CN105112356A - 一种原代肝细胞体外复极性的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种原代肝细胞体外复极性的培养方法，将肝细胞上样于微孔培养板，50g-250g离心1-10min，去除微孔培养板表面多余细胞悬液，加入肝细胞表型无血清培养液进行培养。本发明以力学紧凑种植方式种植原代成熟肝细胞群，肝细胞在结构和功能学上的复极性均提前至种植后第12h形成，加快了体外肝细胞群在三维环境下的复极性速度，可为肝组织工程提供具有近似生理功能表型的原代成熟肝细胞。

Description

一种原代肝细胞体外复极性的培养方法

技术领域

本发明涉及肝脏组织工程学技术领域，尤其涉及一种原代肝细胞体外复极性的培养方法。

背景技术

肝组织工程学在药物筛选、体外支持治疗、以及肝组织生理与疾病模拟模型等领域中具有重要的基础研究和临床应用价值。具有近似生理功能表型的原代成熟肝细胞是肝组织工程的重要细胞成分。如何获得具有最近似体内功能的工程化肝组织是该领域研究的核心目标和成功的关键技术之一。

成熟肝细胞在功能和结构上具有与其他上皮细胞不同的复杂极性特征，该极性是肝细胞发挥生理功能的基础。经酶解离开体内组织内环境后，成熟肝细胞失去极性，原有功能表型发生迅速减退。在一定的体外条件下，肝细胞恢复并维持其极性，保持较高的功能水平，并维持较长时间，此现象称为肝细胞复极性。肝细胞复极性包括以下特征：重新出现典型肝细胞间极性超微结构和功能性胆小管排泌。一般认为，新分离的肝细胞只有恢复细胞极性后方具备正常的细胞功能。因此，通过各种技术和方法处理以恢复细胞极性，是肝脏组织工程学的重要观察指标和目标。

二维和三维培养的原代成熟肝细胞，在适合的技术细节条件下，都有可能发生复极性现象。由于更接近生理特征，促进三维肝细胞复极性是目前肝组织工程技术研究的着力点。如肝细胞微球体，作为一种获得较多研究的三维肝组织体，其形成体现了典型的体外肝细胞自组织过程：新鲜分离的原代肝细胞有自发聚集的趋势，它们会在聚集体的基础上，逐渐紧凑并重新建立极性结构。目前大多研究通过优化培养基成分，提高氧气供应，改良培养基质的化学或物理结构以及改进种植方式等手段，使体外肝细胞复极性。

RyoSudo等应用鼠尾胶原三明治构型培养大鼠原代肝细胞，细胞培养液由基本培养基(DMEM)，20mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，25mM碳酸氢钠，30mg/LL-脯氨酸，10^-7M地塞米松，10mM烟酰胺，1mM的抗坏血酸-2-磷酸，10ng/mL表皮细胞生长因子和青霉素链霉素双抗组成，在肝细胞种植后第72h第一次检测到功能性胆小管对荧光素二乙酸(FDA)的排泌功能(SudoR.,MitakaT.,IkedaM.,andTanishitaK.(2005)Reconstructionof3Dstacked-upstructuresbyratsmallhepatocytesonmicroporousmembranes.TheFASEBJournal19(12):1695-7.)。MarkA.Talamini等用同法培养大鼠原代肝细胞，在肝细胞种植后48h检测到膜抗原蛋白的非对称性极性分布(Talamini,M.A.,KappusB.,andHubbardA.(1997)Repolarizationofhepatocytesinculture.Hepatology25(1):167-72.)。这是已有研究报道中肝细胞(结构和功能学)复极性的形成出现最早的时间(48h-72h)。

上述现有技术存在以下主要缺点：

1.虽然使原代肝细胞在体外条件下发生了复极性的行为，但不是生理性恢复。例如，二维单层培养原代肝细胞基本没有形成肝板样结构，形成的囊泡样胆小管片段接种48h后消失，肝细胞膜区域蛋白特异性分布在培养后1周后基本消失。

2.三明治构型培养的原代肝细胞提高了生理性原代肝细胞复极性的能力，肝细胞形成肝板样结构，伴胆小管网络形成，肝细胞膜区域蛋白呈特异性分布，但提高程度不显著。例如，三明治培养原代肝细胞在72h时白蛋白合成量为30μg/10⁶细胞/天，尿素合成量为120μg/10⁶细胞/天。

3.复极性出现的时间晚。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种原代肝细胞体外复极性的培养方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种原代肝细胞体外复极性的培养方法，将原代肝细胞上样于微孔培养板，50g-250g离心1-10min，去除微孔培养板表面多余液体，加入肝细胞表型无血清培养液进行培养。

优选地，原代肝细胞上样于微孔培养板后，静置5-10min，50g-250g离心1-10min，去除微孔培养板表面多余的细胞悬液，加入肝细胞表型无血清培养液进行培养。

更优选地，离心条件为100g-250g离心2-5min。

更进一步优选地，离心条件为100g离心2min。

优选地，原代肝细胞的密度为4-6×10⁶个/mL，按照300μL/孔的上样量上样于微孔培养板。

优选地，原代肝细胞的培养条件为37℃、5％CO₂，每48h换液一次。

优选地，肝细胞的培养时间为12h以上。

更优选地，肝细胞的培养时间为12h至120h。

更进一步优选地，肝细胞的培养时间为12h至48h。

更进一步优选地，肝细胞的培养时间为12h至24h。

优选地，肝细胞表型无血清培养液包含基础培养基HepatoZYMESFM(Invitrogen，LifeTechnologies，USA)、2mML-谷氨酰胺、60μMHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、50μM地塞米松和1×青霉素/链霉素双抗。

发明人通过对现有技术的分析，认为现有技术之所以存在多种缺点的原因可能有：肝细胞不能快速形成高密度培养；肝细胞间排列松散，没有形成紧密接触。因此，发明人对此进行了改进，形成了本发明。本发明原代肝细胞体外复极性的培养方法利用力学紧凑种植方式将原代肝细胞种植于微孔培养板中后进行复极性培养。力学紧凑种植是指利用机械力种植细胞，使细胞紧密排列，实现细胞的高密度种植的种植方式。所施加的机械力可以使细胞紧凑，因此该机械力称为紧凑力。本发明采用离心力将原代肝细胞种植于微孔培养板中静态培养，称为微孔离心静态培养法。

本发明微孔离心静态培养法以力学紧凑种植方式种植原代肝细胞，加快了体外肝细胞在三维环境下的复极性速度，可为肝组织工程提供具有近似生理功能表型的原代成熟肝细胞。与现有技术相比，本发明微孔离心静态培养法具有如下有益效果：

(1)本发明中利用力学紧凑种植原代肝细胞，可以使肝细胞间排列紧凑，形成紧密接触，肝细胞可以快速形成高密度培养。

(2)本发明中利用力学紧凑种植原代肝细胞，显著提高了肝细胞群的体外细胞功能，原代肝细胞在培养72h，白蛋白合成量为150μg/10⁶细胞/天，尿素合成量为750μg/10⁶细胞/天，远远高于现有技术培养原代肝细胞的合成水平。

(3)本发明对原代肝细胞进行模拟体内肝组织力学特点的力学紧凑方式进行种植和三维培养，本发明中肝细胞在结构和功能学上的复极性均提前至种植后第12h形成。

附图说明

图1为效果实施例1中普通显微镜观察图和激光共聚焦荧光显微图。图1A(i)和图1B(i)分别为对照组和处理组的普通显微镜观察图，图1A(ii)和图1B(ii)分别为对照组和紧凑力组的荧光标记后的激光共聚焦荧光显微图。

图2为效果实施例1中肝细胞种植密度柱状图。

图3为效果实施例2中肝细胞形状图。图3A为对照组细胞形状图，图3B为处理组细胞形状图，图3C为种植在具有典型肝细胞正弦曲线的肝细胞切片上的肝细胞形状图。

图4为效果实施例2中肝细胞接触距离图。图4A为对照组接触距离图，图4B为处理组接触距离图。

图5为效果实施例2中肝细胞接触面积柱状图。

图6为效果实施例3中胆小管排泌FDA情况图。图中箭头指示的是FDA集中分泌的区域，即形成胆小管的区域。

图7为效果实施例4中肝细胞在扫描电镜下的超微结构图。

图8为效果实施例5中白蛋白合成量柱状图。

图9为效果实施例5中尿素合成量柱状图。

图10为效果实施例6中肝细胞蛋白的极性排布图。

图11为效果实施例6中肝细胞pan-cadherin/F-actin荧光标记胆小管腔面积与肝组织面积比。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合附图和具体实施方式作进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

实施例1、微孔离心静态培养法

本实施例提供一种原代肝细胞体外复极性的培养方法，包括以下步骤：

将密度为5×10⁶个/mL原代肝细胞悬液按照300μL/孔的上样量上样于微孔培养板，将微孔培养板置于常用6孔培养板以便后续离心，静置5-10min使细胞悬液初步沉淀进微孔后，静置5-10min既可以保证肝细胞沉淀进微孔中，又能保证肝细胞的活力；100g离心2min，使细胞进入微孔，并且细胞间紧密接触，从而快速实现细胞的高密度种植；离心后利用无菌载玻片轻轻刮去微孔培养板表面多余的细胞悬液；向微孔培养板内加入肝细胞表型无血清培养液，在37℃、5％CO₂条件下培养，每48h进行细胞换液。

所述肝细胞表型无血清培养液包含基础培养基HepatoZYMESFM(Invitrogen，LifeTechnologies，USA)、2mML-谷氨酰胺，60μMHEPES、50μM地塞米松和1×青霉素/链霉素双抗(青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL)。L-谷氨酰胺为肝细胞培养提供能量，参与肝细胞的蛋白和核酸合成。HEPES是细胞培养用的缓冲液，调节细胞培养液的pH值在约7.4左右。地塞米松调节肝细胞的分泌功能等，双抗抑制细菌生长，避免细胞污染。

本实施例中原代肝细胞的通过以下方式分离获得：参照Selgen两步灌流法，分离Wistar大鼠原代成熟肝细胞。酶解细胞悬液经两次离心，每次50g离心10min，留取离心细胞沉淀，用肝细胞表型无血清培养液制备成原代肝细胞悬液。细胞活力(台盼兰染色法)在90％以上的分离样本可用于接种进行体外复极性实验。

对比例1、不施加离心力作用的成熟肝细胞体外复极性的培养方法

本实施例提供一种原代肝细胞体外复极性的培养方法，包括以下步骤：

将密度为5×10⁶个/mL原代肝细胞悬液按照300μL/孔的上样量上样于微孔培养板，将微孔培养板置于常用6孔培养板，静止5-10min使细胞悬液初步沉淀进微孔后，利用无菌载玻片轻轻刮去微孔培养板表面多余的细胞悬液。向微孔培养板内加入肝细胞表型无血清培养液进行培养。本对比例中肝细胞表型无血清培养液及原代肝细胞的分离方法与实施例1相同。

效果实施例1、肝细胞种植密度

检测实施例1中肝细胞的种植密度(处理组)，以对比例1中肝细胞作为对照。具体测定方法为：

用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤肝细胞3次，每次洗涤5min后，用3.7％(w/v)多聚甲醛(PFA)室温固定30min，PBS振荡洗涤3次，每次洗涤5min；250nmol/mLSytoxGreen荧光染料(Invitrogen,LifeTechnologies,USA)和200μg/mLRNAse(Sigma,USA)标记细胞核，室温染色30min，PBS振荡洗涤3次，每次洗涤5min。用普通显微镜和激光共聚焦荧光显微镜观察并拍照得到三维图像。

激光共聚焦图像中的细胞核使用Imarissoftware(version7.1.0,Bitplane,Switzerland)中的斑点检测模块鉴定。细胞总数为校正多核肝细胞后的细胞核总数，如间隔少于20μm的多个细胞核视为一个细胞核。计算每一个共焦量中细胞数目，获得单位体积内细胞数量，即细胞种植密度。通过检测肝细胞的平均直径，进一步估计每个培养室中的细胞体积，获得单位空间肝细胞占用比例。结果如图1-2所示。

由图1-2可知，在对照组中，细胞种植密度为5.3×10⁷±3.5×10⁶个/cm³，高于常见的肝细胞种植密度1×10⁶个/cm³，单位空间里细胞占用比例为65.9％±3％，略大于理论计算单位空间里刚性球体占用比例为63.4％；而在紧凑力处理组里，细胞种植密度为8.9×10⁷±4.9×10⁶个/cm³，单位空间肝细胞占用比例为88.5％±3.1％，远大于对照组和理论最大刚性球承载比例。以上结果表明，力学紧凑种植原代肝细胞，可实现肝细胞在体外的高密度培养。

效果实施例2、肝细胞形状和接触面积

新鲜分离的原代肝细胞以5μg/mL的CellMaskOrange(Invitrogen,LifeTechnologies,USA)染色标记，室温作用15min后，培养基洗涤一次。按照实施例1所述的方法复极性作为处理组，按照对比例1所述的方法复极性作为对照组。培养48h后观察和测量获得的肝细胞群的形状和接触面积。

样品处理方法如下：弃去细胞培养液，PBS振荡洗涤3次，每次洗涤5min；用3.7％(w/v)PFA室温固定30min，PBS振荡洗涤3次，每次洗涤5min。激光共聚焦荧光显微镜观察上述处理后的肝细胞并拍照得到三维图像。为了观察细胞与细胞之间的接触程度，三维共聚焦图像利用ImageJ1.43进行重建。通过测定每个培养室中20对接触细胞的距离，估计细胞与细胞之间的接触表面积。接触细胞的距离(三维堆叠的高度)通过图像接触部分确定。假设细胞等长压缩，细胞间的接触表面积以接触高度的平方值计算。结果如图3-5所示。

如图3-4所示，处理组中力学紧凑在肝细胞间传递，细胞个体受到来自周围细胞的三维挤触，形状发生变化。虽然目前技术手段还不能直接测到细胞群内部紧凑力的准确大小，但对荧光标记的细胞膜进行显微观察，与对照组相比，处理组多数细胞出现由球形向方形的变化。体内肝细胞为多角形，相对于对照组的球形细胞，处理组的方形细胞较接近体内肝细胞的形态。

如图4-5所示，力学紧凑处理组细胞间距离是11.2±0.6μm，对照组细胞间距离是13.9±0.3μm；力学紧凑处理组细胞间接触面积是187±0.6μm²，对照组细胞间接触面积是97±0.5μm²，处理组细胞间接触面积大约是对照组的两倍，差异具有统计学意义(P＜0.05)。因此，微孔离心静态培养法使肝细胞群排列更紧凑，细胞间接触更直接紧密。

效果实施例3、胆小管排泌FDA

检测实施例1培养12h、24h和48h获得的肝细胞群胆小管排泌FDA的情况(处理组)。以对比例1为对照组，检测对比例1培养12h、24h和48h获得的肝细胞群的胆小管排泌FDA的情况。

处理组和对照组肝细胞群各样品处理如下：分别分为两份，一份肝细胞群PBS洗涤3次，每次5min，后用含20μg/mLFDA的培养基37℃培养细胞40min，用PBS振荡洗涤细胞3次，每次5min。另一份肝细胞群不染色进行激光共聚焦荧光显微镜观察并拍照，排除肝细胞自发荧光的影响。用激光共聚焦荧光显微镜观察并拍照。FDA定位得到的胆小管腔大小使用ImageJ软件的阈值和魔法棒功能进行识别和定量。测定各个条件5个以上随机视野的胆小管大小。

本实施例经过5次以上重复实验确认，结果如图6所示，处理组肝细胞接种后不超过12h就普遍出现FDA排泌现象，而对照组肝细胞群需要48h才出现FDA排泌现象，与以往报道的三明治培养法模型中72h才出现FDA排泌现象相比，均有大幅提前。这是可能因为本实施例中采用微孔静态培养肝细胞，细胞种植密度比常用的三明治培养法高。

效果实施例4、肝细胞群超微结构的观察

本实施例进一步对种植后12h和48h的肝细胞群进行了超微结构观察。肝细胞群用2.5％(w/v)戊二醛固定30min，在显微镜观察下，利用微观钳把细胞团从微孔中移出。细胞团用1％(w/v)四氧化锇固定，使用浓度梯度(25％,50％,75％,95％,100％)乙醇脱水，每个浓度作用15min，随后用100％丙酮脱水两次，每次15min。样品用体积比1:1的丙酮和环氧树脂混合液室温孵育4h，再用体积比1:6的丙酮和环氧树脂孵育过夜。样品包埋在100％环氧树脂，60℃烘箱内固化24h。利用莱卡EMUC6超薄切片机切片，样品收集在200目网眼的铜筛中。样品使用3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色后，利用透射电子显微镜观察并拍照。

如图7所示，紧凑力作用的处理组肝细胞在种植后12h就形成功能性胆小管，并且伴随着微绒毛和紧密连接的形成，这种超微结构保持至48h以上，进一步确定了重建胆小管(BC)的存在；相反地，种植后12h的对照组肝细胞中没有出现伴随着微绒毛(MV)和紧密连接(TJ)形成的功能性胆小管结构，仅在种植后的48h出现了散在分布的小管状结构。以上结果清楚地表明，微孔离心静态培养法显著加速了肝细胞群的结构和功能学特征表型形成。

效果实施例5、白蛋白和尿素分泌实验

利用5mL注射器收集按照实施例1中方法采用紧凑力处理培养24h、48h、72h、96h和120h后的肝细胞群培养基，测定肝细胞群合成白蛋白和尿素的功能变化(处理组)。传统的二维胶原蛋白培养肝细胞作为空白对照组。培养基中白蛋白的浓度使用大鼠白蛋白酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(BethylLaboratories,USA)进行定量，尿素浓度则使用尿素尿素氮试验(BUN)试剂盒(StanbioLaboratory,USA)进行定量。利用多功能酶标仪分别测定白蛋白样品在450nm波长，尿素样品在520nm波长的光强吸光值。

根据文献报道，三明治培养法原代肝细胞在72h时白蛋白合成量为30μg/10⁶细胞/天，尿素合成量为120μg/10⁶细胞/天。本实施例的结果如表1和图8-9所示，处理组原代肝细胞在培养72h时，白蛋白合成量为150μg/10⁶细胞/天，尿素合成量为750μg/10⁶细胞/天，远远高于现有技术培养原代肝细胞的合成水平。在接种后培养的前三天，处理组肝细胞群的白蛋白合成能力是对照组(二维单层培养)肝细胞的2-10倍，在三天后则下降至二维培养肝细胞相当的水平。紧凑力处理肝细胞群尿素合成量在接种后培养的5天中相对稳定(ANOVA，p＝0.131)，比二维培养肝细胞高出近20倍。以上结果清楚表明，微孔离心静态培养法可以显著提高肝细胞群的体外功能和活力。

表1白蛋白和尿素合成量表

效果实施例6、肝细胞群极性蛋白的免疫荧光染色及肌动蛋白F-actin的特异性染色

使用实施例1所述方法培养12h、24h和48h的肝细胞群作为处理组，以对比实施例1所述方法培养相应时间的肝细胞群为对照组，检测肝细胞群极性蛋白的免疫荧光染色及肌动蛋白F-actin的特异性染色。

样品处理方法为：肝细胞群PBS洗涤3次，每次5min后，用3.7％(w/v)PFA室温固定30min，PBS洗涤3次，每次洗涤5min；0.1％TritonX-100的PBS室温静置通透肝细胞30min；PBS洗涤3次，每次洗涤5min。在显微镜观察下，利用微观钳把细胞团从微孔中移出。使用2％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％TritonX-100的PBS4℃封闭过夜，PBS洗涤3次，每次洗涤5min。所有的一抗抗体覆盖标本表面，4℃孵育过夜或室温作用2h；PBS洗涤3次，每次洗涤5min；所有的二抗抗体覆盖标本表面，同时加入100U/mLAlexafluor488phalloidin，37℃避光孵育60min；PBS避光洗涤3次，每次洗涤5min。紧密连接蛋白ZO-1RabbitPolyclonalAntibody(61-7300,Lifetechnologies,USA的稀释度为1:200，总黏附连接蛋白pan-cadherin一抗(C1821,Sigma,USA)的稀释度为1:500，罗丹明标记羊抗兔二抗(Sigma,USA)的稀释度为1:200。新鲜稀释Hoechst33342(H3570,Invitrogen,LifeTechnologies,USA,1mg/mL)覆盖细胞表面，室温避光静置10min；PBS避光振荡洗涤3次，每次洗涤5min。激光共聚焦成像荧光显微镜(ZeissLSM,Germany)进行观察和拍照。利用ImageJ软件对荧光标记胆小管腔面积进行定量。结果如图10和图11所示。

由图10和图11可知，在相同培养条件下，对照组复极性出现时间为种植后第48h，而力学紧凑处理组则显著加速至种植后第12h。这一时间较迄今已有文献报道的时间显著缩短。在12h，我们发现在力学处理组肌动蛋白F-actin提前加强分布于BC范围内并随时间的延长，加强分布的范围扩大。由总粘附连接蛋白pan-cadherin复染的分布特点可以判断，F-actin与BC形成、加速形成和成熟有密不可分的关系。pan-cadherin/F-actin荧光标记胆小管腔面积与肝组织面积的比值，随着培养时间递增而升高。在检测时间点12h、24h和48h，处理组的pan-cadherin/F-actin荧光标记胆小管腔面积与肝组织面积的比值分别为4.5％±0.1％，8.0％±0.2％，13.5％±0.5％，对照组的pan-cadherin/F-actin荧光标记胆小管腔面积与肝组织面积的比值分别为1.5％±0.2％，3.5％±0.4％，4.5％±0.4％。处理组的pan-cadherin/F-actin荧光标记胆小管腔面积与肝组织面积的比值均约为对照组的三倍。以上结果表明，微孔离心静态培养法显著加快了体外肝细胞群在三维环境下的复极性速度，之后肝细胞极性也得到充分维持。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种原代肝细胞体外复极性的培养方法，其特征在于：将原代肝细胞上样于微孔培养板，50g-250g离心1-10min，去除微孔培养板表面多余细胞悬液，加入肝细胞表型无血清培养液进行培养。

2.根据权利要求1所述的原代肝细胞体外复极性的培养方法，其特征在于：原代肝细胞上样于微孔培养板后，静置5-10min，50g-250g离心1-10min，去除微孔培养板表面多余的细胞悬液，加入肝细胞表型无血清培养液进行培养。

3.根据权利要求1或2所述的原代肝细胞体外复极性的培养方法，其特征在于：离心条件为100g-250g离心2-5min。

4.根据权利要求3所述的原代肝细胞体外复极性的培养方法，其特征在于：离心条件为100g离心2min。

5.根据权利要求1所述的原代肝细胞体外复极性的培养方法，其特征在于：原代肝细胞的密度为4-6×10⁶个/mL，按照300μL/孔的上样量上样于微孔培养板。

6.根据权利要求1或2所述的原代肝细胞体外复极性的培养方法，其特征在于：肝细胞的培养时间为12h以上。

7.根据权利要求6所述的原代肝细胞体外复极性的培养方法，其特征在于：肝细胞的培养时间为12h至120h。

8.根据权利要求7所述的原代肝细胞体外复极性的培养方法，其特征在于：肝细胞的培养时间为12h至48h。

9.根据权利要求8所述的原代肝细胞体外复极性的培养方法，其特征在于：肝细胞的培养时间为12h至24h。

10.根据权利要求1或2所述的原代肝细胞体外复极性的培养方法，其特征在于：肝细胞表型无血清培养液包含基础培养基HepatoZYMESFM、2mML-谷氨酰胺、60μMHEPES、50μM地塞米松和1×青霉素/链霉素双抗。