CN113218741B - 组织透明化试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种组织透明化试剂盒和方法，其中，组织透明化试剂盒包括芳香胺以及葡萄糖，芳香胺和葡萄糖用以配制分别将组织透明化处理的试剂一和试剂二；在试剂一中，芳香胺的质量比为25～40％，葡萄糖的质量比为5～10％；在试剂二中，芳香胺的质量比为30～45％，葡萄糖的质量比为30～45％。本发明组织透明化试剂盒可实现对组织(尤其是管状、腔体状组织)进行透明化处理，并对透明化的组织进行塑型，使得组织可用于制备冰冻切片或组织标本切片等。

Description

组织透明化试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及组织透明化试剂盒和方法。
背景技术
随着生命科学技术的快速发展，利用生物组织透明化技术获取生物组织的三维图像信息成为了研究的热点。目前，FOCM、SCALE、CUBIC、SEEDB、MACS等透明化技术已在生命科学领域得到了较为广泛的应用。但是，现有的透明化试剂处理后的组织(尤其是管状、腔体状的组织)比较松、软，难以塑型，使得组织无法再进行修饰或者切片等。
上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种组织透明化试剂盒和方法，旨在解决现有技术无法实现对生物组织塑型的技术问题。
为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种组织透明化试剂盒，包括芳香胺以及葡萄糖，所述芳香胺和所述葡萄糖用以配制试剂一和试剂二，所述试剂一和所述试剂二可将组织透明化处理；
其中，在所述试剂一中，所述芳香胺的质量比为大于或等于25％，且小于或等于40％；所述葡萄糖的质量比为大于或等于5％，且小于或等于10％；
在所述试剂二中，所述芳香胺的质量比为大于或等于30％，且小于或等于45％；所述葡萄糖的质量比为大于或等于30％，且小于或等于45％。
可选地，所述组织透明化试剂盒还包括尿素，所述尿素用以与所述芳香胺、所述葡萄糖共同配制成所述试剂一，所述尿素在所述试剂一中的质量比为大于0，且小于或等于5％。
可选地，所述组织透明化试剂盒还包括甘油，所述甘油用以与所述芳香胺、所述葡萄糖共同配制成所述试剂一，所述甘油在所述试剂一中的质量比为大于0，且小于或等于2％。
可选地，所述组织透明化试剂盒还包括尿素，所述尿素用以配合所述芳香胺、所述葡萄糖配制所述试剂二，所述尿素在所述试剂二中的质量比为大于0，且小于或等于1％。
可选地，所述芳香胺包括邻苯二甲胺、间苯二甲胺或对苯二甲胺及其衍生物的至少一种。
第二方面，本发明还提出一种组织透明化方法，包括以下步骤：
(1)将固定过的组织放入试剂一中孵育，得到初步透明化的组织；
(2)将上步所得的初步透明化的组织放入试剂二中孵育，得到水凝胶包埋的透明化组织。
可选地，所述组织放入所述试剂一中的孵育温度为大于或等于25℃，且小于或等于37℃；所述组织放入所述试剂一中的孵育时间为大于或等于4小时，且小于或等于48小时。
可选地，所述组织放入所述试剂二中的孵育温度为大于或等于4℃，且小于或等于37℃；所述组织放入所述试剂二中的孵育时间为大于或等于6小时，且小于或等于48小时。
本发明组织透明化试剂盒包括芳香胺以及葡萄糖，所述芳香胺和所述葡萄糖用以配制试剂一和试剂二，所述试剂一和所述试剂二可将组织透明化处理；其中，在所述试剂一中，所述芳香胺的质量比为大于或等于25％，且小于或等于40％；所述葡萄糖的质量比为大于或等于5％，且小于或等于10％；在所述试剂二中，所述芳香胺的质量比为大于或等于30％，且小于或等于45％；所述葡萄糖的质量比为大于或等于30％，且小于或等于45％。
如此，所述芳香胺的-NH2基团可与组织的脂质结合，使脂质从组织内渗出，从而降低组织内各成分的折射率差异；所述葡萄糖可以避免组织的结构及内部的蛋白遭到破坏，以使组织保持原先的状态。当组织放置于所述试剂一中孵育时，所述芳香胺和所述葡萄糖共同作用，使得组织初步具有了透明化的效果；当组织放置于所述试剂二中孵育时，所述芳香胺和所述葡萄糖共同作用，使得组织在透明化的同时被水凝胶包埋，这样组织尤其管状、腔体状的组织，不会出现松、软、难以移动的情况，可被塑型并用于制备冰冻切片或组织标本切片等。本发明组织透明化方法，采用上述组织透明化试剂盒，至少具有上述组织透明化试剂盒所带来的所有有益效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为实施例二组织透明化处理的流程图；
图2为实施例二组织透明化处理前、后的对比图；
图3为实施例三不同透明化方法处理组织的流程和时间；
图4为实施例三组织被不同透明化方法处理后透光率的对比图；
图5为实施例四组织被不同透明化方法处理前、后荧光成像的对比图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
需要说明，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。
本发明提出一种组织透明化试剂盒，所述组织透明化试剂盒包括芳香胺以及葡萄糖，所述芳香胺和所述葡萄糖用以配制试剂一和试剂二，所述试剂一和所述试剂二可将组织透明化处理；其中，在所述试剂一中，所述芳香胺的质量比为大于或等于25％，且小于或等于40％；所述葡萄糖的质量比为大于或等于5％，且小于或等于10％；在所述试剂二中，所述芳香胺的质量比为大于或等于30％，且小于或等于45％；所述葡萄糖的质量比为大于或等于30％，且小于或等于45％。
在本发明试剂盒中，所述芳香胺是指具有一个芳香性取代基的胺，包含-NH2基团、-NH-基团或含氮基团，种类多样，一般为高沸点的液体或者低熔点的固体。所述试剂一和所述试剂二可以采用蒸馏水作为溶剂，所述蒸馏水属于实验室常用试剂，容易获得。在所述试剂一中，所述蒸馏水的质量比可以为大于或等于50％，且小于或等于70％。在所述试剂二中，所述蒸馏水的质量比可以为大于或等于5％，且小于或等于40％。在所述试剂一和所述试剂二的配制过程中，先将所述蒸馏水与所述芳香胺混匀，再加入所述葡萄糖，充分搅拌溶解。由于所述试剂一和所述试剂二中含有所述葡萄糖，随着温度的升高和时间的延长会逐渐变黄，为了不影响对组织的透明化效果，所述试剂一和所述试剂二可以现配现用。
在所述试剂一中，若，①所述芳香胺的质量比为小于25％，所述葡萄糖的质量比为小于5％；②所述芳香胺的质量比为小于25％，所述葡萄糖的质量比为处于5％～10％；③所述芳香胺的质量比为处于25％～40％之间，所述葡萄糖的质量比为小于5％；上述三种情况下，所述试剂一的浓度不高，所述组织可能存在过度吸水的现象，透明化的效果不好。在所述试剂一中，若，①所述芳香胺的质量比为大于40％，所述葡萄糖的质量比为大于10％；②所述芳香胺的质量比为大于40％，所述葡萄糖的质量比为处于5％～10％；③所述芳香胺的质量比为处于25％～40％之间，所述葡萄糖的质量比为大于10％；上述三种情况下，所述试剂一比较粘稠，所述组织的吸水程度不高(或者处于失水状态)，脂质等物质无法快速从所述组织内渗出，透明化的效果不好。
在所述试剂二中，若，①所述芳香胺的质量比为小于30％，所述葡萄糖的质量比为小于30％；②所述芳香胺的质量比为小于30％，所述葡萄糖的质量比为处于30％～45％；③所述芳香胺的质量比为处于30％～45％之间，所述葡萄糖的质量比为小于30％；上述三种情况下，所述试剂二形成凝胶的效果不好，一方面增加了透明化处理的时间，另一方面所述组织的塑型效果不好，会影响后续的组织切片等实验。在所述试剂二中，若，①所述芳香胺的质量比为大于45％，所述葡萄糖的质量比为大于45％；②所述芳香胺的质量比为大于45％，所述葡萄糖的质量比为处于30％～45％；③所述芳香胺的质量比为处于30％～45％之间，所述葡萄糖的质量比为大于45％；上述三种情况下，所述试剂二形成水凝胶的速度比较快，所述组织可能还未完成透明化，就已经被成型的水凝胶包埋，并且所述组织可能会有过度脱水的情况，影响后续的观察效果。
在本发明组织透明化试剂盒中，所述芳香胺的-NH2基团可与组织的脂质结合，使脂质从组织内渗出，从而降低组织内各成分的折射率差异；所述葡萄糖可以避免组织的结构及内部的蛋白遭到破坏，以使组织保持原先的状态。当组织放置于所述试剂一中孵育时，所述芳香胺和所述葡萄糖共同作用，使得组织初步具有了透明化的效果；当组织放置于所述试剂二中孵育时，所述芳香胺和所述葡萄糖共同作用，使得组织在透明化的同时被水凝胶包埋，这样组织尤其管状、腔体状的组织，不会出现松、软、难以移动的情况，可被塑型并用于制备冰冻切片或组织标本切片等。具体地，水凝胶包埋的透明化组织，可在共聚焦显微镜和光片显微镜下直接荧光成像，或在相配的介质(例如35％～50％的葡萄糖溶液)中成像；也可置于冰冻切片机、振动切片机或石蜡切片机上制备100μm以上的厚片，用于3D器官的成像。
可选地，所述组织透明化试剂盒还包括尿素，所述尿素用以与所述芳香胺、所述葡萄糖共同配制成所述试剂一，所述尿素在所述试剂一中的质量比为大于0，且小于或等于5％。所述尿素是良好的组织渗透剂，可以通过自由扩散的方式进出所述组织，并同时促进所述芳香胺和所述葡萄糖渗透进所述组织。当所述尿素的质量比为大于5％时，所述尿素会对所述组织的透明化起到不利效果。在本实施例中，所述蒸馏水在所述试剂一中的质量比可以为大于或等于45％，且小于70％。
可选地，所述组织透明化试剂盒还包括甘油，所述甘油用以与所述芳香胺、所述葡萄糖共同配制成所述试剂一，所述甘油在所述试剂一中的质量比为大于0，且小于或等于2％。所述甘油是脂溶性物质，也可以通过自由扩散的方式进出所述组织，同时也可以促进所述芳香胺和所述葡萄糖渗透进所述组织。当所述甘油的质量比为大于5％时，所述甘油增加了溶液的粘稠度，会对所述组织的透明化起到不利效果。在本实施例中，所述蒸馏水在所述试剂一中的质量比可以为大于或等于48％，且小于70％。当然，所述尿素、所述甘油可以与所述芳香胺、所述葡萄糖共同配制成所述试剂一。此时，在所述试剂一中，所述蒸馏水的质量比可以为大于或等于43％，且小于70％。所述尿素和所述甘油共同增强了所述芳香胺和所述葡萄糖渗透进所述组织的效果，所述组织的透明化效果更好。
可选地，所述组织透明化试剂盒还包括尿素，所述尿素用以配合所述芳香胺、所述葡萄糖配制所述试剂二，所述尿素在所述试剂二中的质量比为大于0，且小于或等于1％。所述尿素的加入，也促进了所述试剂二中的所述芳香胺和所述葡萄糖渗透进所述组织的效果。所述蒸馏水在所述试剂二中的质量比可以为大于或等于4％，且小于40％。
可选地，所述芳香胺包括邻苯二甲胺、间苯二甲胺或对苯二甲胺及其衍生物的至少一种。上述多种芳香胺含有的-NH2基团可以与所述葡萄糖配合，实现所述组织的透明化处理。当然，本方案提出的芳香胺的种类不限于此，任何可以实现上述效果的芳香胺均在本方案的保护范围内。
本发明还提出一种组织透明化方法，所述组织透明化方法包括以下步骤：(1)将固定过的组织放入试剂一中孵育，得到初步透明化的组织；(2)将上步所得的初步透明化的组织放入试剂二中孵育，得到水凝胶包埋的透明化组织。
在本发明组织透明化方法中，所述组织可以包括哺乳动物、鱼类或者爬行动物的脑、小肠、气管、食管、骨骼、肝脏、肺脏、脾脏或者血管组织的至少一种。所述组织可以采用4％的多聚甲醛固定，骨组织可以先采用20％的EDTA进行脱钙预处理后，再进行固定。
本发明组织透明化方法，采用上述组织透明化试剂盒，使得组织尤其管状、腔体状的组织，不会出现松、软、难以移动的情况，可被塑型并用于制备冰冻切片或组织标本切片等。
可选地，所述组织放入所述试剂一中的孵育温度为大于或等于25℃，且小于或等于37℃；所述组织放入所述试剂一中的孵育时间为大于或等于4小时，且小于或等于48小时。
可选地，所述组织放入所述试剂二中的孵育温度为大于或等于4℃，且小于或等于37℃；所述组织放入所述试剂二中的孵育时间为大于或等于6小时，且小于或等于48小时。
不同组织放入所述试剂一和所述试剂二中的孵育温度和孵育时间，可以根据相应的组织进行调整。例如，孵育温度为25℃的情况下，小鼠的半脑在所述试剂一中的孵育时间可以为24h～48h，小鼠的小肠可以为18h～24h，小鼠的气管可以为12h～24h，小鼠的食管可以为8h～12h，小鼠的桡骨可以为6h～12h，小鼠的肝脏可以为24h～32h，小鼠的肺脏可以为16h～32h，大鼠的主动脉血管可以为4h～12h。孵育温度为4℃的情况下，小鼠的半脑在所述试剂二中的孵育时间可以为24h～48h，小鼠的小肠可以为12h～24h，小鼠的气管可以为12h～24h，小鼠的食管可以为8h～12h，小鼠的桡骨可以为12h～24h，小鼠的肝脏可以为24h～32h，小鼠的肺脏可以为16h～32h，大鼠的主动脉血管可以为6h～12h。上述组织在所述试剂一和所述试剂二孵育时，为了保持试剂的新鲜(时间久了会变黄)，可以2h～8h换一次新鲜溶液。
实施例一
本实施例采用C57小鼠的小肠组织(已被4％多聚甲醛固定，长为2cm)，设置三个实验组(编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和三个对照组(编号为Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ)。实验组的试剂一和试剂二的组成及浓度，对照组中替代试剂的组成及浓度请参阅表1。在三个对照组中，分别用甘露糖、果糖和山梨醇替代所述葡萄糖。本实施例采用本发明组织透明化方法，所述组织的孵育温度和时间请参阅表2。实验结果请参阅表3。
表1实验组和对照组的试剂组成及浓度
Figure BDA0003046906070000071
表2实验组和对照组的孵育温度和时间
Figure BDA0003046906070000081
表3组织透明效果及成胶性评价
组 透明度 状态 粘性
Ⅰ 高 固体，凝胶 有
Ⅱ 高 固体，凝胶 有
Ⅲ 高 固体，凝胶 有
Ⅳ 高 液体 很高
Ⅴ 高 液体 很高
Ⅵ 高 液体 很高
请参阅表1和表2，所述Ⅰ组的试剂一不包含所述甘油，且所述尿素的质量比大于其他组，但是所述组织在所述Ⅰ组的试剂一中的孵育时间短于其他组(不包括Ⅱ组)；说明，在所述试剂一中，在一定的浓度范围内，所述尿素和所述甘油可以产生相似的作用效果。并且，所述Ⅰ组的试剂一中所述葡萄糖的质量比大于其他组，且所述间苯二甲胺的质量比小于其他组；说明，在所述试剂一中，在一定的浓度范围内，所述葡萄糖和所述芳香胺通过彼此配合可以产生相似的作用效果。所述Ⅱ组的试剂一中所述间苯二甲胺的质量比大于其他组，且所述组织在所述Ⅱ组的试剂一中的孵育时间短于其他组(不包括Ⅰ组)；说明，适当提高所述间苯二甲胺的质量比，有助于加快所述组织的透明化。另外，所述Ⅱ组的试剂二中所述间苯二甲胺的质量比小于其他组，且所述葡萄糖的质量比大于其他组，但所述组织在所述Ⅱ组的试剂二中的孵育时间与其他组一致；也说明，在所述试剂二中，在一定的浓度范围内，所述葡萄糖和所述芳香胺通过彼此配合可以产生相似的作用效果。
表3的结果表明，只有以所述葡萄糖为基础的糖溶液(所述试剂一和所述试剂二)才能使所述组织透明化的同时呈凝胶状态；且不会产生很高的粘性，也即不会导致管状、腔体状的组织标本粘附成块。所述甘露糖、所述果糖和所述山梨醇均不能实现类似效果，所述葡萄糖在形成凝胶中起到非常重要的作用。
实施例二
被透明化处理后的组织，可以依次在共聚焦、双光子和光片显微镜下成像观察。图1为小鼠的小肠组织成像观察过程，包括解剖(Dissection)、固定(Fixation)、染色(Staining)、透明化(Clearing)、LSCM成像(Imaging)、TPFM成像(Imaging)和数据分析(Date Analysis)。具体过程为：采用戊巴比妥钠将所述小鼠麻醉后，经心尖灌注0.01M枸橼酸钠-磷酸盐缓冲液，待到所述小鼠体内的血液被置换完全，取出所需的组织，经4％多聚甲醛固定过夜后，依次浸泡在所述试剂一和所述试剂二中透明化处理，最后在显微镜下成像。
在本实施例中，所述试剂一包含：间苯二甲胺30％、尿素5％、葡萄糖10％；所述试剂二包含：间苯二甲胺40％、葡萄糖40％。在所述试剂一中，孵育温度为25℃，孵育时间为小鼠的半脑24h～48h，小鼠的小肠18h～24h，小鼠的气管12h～24h，小鼠的食管8h～12h，小鼠的桡骨6h～12h，小鼠的肝脏24h～32h，小鼠的肺脏16h～32h，大鼠的主动脉血管4h～12h；其中，小鼠的桡骨在固定前先用20％的EDTA处理。在所述试剂二中，孵育温度为4℃，孵育时间为小鼠的半脑24h～48h，小鼠的小肠12h～24h，小鼠的气管12h～24h，小鼠的食管8h～12h，小鼠的桡骨12h～24h，小鼠的肝脏24～32h，小鼠的肺脏16h～32h，大鼠的主动脉血管6h～12h。
图2为上述组织经透明化处理前、后所拍摄的对比图像。编号A、B、C、D、E、F、G、H、I分别为所述小鼠的小肠、所述小鼠的平铺小肠、所述小鼠的食管、所述小鼠的气管、所述小鼠的桡骨、所述小鼠的肺脏、所述小鼠的肝脏、所述小鼠的半脑和所述大鼠的主动脉血管。图2中，上排图像为组织透明化处理前的图像，由于组织的浑浊特性，组织下方的线格被组织遮盖不可见；下排图像为同一组织经过透明化处理后的图像，此时组织变得高度透明，组织下方的线格清晰可见(背景线格为2mm*2mm)。以上结果说明，本发明试剂盒和方法对组织具有非常好的透明化处理效果，尤其是图2中的B(小鼠的平铺小肠)和E(小鼠的桡骨)，已接近100％的透明状态，透明化效果非常突出。
实施例三
本实施例对比本发明方法和现有透明化方法对组织的透明化效果，样本采用C57小鼠的小肠组织，包括实验组(本发明方法，PHCS)以及三个对照组(CUBIC、MACS、FOCM)。每个组选取三个样本，分别对其在波长400nm～800nm范围内的光透过率进行测量，并计算平均值。
图3为四种透明化方法处理小肠组织的流程和时间。具体地，实验组(PHCS)：将所述组织浸泡在所述试剂一(PHCS1，包含间苯二甲胺30％、尿素5％、葡萄糖10％)中，25℃孵育12h～24h，再将组织浸泡在所述试剂二(PHCS2，包含间苯二甲胺40％、葡萄糖40％)中，4℃孵育12h～24h。对照组(CUBIC)：将所述组织浸泡在Reagent-1中(包含25％尿素、25％依地醇、15％Triton X-100)，25℃孵育3d～4d；PBS清洗后；再将组织浸泡在Reagent-2(包含50％蔗糖、25％尿素、10％三乙醇胺、0.1％Triton X-100)中，4℃孵育1d～2d。对照组(MACS)：将所述组织浸泡在MACS-R0(包含20％间苯二甲胺、15％山梨糖醇)中，25℃孵育1d；再将组织浸泡在MACS-R1(包含40％间苯二甲胺、30％山梨糖醇)中，4℃孵育12h；最后将组织浸泡在MACS-R2(包含40％间苯二甲胺、50％山梨糖醇)中。对照组(FOCM)：将所述组织浸泡在透明化液(包含20％尿素、30％山梨糖醇、5％甘油、45％DMSO)中直至透明。请参阅图3，本发明方法(PHCS)和对照组(MACS)处理所述组织透明化的用时最短，2天即能完成对所述组织的透明化处理。
图4为被四种透明化方法处理后的小肠组织的透光率结果。图4的结果显示，所述组织在透明化处理之后的透光率随着波长的增加逐渐增加；本发明方法(PHCS)处理后的所述组织的透光率最高：在400nm波长下，透光率接近70％；在800nm波长下，透光率超过90％。说明被本发明方法处理后，所述组织内部的折射率高度均一化，散射最小。综合图3和图4的结果，本发明对组织透明化处理的效果最好。
实施例四
本实施例生物组织取自tdTomato转基因小鼠的小肠组织，按照实施例四中的不同透明化处理方法，分别对所述组织进行透明化处理，并对组织进行切片后放置在荧光显微镜下观察。所述tdTomato转基因小鼠的小肠组织可以产生tdTomato荧光蛋白，荧光信号在荧光显微镜下呈现为红色。
图5为透明化处理前、后的小肠绒毛的荧光图像对比图。上排为所述组织在透明化处理前的荧光图像、下排为所述组织在透明化处理后的荧光图像。图5的结果表明，本发明方法(PHCS)对组织的透明化处理并没有影响到所述组织表达tdTomato蛋白的结果展示，荧光信号仍清晰可见，其他透明化方法处理后的所述组织的荧光信号变得弥散且不清晰，定位困难。并且，经过本发明方法处理后的小肠组织切片，在共聚焦显微镜下的荧光成像深度大大增加，图像的清晰度更高(图像中更亮)。以上结果说明，本发明方法处理过的透明化组织可被塑形用于组织切片，且组织切片后的观察效果很好。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种组织透明化试剂盒，其特征在于，包括芳香胺以及葡萄糖，所述芳香胺和所述葡萄糖用以配制试剂一和试剂二，所述试剂一和所述试剂二可将组织透明化处理；
其中，在所述试剂一中，所述芳香胺的质量比为大于或等于25％，且小于或等于40％；所述葡萄糖的质量比为大于或等于5％，且小于或等于10％；
在所述试剂二中，所述芳香胺的质量比为大于或等于30％，且小于或等于45％；所述葡萄糖的质量比为大于或等于30％，且小于或等于45％；
还包括甘油，所述甘油用以与所述芳香胺、所述葡萄糖共同配制成所述试剂一，所述甘油在所述试剂一中的质量比为大于0，且小于或等于2％；
所述芳香胺包括邻苯二甲胺、间苯二甲胺或对苯二甲胺及其衍生物的至少一种。
2.如权利要求1所述的组织透明化试剂盒，其特征在于，还包括尿素，所述尿素用以与所述芳香胺、所述葡萄糖共同配制成所述试剂一，所述尿素在所述试剂一中的质量比为大于0，且小于或等于5％。
3.如权利要求1所述的组织透明化试剂盒，其特征在于，还包括尿素，所述尿素用以配合所述芳香胺、所述葡萄糖配制所述试剂二，所述尿素在所述试剂二中的质量比为大于0，且小于或等于1％。
4.一种组织透明化方法，其特征在于，采用权利要求1至3中任意一项所述的组织透明化试剂盒，所述组织透明化方法包括以下步骤：
(1)将固定过的组织放入试剂一中孵育，得到初步透明化的组织；
(2)将上步所得的初步透明化的组织放入试剂二中孵育，得到水凝胶包埋的透明化组织。
5.如权利要求4所述的组织透明化方法，其特征在于，所述组织放入所述试剂一中的孵育温度为大于或等于25℃，且小于或等于37℃；所述组织放入所述试剂一中的孵育时间为大于或等于4小时，且小于或等于48小时。
6.如权利要求4所述的组织透明化方法，其特征在于，所述组织放入所述试剂二中的孵育温度为大于或等于4℃，且小于或等于37℃；所述组织放入所述试剂二中的孵育时间为大于或等于6小时，且小于或等于48小时。
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