CN101812427A

CN101812427A - 一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法

Info

Publication number: CN101812427A
Application number: CN200910192440A
Authority: CN
Inventors: 冉丕鑫; 王健; 田艳; 陈豫钦; 蒋永亮; 万利梅
Original assignee: STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE; GUANGZHOU MEDICAL COLLEGE
Current assignee: STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE; GUANGZHOU MEDICAL COLLEGE
Priority date: 2009-09-18
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2010-08-25

Abstract

本发明涉及一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法，其特征是：包括获取原代培养的大鼠气道平滑肌细胞和获取传代培养的大鼠气道平滑肌细胞二个步骤，其中步骤1)将大鼠气管中膜用消化液在30℃～45℃消化14～30min后收集气道平滑肌细胞，进行原代细胞培养；所述消化液由HBSS平衡盐溶液、I型胶原酶、牛血清白蛋白和二硫苏糖醇按比例配制而成。本发明培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞纯度高，形态均一，生长良好；独特配方的消化液将气道平滑肌层的消化时间控制在14-30min，克服了现有技术中因大鼠中膜平滑肌层较主动脉薄、平滑肌细胞较主动脉肺动脉少、气道平滑肌细胞萌出时间长、生长缓慢的缺点。

Description

一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，尤其是一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

哮喘等呼吸系统疾病，是以气道高反应性和可逆性气道阻塞为主要临床特征，而气道的异常改变是作为哮喘的重要病理特征。气道平滑肌细胞是探寻COPD、哮喘等呼吸系统疾病发病机制的重要细胞材料，体外气道平滑肌细胞的培养和细胞株的建立是研究细胞生物学行为，是研究疾病发病机制及其防治手段的基础。因此找到一种简便、高效的平滑肌细胞培养方法对呼吸系统疾病方面的研究具有十分重要的意义。目前，气道平滑肌细胞培养的方法主要有贴块法和酶消化法。其中，贴块法虽然操作简单，但是周期太长，且对组织的分离要求高，当分离不佳时，细胞难以爬出。而且由于以下原因导致以大鼠气道为平滑肌细胞来源的细胞培养受到限制：1、大鼠体形较小，心肺组织更小，用常规分离牛、猪等大型动物动脉的方法来分离大鼠气道难度较大、不易成功；2.分离到的大鼠气管较动脉弹性差，周围纤维结缔组织多而且黏附紧密，外膜、中膜及内膜无明显过度分界；3.中膜平滑肌层较主动脉薄，平滑肌细胞较主动脉肺动脉少，一般的方法培养气道平滑肌细胞萌出时间长，生长非常缓慢。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种高效、简便、纯度高、成本低的大鼠气道平滑肌细胞原代培养的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法，其特征是：包括获取原代培养的大鼠气道平滑肌细胞和获取传代培养的大鼠气道平滑肌细胞二个步骤，

1)将大鼠气管中膜用消化液在30℃～45℃消化14～30min后收集气道平滑肌细胞，进行原代细胞培养，获取原代培养的大鼠气道平滑肌细胞；

2)当原代细胞达到90％融合密度后，用PBS溶液清洗，加入0.2～0.25％胰蛋白酶溶液室温消化1～2分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，清洗细胞，加入混合培养液，轻轻吹打使之形成细胞悬浮液，按1∶2接种于新的培养瓶中进行培养，3～5天至细胞生长至对数生长期，获取传代培养的大鼠腔静脉平滑肌细胞。

其中，步骤1)中消化液是：5mlHBSS平衡盐溶液中加入39.5-40.5mgI型胶原酶、9.5～10.5mg牛血清白蛋白和0.65～0.75mg二硫苏糖醇配制而成。按照此配方配制的消化液既能保证消化时间控制在一个较短的时间内同时不会伤害细胞膜，对细胞的伤害最小。所述消化液也可以是：5mlHBSS平衡盐溶液中加入31mg I型胶原酶、2mg木瓜酶、10mg牛血清白蛋白和0.7mg二硫苏糖醇配制而成，此配方的消化液能够使消化时间控制在14-16min。

所述步骤1)获取原代培养的大鼠气道平滑肌细胞的具体步骤为：

1)快速取出大鼠心肺组织放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中洗除血污；将心肺组织置于体视显微镜下，沿气管解剖结构快速钝性分离气管周围组织并反复用HBSS冲洗使视野清晰；将气管剪下放入HBSS中反复漂洗至组织干净光滑，剥离气管外脂肪和纤维组织外膜，剪开气管，刮除气管内外膜至其光滑为止，用HBSS反复冲洗去除内皮细胞；

2)取出中膜平滑肌层组织，将其放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中漂洗多次，至组织干净透明，然后用消化液在37℃消化中膜组织25-30min，见组织块松软、边缘发毛，呈一定程度的破碎状；

3)加入混合培养液中和消化液，收集细胞悬浮液并离心，弃上清液后加入混合培养液调整细胞密度以1～2×10⁵细胞/ml的密度种植于6孔培养板中，置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养，3-4天后换培养液，当细胞生长至对数生长期5-6天，即完成原代细胞培养，获得原代培养的大鼠气道平滑肌细胞。

所述步骤2)中每35mm单孔板需用胰蛋白酶溶液的用量为0.3～0.5ml，胰蛋白酶溶液中含0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)；所述的细胞接种密度为1～2×10⁵个/ml。

所述混合培养液为含95～105U/ml的青霉素、95～105U/ml的链霉素和10～20％胎牛血清的低糖DMEM(Dulbcco’s Modifed Eagle Medium)培养液。

所述HBSS平衡盐溶液为：1000ml三蒸水中加入7.6g氯化钠、0.38g氯化钾、0.25g氯化镁、1.8g葡萄糖和2.24gHEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)配制而成。

所述含氯化钙的HBSS平衡盐溶液为上述HBSS平衡盐溶液中每100ml加入150μl 1M氯化钙溶液。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞纯度高，形态均一，生长良好，很好地解决了贴块法培养平滑肌细胞存在周期长、对组织的分离要求高、细胞难以爬出等问题。

2、本发明采用独特配方的消化液，将气道平滑肌层的消化时间控制在14-30min；培养4-5天即可得到纯度为95％以上的平滑肌细胞，克服了现有技术中因大鼠中膜平滑肌层较主动脉薄、平滑肌细胞较主动脉肺动脉少、气道平滑肌细胞萌出时间长、生长缓慢的缺点。

3、本发明采用的气道平滑肌细胞，其取材部位位于气管至末梢支气管段，经本发明提供的方法获得的细胞经过倒置显微镜观察及细胞免疫荧光鉴定具有典型的平滑肌细胞形态及特点，为进一步研究COPD，哮喘等呼吸系统疾病的发病机制奠定了条件，提供了丰富的实验材料来源。

附图说明

图1是荧光显微镜(400×)下大鼠气道平滑肌细胞胞浆内肌丝α-Actin抗原发红色阳性荧光反应。

图2是荧光显微镜(400×)下大鼠气道平滑肌细胞胞核中出现绿色的阳性荧光反应。

图3是普通倒置显微镜(100×)下大鼠气道平滑肌细胞。

图4是荧光显微镜(400×)下大鼠气道平滑肌细胞，可见胞核中出现绿色的阳性荧光反应，平滑肌细胞胞浆中肌丝α-Actin抗原发红色阳性荧光反应。

具体实施例

下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

具体实施例1

图1～图4反映本实施例中大鼠气道平滑肌细胞状态图。

本实施例包括获取原代培养的大鼠气道平滑肌细胞和获取传代培养的大鼠气道平滑肌细胞二个步骤：

1、主要实验材料

(1)动物来源：大鼠可用5～6周龄(180-200g)的雄性SPF级SD大鼠。

(2)HBSS平衡盐溶液：1000ml三蒸水中加入7.6g氯化钠、0.38g氯化钾、0.25g氯化镁、1.8g葡萄糖和2.24gHEPES。

(3)消化液：5mlHBSS平衡盐溶液中加入40mg I型胶原酶、10mg牛血清白蛋白和0.7mg二硫苏糖醇，实验前24小时配制并过滤除菌。

(4)混合培养液：含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和10％胎牛血清的低糖DMEM培养液。

(5)1.5mM氯化钙的HBSS平衡盐溶液：100ml的HBSS平衡盐溶液加入150μl的1M氯化钙。

(6)3％戊巴比妥溶液：3g戊巴比妥用100ml生理盐水溶解，过滤除菌备用。

2、大鼠气道平滑肌细胞的培养方法

2.1获取原代培养的大鼠气管平滑肌细胞

1)称重大鼠，腹腔注射3％戊巴比妥钠(150mg/kg)麻醉大鼠，无菌条件下取大鼠心肺组织，放入25℃左右含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中，待心脏将血液泵净后，再用25℃左右含氯化钙的HBSS平衡盐溶液漂洗去掉血污，用HBSS平衡盐溶液洗除血污；将心肺组织固定在蜡块上，置于体视显微镜下，沿气管解剖结构用显微镊和显微剪刀于显微镜下快速钝性分离气管周围的肺组织和血管；将气管剪下放入HBSS平衡盐中反复漂洗至组织干净光滑，使视野清晰；调大显微镜的放大倍数，于显微镜观察下用显微镊和显微剪刀小心剥离气管外脂肪和纤维组织外膜，剪开气管，用细胞刮子或者棉签轻轻刮拭气管内外膜至其光滑为止，用HBSS平衡盐反复冲洗去除内皮细胞；

2)取出中膜平滑肌层组织，将其放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中漂洗多次，至组织干净透明，然后再用消化液在37℃消化中膜组织25-30min，可见组织块松软、边缘发毛，呈一定程度的破碎状；

3)加入2ml混合培养液中和消化液，终止消化；用100目无菌不锈钢筛网过滤；将收集的细胞悬浮液离心(1000rpm，5min)，弃上清液后，再加入新的混合培养液，小心吹打十数次，悬浮细胞，调整细胞密度以1～2×10⁵细胞/ml的密度种植于6孔培养板中(其中2孔放入盖玻片，鉴定时用)。置于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养，3-4天后换培养液，当细胞生长至对数生长期5-6天，即完成原代细胞培养，获得原代培养的大鼠气道平滑肌细胞。

2.2获取传代培养的大鼠气管平滑肌细胞

当原代细胞生长密度达90％后，即可传代。届时，用2mlPBS溶液清洗细胞3次，加入0.5ml 0.25％(m/v)胰蛋白酶溶液(含0.02％EDTA)室温消化1-2分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，加入2ml混合培养液中和胰蛋白酶溶液，轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之形成细胞悬浮液，以1～2×10⁵个/ml的细胞密度接种于新的培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中培养，培养基变黄时换液一次，至细胞生长至对数生长期3-5天，获得传代培养的大鼠气道平滑肌细胞。

以上操作步骤应注意以下几点：

1、试剂配制：按上述配方配制各种试剂，HBSS平衡盐溶液、消化液需现用现配，一般不超过24小时。调整HBSS平衡盐溶液的PH值时需要准确，否则影响细胞活性及酶的消化能力。培养液不宜偏酸性，平滑肌细胞耐碱性能力较强。

2、分离气管时准确辨别是关键，应以气管和血管的解剖关系来确定气管。将心肺组织的背面向下胸腔面向上固定，钝性分离肺组织后可见三条管腔，由上至下分别是肺静脉，气管支气管，肺动脉。

3、干净剥除气管外膜及选择性消化去除内膜是提高细胞纯度的关键，因为外膜纤维脂肪层与中层粘连紧密难于剥离，需要利用显微外科镊仔细将外膜剥离，利用选择性消化法和棉签机械擦除去除内皮细胞。

3、培养结果

3.1倒置相差显微镜下观察，刚种植的细胞呈圆形、透亮、单个均匀分布。原代培养的大鼠气道平滑肌细胞生长2-3天左右可见部分细胞贴壁、展开细胞形态多样，呈棱形、多角形、星形或不规则形，大小略有差异；胞浆丰富；胞核多为卵圆形多数细胞为单核，少数细胞有双核或三核，有一个或多个核仁居中。4-6天后细胞数量明显增多呈积聚性生长，细胞间常有突起相连。5-6天细胞生长达到对数期生长，部分区域细胞重叠堆积生长形成“峰”，“峰”与“峰”之间细胞层数渐少，形成“谷”。细胞密度低时常交织成网状，密度高时则排列为旋涡状或栅栏状，当细胞生长至融汇后，细胞间相互平行排列成束，高低起伏，形成典型的平滑肌细胞生长特征“峰”“谷”状生长。

3.2倒置相差显微镜下观察，传代培养的大鼠气道平滑肌细胞。细胞生长速度较原代培养细胞明显加快。传代后2天细胞贴壁、展开可见细胞呈棱形、多角形、星形或不规则形，3天后细胞数量明显增多呈积聚性生长，细胞间常有突起相连。5天后细胞生长至融汇，形成典型的平滑肌细胞生长特征“峰”“谷”状生长。原代培养的细胞与传代细胞形态一致。

3.3平滑肌α-Actin抗原的免疫荧光检测：采用平滑肌α-Actin单克隆抗体对培养的细胞进行鉴定，并采用国际常用的复染法进行染色，用Yo-pro I对所有细胞核进行染色，保证细胞纯度计算的可靠性。在荧光显微镜下观察，可见Cy3标记的细胞浆平滑肌α-Actin抗原发红色荧光，Yo-pro I标记的细胞核发绿色荧光。高倍镜下观察，平滑肌细胞胞浆中的肌丝平行于细胞长轴呈细丝状表达。阴性对照无加一抗，仅检测到Yo-proI标记的细胞核没有检测Cy3标记的平滑肌α-Actin，所以仅见发绿色荧光。低倍镜计算细胞纯度，每张片随机取5个视野，每个视野至少检测200个细胞。计算每个视野中α-Actin表达阳性细胞占该视野总细胞数的比例，为平滑肌细胞纯度，平均达95％以上。

具体实施例2

本实施例的特点是：所述消化液为：5mlHBSS平衡盐溶液中加入40.5mg I型胶原酶、9.5mg牛血清白蛋白和0.75mg二硫苏糖醇配制而成。其余与具体实施例1相同。

具体实施例3

本实施例的特点是：所述消化液为：5mlHBSS平衡盐溶液中加入39.5mgI型胶原酶、10.5mg牛血清白蛋白和0.65mg二硫苏糖醇配制而成。其余与具体实施例1相同。

具体实施例4

本实施例的特点是：所述消化液为：5mlHBSS平衡盐溶液中加入31mg I型胶原酶、2mg木瓜酶、10mg牛血清白蛋白和0.7mg二硫苏糖醇配制而成；用此消化液在37℃消化中膜组织14-16min，可见组织块松软、边缘发毛，呈一定程度的破碎状，即可加入混合培养液终止消化。其余与具体实施例1相同。

Claims

1.一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法，其特征是：包括获取原代培养的大鼠气道平滑肌细胞和获取传代培养的大鼠气道平滑肌细胞二个步骤，

1)将大鼠气管中膜用消化液在30℃～45℃消化15～30min后收集气道平滑肌细胞，进行原代细胞培养，获取原代培养的大鼠气道平滑肌细胞；

2.根据权利要求1所述的一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法，其特征是：所述消化液由HBSS平衡盐溶液、I型胶原酶、牛血清白蛋白和二硫苏糖醇按比例配制而成。

3.根据权利要求1所述的一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法，其特征是：所述消化液为：在5mlHBSS平衡盐溶液中加入31mg I型胶原酶、2mg木瓜酶、10mg牛血清白蛋白和0.7mg二硫苏糖醇配制而成。

4.根据权利要求2所述的一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法，其特征是：所述消化液其配制方法是：在5mlHBSS平衡盐溶液中加入39.5～40.5mgI型胶原酶、9.5～10.5mg牛血清白蛋白和0.65～0.75mg二硫苏糖醇混合配制而成。

5.根据权利要求1所述的一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法，其特征是：步骤1)所述获取原代培养的大鼠气道平滑肌细胞的具体步骤如下：

1)快速取出大鼠心肺组织放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中洗除血污；将心肺组织置于体视显微镜下，沿气管解剖结构快速钝性分离气管周围组织并反复用HBSS冲洗使视野清晰；将气管剪下放入HBSS平衡盐溶液中反复漂洗至组织干净光滑，利用显微外科镊剥离气管外脂肪和纤维组织外膜，剪开气管，刮除气管内外膜至其光滑为止，用HBSS平衡盐溶液反复冲洗去除内皮细胞；

2)取出中膜平滑肌层组织，并放入含氯化钙的HBSS平衡盐溶液中漂洗多次至组织干净透明，然后用消化液在30℃～45℃消化中膜组织25～30min，见组织块松软、边缘发毛，呈一定程度的破碎状；

3)加入混合培养液中和消化液，收集细胞悬浮液并离心，弃上清液后加入混合培养液调整细胞密度以1～2×10⁵细胞/ml的密度种植于培养板中，置于30℃～45℃、5％CO₂培养箱内静置培养，3～4天后换培养液，当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的大鼠气道平滑肌细胞。

6.根据权利要求5所述的一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法，其特征是：所述混合培养液中含有95～105U/ml的青霉素、95～105U/ml的链霉素和10～20％胎牛血清，为低糖DMEM培养液。

7.根据权利要求1所述的一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法，其特征是：所述胰蛋白酶溶液中含有0.02％乙二胺四乙酸EDTA；所述细胞接种密度为1～2×10⁵个/ml。