CN112608820A - 一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用，该方法主要包括：先利用高孔隙率精准微孔滤膜对样本中的背景细胞和稀有目标细胞分别实现初次高效率去除与回收；再利用与背景细胞特异结合的免疫磁珠对背景细胞进行再次去除；最后，再次利用微孔滤膜对稀有目标细胞进行回收和富集。本发明提供的“先滤膜过滤，再磁珠负选”的方法，在实现背景细胞最大限度去除，保证稀有目标细胞高细胞活性、高体积通量、高灵敏度、高纯度分离与富集的同时，降低了免疫磁珠用量及经济成本。因此，本发明提供的方法，不仅操作流程简单、集成度高，避免了离心、液体转移等造成的细胞活性降低；而且经济成本低、装置便携，应用范围广、潜能大。

Description

一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用
技术领域
本发明涉及生物医学基础研究及临床医学领域，特别是涉及一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的重大医学问题，2015年中国恶性肿瘤流行情况分析指出，我国平均每分钟有7人被诊断为肿瘤，4人死于肿瘤。近年来，液体活检已发展成为癌症精准医疗的关键技术之一。从液体中分离富集稀有细胞的液体活检技术在癌症早期检测和动态预后监测中具有巨大的应用前景。液体活检方法主要可分为基于物理性质分离和基于生物亲和性分离两类。基于物理性质的稀有目标细胞分离方法可以保留稀有目标细胞的异质性，并且能够实现全部稀有目标细胞的富集。其中，基于尺寸分离的微孔过滤法已被公认为有望实现高通量分离，满足处理实际临床样品需求。然而，由于稀有目标细胞与其他血细胞在尺寸上有一定重叠，使得通过微孔过滤法富集液体中稀有目标细胞纯度较低。
目前，逐渐有研究者将基于生物亲和性分离和尺寸分离相结合，通过复合方式扬长避短，提高稀有目标细胞的分离富集效果。如在专利CN104178454A分离富循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)过程中，先通过免疫磁珠法去除大部分白细胞，再基于尺寸进行过滤式富集。该方法虽然提高了富集效率(富集效率>80％)，对白细胞的去除效率>99.9％，但由于血液中白细胞数量(～107/mL)相对于CTC(1～10/mL)较多，导致最终得到的CTC悬液纯度依然较低。假设5mL血液样本中含有5×107个白细胞，50个CTCs，通过上述方法进行CTC富集后即使白细胞去除效率>99.9％，相较于50个CTCs，最终CTC悬液中白细胞(5×104)残留较多，阻碍对细胞提出高细胞活性和高纯度要求的下游分析。同时，由于血液中白细胞数量较多，富集过程中需消耗大量生物亲和性磁珠，经济成本高，在实际应用中仍有很大局限。
稀有细胞的单细胞组学分析、肿瘤类器官培养及药物耐药性分析等近年来发展迅速。从复杂液体样品中高效地分离、富集稀有目标细胞是下游平台精准检测和分析的关键前提。与传统分离方法(连续稀释法、显微操作法、激光捕获显微切割术、拉曼镊技术、微流控技术、荧光激活细胞分选术)相比，通过先进微纳米技术分离与富集得到的稀有细胞有望实现高细胞活性、高通量、高灵敏度、高纯度等优点，满足下游单细胞组学分析对样品的要求。以单细胞转录组测序为例，细胞纯度和活性是保证分析质量的关键。
综上，亟需一种高细胞活性、高体积通量、高灵敏度、高纯度、强普适性、低成本的稀有目标细胞分离与富集方法。
发明内容
为解决上述背景技术中存在的问题，本发明提供了一种高细胞活性稀有目标细胞分离与富集的方法，该方法将基于物理尺寸差异分离的微孔滤膜法和基于生物亲和性的免疫磁珠负选法进行综合，并基于微孔滤膜法对提纯后的稀有目标细胞进行富集，通过该方法可实现对稀有目标细胞的高细胞活性、高体积通量、高灵敏度、高纯度、强普适性、低成本的分离与富集。
其中，本发明将高孔隙率精准微孔滤膜过滤与磁珠负选法结合，综合两者的优势，采用高孔隙率精准微孔滤膜对稀有目标细胞进行初级回收的同时，去除大量的背景细胞是本专利区别于已有专利的核心优势，具体如下：一方面，提高了后续免疫磁珠负选的效率，使背景细胞被最大限度地去除，实现了稀有目标细胞的高体积通量、高纯度分离与富集；另一方面，降低免疫磁珠使用量，从而降低经济成本，扩大了本发明的应用范围和转化潜能。同时，本发明提供的方法，采用免疫磁珠负选能够将具有生化异质性的所有亚型目标细胞全部分离与富集，保证了稀有目标细胞分离与富集的灵敏度；且操作对稀有细胞不会有损伤，保证了稀有细胞的活性。并且，本发明提供的方法，操作流程简单、集成度高，避免了离心、液体转移等造成细胞回收灵敏度和活性被降低，再次保证了稀有目标细胞分离与富集的高细胞活性、高灵敏度。
第一方面，本发明提供了一种高细胞活性稀有目标细胞分离与富集的方法，所述方法包括：
步骤1，通过表面功能化修饰的微孔滤膜，对复杂液体样品进行分离，使得稀有目标细胞被俘获于微孔滤膜；所述复杂液体样品包括稀有目标细胞和背景细胞；
步骤2，激活俘获有稀有目标细胞的微孔滤膜的表面功能化修饰层，使得所述微孔滤膜上的稀有目标细胞被释放/回收到预处理后的低吸附样品管中，得到初级稀有目标细胞悬液；
步骤3，基于生物亲和性原理去除所述初级稀有目标细胞悬液中混有的背景细胞，得到次级稀有目标细胞悬液；
步骤4，通过所述表面功能化修饰的微孔滤膜，对所述次级稀有目标细胞悬液中的稀有目标细胞进行回收、释放与富集，得到稀有目标细胞悬液。
可选地，所述表面功能化修饰的微孔滤膜包括微孔滤膜基体和表面功能修饰剂；
所述表面功能修饰剂附着在所述微孔滤膜基体的表面。
可选地，制备所述微孔滤膜基体的材料包括聚对二甲苯、硅、氮化硅、钯、SU8和聚二甲基硅氧烷中的任意一种；
所述表面功能修饰剂为具有生物兼容性好、易于可控切换的材料，包括聚乙烯醇、海藻酸凝胶、明胶、胶原中的任意一种；其中，所述可控切换是指结构或性能可切换，包括聚合大分子溶解成小分子、固态相变为液态、亲水性切换成疏水性中的任意一种或多种。
可选地，所述表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的形状包括：正六边形、圆形、正四边形、正三边形中的任意一种；
所述表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的直径，根据所述稀有目标细胞的直径确定；相邻膜孔间的连接部分的最大距离小于所述背景细胞直径的一半。
可选地，所述表面功能化修饰的微孔滤膜，是按照以下步骤获得的：
步骤S11，通过表面功能修饰剂溶液润湿载破片，并将微孔滤膜基体放置于所述润湿后的载玻片上；
步骤S12，通过旋涂的方式，在所述微孔滤膜基体的表面，覆盖所述表面功能修饰剂溶液，得到表面功能化修饰的微孔滤膜初品；
步骤S13，室温晾干所述微孔滤膜初品，得到表面功能化修饰的微孔滤膜。
可选地，在所述步骤2之前，所述方法还包括：
对用于存放所述稀有目标细胞悬液的样品管进行预处理；所述预处理包括：基于低吸附处理试剂，对所述样品管的内壁进行表面低吸附处理。
其中，所述低吸附处理试剂包括：全氟辛基三氯硅烷、牛血清白蛋白、聚乙二醇、聚乙烯醇中的任意一种；
可选地，所述基于生物亲和性原理去除所述初级稀有目标细胞悬液中的背景细胞，包括：
通过具有生物亲和性的免疫磁珠，进一步去除所述初级稀有目标细胞悬液中的背景细胞；
其中，所述生物亲和性的免疫磁珠是指：偶联有与所述背景细胞进行特异性结合的生物亲和性分子的免疫磁珠；
所述生物亲和性分子包括抗体、核酸适配体中的一种或多种。
可选地，所述复杂液体样品包括：人或动物的血液、尿液、肺泡灌洗液、胸水、腹水、脑脊液或痰液中的任意一种；
所述复杂液体样品中的稀有目标细胞包括：肿瘤细胞、上皮细胞、巨噬细胞、胞外囊泡、细菌或真菌中的任意一种。
第二方面，本发明提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的装置，所述装置包括：表面功能化修饰的微孔滤膜，一体化芯片，磁铁，注射泵；
所述装置用于执行上述第一方面所述的高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法。
第三方面，本发明提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法的应用，具体实施时，将上述第一方面所述的方法，应用于从含有背景细胞的复杂液体样品中提取稀有目标细胞；或
将上述第一方面所述的方法，应用于制备待检测的细胞样本。
本发明实施例提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用，该方法包括：通过表面功能化修饰的微孔滤膜，对复杂液体样品进行分离，使得稀有目标细胞被俘获于微孔滤膜；激活俘获有稀有目标细胞的微孔滤膜的表面功能化修饰层，使得释放微孔滤膜上的稀有目标细胞被释放，得到初级稀有目标细胞悬液；基于生物亲和性原理去除初级稀有目标细胞悬液中的背景细胞，得到次级稀有目标细胞悬液；通过表面功能化修饰的微孔滤膜，对次级稀有目标细胞悬液中的稀有目标细胞进行回收、富集与释放，得到稀有目标细胞悬液。通过本发明提供的方法，可以实现大体积复杂液体样品中稀有目标细胞的高细胞活性、高体积通量、高灵敏度、高纯度、强普适性、低成本的分离与富集。
与现有技术相比，本发明包括以下优点：
1、本发明表面功能化修饰的微孔滤膜，具有独特的2.5D结构(即，超薄结构，约10μm左右)、超大面积(>20mm×20mm)、大的厚/宽比(10μm/<4μm)，且具有超高孔隙率(>50％)等特点，从而可实现在存在大量背景细胞的情况下，稀有目标细胞高效率、高体积通量地被分离与富集。
2、本发明表面功能化修饰的微孔滤膜的孔-孔间距小，且采用基于物理尺寸差异分离的微孔滤膜法，仅在重力作用下过滤，不需要任何额外的压力载荷，对细胞损伤小，在保留生化异质性的同时实现稀有目标细胞的高细胞活性分离及富集。
3、本发明采用免疫磁珠负选法，由于稀有目标细胞不会与免疫磁珠结合，一方面，能够将具有生化异质性的所有亚型目标细胞全部分离与富集，保证了稀有细胞分离与富集的灵敏度；并且，因稀有目标细胞未与免疫磁珠结合，从而避免了结合过程对稀有目标细胞造成的损伤，进而保证了所分离与富集的稀有目标细胞的高活性。另一方面，解决了由于与稀有目标细胞结合的生物亲和性分子弱表达而造成的稀有目标细胞分离与富集灵敏度低的问题；与磁珠正选法相比，磁珠负选法可以保持稀有目标细胞的生化多样性/异质性不受影响，有利于保证稀有目标细胞下游分析检测信息的完整性。
4、本发明将基于物理尺寸差异分离的微孔滤膜法和基于生物亲和性的免疫磁珠负选法综合优化，首先通过基于物理尺寸差异分离的微孔滤膜法去除大数量级的背景细胞，然后再通过基于生物亲和性原理的免疫磁珠法，进一步去除背景细胞，提升了背景细胞的去除性能，从而提高了稀有目标细胞悬液纯度，实现了大体积复杂液体样品中稀有目标细胞的高效率、高纯度分离。
综上，本发明的一大亮点是首先采用高孔隙率精准微孔过滤，高体积通量地去除大数量级的背景细胞，可以带来很大优势：一方面，后续的免疫磁珠负选过程中背景细胞的去除效率提高，从而保证稀有细胞的分离纯度；另一方面，在后续的免疫磁珠去除过程中，磁珠的消耗量大大减少，从而降低了稀有目标细胞分离与富集的经济成本。因此说，本发明提供的方法，在保证稀有目标细胞分离与富集高细胞活性与高灵敏度的前提下，在实现背景细胞的高效率去除、提高稀有目标细胞的分离纯度的同时，降低了经济成本，有利于扩大该方法的应用范围、增大转化潜能。
附图说明
图1是本发明实施例中一种高细胞活性稀有细胞分离与富集方法的操作示意图；
图2是本发明实施例中一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的装置(以循环肿瘤细胞为例)。
图1中的附图标记如下：
1-样品管，2-与稀有目标细胞存在尺寸重叠的背景细胞，3-与稀有目标细胞不存在尺寸重叠的背景细胞，4-稀有目标细胞，5-表面功能化修饰的微孔滤膜膜孔，6-表面功能化修饰的微孔滤膜膜孔连接部分，7-离心管，8-免疫磁珠，9-环形磁铁。
图2中的附图标记如下：
1-第一注射泵，2-磁铁，3、一体化芯片的细胞释放槽，4-一体化芯片的基体，5-一体化芯片的表面功能化修饰的微孔滤膜，6-第二注射泵。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本实施例采用基于物理尺寸差异分离的微孔滤膜法与基于生物亲和性原理分离的免疫磁珠负选法结合的方式，首先采用微孔滤膜对液体进行过滤，初步去除大量的背景细胞，然后利用免疫磁珠与背景细胞特异性结合负性去除剩余的背景细胞。在两种方法复合过滤中，保证稀有目标细胞活性并保留生化异质性的同时提高稀有目标细胞回收率和纯度，降低了磁珠的消耗量/经济成本，从而实现了稀有目标细胞高细胞活性、高通量、高灵敏度、高纯度分离与富集。具体地，本实施例中采用的液体样品可以是外周血。
第一方面，本发明提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法，图1是本发明实施例中一种高细胞活性稀有细胞分离与富集方法的操作示意图；如图1所示，该方法包括：
步骤1，通过表面功能化修饰的微孔滤膜，对复杂液体样品进行分离，使得稀有目标细胞被回收于微孔滤膜；该复杂液体样品包括稀有目标细胞和背景细胞。
具体实施时，将液体通过表面功能化修饰的微孔滤膜，俘获稀有目标细胞。其中，俘获的稀有目标细胞被回收于表面功能化修饰的微孔滤膜上；并且，由于此步骤中俘获的稀有目标细胞中仍然混有部分背景细胞，因而，还需对俘获的细胞进行释放/回收并进一步提纯。
步骤2，激活回收有稀有目标细胞的微孔滤膜的表面功能化修饰层，使得该微孔滤膜上的稀有目标细胞被释放/回收到预处理后的低吸附样品管中，得到初级稀有目标细胞悬液。
具体实施时，由于需要对稀有目标细胞作进一步提纯，因而需先将步骤1中的微滤滤膜上的细胞释放到容器(如，样品管7)中。又由于细胞与微孔滤膜之间存在表面功能化修饰结构的介导，因此，在释放细胞时，需激活微孔滤膜的表面功能化修饰层，使所俘获的稀有目标细胞从滤膜上被释放/回收至预处理后的低吸附样品管中。此时，该样品管中盛放的是初级稀有目标细胞悬液。需要指出的是，该初级稀有目标细胞悬液中仍然含有部分背景细胞。
步骤3，基于生物亲和性原理去除初级稀有目标细胞悬液中混有的背景细胞，得到次级稀有目标细胞悬液。
本实施步骤中，为了确保最终所分离与富集的稀有目标细胞的生化异质性，采用免疫磁珠负选法，从初级稀有目标细胞悬液中，将与免疫磁珠进行特异性结合的背景细胞去除，留下不与免疫磁珠结合的稀有目标细胞。通过该负选法，一方面，能够将具有生化异质性的所有亚型目标细胞全部分离与富集，保证了稀有细胞分离与富集的灵敏度；另一方面，由于稀有目标细胞未与免疫磁珠结合，因而避免了结合过程对稀有目标细胞造成的损伤，从而保证了所分离与富集的稀有目标细胞的高细胞活性。
具体实施时，通过具有生物亲和性的免疫磁珠，进一步去除初级稀有目标细胞悬液中的背景细胞，得到次级稀有目标细胞悬液。其中，生物亲和性的免疫磁珠是指：免疫磁珠上偶联有与背景细胞进行特异性结合的生物亲和性分子。
本实施例中，可选地，生物亲和性分子包括抗体、核酸适配体中的一种或多种。
步骤4，通过表面功能化修饰的微孔滤膜，对次级稀有目标细胞悬液中的稀有目标细胞进行回收、富集与释放，得到稀有目标细胞悬液。
具体实施时，对去除背景细胞后的次级稀有目标细胞悬液在微孔滤膜上重复步骤(1)以高效率回收稀有目标细胞，最终得到高细胞活性、高纯度的稀有目标细胞悬液。其中，该步骤中所用的微孔滤膜，是与步骤1中所用的微孔滤膜相同的未使用过的新滤膜。
本实施例中，可选地，表面功能化修饰的微孔滤膜包括微孔滤膜基体和表面功能修饰剂；表面功能修饰剂覆盖在微孔滤膜基体的表面。
本实施例中，可选地，制备微孔滤膜基体的材料包括聚对二甲苯、硅、氮化硅、钯、SU8和聚二甲基硅氧烷中的任意一种；
表面功能修饰剂为具有生物兼容性好、易于可控切换的材料，包括聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol，PVA)、海藻酸凝胶、明胶、胶原中的任意一种；其中，可控切换是指结构或性能可切换，包括聚合大分子溶解成小分子、固态相变为液态、亲水性切换成疏水性中的任意一种或多种。
本实施例中，可选地，表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的形状包括：正六边形、圆形、正四边形、正三边形中的任意一种；
为了使稀有目标细胞被俘获在表面功能化修饰的微孔滤膜的表面，本实施例中，表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的直径，根据稀有目标细胞的直径确定，具体的膜孔直径的确定，可综合稀有目标细胞和背景细胞尺寸来确定，旨在最大限度提高稀有目标细胞俘获效率及降低背景细胞俘获效率。也就是说，既要保证滤膜膜孔能够收集稀有目标细胞，同时又要过滤去除掉背景细胞。
为了使背景细胞可以随液体大通量地通过表面功能化修饰的微孔滤膜，且确保稀有目标细胞尽可能地被俘获在表面功能化修饰的微孔滤膜表面，本发明中采用的微孔滤膜中，其孔-孔间距较小，以使孔隙率高、过滤面积大，以保证高体积通量过滤；并且滤膜厚度薄，以降低过滤过程中液体对细胞的压力，从而保证高细胞活性。本实施例中，为了防止背景细胞非特异性吸附，相邻膜孔间的连接部分的最大距离小于背景细胞直径的一半。
本实施例中，表面功能化修饰的微孔滤膜，是按照以下步骤获得的：
步骤S11，通过表面功能修饰剂溶液润湿载破片，并将微孔滤膜基体放置于润湿后的载玻片上；
步骤S12，通过旋涂的方式，在微孔滤膜基体的表面，覆盖表面功能修饰剂溶液，得到表面功能化修饰的微孔滤膜初品；
步骤S13，室温晾干微孔滤膜初品，得到表面功能化修饰的微孔滤膜。
本实施例中，为防止细胞非特异性粘附在样品管7的内壁上，可以提前对样品管7的内壁进行表面低吸附处理。可选地，在步骤2之前，该方法还包括：
对用于存放稀有目标细胞悬液的样品管进行预处理。该预处理包括：基于低吸附处理试剂，对样品管的内壁进行表面低吸附处理。
本实施例中，可选地，低吸附处理试剂包括：全氟辛基三氯硅烷(PerfluorooctylTrichlorosilane)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)、聚乙二醇(PolyethyleneGlycol，PEG)、聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol，PVA)中的任意一种；
本实施例中，可选地，复杂液体样品包括：人或动物的血液、尿液、肺泡灌洗液、胸水、腹水、脑脊液或痰液中的任意一种。
本实施例中，可选地，复杂液体样品中的稀有目标细胞包括：肿瘤细胞、上皮细胞、巨噬细胞、胞外囊泡、细菌或真菌中的任意一种。
为使本领域技术人员更好地理解本发明，以下通过具体的实施例来说明本发明提供细胞分离与富集方法。
实施例1
1、样本处理
3mL未稀释全血中定量加入A549细胞(数目为N0，Cell Tracker Red预染)，得到模拟肿瘤血样。
2、微孔滤膜法分离
使用10μm孔径，4μm孔-孔间距的表面功能化修饰的微孔滤膜(经PVA表面修饰)过滤模拟肿瘤血样，部分白细胞和A549存在尺寸重叠，所以加入的A549和部分尺寸较大的白细胞同时被俘获到表面功能化修饰的微孔滤膜上。
3、释放表面功能化修饰的微孔滤膜上俘获的细胞
将表面功能化修饰的微孔滤膜上俘获的A549和尺寸较大的白细胞释放到不大于500μL体积的PBS溶液中，然后向该PBS溶液中加入CD45免疫磁珠，得到A549、尺寸较大的白细胞和CD45免疫磁珠混合悬液，并将所得的混合悬液放置于低吸附EP管内，并使用封片剂将释放后的第一张表面功能化修饰的微孔滤膜(带有残存细胞)封片；
本实施例中的低吸附EP管的低吸附预处理步骤为：通过1％BSA的预处理试剂，采用涂覆的方式，对EP管的内壁进行表面低吸附处理，得到低吸附EP管。
需要说明的是，在本实施步骤中，可根据实际情况(如，磁珠货源、磁珠规格等)，确定投加CD45免疫磁珠的量。
4、免疫磁珠孵育
对步骤3中得到的A549、尺寸较大的白细胞和CD45免疫磁珠混合悬液进行孵育；在孵育过程中，保持混匀(旋转震荡或者涡旋)状态，孵育时间可以为30min。
5、免疫磁珠负选法去除白细胞
装有CD45磁珠/细胞悬液的EP管置于磁力架上，室温静置，至磁珠被吸到接触磁力架的管壁上，液体变澄清，取澄清液通过第二张10μm孔径表面功能化修饰的微孔滤膜过滤，实现对有目标细胞A549的回收、富集，并使用封片剂将第二张表面功能化修饰的微孔滤膜封片；
6、细胞鉴定和计数
镜下观察，计数第一张滤膜上A549(N1A)、第二张滤膜上A549(N2A)和WBC(N2W)，计算A549回收效率及纯度，实验结果详见表1。
表1.模拟肿瘤血样分离A549实验结果
实验组 N<sub>0</sub> N<sub>1A</sub> N<sub>2A</sub> N<sub>2W</sub> 回收效率 纯度
1 92 31 56 9 60.9％ 86.2％
2 87 15 66 9 75.9％ 88.0％
3 12 2 10 4 83.3％ 71.4％
4 180 5 163 14 90.6％ 92.1％
从表1中计算分析可以得出，本发明提出的分离富集分析方法实现了大体积液体样本中稀有目标细胞的高效(高回收效率、高纯度)分离。其中，平均回收率为77.7±12.7％，回收后的稀有目标细胞的纯度为84.4±9.0％。
并且，随着A549细胞数目含量的升高，回收率随之增高。其中，回收率＝N2A/N0；纯度＝N2A/(N2W+N2A)。
本实施例与CTC其他分离原理的对比分析结果如表2所示，针对不同分离方法CTC的回收率以及CTC的纯度进行比较。
表2.本实施例与其他分离方法的比较
Figure BDA0002838747430000121
Figure BDA0002838747430000131
其中，方案1中，分离方法为：先磁珠负选，再滤膜过滤；其免疫磁珠结合原理为：包覆CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a中两种或两种以上抗体的磁珠结合并分离白细胞；其参考文件为Jiasen Xu et al.；方案2中，分离方法为：先磁珠正选，再滤膜过滤；其免疫磁珠结合原理为：包覆EpCAM抗体的磁珠结合并分离高表达EpCAM抗原的MCF7细胞；其参考文件为Yao-Kuang Chung et al.；方案3中，分离方法为：先磁珠正选，再磁珠负选，最后滤膜过滤；其免疫磁珠结合原理为：包覆EpCAM抗体的磁珠结合并分离高表达EpCAM抗原的MCF-7/KATO III/PC-3细胞同时包覆CD45抗体的磁珠结合并分离白细胞；其参考文件为Na Sun et.al.；本发明实施例中，分离方法为：先滤膜过滤，再磁珠负选；其免疫磁珠结合原理为：包覆CD45抗体的磁珠结合并分离白细胞。
第二方面，本发明实施例提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的装置，所述装置包括：表面功能化修饰的微孔滤膜，一体化芯片，磁铁，注射泵；所述装置用于执行上述第一方面所述的稀有细胞分离与富集的方法。
实施例2
本实施提供的一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的装置，可以应用于下游单细胞组学分析，实现大体积复杂液体样本中稀有目标细胞的分离与富集。
针对单细胞组学分析对检测样品提出的高细胞活性、高纯度要求，本实施例提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的装置，如图2所示，本发明实施例提供的高细胞活性稀有细胞分离与富集的装置，包括：1-第一注射泵，2-磁铁，3-一体化芯片的细胞释放槽，4-一体化芯片的基体，5-一体化芯片的表面功能化修饰的微孔滤膜，6-第二注射泵。本实施例中，一体化芯片采用聚二甲基硅氧烷制备。
具体实施时，该装置可在一体化芯片内完成细胞释放、磁珠孵育以及回收稀有目标细胞悬液导出工作。参照图2，以分离与富集CTCs为例，具体操作步骤包括：
1、对高细胞活性稀有细胞分离与富集装置中一体化芯片(包括一体化芯片的细胞释放槽(3)、一体化芯片的基体(4))进行疏水处理；
2、将实施例1中步骤2过滤后表面功能化修饰的微孔滤膜CTCs(5)面朝下，与一体化芯片下端中心的细胞释放槽(3)对准后将一体化芯片上下层夹封；
3、通过第一注射泵(1)，经一体化芯片的B口注入释放缓冲液，液体流经表面功能化修饰的微孔滤膜(5)同时激活微孔滤膜(5)的表面功能化修饰层，使得微孔滤膜(5)上的CTCs被释放至细胞释放槽(3)中；
其中，在实际操作中，可根据具体需求确定缓冲液的释放量，例如，上述释放量为20μL左右；
4、通过第二注射泵(6)，经一体化芯片的A口注入与白细胞特异性结合的免疫磁珠，以一定速率间隔交替抽吸A/B两端的注射泵，实现免疫磁珠均匀孵育；
5、利用一体化芯片下端放置的磁铁(2)，将与免疫磁珠进行特异性结合的白细胞去除，纯化CTCs，室温静置，至免疫磁珠被吸到磁铁(2)上，液体变澄清，将澄清液用第二注射泵(6)经A口吸出，得到高细胞活性、高纯度的CTCs悬液；
6、选择合适的下游样品制备及测序平台，将得到的高细胞活性、高纯度的CTCs悬液进行后续单细胞组学分析。
第三方面，本发明实施例提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法的应用，具体实施时，将上述第一方面所述的方法，应用于从含有背景细胞的复杂液体样品中提取稀有目标细胞；或
将上述第一方面所述的方法，应用于制备待检测的细胞样本，特别是应用于对下游检测样本有高细胞活性、高纯度要求的场景中。
对于方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
以上对本发明所提供的一种高细胞活性细胞分离与富集的方法及装置和应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1，通过表面功能化修饰的微孔滤膜，对复杂液体样品进行分离，使得稀有目标细胞被俘获于微孔滤膜；所述复杂液体样品包括稀有目标细胞和背景细胞；
步骤2，激活俘获有稀有目标细胞的微孔滤膜的表面功能化修饰层，使得所述微孔滤膜上的稀有目标细胞被释放/回收到预处理后的低吸附样品管中，得到初级稀有目标细胞悬液；
步骤3，基于生物亲和性原理负选去除所述初级稀有目标细胞悬液中混有的背景细胞，得到次级稀有目标细胞悬液；
步骤4，通过所述表面功能化修饰的微孔滤膜，对所述次级稀有目标细胞悬液中的稀有目标细胞进行回收、富集与释放，得到稀有目标细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面功能化修饰的微孔滤膜包括微孔滤膜基体和表面功能修饰剂；
所述表面功能修饰剂附着在所述微孔滤膜基体的表面。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，制备所述微孔滤膜基体的材料包括聚对二甲苯、硅、氮化硅、钯、SU8和聚二甲基硅氧烷中的任意一种；
所述表面功能修饰剂为具有生物兼容性好、易于可控切换的材料，包括聚乙烯醇、海藻酸凝胶、明胶、胶原中的任意一种；其中，所述可控切换是指结构或性能可切换，包括聚合大分子溶解成小分子、固态相变为液态、亲水性切换成疏水性中的任意一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的形状包括：正六边形、圆形、正四边形、正三边形中的任意一种；
所述表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的直径，根据所述稀有目标细胞的直径确定；相邻膜孔间的连接部分的最大距离小于所述背景细胞直径的一半。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，所述表面功能化修饰的微孔滤膜，是按照以下步骤获得的：
步骤S11，通过表面功能修饰剂溶液润湿载破片，并将微孔滤膜基体放置于所述润湿后的载玻片上；
步骤S12，通过旋涂的方式，在所述微孔滤膜基体的表面，覆盖所述表面功能修饰剂溶液，得到表面功能化修饰的微孔滤膜初品；
步骤S13，室温晾干所述微孔滤膜初品，得到表面功能化修饰的微孔滤膜。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤2之前，所述方法还包括：
对用于存放所述稀有目标细胞悬液的样品管进行预处理；所述预处理包括：基于低吸附处理试剂，对所述样品管的内壁进行表面低吸附处理；
其中，所述低吸附处理试剂包括：全氟辛基三氯硅烷、牛血清白蛋白、聚乙二醇、聚乙烯醇中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基于生物亲和性原理去除所述初级稀有目标细胞悬液中混有的背景细胞，包括：
通过具有生物亲和性的免疫磁珠，进一步去除所述初级稀有目标细胞悬液中混有的背景细胞；
其中，所述生物亲和性的免疫磁珠是指：偶联有与所述背景细胞进行特异性结合的生物亲和性分子的免疫磁珠；
所述生物亲和性分子包括抗体、核酸适配体中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复杂液体样品包括：人或动物的血液、尿液、肺泡灌洗液、胸水、腹水、脑脊液或痰液中的任意一种；
所述复杂液体样品中的稀有目标细胞包括：肿瘤细胞、上皮细胞、巨噬细胞、胞外囊泡、细菌或真菌中的任意一种。
9.一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的装置，其特征在于，所述装置包括：表面功能化修饰的微孔滤膜，一体化芯片，磁铁，注射泵；
所述装置用于执行上述权利要求1-8中任意一项所述的高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法。
10.一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法的应用，其特征在于，将上述权利要求1-8任意一项所述的方法，应用于从含有背景细胞的复杂液体样品中提取稀有目标细胞；或
将上述权利要求1-8任意一项所述的方法，应用于制备待检测的细胞样本。
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