CN112094809A - 一种从血清或血浆中提取外泌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种操作简便、成本低，提取效率高、外秘体大小均匀的从血清或血浆中的提取外泌体的方法，本发明所提供的提取外泌体的方法包括以下步骤：去除细胞碎片、超速离心、上清过滤、上清加入聚沉剂、超速离心、PBS重悬沉淀。经实验表明，本发明方法提取的外泌体大小均匀，多分布在30‑80nm；其标志蛋白的含量高，并且能够去除部分杂蛋白，提高外泌体的提取效率；并且此法提取外泌体操作简单，耗时较少。

Description

一种从血清或血浆中提取外泌体的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种从血清或血浆中提取外泌体的方法。
背景技术
外泌体(Exosome)发现于1986年，是一种直径约30-150nm的双层脂膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。外泌体携带大量特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)以及功能性的mRNA、miRNA等生物活性物质。
虽然外泌体的功能及临床应用已经被许多研究证实，但目前简便高效提纯外泌体的方法依然是限制了外泌体的研究进展速度，目前常用的提取方法有超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、PEG沉淀法、磁珠法以及膜亲和柱法等，超速离心法是外泌体提取的金标准，但超速离心法耗时耗力，并且提取率低；沉淀法虽然简单，但会同时沉淀许多杂蛋白，并且商品化试剂成本高。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在提供一种操作简便、成本低，提取效率高、外泌体大小均匀的从血清或血浆中提取的方法。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种从血清或血浆中提取外泌体的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）血清以2000×g，4℃，离心20min，去除细胞碎片沉淀，保留上清液；
2）将步骤1）中得到的上清液以30000×g，4℃，离心20min，仔细吸出上清液保留；
3)将步骤2）中得到的上清液通过截留分子量为3KD的滤膜，收集滤液；
4)向步骤3）中得到的滤液中加入沉淀剂，混匀，放置于2-8℃环境中孵育30-60min；所述的沉淀剂：滤液的重量分数比为：3-6:1；优选沉淀剂：滤液5:1。
所述的沉淀剂采用PEG2000、重水、聚乙烯醇(PVA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、共聚维酮S-630、羧甲基纤维素（CMC）、海藻酸钠一种或几种的混合物。
其中两种沉淀剂的混合物为：PEG20000和聚乙烯醇(PVA）；PEG20000和聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）；PEG20000和共聚维酮S-630；聚乙烯醇(PVA）和羧甲基纤维素（CMC）；聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）和共聚维酮S-630；当沉淀剂的混合物由两种沉淀剂混合而成时，两种沉淀剂的混合比例为50:1~1:50；
三种沉淀剂的混合物为：PEG20000、聚乙烯醇(PVA）及共聚维酮S-630；
PEG20000、聚乙烯醇(PVA）及聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）；
聚乙烯醇(PVA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）及共聚维酮S-630；
聚乙烯醇(PVA）、共聚维酮S-630及羧甲基纤维素（CMC）；
三种沉淀剂的混合比列为1:1:1~1:15:15；优选的混合比例为1:1:1、1:5:5、1:7:7、1:15:15。
5)将步骤4）中孵育好的样品，置于120000×g，4℃，超速离心90-120min，弃上清液，保留沉淀；
6）将步骤5）中得到的沉淀以100ulPBS重悬，分装，储存于-80℃备用。
本发明进一步公开了从血清或血浆中提取外泌体方法在提高外泌体提取效率方面的应用。实验结果显示在同等体积血清上清液，富集同等体积的外泌体富集液的情况下，传统超速离心法测定的外泌体的浓度为1.8565µg/µl；而本发明方法得到的外泌体的浓度为5.3568µg/µl。
本发明取得的有益效果：经透射电镜观察分析，本发明方法提取的外泌体大小分布均匀，且背景无污染，即不存在蛋白污染问题，提取的外泌体浓度高，提取率较高；经Western Blot结果显示，两种方法提取的外泌体内均含有多种蛋白成分，且不同分子量蛋白表达强度具有明显差异，本发明方法的蛋白质含量明显高于传统超速离心法。
本发明主要解决了传统超速离心法提取外泌体粒径大小分布不均匀、存在蛋白污染、提取率低等问题，重点考察了如何提取高浓度外泌体，主要的难点在于如何提高外泌体的提取浓度。
附图说明
图1是传统超速离心法提取到的外泌体的透射电镜结果图；
图2是本发明方法提取到的外泌体的透射电镜结果图；
图3是本发明方法提取到的外泌体采用纳米粒度检测仪的检测结果分析图；
图4是传统超速离心法提取到的外泌体采用纳米粒度检测仪的检测结果分析图；
图5是Western Blot结果分析图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
传统超速离心法：
血清转移到超虑离心管，培养基在4℃、以2000r/min离心20min以进一步去除细胞和细胞碎片，得到700ml上清培养液。再通过0.2μm的过滤膜去除＞200nm的颗粒。4℃条件下以34288r/min离心80min收集外泌体，所得沉淀即为外泌体，得到500ul的外泌体富集液。
实施例
本发明血清或血浆中的提取外泌体步骤：
1）、血清以2000×g，4℃，离心20min，去除细胞碎片沉淀，得到700ml上清培养液；
2）、将步骤1中得到的上清液以30000×g，4℃，离心20min，仔细吸出上清液保留；
3）、将步骤2中得到的上清液通过截留分子量为3KD的滤膜，收集滤液；
4）、向步骤3中得到的滤液中加入沉淀剂（沉淀剂：滤液5:1），混匀，放置于2-8℃环境中孵育30-60min；
5）、将步骤4中孵育好的样品，置于120000×g，4℃，超速离心90-120min，弃上清液，保留沉淀；
6）将步骤5中得到的沉淀以100ulPBS重悬，得到外泌体，，得到500ul的外泌体富集液，分装，储存于-80℃备用。
步骤4中的沉淀剂采用PEG20000、重水、聚乙烯醇(PVA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、共聚维酮S-630、羧甲基纤维素（CMC）、海藻酸钠一种或几种的混合物。
沉淀剂可以是步骤4中所述沉淀剂的任意一种物质。沉淀剂的混合物也可以是两种沉淀剂的任意混合，如：
PEG20000和重水；
PEG20000和聚乙烯醇(PVA）；；
PEG20000和聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）；
PEG20000和共聚维酮S-630；；
聚乙烯醇(PVA）和共聚维酮S-630；
聚乙烯醇(PVA）和羧甲基纤维素（CMC）；
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）和海藻酸钠；
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）和共聚维酮S-630；
优选的两种沉淀剂的混合物为：PEG20000和聚乙烯醇(PVA）；PEG20000和聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）；PEG20000和共聚维酮S-630；聚乙烯醇(PVA）和羧甲基纤维素（CMC）；
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）和共聚维酮S-630。
当沉淀剂的混合物由两种沉淀剂混合而成时，两种沉淀剂的混合比例为50:1~1:50；可以为50:1、30:1、25:1、10:1、1:1、1:5、1:10、1:20；优选的为5:1~1:8；最优选的为2:1~1:5。
沉淀剂的混合物还可以由三种沉淀剂混合而成，比如：
PEG20000、重水及聚乙烯醇(PVA）；
PEG20000、聚乙烯醇(PVA）及共聚维酮S-630；
PEG20000、聚乙烯醇(PVA）及聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）；
聚乙烯醇(PVA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）及共聚维酮S-630；
聚乙烯醇(PVA）、共聚维酮S-630及羧甲基纤维素（CMC）；
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素（CMC）及海藻酸钠；
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、共聚维酮S-630及羧甲基纤维素（CMC）。
优选的三种沉淀剂的混合物为：PEG20000、聚乙烯醇(PVA）及共聚维酮S-630；
PEG20000、聚乙烯醇(PVA）及聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）；
聚乙烯醇(PVA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）及共聚维酮S-630；
聚乙烯醇(PVA）、共聚维酮S-630及羧甲基纤维素（CMC）；
当沉淀剂的混合物可以由三种沉淀剂混合而成时，三种沉淀剂的混合比列为1:1:1~1:15:15；优选的混合比例为1:1:1、1:5:5、1:7:7、1:15:15。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
结果讨论：
一、外泌体形态观察：
我们采用透射电镜（透射电子显微镜hitachiHT7800/HT7700），直接观察外泌体的形态：
1）、用移液枪（thermo公司，美国）吸取20ul样本滴在碳膜铜网放置3-5min，然后用滤纸吸去多余液体。
2）、将2%磷钨酸滴在150目碳支持膜铜网放置1-2min，用滤纸吸去多余液体，室温干燥。
3）、透射电子显微镜下观察，采集图像分析。
二、粒度检测
我们采用纳米粒度检测仪（Zetasizer Nano ZSP），直接检测外泌体的粒径分布：
1）、用移液枪（thermo公司，美国）吸取20ul样本滴在样品池放置3-5min。
2）、纳米粒度检测仪下观察，采集图像分析。
三、Western Blot
1、SDS-PAGE电泳
1.1配置合适浓度的分离胶和浓缩胶，具体配方根据SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，P1200）说明书进行操作；
1.2新鲜配制电泳缓冲液，使用80V电泳（电泳仪，伯乐，PowerPac HC）直至条带跑出浓缩胶后，升高为120V，直至Loading刚刚跑出胶停止电泳。
2、转膜（转膜仪，伯乐，Trans-Blot SD）
2.1将电泳完成后的胶取出，切去浓缩胶，将分离胶放入配制好的1×转膜液（索莱宝，D1060）中平衡20min；
2.2裁剪适当大小的PVDF膜（Millipore IPVH00010）和薄、厚滤纸，使用无水甲醇（国药集团，80080418）激活PVDF膜，然后将PVDF膜、薄厚滤纸放入转膜液中平衡20min；
2.3按照负极-厚滤纸-薄滤纸-胶-PVDF膜-薄滤纸-厚滤纸-正极的顺序进行放置，放置过程中注意不要产生气泡。200mA恒流转膜1h。
3、封闭和抗体孵育
3.1使用1×TBST（索莱宝，T1081）配制5%脱脂奶粉（索莱宝，LP0031B）溶液进行封闭；
3.2按照抗体说明书，加入适量稀释的一抗（Abcam），4℃摇床孵育过夜，然后使用1×TBST清洗3次，每次10min；
3.3将清洗后的膜，放入稀释好的二抗中，室温摇床孵育1h，然后使用1×TBST清洗3次，每次10min。
4、ECL显色
4.1按照ECL显色试剂盒（索莱宝，PE0010）说明书要求，配制适量ECL工作液；
4.2沥干PVDF膜上的洗膜液，将配制好的ECL工作液，均匀滴在膜上，室温孵育5min，然后吸去多余显色液，放入全自动化学发光图像分析系统内成像，使用灰度值软件对结果进行分析。
四、采用BCA法检测传统超高速离心法及本发明方法提取外泌体的浓度
按照BCA蛋白浓度测定试剂盒（索莱宝，PC0020）说明书进行试验。
外泌体外观形态观察分析讨论
如图1、2所示，利用透射电镜观察两种不同方法提取的外泌体，外泌体为直径在40-100nm的呈圆形或者椭圆形囊泡状。传统超速离心法提取的外泌体粒径分布不均匀，提取率低；本发明方法提取的外泌体大小分布均匀，且背景无污染，即不存在蛋白污染问题，提取率较高。
外泌体纳米粒度检测仪检测分析讨论
如图3、4所示，利用纳米粒度检测仪检测两种不同方法提取的外泌体，外泌体的直径分布在50-300nm的范围内。传统超速离心法提取的外泌体粒径分布不均匀，提取率低；本发明方法提取的外泌体大小分布均匀，提取率较高。
Western Blot图像分析
Western Blot结果图5所示，左数第1-3条带是由传统超速离心方法提取的外泌体的WB结果图，左数第4-6条带是由本发明方法提取到的外泌体的WB结果图。由图5可看出两种方法提取的外泌体内均含有多种蛋白成分，且不同分子量蛋白表达强度具有明显差异，本发明方法的蛋白质含量明显高于传统超速离心法。
利用实施例1及实施例2所述的方法的到的外泌体，通过BCA浓度测定试剂盒结果得知，传统超速离心法测定的外泌体的浓度为1.8565µg/µl；而本发明方法得到的外泌体的浓度为5.3568µg/µl。

Claims (4)

1.一种从血清或血浆中提取外泌体的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
血清以2000×g，4℃，离心20min，去除细胞碎片沉淀，保留上清液；
将步骤1）中得到的上清液以30000×g，4℃，离心20min，仔细吸出上清液保留；
将步骤2）中得到的上清液通过截留分子量为3KD的滤膜，收集滤液；
向步骤3）中得到的滤液中加入沉淀剂，混匀，放置于2-8℃环境中孵育30-60min；所述的沉淀剂：滤液的重量分数比为：3-6:1；所述的沉淀剂采用PEG2000、重水、聚乙烯醇(PVA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、共聚维酮S-630、羧甲基纤维素（CMC）、海藻酸钠一种或几种的混合物；
将步骤4）中孵育好的样品，置于120000×g，4℃，超速离心90-120min，弃上清液，保留沉淀；
将步骤5）中得到的沉淀以100ulPBS重悬，分装，储存于-80℃备用。
2.权利要求1所述的从血清或血浆中提取外泌体的方法，其中所述的步骤4）中的沉淀剂：滤液5:1。
3.权利要求1所述的从血清或血浆中的提取外泌体的方法，其中所述的步骤4）中几种沉淀剂的混合物指的是两种沉淀剂的混合物为：PEG20000和聚乙烯醇(PVA）；PEG20000和聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）；PEG20000和共聚维酮S-630；聚乙烯醇(PVA）和羧甲基纤维素（CMC）；聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）和共聚维酮S-630；当沉淀剂的混合物由两种沉淀剂混合而成时，两种沉淀剂的混合比例为50:1~1:50；
三种沉淀剂的混合物为：PEG20000、聚乙烯醇(PVA）及共聚维酮S-630；
PEG20000、聚乙烯醇(PVA）及聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）；
聚乙烯醇(PVA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）及共聚维酮S-630；
聚乙烯醇(PVA）、共聚维酮S-630及羧甲基纤维素（CMC）；
三种沉淀剂的混合比列为1:1:1~1:15:15。
4.权利要求1所述从血清或血浆中提取外泌体方法在提高外泌体提取效率方面的应用。
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