CN109596828A - 一种微球增强的尺寸分离芯片及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微球增强的尺寸分离芯片及其制备方法与应用。所述微球增强的尺寸分离芯片包括：芯片主体，所述芯片主体包括腔室以及设置于腔室内的过滤膜，所述腔室与进样口和出样口连通，液体样品被从进样口注入腔室并经过过滤膜过滤后，再从出样口输出，所述过滤膜用于阻拦液体样品中的目标循环肿瘤细胞；以及，至少用以对所述目标循环肿瘤细胞进行特异亲和捕获并使其尺寸增强的微球。所述的制备方法包括：分别制作上腔室、下腔室、过滤膜，并采用等离子处理进行集成，形成芯片主体；在微球表面修饰连接亲和捕获分子层，获得具有亲和捕获功能的微球。本发明的尺寸分离芯片结构简单、经济且通量大，可以成功分离病人血样中的CTC。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤细胞捕获方法及设备，特别是一种微球增强的尺寸分离芯片及其制备方法和在CTC临床检测和高效分离方面的应用，属于生物医学早期诊断技术领域。
背景技术
CTC(circulating tumor cell)即循环肿瘤细胞，是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。它是绝大多数恶性肿瘤患者在术后出现远处转移和术后复发的主要原因。研究表明血液中CTC数目与癌症患者病情发展息息相关，因此监测血液中CTC数目对于评估癌症转移和药物疗效有十分重要的指导意义。
基于细胞大小的膜过滤分离肿瘤细胞技术是富集循环肿瘤细胞常用的方法之一。该技术基于循环肿瘤细胞体积与血细胞体积差异实现循环肿瘤细胞的选择性截留，但是循环肿瘤细胞具有不均一性，有些细胞的体积可能比血细胞要小，从而导致单纯的ISET技术对于某些循环肿瘤细胞在细胞捕获效率方面是偏低的。
因此，如何优化用于CTC检测的尺寸分离方法，以提高CTC的检测效率和准确性，是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种微球增强的尺寸分离芯片及其制备方法和在CTC临床检测和高效分离方面的应用，从而解决临床病人全血中CTC的检测效率和准确性较低等问题。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种微球增强的尺寸分离芯片，其包括：
芯片主体，所述芯片主体包括腔室以及设置于所述腔室内的过滤膜，所述腔室与进样口和出样口连通，液体样品被从所述进样口注入所述腔室并经过所述过滤膜过滤后，再从所述出样口输出，所述过滤膜用于阻拦所述液体样品中的目标循环肿瘤细胞；
以及，至少用以对所述目标循环肿瘤细胞进行特异亲和捕获并使其尺寸增强的微球。
在一实施方案之中，所述微球包括复数个修饰有亲和捕获分子层的微米颗粒。
优选的，所述微米颗粒包括硅球和/或磁性粒子。
进一步的，所述硅球和/或磁性粒子具有氨基功能团和/或羧基功能团。
在一实施方案之中，所述亲和捕获分子层包括基于目标循环肿瘤细胞粘附蛋白筛选的特异性适配体和/或抗体或者所述特异性适配体和/或抗体的修饰化产物。
本发明实施例还提供了前述的微球增强的尺寸分离芯片的制备方法，其包括：
1)采用阳模板分别制作上腔室、下腔室，提供过滤膜，并采用等离子处理将上腔室、下腔室和过滤膜进行集成，形成芯片主体；
2)提供原始微球，并在所述原始微球表面修饰连接亲和捕获分子层，获得具有亲和捕获功能的微球。
在一实施方案之中，步骤1)还包括：将抗粘附分子水溶液通入所述芯片主体的上腔室和下腔室，从而在所述芯片主体的过滤膜的表面、上腔室和下腔室的内壁上形成抗粘附分子层。
本发明实施例还提供了前述的微球增强的尺寸分离芯片于全血CTC检测和高效分离中的应用。
例如，本发明还提供了前述的微球增强的尺寸分离芯片于制备用于CTC检测方法的检测装置的用途，所述的CTC检测方法包括：
将液体样品与0.4～0.8wt％的多聚甲醛溶液均匀混合5～15min，之后加入所述微球并在37℃、10～40r/min的条件下反应10～60min，使所述微球对液体样品中的目标循环肿瘤细胞进行特异亲和捕获并使其尺寸增强，获得孵育后的样品；
以0.1～10ml/min的进样速率将所述孵育后的样品加入芯片主体，对所述孵育后的样品进行尺寸分离使其留在过滤膜上，而后进行免疫荧光鉴定检测。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明提供的微球增强的CTC尺寸分离芯片引入微米级颗粒进行循环肿瘤细胞的亲和捕获，一方面旨在增加目标循环肿瘤细胞(即靶细胞)过滤尺寸，增大靶细胞与血液细胞的体积差异，与传统尺寸分离方法相比大大提高了循环肿瘤细胞的截留效率。另一方面，可以保障微球与血液细胞的作用在较低的几率，从而提高了血液中靶细胞的截留纯度，保障循环肿瘤细胞的计数准确性。
2)本发明提供的微球增强的CTC尺寸分离芯片通过引入BSA等抗粘附分子，从而能够有效的抑制血细胞的非特异粘附，降低后续的CTC鉴定过程中血细胞的干扰。
3)本发明提供的亲和捕获分子修饰的微球可以特异识别病人血样中的CTC并结合增大其尺寸，可以大大提高尺寸较小的CTC的捕获效率，这对CTC的分子鉴定等研究非常有帮助。
4)本发明利用微流控技术自动、高效和分析速度快的优势，将ISET技术与微流控技术进行结合，在达到高效捕获循环肿瘤细胞的前提下，将血液细胞对循环肿瘤细胞的鉴定等的影响降低，实现准确有效的循环肿瘤细胞计数。
5)本发明提供的微球增强的CTC尺寸分离芯片和相应微球制备方法简单、经济且具有大通量的优势，可以成功分离实际病人血样中的CTC，在临床病人样本CTC检测中的应用性强。
附图说明
图1是本发明实施例1中具有氨基功能团的微球修饰亲和捕获分子的示意图。
图2是本发明应用例中采用实施例1所获微球增强的尺寸分离芯片对病人全血进行CTC检测的原理图。
图3是本发明性能测试中所使用的几种靶细胞的尺寸统计示意图。
图4本发明测试例1中进样速率对传统尺寸分离芯片(ISET)及微球增强的尺寸分离芯片(M-ISET)的靶细胞分离效率影响的对比示意图。
图5是本发明测试例2中传统尺寸分离芯片(ISET)及微球增强的尺寸分离芯片(M-ISET)对不同尺寸靶细胞分离效率的对比示意图。
图6a是本发明测试例3中ISET组分离后的靶细胞SEM图。
图6b是本发明测试例3中M-ISET组分离后的靶细胞SEM图。
图6c是本发明测试例3中M-ISET组分离后的靶细胞表面绑定的微球数量统计示意图。
图7是本发明测试例4中微球增强的尺寸分离芯片(M-ISET)对血液样本中靶分离效率统计示意图。
图8a是本发明测试例5中微球增强的尺寸分离芯片(M-ISET)对血液样本中分离的白细胞的荧光鉴定图像。
图8b是本发明测试例5中微球增强的尺寸分离芯片(M-ISET)对血液样本中分离的靶细胞的荧光鉴定图像。
图8c是本发明测试例5中预染色组和免疫荧光鉴定组分别利用微球增强的尺寸分离芯片(M-ISET)对血液样本中靶细胞分离的效率对比示意图。
图9是本发明测试例6中微球增强的尺寸分离芯片(M-ISET)从实际病人样本中分离出的CTC的荧光鉴定图像。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的系一种微球增强的尺寸分离芯片，用于病人全血中CTC的精准捕获，其包括：
芯片主体，所述芯片主体包括腔室以及设置于所述腔室内的过滤膜，所述腔室与进样口和出样口连通，液体样品被从所述进样口注入所述腔室并经过所述过滤膜过滤后，再从所述出样口输出，所述过滤膜用于阻拦所述液体样品中的目标循环肿瘤细胞；
以及，至少用以对所述目标循环肿瘤细胞进行特异亲和捕获并使其尺寸增强的微球。
在一实施方案之中，所述微球包括复数个修饰有亲和捕获分子层的微米颗粒。
优选的，所述用于尺寸增强的微球包括但不限于具有氨基功能团或羧基功能团等的硅球或磁性粒子等。
在本发明中，靶细胞为上皮蛋白过表达的循环肿瘤细胞；在一实施方案之中，所述靶细胞亲和捕获分子为基于靶细胞粘附蛋白筛选的特异性适配体、抗体或者所述特异性适配体、抗体的修饰化产物。微球表面修饰的亲和捕获分子层包括但不限于适配体和抗体。
进一步的，所述微球的粒径尺寸为1～5μm。
在一实施方案之中，所述过滤膜的表面以及腔室的内壁上均覆设有抗粘附分子层。
优选的，所述抗粘附分子层的材质包括但不限于聚乙二醇(PEG)、牛血清白蛋白分子(BSA)等。
在一实施方案之中，所述腔室包括上腔室和下腔室，所述过滤膜设置于所述上腔室和下腔室之间，所述上腔室具有进样口，所述下腔室具有出样口。
优选的，所述腔室的材质包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
进一步的，所述上腔室或下腔室的深度为50～300μm。
在一实施方案之中，过滤膜包括但不限于商用尺寸分离的聚碳酸酯膜和实验室制备的二氧化硅等具备相应孔径尺寸的薄膜。
优选的，所述过滤膜所含通孔的孔径为5～10μm。
作为本发明技术方案的另一个方面，其所涉及的系前述的微球增强的尺寸分离芯片的制备方法，其包括：
1)采用阳模板分别制作上腔室、下腔室，提供过滤膜，并采用等离子处理将上腔室、下腔室和过滤膜进行集成，形成芯片主体；
2)提供原始微球，并在所述原始微球表面修饰连接亲和捕获分子层，获得具有亲和捕获功能的微球。
在一实施方案之中，步骤1)还包括：将抗粘附分子水溶液通入所述芯片主体的上腔室和下腔室，从而在所述芯片主体的过滤膜的表面、上腔室和下腔室的内壁上形成抗粘附分子层。
在一实施方案之中，步骤1)具体包括：采用3M胶带制版、掩模板刻蚀中的任一种方式制备阳模板，将聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂浇注在阳模板上，固化后剥离得到芯片主体的上腔室和下腔室，在所述上腔室和下腔室上分别开设进样口和出样口，之后采用等离子处理将上腔室、下腔室和过滤膜进行集成，形成芯片主体。
优选的，所述上腔室和/或下腔室的材质包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
优选的，过滤膜包括但不限于商用尺寸分离的聚碳酸酯膜和实验室制备的二氧化硅等具备相应孔径尺寸的薄膜。
进一步的，所述过滤膜所含通孔的孔径为5～10μm。
在一实施方案之中，步骤1)还包括：将APTES的乙醇溶液充满所述芯片主体的腔室，室温反应1～2h，而后将1～2.5vt％戊二醛的PBS溶液充满所述芯片主体的腔室，室温反应1～4h，之后再将抗粘附分子水溶液充满所述芯片主体的腔室，4～25℃反应2～12h，从而得到所述的抗粘附分子层。
优选的，所述抗粘附分子层的材质包括但不限于聚乙二醇(PEG)、牛血清白蛋白分子(BSA)等。
在一实施方案之中，步骤2)具体包括：采用化学修饰的方法在原始微球上接枝链酶亲和素，之后将生物素修饰的亲和捕获分子水溶液与链酶亲和素修饰后的微球孵育，制得具有亲和捕获功能的微球。
在一实施方案之中，所述微球包括复数个修饰有亲和捕获分子层的微米颗粒。
优选的，所述用于尺寸增强的微球包括但不限于具有氨基功能团或羧基功能团等的硅球或磁性粒子等。
在本发明中，靶细胞为上皮蛋白过表达的循环肿瘤细胞；在一实施方案之中，所述靶细胞亲和捕获分子为基于靶细胞粘附蛋白筛选的特异性适配体、抗体或者所述特异性适配体、抗体的修饰化产物。微球表面修饰的亲和捕获分子层包括但不限于适配体和抗体。
进一步的，所述微球的粒径尺寸为1～5μm。
在一实施方案之中，步骤2)具体包括：将原始微球配成浓度为1～2mg/mL的悬浮溶液与浓度为1～2.5vt％的戊二醛溶液混合均匀，搅拌反应1～2h，而后加入1～100μg/mL的链霉亲合素，室温反应2～4h，之后采用浓度为0.1～1μM的生物素修饰的DNA适配体或抗体溶液室温修饰1～4h，制得所述具有亲和捕获功能的微球。
在一更为具体的实施方案之中，所述的制备方法可以包括以下步骤：
步骤一、利用3M胶带或刻蚀的方法制备腔室流道的阳模板，将PDMS预聚物和固化剂浇注在阳模板上，固化后剥离得到芯片的上、下腔室。在上、下腔室相应位置打好进样口和出样口，最后通过等离子处理将上、下腔室及过滤膜粘合在一起制得芯片主体。
步骤二、向所述步骤一得到的芯片主体通入抗粘附分子水溶液，得到覆盖在所述过滤膜和上下腔室内壁上的抗粘附分子层。
步骤三、利用化学修饰的方法将原始的微球接枝一层链酶亲和素，将生物素修饰的靶细胞亲和捕获分子水溶液与链酶亲和素修饰后的微球孵育制得有亲和捕获功能的微球。
其中，步骤一中阳模板的制备包括但不限于简单的3M胶带制版以及掩模板刻蚀等方法。
更为具体的，所述步骤二包括：
利用蠕动泵将0.1～1vt％APTES的乙醇溶液充满芯片主体的腔室，室温反应1～2h，无水乙醇和PBS清洗去除多余的未反应的APTES，而后将1～2.5％戊二醛的PBS溶液充满腔室，室温反应1～4h，PBS清洗干净，0.1～1mg/mL的PEG溶液或0.1％～1wt％的BSA水溶液充满腔室，4℃反应6～12h后PBS溶液清洗干净，从而在芯片主体的过滤膜上修饰上抗粘附分子层(PEG或BSA)。
其中，PBS(phosphate buffer saline)是磷酸缓冲盐溶液。
更为具体的，所述步骤三包括：
以表面带有氨基的微球为例制备有亲和捕获功能的微球。为防止修饰过程中微球粘附在离心管壁上，将离心管首先用0.3～3wt％的BSA溶液封闭1～2h。然后将微球配成浓度为1～2mg/mL的悬浮溶液加入到BSA封闭后的离心管内，清洗3遍后加入1mL浓度为1～2.5％的戊二醛溶液剧烈搅拌条件下反应1～2h，PBS溶液清洗5～7遍，加入1～100μg/mL的链霉亲合素(SA)室温反应2～4h，PBS清洗3～5遍，利用浓度为0.1～1μM的生物素修饰的DNA适配体或抗体溶液室温修饰4h，PBS溶液清洗3～5次后制得所述接枝有亲和捕获分子的微球。
作为本发明技术方案的另一个方面，其所涉及的系前述的微球增强的尺寸分离芯片于全血CTC检测和高效分离中的应用。
所述应用主要是将修饰有亲和捕获分子层的微球与靶细胞或病人血样孵育后即可在芯片主体中进行尺寸分离，最终进行对分离的靶细胞进行免疫荧光鉴定。
例如，本发明还提供了前述的微球增强的尺寸分离芯片于制备用于CTC检测方法的检测装置的用途，所述的CTC检测方法包括：
将液体样品与0.4～0.8wt％的多聚甲醛溶液均匀混合5～15min，之后加入所述微球并在37℃、10～40r/min的条件下反应10～60min，使所述微球对液体样品中的目标循环肿瘤细胞进行特异亲和捕获并使其尺寸增强，获得孵育后的样品；
以0.1～10ml/min的进样速率将所述孵育后的样品加入芯片主体，对所述孵育后的样品进行尺寸分离使其留在过滤膜上，而后进行免疫荧光鉴定检测。
进一步的，所述液体样品为血液样品。
在一更为具体的实施方案之中，所述的检测方法可以包括以下步骤：
从医院取得乳腺癌或其他癌症病人血液样品，向1～5mL血液样品中加入0.4％～0.8wt％的多聚甲醛溶液，5～15min后加入所述微球并在37℃、10r/min的条件下反应30min，然后利用蠕动泵将孵育后的血液样品通入所述芯片主体过滤，进样速率控制在0.1～10ml/min，样本过滤结束后利用3～5mL的PBS溶液清洗，并利用4％的多聚甲醛固定5～15min，PBS溶液清洗后利用0.1～0.3vt％的Triton-X对细胞膜进行通透5～15min，PBS溶液清洗后加入1～3％的BSA溶液封闭5～15min，PBS溶液清洗去除多余的BSA，加入抗体CD45-PE染色1～2h，PBS溶液清洗后加入抗体PanCK-FITC染色1～2h，再次用PBS清洗去除多余的染料后加入DAPI染色15min，利用PBS溶液清洗过滤膜后，将过滤膜拿到荧光显微镜下鉴定检测到的CTC。
藉由上述技术方案，本发明提供的微球增强的CTC尺寸分离芯片引入微米级颗粒进行循环肿瘤细胞的亲和捕获，一方面旨在增加目标循环肿瘤细胞(即靶细胞)过滤尺寸，增大靶细胞与血液细胞的体积差异，与传统尺寸分离方法相比大大提高了循环肿瘤细胞的截留效率。另一方面，可以保障微球与血液细胞的作用在较低的几率，从而提高了血液中靶细胞的截留纯度，保障循环肿瘤细胞的计数准确性。同时将ISET技术与微流控技术进行结合，在达到高效捕获循环肿瘤细胞的前提下，将血液细胞对循环肿瘤细胞的鉴定等的影响降低，实现准确有效的循环肿瘤细胞计数，在临床病人样本CTC检测中的应用性强。
下面通过结合附图及实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，应当理解的是，这些具体实施方式仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定。
实施例1
步骤一：利用简单3M胶带制作芯片主体。将厚度为300μm的3M双面胶带刻出所需尺寸的模板，将模板贴在干净的石英玻璃上，PDMS预聚物和固化剂按10:1比例混合均匀，去除气泡后倒入有模板的石英玻璃上，放入90℃烘箱内放置20min后将固化的PDMS剥离得到具有对应尺寸的上腔室和下腔室。分别在上腔室、下腔室上面利用打孔器在人字形处打出进样口和出样口，利用氧等离子分别处理上腔室、下腔室和聚碳酸酯膜60s，并将其键合在一起制得芯片主体。
步骤二：在芯片主体内制备BSA抗粘附分子层。利用蠕动泵将1vt％APTES的乙醇溶液充满芯片主体的腔室，室温反应2h，无水乙醇和PBS清洗去除多余未反应的APTES，而后将2.5vt％戊二醛的PBS溶液充满腔室，室温反应1h，PBS清洗干净，然后将1wt％的BSA水溶液充满腔室，4℃反应8h后PBS溶液清洗干净，最终在芯片主体的过滤膜表面和腔室内壁修饰上抗粘附分子层。
步骤三：以表面带有氨基的微球为例制备有亲和捕获功能的微球，参见图1。为防止修饰过程中微球粘附在离心管壁上，将离心管首先用1％的BSA溶液封闭1h。然后将微球配成浓度为1mg/mL的悬浮溶液加入到BSA封闭后的离心管内，清洗3遍后加入1mL浓度为2.5vt％的戊二醛溶液剧烈搅拌条件下反应2h，PBS溶液清洗5～7遍，加入1μg/mL的链霉亲合素(SA)室温反应2h，PBS清洗3～5遍，利用浓度为1μM的生物素修饰的DNA适配体水溶液室温修饰4h，PBS溶液清洗3～5次后制得所述接枝有亲和捕获分子的微球。
实施例2
步骤一：利用掩模板和刻蚀工艺制作芯片主体。设计制备具有一定尺寸形状的掩模板，利用光刻和刻蚀工艺制得高度为100μm阳模板，而后将PDMS预聚物和固化剂按10:1比例混合均匀，去除气泡后倒入有阳模板的器具中，放入90℃烘箱内放置20min后将固化的PDMS剥离得到具有对应尺寸的上腔室和下腔室。分别在上腔室、下腔室上面利用打孔器在人字形处打出进样口和出样口，利用氧等离子分别处理上腔室、下腔室和聚碳酸酯膜60s，并将其键合在一起制得芯片主体。
步骤二：在芯片主体内制备PEG抗粘附分子层。利用蠕动泵将1vt％APTES的乙醇溶液充满芯片的腔室，室温反应2h，无水乙醇和PBS清洗去除多余的未反应的APTES，而后将2.5vt％戊二醛的PBS溶液充满腔室，室温反应1h，PBS清洗干净后将1mg/mL的PEG溶液充满腔室，反应8h后PBS溶液清洗干净，从而在芯片主体的过滤膜表面和腔室内壁修饰上PEG抗粘附分子。
步骤三：以表面带有羧基的微球为例制备有亲和捕获功能的微球。将微球配成浓度为1mg/mL的悬浮溶液加入到BSA封闭后的离心管内，清洗3遍后加入0.1～0.2moL/L的EDC、0.05～0.2moL/L的NHS对微球表面的羧基进行活化，PBS溶液清洗3遍，加入1μg/mL的链霉亲合素(SA)室温反应2h，PBS清洗3-5遍，利用浓度为1μM的生物素修饰的DNA适配体水溶液室温修饰4h，PBS溶液清洗3～5次后制得所述接枝有亲和捕获分子的微球。
应用例
本应用例提供一种应用实施例1所获的微球增强的尺寸分离芯片在CTC检测中的应用，如图2所示为应用该芯片在病人全血中进行CTC检测的原理图。
从医院取得乳腺癌或其他癌症病人血液样品(以下可简称血样)，2mL血液中加入0.8wt％的多聚甲醛溶液，15min后加入所述微球并在37℃、10r/min的条件下反应30min，然后利用蠕动泵将孵育后的血样通入所述芯片主体过滤，样本的进样速率控制在1ml/min，样本过滤结束后利用5mL的PBS溶液清洗，并利用4％的多聚甲醛固定15min，PBS溶液清洗后利用0.3vt％的Triton-X对细胞膜进行通透15min，PBS溶液清洗后加入3wt％的BSA溶液封闭15min，PBS溶液清洗去除多余的BSA，加入抗体CD45-PE染色1h，PBS溶液清洗后加入抗体PanCK-FITC染色1h，再次用PBS清洗去除多余的染料后加入DAPI染色15min，利用PBS溶液清洗芯片主体的过滤膜后，将过滤膜拿到荧光显微镜下鉴定检测到的CTC。
性能测试
模型靶细胞前处理：分别将生长状态良好的MCF-7、PC-3和KATO III细胞利用0.25wt％的胰酶消化收集后，用终浓度为10μg/mL的DIO溶液染色15min，用PBS清洗3-5次后，计数配置成104cells/mL的细胞悬液。
性能测试所使用的模型靶细胞及血细胞尺寸统计结果见图3。
测试例1：进样速率对传统尺寸分离芯片及微球增强的尺寸分离芯片的靶细胞分离效率影响的考察
本测试例选择EpCAM阳性乳腺癌细胞株MCF-7作为研究对象，综合考察传统尺寸芯片分离及微球增强的尺寸分离芯片对MCF-7细胞在过滤膜上分离效率的影响，以确定最佳的流速。
为方便区分，将传统尺寸分离方法实验组记为ISET组，微球增强的尺寸分离方法实验组记为M-ISET组，之后的测试例做同样处理。
在M-ISET组进行芯片过滤之前，将已准备好的细胞悬液分别与0.1mg/ml的连接有亲和捕获分子的微球在37℃、10r/min条件下反应30min。随后，将两组细胞样本分别以0.5ml/min、1ml/min、2ml/min、3ml/min和5ml/min的进样速率通入芯片主体，进样完毕后利用3ml的PBS溶液清洗，将芯片主体放置于荧光显微镜下观察过滤膜上分离的细胞，计数并计算ISET组和M-ISET组每个流速下MCF-7细胞的分离效率，结果汇总见图4。
通过图4可知：(1)细胞在过滤膜上的分离效率几乎是随着流速的增加而降低，这是由于流速增加时，细胞在腔室内受到的剪切力增大导致细胞的变形程度增大使其更容易通过过滤膜的孔洞。(2)与ISET组相比，M-ISET组的分离效率有明显的提高。在1mL/min的流速下，ISET组对MCF-7细胞的截留效率为69.58％，M-ISET组对MCF-7细胞的截留效率为96.08％。
综合以上数据分析，将进样速率确定为1mL/min用以进行后续的测试例。
测试例2：传统尺寸分离芯片及微球增强的尺寸分离芯片对不同尺寸靶细胞分离效率的考察
本测试例主要考察传统尺寸分离及微球增强的尺寸分离对不同尺寸靶细胞分离效率的影响。本测试例选择了3种癌细胞作为研究对象，包括MCF-7细胞、KATOⅢ细胞以及PC-3细胞。M-ISET组的细胞首先与修饰有亲和捕获分子的微球孵育，随后分别对ISET组和M-ISET组的样本进行过滤，进样速率控制在1ml/min，清洗后对过滤膜表面分离的细胞进行数据统计，图5是ISET组和M-ISET组中3种癌细胞的分离效率对比示意图。
由图5可以发现，3种癌细胞在与微球作用后，分离效率都发生明显增加，因此利用微球与癌细胞作用能够大大增加癌细胞的体积，从而有效的提高靶细胞的分离效率。
测试例3：微球增强的尺寸分离芯片对靶细胞尺寸增强的微观考察
为了更直观的证实微球与靶细胞之间的作用，本测试例分别考察了ISET组和M-ISET组过滤后的MCF-7细胞样本微观形貌。分别将ISET组和M-ISET组细胞悬液在流经过滤膜后，将芯片主体内分离的细胞利用4％多聚甲醛固定，不同浓度的乙醇溶液脱水，然后在场发射环境扫描电子显微镜下观察过滤膜表面截留的细胞形态，参见图6a和图6b。图6a为ISET组分离后的细胞形貌，图6b为M-ISET组分离后的细胞形貌。图6b直观地展现了细胞与微球的相互作用，可以看到几乎每个细胞表面均有数个微球绑定，细胞的体积因此发生明显的增大，这也是造成该组细胞分离效率明显提高的根本原因。图6c进一步的统计了每一个细胞表面绑定的微球数量，结果发现96％以上的细胞被微球绑定，证实了微球增强的有效性。
测试例4：微球增强的尺寸分离芯片对血液样本中循环肿瘤细胞分离效率的考察
为了考察微球增强的尺寸分离芯片在临床上应用的可行性，本测试例将少量癌细胞加入到正常人全血中来模拟病人样本测试其分离效率。
将MCF-7细胞利用DIO染色后，依次取10、20、50、100个MCF-7细胞分别加入到1ml人正常血液中，随后分别将0.1mg微球加入含有MCF-7细胞的血液中，在37℃条件下孵育30min，结束后利用蠕动泵使血液样本在1mL/min的流速下流经过滤膜，最后利用3-5ml的PBS清洗腔室。荧光显微镜下观察计数过滤膜上捕获到的MCF-7细胞并计算捕获效率，结果见图7。
由图7可知，当血液中循环肿瘤细胞数量极少时，该芯片在微球增强尺寸的条件下对MCF-7细胞的分离效率在90％以上，具备对血液样本中极少量靶细胞高效率高灵敏度捕获的性能，在临床应用上具有巨大的应用潜力。
测试例5：微球增强的尺寸分离芯片对血液样本中循环肿瘤细胞检测有效性的考察
由于临床病人样本中CTCs的检测多采用免疫荧光染色的方式进行鉴定，为了进一步考察微球增强的尺寸分离对血液样本中CTC检测的准确性和有效性，本测试例分别测试了预染色组和免疫荧光鉴定组中M-ISET的检测效率。在预染色组中，将100个已利用DIO染色的MCF-7细胞投入1ml全血中，与修饰有亲和捕获分子的微球孵育后检测计数。在免疫荧光鉴定组中，取100个未染色处理的MCF-7细胞投入全血进行检测，过滤后，利用4％多聚甲醛固定15min后依次用浓度为0.3vt％的triton-X溶液通透15min、3wt％的BSA溶液封闭15min，然后依次用PE标记的anti-CD45、FITC标记的anti-PanCK、DAPI染色各1h，最后在激光共聚焦显微镜下观察所分离的细胞，见图8a和图8b，图8a中DAPI(+)、PanCK-FITC(-)、CD45-PE(+)的细胞即鉴定为截留的白细胞，图8b中DAPI(+)、PanCK-FITC(+)、CD45-PE(-)的细胞即鉴定为分离到的血液中的靶细胞。两组的分离效率数据对比汇总见图8c，可以发现免疫荧光鉴定组靶细胞的数目与预染色组差别不大，这一数据说明M-ISET对血液中靶细胞的分离鉴定具备较高的准确性和有效性。
测试例6：微球增强的尺寸分离芯片对实际病人样本中CTC检测的考察
本测试例为进一步说明所述微球增强的尺寸分离芯片在CTC临床检测中的应用。
从医院取得乳腺癌病人样本，向2mL血液中加入0.8％的多聚甲醛溶液，15min后加入所述微球并在37℃、10r/min的条件下反应30min，然后利用蠕动泵将孵育后的血样通入所述芯片主体的过滤膜，进样速率控制在1ml/min，样本过滤结束后利用5mL的PBS溶液清洗，并利用4wt％的多聚甲醛固定15min，PBS溶液清洗后利用0.3vt％的Triton-X对细胞膜进行通透15min，PBS溶液清洗后加入3wt％的BSA溶液封闭15min，PBS溶液清洗去除多余的BSA，加入抗体CD45-PE染色1h，PBS溶液清洗后加入抗体PanCK-FITC染色1h，再次用PBS清洗去除多余的染料后加入DAPI染色15min，利用PBS溶液清洗过滤膜后，将过滤膜拿到荧光显微镜下鉴定检测到的CTC。同样的，表现为DAPI(+)、PanCK-FITC(+)、CD45-PE(-)的细胞即鉴定CTC，见图9。
同时，本测试例对3例健康志愿者的血样进行了检测。健康血样及病人血样的检测结果见表1。在健康人血样中不能检测出CTC，6例病人的7个血样中检测出0-35个CTC，且第一例病人治疗前后CTC的数量有明显变化。该结果表明，该微球增强的尺寸分离芯片在临床检测，尤其在病人疗效实时监测中具有一定的应用前景。
表1测试例6中M-ISET芯片从实际病人样本中分离出的CTC汇总
综述之，本发明构筑了可大通量检测的尺寸分离芯片，同时制备了修饰有亲和捕获分子的微球用于增强血样中靶细胞的尺寸以提高其分离效率。该微球增强的尺寸分离芯片对血样中的靶细胞具有极高的分离灵敏度和有效性，且能够有效分离实际病人血样中的CTC，在临床检测中具有一定的应用前景。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (17)
1.一种微球增强的尺寸分离芯片，其特征在于包括：
芯片主体，所述芯片主体包括腔室以及设置于所述腔室内的过滤膜，所述腔室与进样口和出样口连通，液体样品被从所述进样口注入所述腔室并经过所述过滤膜过滤后，再从所述出样口输出，所述过滤膜用于阻拦所述液体样品中的目标循环肿瘤细胞；
以及，至少用以对所述目标循环肿瘤细胞进行特异亲和捕获并使其尺寸增强的微球。
2.根据权利要求1所述的微球增强的尺寸分离芯片，其特征在于：所述微球包括复数个修饰有亲和捕获分子层的微米颗粒；优选的，所述微米颗粒包括硅球和/或磁性粒子；尤其优选的，所述硅球和/或磁性粒子具有氨基功能团和/或羧基功能团。
3.根据权利要求2所述的微球增强的尺寸分离芯片，其特征在于：所述亲和捕获分子层包括基于目标循环肿瘤细胞粘附蛋白筛选的特异性适配体和/或抗体或者所述特异性适配体和/或抗体的修饰化产物。
4.根据权利要求1或2所述的微球增强的尺寸分离芯片，其特征在于：所述微球的粒径尺寸为1～5μm。
5.根据权利要求1所述的微球增强的尺寸分离芯片，其特征在于：所述过滤膜的表面以及腔室的内壁上均覆设有抗粘附分子层；优选的，所述抗粘附分子层的材质包括聚乙二醇和/或牛血清白蛋白分子。
6.根据权利要求1或5所述的微球增强的尺寸分离芯片，其特征在于：所述腔室包括上腔室和下腔室，所述过滤膜设置于所述上腔室和下腔室之间，所述上腔室具有进样口，所述下腔室具有出样口；优选的，所述腔室的材质包括聚二甲基硅氧烷；优选的，所述上腔室或下腔室的深度为50～300μm。
7.根据权利要求1或5所述的微球增强的尺寸分离芯片，其特征在于：所述过滤膜的材质包括聚碳酸酯膜和/或二氧化硅；优选的，所述过滤膜所含通孔的孔径为5～10μm。
8.权利要求1-7中任一项所述的微球增强的尺寸分离芯片的制备方法，其特征在于包括：
1)采用阳模板分别制作上腔室、下腔室，提供过滤膜，并采用等离子处理将上腔室、下腔室和过滤膜进行集成，形成芯片主体；
2)提供原始微球，并在所述原始微球表面修饰连接亲和捕获分子层，获得具有亲和捕获功能的微球。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤1)还包括：将抗粘附分子水溶液通入所述芯片主体的上腔室和下腔室，从而在所述芯片主体的过滤膜的表面、上腔室和下腔室的内壁上形成抗粘附分子层。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤1)具体包括：采用3M胶带制版、掩模板刻蚀中的任一种方式制备阳模板，将聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂浇注在阳模板上，固化后剥离得到芯片主体的上腔室和下腔室，在所述上腔室和下腔室上分别开设进样口和出样口，之后采用等离子处理将上腔室、下腔室和过滤膜进行集成，形成芯片主体；优选的，所述上腔室和/或下腔室的材质包括聚二甲基硅氧烷；优选的，所述过滤膜的材质包括聚碳酸酯膜和/或二氧化硅；优选的，所述过滤膜所含通孔的孔径为5～10μm。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤1)还包括：将APTES的乙醇溶液充满所述芯片主体的腔室，室温反应1～2h，而后将1～2.5vt％戊二醛的PBS溶液充满所述芯片主体的腔室，室温反应1～4h，之后再将抗粘附分子水溶液充满所述芯片主体的腔室，4～25℃反应2～12h，从而得到所述的抗粘附分子层；优选的，所述抗粘附分子层的材质包括聚乙二醇和/或牛血清白蛋白分子。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2)具体包括：采用化学修饰的方法在原始微球上接枝链酶亲和素，之后将生物素修饰的亲和捕获分子水溶液与链酶亲和素修饰后的微球孵育，制得具有亲和捕获功能的微球。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于：所述微球包括复数个修饰有亲和捕获分子层的微米颗粒；优选的，所述微米颗粒包括硅球和/或磁性粒子；尤其优选的，所述硅球和/或磁性粒子具有氨基功能团和/或羧基功能团。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤2)具体包括：将原始微球配成浓度为1～2mg/mL的悬浮溶液与浓度为1～2.5vt％的戊二醛溶液混合均匀，搅拌反应1～2h，而后加入1～100μg/mL的链霉亲合素，室温反应2～4h，之后采用浓度为0.1～1μM的生物素修饰的DNA适配体或抗体溶液室温修饰2～4h，制得所述具有亲和捕获功能的微球。
15.权利要求1-7中任一项所述的微球增强的尺寸分离芯片于全血CTC检测和高效分离中的应用。
16.权利要求1-7中任一项所述的微球增强的尺寸分离芯片于制备用于CTC检测方法的检测装置的用途，所述的CTC检测方法包括：
将液体样品与0.4～0.8wt％的多聚甲醛溶液均匀混合5～15min，之后加入所述微球并在37℃、10～40r/min的条件下反应10～60min，使所述微球对液体样品中的目标循环肿瘤细胞进行特异亲和捕获并使其尺寸增强，获得孵育后的样品；
以0.1～10ml/min的进样速率将所述孵育后的样品加入芯片主体，对所述孵育后的样品进行尺寸分离使其留在过滤膜上，而后进行免疫荧光鉴定检测。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于：所述液体样品为血液样本，尤其包含实际临床病人样本。
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Cited By (2)
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