CN113804531B - 一种细胞高活性染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供了一种细胞高活性染色方法,所述方法包括:将包含目标细胞的样本和特异性的直标抗体混合;通过电极对样本中的目标细胞进行电穿孔标记,在电穿孔过程中,特异性的直标抗体进入目标细胞,完成特异性标记;对完成特异性标记的目标细胞进行静置,以使目标细胞的细胞膜复原。在本发明中,利用电穿孔方法将特异性的直标抗体导入目标细胞的过程中,不会对细胞造成不可逆的破坏,在完成电穿孔操作之后,目标细胞的细胞膜在10分钟内即可复原,恢复高活性且标记特异性接近100%。
Description
技术领域
本发明涉及生物/医学鉴定领域,具体涉及一种细胞高活性染色方法。
背景技术
免疫荧光染色是以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术,常应用于目标细胞的检出和鉴别。
通常采用的免疫荧光染色技术中,为了提高染色效率,一般需要固定、破膜、封闭、抗体孵育等一系列步骤。其中固定的目的是终止细胞内酶的活动及其他代谢活动,破膜是破坏细胞膜结构,暴露膜内抗原蛋白位点,保证抗原抗体有机会结合。上述步骤均为不可逆破坏,因此经过免疫荧光染色的细胞一般活性极低,无法实现下游细胞分析,如活细胞杨氏模量测量、增殖特性分析、转移特性分析等。此外,在传统的免疫荧光染色技术中整个实验需要耗时2小时以上(甚至过夜孵育),无法快速完成细胞染色。
总之,现有方法无法快速实现目标细胞的高特异性、高活性特异性标记。因此,目前亟需一种可以实现快速、高活性的目标细胞染色的方案。
发明内容
本发明涉及一种细胞高活性快速染色方法,该方法在保证高特异性细胞标记的同时可以保证细胞活性不受影响,该方法所需时间较短,染色效率远优于目前的染色方法。
为了解决上述问题,本发明实施例提供了一种细胞高活性染色方法,所述方法包括:
将含有目标细胞的样本和特异性的直标抗体混合;
通过电极对所述样本中目标细胞进行电穿孔标记,在标记过程中,所述特异性的直标抗体进入所述目标细胞,实现所述目标细胞的特异性标记;
对完成特异性标记的目标细胞进行静置处理,以使所述目标细胞的细胞膜复原。
可选地,在将包含目标细胞的样本和特异性的直标抗体混合之前,所述方法还包括:
对液基样本进行预处理,分离得到所述液基样本中的所述目标细胞。
可选地,所述对液基样本进行预处理,分离得到所述液基样本中的所述目标细胞,包括:
利用高孔隙多孔滤膜对所述液基样本进行过滤,将所述目标细胞分离、富集在所述高孔隙多孔滤膜之上。
可选地,所述高孔隙多孔滤膜的材料为聚对二甲苯,所述高孔隙多孔滤膜整体的大小范围为1mm2~400mm2;所述高孔隙多孔滤膜的膜孔为六边形膜孔,所述高孔隙多孔滤膜的模孔直径范围是2μm~100μm,孔间距小于10μm。
可选地,所述通过电极对所述目标细胞进行电穿孔标记,包括:将所述高孔隙多孔滤膜置于电极对之间,所述电极对连接一外部电脉冲发生器,所述电脉冲发生器向所述电极对施加电脉冲,以对所述目标细胞进行电穿孔标记。
可选地,所述特异性的直标抗体与传统免疫荧光染色所用抗体一致,用于特异性标记所述目标细胞。
可选地,对完成特异性标记的目标细胞进行静置处理之后,所述方法还包括:
对完成特异性标记的目标细胞进行原位培养,以对所述目标细胞进行下游分析。
本发明提出的一种细胞高活性染色方法,利用电穿孔方法将特异性的直标抗体导入目标细胞的过程中,不会对细胞造成不可逆的破坏,在完成电穿孔操作之后,目标细胞的细胞膜在10分钟以内可以快速复原,恢复高活性。
并且,在本发明实施例中,无需固定、破膜、封闭、抗体孵育等一系列步骤,利用电穿孔方法一步操作即可瞬时完成细胞快速、高活性、高特异性染色。
本发明提供的染色方法步骤简单、快速,染色效果稳定,可重复性高,适用于大体积临床样本中靶向细胞(如循环肿瘤细胞CTCs)的快速鉴定,且由于标记后活性高,可与下游多种分析方法兼容,可广泛推广应用于肿瘤早期诊断及转移机制研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的一种细胞高活性染色方法流程图;
图2是本发明实施例提供的一种细胞高活性染色方法操作流程图;
图3是本发明实施例提供的细胞高活性染色方法在标记效率及标记活性上与传统免疫荧光染色方法的对比结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在传统的免疫荧光染色技术中,目标细胞经过固定、破膜、封闭、抗体孵育等一系列的处理后,活性极低,无法实现下游细胞分析。
电穿孔技术是一种将外源性大分子引入细胞或细菌内的方法。其依据是当细胞受一定强度的电脉冲作用时,细胞膜或细胞壁上会可逆地形成纳米级的孔,从而允许大分子进入细胞或引发细胞融合。
基于此,本申请提出技术构思:利用电穿孔技术对目标细胞进行处理,将特异性的直标抗体导入目标细胞,对目标细胞进行特异性标记,完成标记后的目标细胞静置后,细胞膜复原,可以用于下游分析。
基于上述技术构思,本发明提出一种细胞高活性染色方法,如图1所示,所述方法包括以下步骤:
步骤S110,将含有目标细胞的样本和特异性的直标抗体混合。
在本发明实施例中,可以将含有目标细胞的样本盛放在特定装置内,并向该装置中加入特异性的直标抗体,以将目标细胞和特异性的直标抗体混合,从而进行后续的细胞染色操作。
在本发明实施例中,可以在标记之前选择性采用现有方法中的任意一种操作方法进行目标细胞预分选,例如利用外力场驱动的主动式细胞分离方法(声、电、光、磁等)或基于流体动力驱动的被动式细胞分离方法(挤压流分离、确定横向位移、螺旋惯性分离、过滤等)等相关操作,本发明对此不作特殊限制。
在实际应用中,在获取到液基样本(例如全血样本)之后,可以对该液基样本进行预处理,以分离得到液基样本中的目标细胞。
其中,预处理操作具体为分离操作,具体的分离方法可以为现有方法中的任意一种操作方法,例如:利用滤膜进行过滤,本申请对此不作特殊限制。
在一种可选的实施方式中,其中预处理操作可以为:利用高孔隙多孔滤膜对所述液基样本进行过滤,将所述目标细胞分离、富集在所述高孔隙多孔滤膜之上。
在本发明实施例中,所述高孔隙多孔滤膜的材料为聚对二甲苯,所述高孔隙多孔滤膜整体的大小范围为1mm2~400mm2;所述高孔隙多孔滤膜的膜孔为六边形膜孔,所述高孔隙多孔滤膜的模孔直径范围是2μm~100μm,孔间距小于10μm。
在本发明实施例中,高孔隙多孔滤膜的膜孔的直径小于目标细胞直径、大于背景细胞直径,因此,多孔滤膜可以从大量背景细胞(如白细胞)中分离出痕量目标细胞(如CTC),并且目标细胞落入孔内可实现目标细胞富集在高孔隙多孔滤膜之上。
具体地,在实际应用时,可以根据实际需要(例如:背景细胞大小、目标细胞大小)确定高孔隙多孔滤膜的模孔直径。
步骤S120,通过电极对所述目标细胞进行电穿孔标记,在标记过程中,所述特异性的直标抗体进入所述目标细胞,实现所述目标细胞的特异性标记。
在本发明实施例中,可以利用电极对目标细胞进行电穿孔标记,在本发明中,可以采用现有的任意一种电穿孔方法,对目标细胞进行标记,例如:利用传统平板电极电转杯进行细胞电穿孔,利用纳米孔的电场聚集效应来进行细胞高活性的电穿孔等。本发明对此不作特殊限制。
在本发明一种可选的实施方式中,电穿孔方法可以包括:
在所述高孔隙多孔滤膜两侧集成电极对,所述电极对连接一外部电脉冲发生器,所述电脉冲发生器向所述电极对施加电脉冲,以对所述目标细胞进行电穿孔标记。
具体地,在本发明实施例中,可以在高孔隙多孔滤膜两侧集成电极对,在利用该高孔隙多孔滤膜完成目标细胞的分离与富集之后,可以接通电源,利用该高孔隙多孔滤膜两侧集成的电极对外接的电脉冲发生器向所述电极对施加电脉冲,以对所述目标细胞进行电穿孔。
在电穿孔的过程中,细胞的细胞膜上会可逆地形成纳米级的孔,从而允许提前加入的特异性的直标抗体进入细胞,实现细胞染色。
在本发明实施例,所用的特异性的直标抗体与传统免疫荧光染色所用抗体一致,用于特异性标记所述目标细胞,以完成细胞染色。
步骤S130,对完成特异性标记的目标细胞进行静置处理,以使所述目标细胞的细胞膜复原。
在本发明实施例中,在完成电穿孔标记之后,静置完成特异性标记的目标细胞,以使目标细胞的细胞膜复原,在本发明实施例中,静置10分钟左右可以实现目标细胞的细胞膜复原。
在一种可选的实施例中,在对完成特异性标记的目标细胞进行静置处理之后,所述方法还包括:
对完成特异性标记的目标细胞进行原位培养,以对所述目标细胞进行下游分析。
具体地,当利用集成了电极对的高孔隙多孔滤膜进行细胞高活性染色时,可以在完成电穿孔标记之后,在该高孔隙多孔滤膜上对目标细胞进行原位培养,以对目标细胞进行下游分析。在本发明实施例中,下游分析具体可以包括:活细胞杨氏模量测量、增殖特性分析、转移特性分析。
本发明提出的一种细胞高活性染色方法,利用电穿孔方法将特异性的直标抗体导入目标细胞的过程中,不会对细胞造成不可逆的破坏,在完成电穿孔操作之后,10分钟以内目标细胞的细胞膜即可复原,恢复细胞高活性。
并且,在本发明实施例中,利用电穿孔方法完成细胞高活性染色,无需固定、破膜、封闭、抗体孵育等一系列步骤,可在10分钟内实现目标细胞的高活性、特异性染色,染色效率大于80%,染色活性大于80%,染色特异性接近100%。从而本发明可以快速的实现细胞的高活性、高特异性染色。
图2为本发明提供的一种具体的细胞高活性染色方法操作流程图,如图2所示,在实际应用过程中,细胞高活性染色方法操作流程主要包括:临床预处理(a),经过特异性抗体电穿孔(b)、细胞膜复原(c)两个流程后,实现目标细胞高特意性染色(d)。
所述操作流程具体包括:全血临床样本经过高孔隙率多孔滤膜1进行预处理操作,目标细胞3(如CTC)被俘获在高孔隙率多孔滤膜的滤孔2上,背景细胞4(如白细胞)因为细胞直径较小、细胞较软穿过高孔隙率多孔滤膜的滤孔2,随全血临床样本被滤出。待完成全临床血样本的预处理操作后,目标细胞3被俘获到高孔隙率多孔滤膜1上。
此时,引入特异性荧光抗体标记物7,在电极对电穿孔的作用下,目标细胞通透性增大,在细胞膜5上形成纳米级的孔,特异性荧光抗体标记物7被导入细胞内,完成目标细胞胞内抗原位点6的标记。
其中,引入特异性荧光抗体标记物,具体包括:将特异性荧光抗体标记物以1:50-1:200的比例加入至电穿孔缓冲液中,并将该电穿孔缓冲液引入捕获了目标细胞的高孔隙率多孔滤膜上。
在完成目标细胞的标记之后,进行细胞膜复原操作,具体为:静置完成目标细胞的标记10分钟左右,得到复原后的细胞膜8。
经过上述步骤实现目标细胞高特意性染色,得到染色后的目标细胞9。
图3示出了采用上述染色方法操作流程进行细胞染色的效率、染色后细胞的活性和采用传统免疫荧光法进行细胞染色的效率、染色后细胞活性的对比。
由图可知,与传统免疫荧光法相比,本发明提供的基于电穿孔的细胞染色法的标记效率和细胞活性都具有大幅度的提升。采用本发明提供的细胞染色方法可在10分钟内实现大规模背景细胞下痕量目标细胞的高活性、特异性染色,其中染色效率大于80%,染色活性大于80%,染色特异性接近100%。
对于方法实施例,为了简单描述,故将其都表述为一系列的动作组合,但是本领域技术人员应该知悉,本发明并不受所描述的动作顺序的限制,因为依据本发明,某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次,本领域技术人员也应该知悉,说明书中所描述的实施例均属于优选实施例,所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
以上对本发明所提供的一种目标细胞高活性分选及标记的原位电穿孔芯片、装置及方法进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本发明的思想,在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处,综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (3)
1.一种细胞高活性染色方法,其特征在于,所述方法包括:
利用高孔隙多孔滤膜对液基样本进行过滤,将痕量目标细胞分离、富集在所述高孔隙多孔滤膜之上;所述高孔隙多孔滤膜的膜孔的直径小于痕量目标细胞直径、大于背景细胞直径,所述痕量目标细胞落入膜孔内实现痕量目标细胞富集在高孔隙多孔滤膜之上,背景细胞穿过高孔隙率多孔滤膜的滤孔,随液基样本被滤出;
将特异性荧光抗体标记物以1:50-1:200的比例加入至电穿孔缓冲液中,并将该电穿孔缓冲液引入捕获了痕量目标细胞的高孔隙率多孔滤膜上;
所述高孔隙多孔滤膜两侧集成有电极对,所述电极对连接一外部电脉冲发生器,在利用所述高孔隙多孔滤膜完成痕量目标细胞的分离与富集之后,接通电源,所述电脉冲发生器向所述电极对施加电脉冲,以对所述痕量目标细胞进行电穿孔标记,在标记过程中,所述特异性的直标抗体进入所述痕量目标细胞,实现所述痕量目标细胞的特异性标记;
对完成特异性标记的富集在高孔隙多孔滤膜之上的痕量目标细胞进行静置处理,以使所述痕量目标细胞的细胞膜复原;
在所述高孔隙多孔滤膜上对痕量目标细胞进行原位培养,以对痕量目标细胞进行下游分析。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述高孔隙多孔滤膜的材料为聚对二甲苯,所述高孔隙多孔滤膜整体的大小范围为1mm2~400mm2;所述高孔隙多孔滤膜的膜孔为六边形膜孔,所述高孔隙多孔滤膜的模孔直径范围是2μm~100μm,孔间距小于10μm。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述特异性的直标抗体与传统免疫荧光染色所用抗体一致,用于特异性标记所述痕量目标细胞。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN102753199A (zh) * | 2010-01-20 | 2012-10-24 | 葛莱高托普有限公司 | 癌干细胞标记物及其用途 |
CN109999248A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-07-12 | 北京大学 | 活体动物循环肿瘤细胞体外功能化仪器 |
CN112608820A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-06 | 北京大学 | 一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用 |
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单细胞分析中的荧光标记化学;朱兰兰等;《化学进展》;20081224(第12期);全文 * |
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CN113804531A (zh) | 2021-12-17 |
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