CN108627563A - 一种电泳装置及电泳系统和透明化组织标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种电泳装置及电泳系统和透明化组织标记方法，所述电泳装置主要由电泳凝胶(1)、存在于电泳凝胶(1)内的电泳孔(2)、封堵所述电泳孔(2)的堵头凝胶(3)、上电泳槽(4)和装配于所述上电泳槽(4)的电极接头一(5)、下电泳槽(6)和装配于所述下电泳槽(6)的电极接头二(7)构成。本电泳体系在不增加染料及抗体使用量的情况下，通过电场力使染料或抗体定向通过组织，克服了被动孵育法标记速度缓慢且效率低下的缺点，极大的节省了时间，减少了染料及抗体的损耗，从而极大的提高了染料及抗体标记的效率。

Description

一种电泳装置及电泳系统和透明化组织标记方法
技术领域
本发明涉及一种电泳装置及电泳系统和透明化组织标记方法。
背景技术
组织透明化过程是首先通过多聚甲醛固定组织蛋白、再与丙烯酰胺交联形成组织凝胶复合物，再通过透明化液清洗组织，除去脂质和内源性生色基团，从而极大的提高组织的光透过度，通过对透明组织孵育抗体及荧光染料、共聚焦或light-sheet成像及3D重构，得到完整组织结构单细胞分辨率水平的可视化信息。
组织凝胶复合物有两个特点：(1)这种复合物可以将蛋白及核酸固定在原位，并可代替脂质，成为构架起细胞的支撑性结构，因而在后续的透明化液清洗过程中可以减少蛋白的丢失；(2)组织凝胶复合物是带有不同大小孔径的，抗体或染料可以通过小孔进入组织内部，与目标蛋白结合，因此能够标记较厚的组织。
目前已有多种透明化方法可以得到透明化效果较好的组织，但对于离体组织的特异性标记方法较少，主要有两种：(1)主动孵育法，即通过循环系统进行抗体或染料的灌注；(2)被动孵育法，即把组织放入所要标记的抗体或染料中，4℃或常温进行摇动孵育。两种方法均存在明显的缺点：(1)主动孵育法要求在整个透明化过程中，组织的循环系统保持通畅完整，这极大的限制了主动孵育法的应用，因为组织离体后，血液极易堵塞血管，且绝大多数离体组织标本无法保持循环系统的完整，对于小动物(如小鼠和大鼠)而言，血管极细，组织透明化后，甚至无法在肉眼下找到其血管，因此此法使用受限明显；(2)被动孵育法不需要保持循环系统的完整，但是其最大的缺点在于孵育速度十分缓慢，对于分子量较大的抗体，需要数天甚至数周的孵育时间，而且多数抗体本身属于蛋白类，在4℃或常温下放置太久会明显影响抗体的活性，成为被动孵育法的一大挑战，而且，由于分子运动的不定向性及不规律性，即便孵育数天至数周，对于较致密的透明化组织，如心肌，分子量稍大的染料也无法通过组织全层，甚至只能结合在组织表面，因此被动孵育法也受到了较大的限制。
如果有一种方法可以使染料或抗体定向通过组织，并和组织内的成分结合，这将会极大的提高染料及抗体的标记效率，本发明的诞生就是为了解决此问题。
由于绝大多数透明化组织标本无法保持循环系统的完整，且对于透明化的小动物组织(如小鼠和大鼠的组织块)而言，甚至无法在肉眼下找到其血管，因此多数组织的标记无法使用通过循环系统灌注的主动孵育法；由于被动孵育法孵育速度十分缓慢且效率低下，耗费时间，浪费染料及抗体，因此很大程度上限制了被动孵育法的使用；
发明内容
为了解决现有技术存在诸如上述缺陷，本发明提供一种电泳装置及电泳系统和透明化组织的标记方法，在不增加染料及抗体使用量的情况下，通过电场力使染料或抗体定向通过组织，并与组织中的特定成分结合，从而极大的提高了染料或抗体的标记效率。
本发明的至少部分技术效果通过以下技术方案实现：
作为本发明的一个方面，涉及一种电泳装置，所述电泳装置主要由电泳凝胶1、存在于电泳凝胶1内的电泳孔2、封堵所述电泳孔2的堵头凝胶3、上电泳槽4和装配于所述上电泳槽4的电极接头一5、下电泳槽6和装配于所述下电泳槽6的电极接头二7构成。
具体来讲，所述电泳凝胶和所述堵头凝胶可以为相同的凝胶。
在一个实施例中，所述电泳孔的长度占所述电泳凝胶的四分之三。
在一个实施例中，所述电泳凝胶和所述堵头凝胶为非变性聚丙烯酰胺凝胶。
作为本发明的另一个方面，还涉及制备所述电泳装置的方法，包括如下步骤：
A、在一个空心装置中固定一个制孔棒，然后往该空心装置内倒入配置好的电泳凝胶液体；
B、待凝胶凝固后，拔出制孔棒，即得到内部包含电泳孔的电泳凝胶；
C、制作一个堵头凝胶；
D、在电泳孔内充满抗体稀释液；
E、将待标记的透明化组织放入电泳孔的底部；
F、吸去抗体稀释液，在电泳孔内充满特定浓度的抗体，并稍漫过胶孔；
G、用堵头凝胶滑动贴合电泳凝胶，将电泳孔完全封堵；
H、在堵头凝胶的上部设置上电泳槽，在电泳凝胶的底部设置下电泳槽。
作为本发明的又一个方面，涉及一种电泳系统，所述电泳系统包括上述电泳装置，并将装配于所述上电泳槽的电极接头一和装配于所述下电泳槽的电极接头二分别接到电源的正负极。
作为本发明的再一个方面，还涉及一种制备上述电泳系统的方法，所述方法是将上述任一项所述电泳装置中，装配于所述上电泳槽(4)的电极接头一(5)和装配于所述下电泳槽(6)的电极接头二(7)分别接到电源的正负极。
本发明还涉及所述电泳装置在透明化组织标记中的应用以及所述电泳系统在透明化组织标记中的应用。
本发明还涉及一种透明化组织标记方法，所述方法使得抗体在电场力作用下，进入待标记的透明化组织内部，并被结合到组织内部。
本发明至少实现了如下有益效果：
本电泳体系不需要依赖循环系统进行染料及抗体的标记，克服了主动孵育法需要保持循环系统完整的缺陷，极大的扩展了染料及抗体标记组织的范畴。
本电泳体系在不增加染料及抗体使用量的情况下，通过电场力使染料或抗体定向通过组织，克服了被动孵育法标记速度缓慢且效率低下的缺点，极大的节省了时间，减少了染料及抗体的损耗，从而极大的提高了染料及抗体的标记效率。
附图说明
图1为本发明实施例的电泳装置结构示意图；
图2为本发明实施例的电泳系统中凝胶截面示意图；
图3为本发明实施例的实验结果图。
其中，1为电泳凝胶，2为电泳孔，3为堵头凝胶，4为上电泳槽，5为电极接头一，6为下电泳槽，7为电极接头二。
具体实施方式
下面结合附图详细介绍本发明技术方案。
参照图1和图2所示，本发明实施例提供一种电泳装置，由电泳凝胶1、存在于电泳凝胶1中心，长度约占四分之三的电泳孔2、堵头凝胶3，上电泳槽4，电极接头一5，下电泳槽6，电极接头二7。
该电泳装置的制备过程比如可以是这样的：
首先在一个空心装置，比如空心管中固定一个制孔棒，然后往该空心装置内倒入配置好的电泳凝胶液体，待凝胶凝固后，拔出制孔棒，即得到内部包含电泳孔2的电泳凝胶1。制作一个堵头凝胶3的过程与电泳凝胶1的过程相同，只是制作过程中不需要加入制孔棒，从而不会有类似电泳孔2的部分。凝胶的制备过程为本领域的常规技术手段，本领域技术人员可以参照现有聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备过程来完成。
在电泳孔2内充满抗体稀释液(所用稀释液由本领域技术人员根据实验需要进行选择)。将待标记的透明化组织放入电泳孔2的底部。此时，可以将一个与电泳孔2内径相适应的中空管(本实施例中称为样本室)放入电泳孔2内，使得样品室底部稍微压紧待标记的透明化组织，吸去电泳孔2中的抗体稀释液。在电泳孔2内，也就是本实施例的样品室中充满特定浓度(具体浓度由本领域技术人员根据实验需要进行选择)的抗体，并稍漫过胶孔。用堵头凝胶3滑动贴合电泳凝胶1，将电泳孔2完全封堵，以电泳孔2中无气泡为准。
在堵头凝胶3的上部设置上电泳槽4，在电泳凝胶1的底部设置下电泳槽6，将上电泳槽4上的电极接头一和下电泳槽6上的电极接头二分别接到电源的正负极上，构成一个完整的电泳系统，调整合适的电压(电压的选择，可由本领域技术人员根据实验需要进行选择)进行电泳。此时，电泳孔2中的抗体在电场力作用下，向下运动，在穿过待标记的透明样品的过程中，被特异性结合到特定的部位。本领域技术人员可以理解，本发明实施例中所用抗体，可以替换为染料，进行同样的工作。
本实施例中，所用凝胶为非变性聚丙烯酰胺凝胶，本领域技术人员比如可以通过如下方式配制：
15％非变性丙烯酰胺凝胶的配制(约30ml)：
6.9ml的蒸馏水，15ml的30％丙烯酰胺溶液(29：1)，适量1.5M Tris-Hcl(pH值为8.8)，适量10％过硫酸铵和适量TEMED。
本发明实施例所提供电泳系统中，采用的是非变性丙烯酰胺凝胶，这就避免了现有技术中丙烯酰胺凝胶电泳主要是用变性凝胶容易导致抗体变性的缺陷。本发明实施例，在电泳过程中，抗体是在电泳孔(样本室)内的液体中运动，在经过待标记的透明化组织时，就特异性结合到组织内。也就是说，本发明实施例中，抗体的有效运动不是在凝胶中进行的，这与现有技术的丙烯酰胺凝胶电泳存在本质区别。
以小鼠心肌组织为例，将心肌组织放入电泳孔2的底部，插入样品室并固定组织后，向样品室里加入从Abcam购买的一抗Anti-Cardiac Troponin Iantibody(ab47003)，稀释浓度1：200，加入电泳液，恒压80V电泳2小时，并静置1小时，PBS清洗，然后将组织放入二抗(购买自Abcam的ab150077，1：200)，常温摇动孵育2天，共聚焦成像。
为了验证电泳效果，我们采用常规一抗孵育法作为对照，配置相同浓度的一抗(ab47003，1：200)2管，分别放入同样大小的心肌组织，分别室温摇动孵育3小时和2天，PBS清洗，然后将组织分别放入二抗(ab150077，1：200)，常温摇动孵育2天，共聚焦成像。
实验结果见图3，由图3可以看出，一抗电泳2小时+静置1小时的组织(A)，颜色很亮且连续，图像上断续的点较少，放大看肌丝形态很完整；常规一抗室温摇孵3小时的组织(B)，图像较暗且断续的点很多，放大看后可见很多部位肌丝连续性差，且肌丝形态不完整；常规一抗室温摇孵2天的组织(C)，颜色较亮且连续，图像上断续的点较少，放大看肌丝形态比较完整；在共聚焦成像时，图像A和C的激发光强度相等，而图像B的激发光强度是A和C的3倍，可是B图的亮度仍远不及A图和C图。
由此，我们得出结论，一抗电泳2小时+静置1小时的组织成像效果远优于常规一抗室温摇孵3小时的组织成像效果，并可比肩常规一抗室温摇孵2天的组织成像效果，此电泳体系效率较高，可明显缩短一抗孵育时间。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种电泳装置，其特征在于，所述电泳装置主要由电泳凝胶(1)、存在于电泳凝胶(1)内的电泳孔(2)、封堵所述电泳孔(2)的堵头凝胶(3)、上电泳槽(4)和装配于所述上电泳槽(4)的电极接头一(5)、下电泳槽(6)和装配于所述下电泳槽(6)的电极接头二(7)构成。
2.如权利要求1所述的电泳装置，其特征在于，所述电泳凝胶(1)和所述堵头凝胶(3)为相同的凝胶。
3.如权利要求1所述电泳装置，其特征在于，所述电泳孔(2)的长度占所述电泳凝胶(1)长度的四分之三。
4.如权利要求1所述电泳装置，其特征在于，所述电泳凝胶(1)和所述堵头凝胶(3)为非变性聚丙烯酰胺凝胶。
5.制备如权利要求1-4任一项所述电泳装置的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、在一个空心装置中固定一个制孔棒，然后往该空心装置内倒入配置好的电泳凝胶液体；
B、待凝胶凝固后，拔出制孔棒，即得到内部包含电泳孔(2)的电泳凝胶(1)；
C、制作一个堵头凝胶(3)；
D、在电泳孔(2)内充满抗体稀释液；
E、将待标记的透明化组织放入电泳孔(2)的底部；
F、吸去抗体稀释液，在电泳孔(2)内充满特定浓度的抗体，并稍漫过胶孔；
G、用堵头凝胶(3)滑动贴合电泳凝胶(1)，将电泳孔(2)完全封堵；
H、在堵头凝胶(3)的上部设置上电泳槽(4)，在电泳凝胶(1)的底部设置下电泳槽(6)。
6.一种电泳系统，其特征在于，所述电泳系统包括权利要求1-4任一项所述电泳装置，并将装配于所述上电泳槽(4)的电极接头一(5)和装配于所述下电泳槽(6)的电极接头二(7)分别接到电源的正负极。
7.制备如权利要求6所述电泳系统的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1-3任一项所述电泳装置中，装配于所述上电泳槽(4)的电极接头一(5)和装配于所述下电泳槽(6)的电极接头二(7)分别接到电源的正负极。
8.权利要求1-4任一项所述电泳装置在透明化组织标记中的应用。
9.权利要求6所述电泳系统在透明化组织标记中的应用。
10.一种透明化组织标记方法，其特征在于，所述方法使得抗体或染料在电场力的作用下，进入透明化组织内部，并被结合到组织内部。
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