周血中CTCs分离应用结构示意图；
图中：1、栅栏式过滤器件 2、过滤装置本体 3、血样接入口 4、密封圈 5、夹子 6、压力检测口 7、真空泵接口。
[具体实施方式]
下面结合附图对本发明作以下进一步说明：
本发明提供了一种循环肿瘤细胞捕获元器件，该元器件为栅栏式过滤器件，该栅栏式过滤器件为扁圆形，直径为8mm(内含约5千个，长宽各100μm的独立的小栅栏)，与试剂灭菌常用的0.22μm滤膜大小一致，优化了栅栏间隙，使小栅栏的栅栏间隙为4-7微米，优选为5微米，达到最佳分离效果，栅栏式过滤器件采用聚苯乙烯材料制成，使用负性光刻胶是SU8胶为原始模板。
该循环肿瘤细胞捕获元器件的制备方法，包括以下步骤：
1)将10μl聚苯乙烯注入模具中，在150℃下铸压15分钟后，缓慢冷却至室温，可获得厚度为0.2mm的聚苯乙烯栅栏式过滤器件，直径为8毫米，栅栏的过滤间隙为4-7微米，栅栏的过滤间隙优选为5微米；
2)得到栅栏成品后，用300瓦氧等离子体处理10分钟，使其表面产生均匀的纳米结构；
3)将用氧等离子体处理后的栅栏浸泡在0.1mg/ml的聚赖氨酸溶液中24小时，用去离子水洗干净；
4)浸泡在10μg/ml的层粘连蛋白溶液中，最后将栅栏置于37℃中干燥3-4小时，即得栅栏式过滤器件。
该栅栏式过滤器件与针头式过滤装置组装成型后，如附图5所示，用于分离外周血中循环肿瘤细胞。该针头式过滤装置包括过滤装置本体2，过滤装置本体顶端的血样口处连接有血样接入口3，血样接入口与过滤装置本体顶端之间设置有密封圈4，栅栏式过滤器件1装于密封圈上，血样接入口与密封圈通过夹子5夹为一体，过滤装置本体侧壁上开设有压力检测口6和真空泵接口7，压力检测口与压力检测仪相连，真空泵接口通过控制阀连接真空泵。
本发明在器件设计方面，通过调查了栅栏间隙大小对肿瘤细胞过滤效率的影响。发现在2.5mb过滤压力下，利用4-7微米的间隙的过滤器件时，随着间隙的扩大，肿瘤细胞分离效率由94％依次降低到91％、75％、68％。若采用5微米间隙的栅栏，在2.5mb过滤压力下，白细胞残留约每毫升1000个，80％的肿瘤细胞能保持活性，达到最佳分离效果(CTC捕获率高的同时白细胞污染率低)。若是新鲜全血，则可以最快在1分钟内完成5毫升全血的过滤。制备时，以聚苯乙烯为材料，进行热压铸造，制备直径8毫米，厚度约15微米，过滤间隙为5微米的栅栏式过滤器件，再通过强氧等离子体的轰击使材料表面产生均匀的纳米结构，接着用聚赖氨酸修饰上正电荷，并用层粘连蛋白(laminin)处理，以用于癌细胞的分离、富集和培养。
本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种循环肿瘤细胞捕获元器件，其特征在于：所述元器件为栅栏式过滤器件，所述栅栏式过滤器件为扁圆形，所述栅栏式过滤器件内开设有若干个相互独立的小栅栏，所述小栅栏的栅栏间隙为4-7微米。
2.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获元器件，其特征在于：所述小栅栏的栅栏间隙为5微米。
3.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获元器件，其特征在于：所述栅栏式过滤器件的直径为8mm。
4.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获元器件，其特征在于：所述栅栏式过滤器件采用聚苯乙烯材料制成。
5.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获元器件，其特征在于：所述小栅栏的长宽均为100μm，所述小栅栏设有5000个。
6.一种循环肿瘤细胞捕获元器件的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将聚苯乙烯注入模具中，在150℃下铸压15分钟后，缓慢冷却至室温，制得厚度为0.2mm的聚苯乙烯栅栏式过滤器件，栅栏的过滤间隙为4-7微米；
2)得到栅栏成品后，用300瓦氧等离子体处理10分钟，使其表面产生均匀的纳米结构；
3)将用氧等离子体处理后的栅栏浸泡在0.1mg/ml的聚赖氨酸溶液中24小时，用去离子水洗干净；
4)浸泡在10μg/ml的层粘连蛋白溶液中，最后将栅栏置于37℃中干燥3-4小时，即得栅栏式过滤器件。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，栅栏的过滤间隙为5微米。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，栅栏式过滤器件的直径为8毫米。
9.一种根据权利要求6至8中任一项所制得的栅栏式过滤器件与针头式过滤装置组装成型，用于分离外周血中循环肿瘤细胞的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述针头式过滤装置包括过滤装置本体，所述过滤装置本体顶端的血样口处连接有血样接入口，所述血样接入口与过滤装置本体顶端之间设置有密封圈，所述栅栏式过滤器件装于密封圈上，所述血样接入口与密封圈通过夹子夹为一体，所述过滤装置本体侧壁上开设有压力检测口和真空泵接口，所述压力检测口与压力检测仪相连，所述真空泵接口通过控制阀连接真空泵。
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