CN105039243A - 一种鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养方法，所述方法包括以下步骤：分离鸡胚人字形肺动脉血管并用PBS保证其湿润，修剪去除血管周围细小的结缔组织，将人字形血管分离为两根血管后分别对两根血管进行一次纵切，用胰蛋白酶溶液将纵切后的血管在15-37℃消化1-2min后用完全培养基终止消化获得消化后的组织块，将消化后的组织块切割成尺寸为0.4-0.6mm的组织小块，将组织小块在完全培养基中进行原代培养。操作简单，重复性好，培养的细胞纯度高，生长周期短，培养第3天即可见细胞爬出，原代培养4天后即可进行传代培养，细胞生长旺盛。

Description

一种鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养方法。

背景技术

利用原代细胞进行体外实验能够直接研究原代培养细胞在特定条件下对生长因子、脂蛋白氧化、基质蛋白合成等应激因素的反应，不受其他多种因子的影响(例如血压)。鸡肺动脉平滑肌细胞是研究鸡心肺健康相关疾病、尤其是肉鸡腹水综合征(又称肺动脉高压综合征)等疾病发病机理的重要材料。原代培养肺动脉平滑肌细胞能够进行信号转导、蛋白磷酸化、细胞增殖和肥大等研究，是研究鸡心血管健康及其疾病预防的重要模型。

目前，肺动脉平滑肌细胞原代培养方法主要有2种，贴块法和酶消化法，酶消化法需要大量的实验材料，常选用具有足够量的组织来进行酶消化的方法。若仅仅以肺主动脉为实验材料需要消耗大量的鸡胚。利用这两种方法可以进行低日龄鸡肺动脉平滑肌细胞的分离培养，但是当将这两种方法应用于鸡胚肺动脉平滑肌细胞的培养时，培养的结果往往不能达到要求，导致培养效率差纯度低的原因可能包括以下几点：1、鸡胚体形较小，肺脏组织小，镶嵌于胸肋骨中，处于相对密闭的空间，要分离得到完整肺脏进行酶消化培养难度较大；2、分离得到的鸡胚肺动脉短薄(<1cm)，血管周围黏附纤维结缔组织，单独分离中膜进行贴块培养难度大；3、酶消化法原代培养鸡肺动脉平滑肌细胞的纯度不易保证，酶消化结合差速贴壁培养能够提高细胞纯度，但操作步骤多，生长周期长。虽然贴块法(取肺主动脉切块，贴块于培养皿内加培养基培养)操作简单，但进行原代鸡胚肺动脉平滑肌细胞培养时，肺动脉纤细而薄，组织块易黏附成团，有成纤维细胞污染的风险。因此，如何高效、高纯度、低成本的获得鸡肺动脉平滑肌细胞是研究鸡相关疾病发生发展及治愈的关键技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种高效、高纯度、低成本的原代鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养方法，所述方法包括以下步骤：

分离鸡胚人字形肺动脉血管并用PBS保证其湿润，修剪去除血管周围细小的结缔组织，将人字形血管分离为两根血管后分别对两根血管进行两次纵切，用胰蛋白酶溶液将纵切后的血管在37℃消化1-2min后用完全培养基终止消化获得消化后的组织块，将消化后的组织块切割成尺寸为0.4-0.6mm的组织小块，将组织小块在完全培养基中进行原代培养。

可选的，将组织小块在完全培养基中原代培养的条件包括，按照0.8-1.2mm左右间距(此间距为组织块大小的2倍左右，有利于组织块有足够的区域爬出细胞)将组织小块平铺在含有完全培养基的培养皿内进行原代培养。

可选的，所述方法还包括在原代培养第3天进行补液；以及，在原代培养第4天挑出培养皿内的组织块并更换培养皿中的完全培养基继续原代培养。

可选的，所述方法还包括在原代培养第5天进行传代培养，所述传代培养的条件包括：用浓度为0.08-0.085％的胰蛋白酶溶液在37℃下消化3-5分钟后添加传代完全培养基终止消化，调整细胞悬液的密度至2.0×10⁵个/ml后接种于培养皿中。

可选的，原代培养中所使用的完全培养基为含有20％FBS和0.5‰抗坏血酸的M199培养基；传代培养中所使用的传代完全培养基为含有10％FBS和0.5‰抗坏血酸的M199培养基。

可选的，用于消化纵切后的血管的胰蛋白酶溶液的浓度为0.25％。

可选的，分离鸡胚人字形肺动脉血管的步骤包括：

将经过75％酒精喷洒消毒的鸡胚放置于超净台内，取用第一套镊子敲击鸡胚钝端气室，镊子小心卡住鸡胚颈部取出鸡胚，用第一套剪刀剪断鸡胚未吸收部分；取用第二套剪刀镊子剪开鸡胚胸腔，防止羽毛黏附于内脏，擦拭剪刀镊子；用第三套镊子夹住心尖，向上提起露出心脏腹面，剪刀小心剥离白色血管周围的结缔组织，并斜向下方向沿着血管根部剪断，保证人字形肺动脉血管的长度，取下放置于盛有PBS的培养皿内。

可选的，所述鸡胚的胚龄为16-17天。

本发明所提供的方法选取16-17胚龄鸡胚的血管，血管处理选用的是刀片(长形刀片，非弧形刀片)而非传统使用的眼科剪，刀片纵切血管后全部置于胰酶溶液中消化，这种处理能够一定层度上去掉内膜内皮细胞和外膜成纤维细胞，且不损坏血管中膜平滑肌层，便于平滑肌细胞爬出。对于鸡胚肺动脉血管纵切酶处理后再进行切块贴块的操作较传统贴块酶消化结合法来说能更好的进行贴块处理，因为，若先切块酶消化再贴块难度较大，血管块体积在1mm²以下，酶消化后呈薄片状，粘结悬浮于培养基内，肉眼条件下难以准确贴块，且易造成细胞培养皿底壁划伤，不利于贴块，而在血管纵切后即进行消化，不仅达到了去除杂细胞、便于目的细胞爬出的目的，而且酶消化后切块能够更好地掌握切块的大小，组织块非悬浮与培养基内便于组织块的移取与贴块。

本发明所提供的方法具有以下有益效果：

1、操作简单，重复性好，培养的细胞纯度高，生长周期短，培养第3天即可见细胞爬出，原代培养4天后即可进行传代培养，细胞生长旺盛。

2、克服了贴块法生长周期长、酶消化法细胞纯度不稳定，肺动脉短薄不易分离培养的问题。

3、本发明取材心脏相连的人字形肺动脉进行原代、传代培养，获得细胞具有典型地平滑肌细胞形态及特点，为研究肉鸡腹水征、猝死综合征等心血管疾病的发病机理提供了实验材料。

附图说明

图1为鸡胚人字形肺动脉分离步骤；

其中，A为所使用的刀片、B为鸡胚心脏和人字形肺动脉血管、C为分离下来的人字形肺动脉血管、D为将人字形肺动脉血管分离为两根血管、E为第一次纵切后获得的四条纵切后的血管、F为第二次纵切后获得的八条纵切后的血管。

图2为组织块铺板3天细胞爬出情况。

图3为显示组织块爬出原代平滑肌细胞具有典型的“峰”“谷”状特征。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出进是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。

以下实施例中：

完全培养基是：M199(含酚红)培养基溶液加入胎牛血清、双抗、抗坏血酸。

实施例1

(1)鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养

75％酒精喷洒消毒孵化至16胚龄的鸡胚，将消毒后的鸡胚放置于超净台内进行下一步操作，取用第一套镊子敲击鸡胚钝端气室，镊子小心卡住鸡胚颈部取出鸡胚，第一套剪刀剪断鸡胚未吸收部分后置于普通培养皿内。取用第二套剪刀镊子剪开鸡胚胸腔，防止羽毛黏附于内脏，擦拭剪刀镊子。第三套镊子夹住心尖，向上提起露出心脏腹面，剪刀小心剥离白色血管周围的结缔组织，并斜向下方向沿着血管根部剪断，保证肺动脉血管的长度，取下放置于盛有PBS的90mm普通培养皿内。用镊子固定心脏，小心刮洗血管内血液，并剥离血管周围结缔组织，分离人字形肺动脉血管和心脏，PBS洗3次，将肺动脉放置于普通培养皿内，PBS保证其湿润。

刀片修剪血管周围细小的结缔组织，将人字形血管分离为两根血管后分别对两根血管进行两次纵切获得八条纵切后的血管(见图1)，将纵切后的血管放置于盛有0.25％胰蛋白酶溶液的1.5ml离心管内，25℃消化1.5min后取出置于35mm培养皿内，培养皿内盛有600μl完全培养基(含20％FBS、0.5‰抗坏血酸的M199培养基)，终止消化、保证血管湿润以防止切块后组织的黏附。消化后组织块呈伸展状态，用刀片横切为0.5mm的组织小块，并用10ml注射器针头挑取组织小块，将其均匀平铺于含有600μl完全培养基(含20％FBS、0.5‰抗坏血酸的M199培养基)的35mm细胞培养皿内，保持组织块的间距为1mm左右，铺板完成后在37℃5％CO₂中原代培养，铺板后1天内不移动培养皿。

原代培养第3天观察细胞爬出情况，并向培养皿内补液200μl，注意不要冲击组织小块，以防组织块脱落。原代培养第4天用针头小心挑出组织小块后吸出培养基，用移液枪吸取1ml完全培养基(含20％FBS、0.5‰抗坏血酸的M199培养基)沿培养皿加入，继续原代培养。

原代培养第5天，细胞长至对数期，进行传代培养，吸出培养基，用25℃的PBS洗涤2次，向35mm细胞培养皿内均匀加入200μl0.08％胰蛋白酶溶液(0.25％PBS稀释，无EDTA)，置于37℃环境消化4min，观察到细胞变圆、回缩，吸出消化液后加入1ml传代完全培养基(含10％FBS、0.5‰抗坏血酸的M199培养基)，小心吸取培养基对着爬出的细胞堆吹打，形成细胞悬液，置于50ml离心管内，培养箱内保存，待所有培养皿内细胞消化完成后，倒置显微镜下观察细胞悬液密度，调节细胞密度至2.0×10⁵个/ml，吸取5ml细胞悬液接种至90mm细胞培养皿内，贴着超净台前后左右晃动培养皿，使得细胞均匀铺板于培养皿内，37℃5％CO₂培养。观察培养基颜色，待培养基颜色由红色变为桔黄色时换液(一般为2天)，继续培养。当细胞生长融合至90％左右后，即可进行后续传代培养。

(2)培养结果

倒置显微镜下观察，铺板第3天组织小块周围有细胞爬出(见图2)，组织块周围细胞重叠堆积生长形成“峰”，在“峰”与“峰”间的细胞较少而呈“谷”状，因而在组织块周围形成“峰”“谷”状的典型特征(见图3)。

倒置显微镜下观察平滑肌α-actin抗原的免疫荧光和Hochest33342的核染荧光，传代细胞生长旺盛，传代后1天即可贴壁，细胞伸展呈梭形、三角形、星形等多种形态，且具有平滑肌典型的“峰”“谷”状。

荧光显微镜下，Cy3标记的平滑肌α-actin抗原发红色荧光，Hochest33342标记的细胞核法蓝色荧光。高倍镜(40×10)下观察，平滑肌细胞胞浆中的肌丝平行于细胞长轴呈细丝状表达。阴性对照未加一抗，仅检测到Hochest33342标记的细胞核蓝色荧光，未见Cy3标记的红色荧光。低倍镜(4×10)下观察计算细胞纯度，每张片子取5个视野，每个视野至少检测200个细胞。计算每个视野中α-actin表达阳性细胞占该视野总细胞数的比例，计算平滑肌细胞的纯度为99％。

实施例2

采用与实施例1相同方法进行鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养，区别仅在于，原代培养过程中所使用的传代完全培养基为含有20％FBS的M199培养基。观察并计算平滑肌细胞纯度为89％。

实施例3

采用与实施例1相同方法进行鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养，区别仅在于，传代培养过程中所使用的传代完全培养基为含有10％FBS的M199培养基。观察并计算平滑肌细胞纯度为92％。

对比例1

本对比例用于说明现有技术对鸡胚肺动脉平滑肌细胞进行分离培养的方法。

按照文献《鸡肺动脉平滑肌细胞培养及免疫组化鉴定》中公开的方法进行鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养，观察并计算平滑肌细胞纯度为95％。

对比例2

本对比例用于说明现有技术对鸡胚肺动脉平滑肌细胞进行分离培养的方法。

按照《低氧条件下鸡胚肺动脉内皮细胞内皮素-1的分泌及其对中膜平滑肌细胞的影响》中公开的方法进行鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养，观察并计算平滑肌细胞纯度为95％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

分离鸡胚人字形肺动脉血管并用PBS保证其湿润，修剪去除血管周围细小的结缔组织，将人字形血管分离为两根血管后分别对两根血管进行两次纵切，用胰蛋白酶溶液将纵切后的血管在37℃消化1-2min后用完全培养基终止消化获得消化后的组织块，将消化后的组织块切割成尺寸为0.4-0.6mm的组织小块，将组织小块在完全培养基中进行原代培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将组织小块在完全培养基中原代培养的条件包括，按照0.8-1.2mm间距将组织小块平铺在含有完全培养基的培养皿内进行原代培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在原代培养第3天进行补液；以及，在原代培养第4天挑出培养皿内的组织块并更换培养皿中的完全培养基继续原代培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在原代培养第5天进行传代培养，所述传代培养的条件包括：用浓度为0.08-0.085％的胰蛋白酶溶液在37℃下消化3-5分钟后添加传代完全培养基终止消化，调整细胞悬液的密度至2.0×10⁵个/ml后接种于培养皿中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，原代培养中所使用的完全培养基为含有20％FBS和0.5‰抗坏血酸的M199培养基；传代培养中所使用的传代完全培养基为含有10％FBS和0.5‰抗坏血酸的M199培养基。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于，用于消化纵切后的血管的胰蛋白酶溶液的浓度为0.25％。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，分离鸡胚人字形肺动脉血管的步骤包括：

将经过75％酒精喷洒消毒的鸡胚放置于超净台内，取用第一套镊子敲击鸡胚钝端气室，镊子小心卡住鸡胚颈部取出鸡胚，用第一套剪刀剪断鸡胚未吸收部分；取用第二套剪刀镊子剪开鸡胚胸腔，防止羽毛黏附于内脏，擦拭剪刀镊子；用第三套镊子夹住心尖，向上提起露出心脏腹面，剪刀小心剥离白色血管周围的结缔组织，并斜向下方向沿着血管根部剪断，保证人字形肺动脉血管的长度，取下放置于盛有PBS的培养皿内。

8.根据权利要求1-5和7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述鸡胚的胚龄为16-17天。