CN115354020A - 大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型及其构建方法与应用。构建方法包括：1)将大鼠气道平滑肌细胞含血清培养24h后吸去旧培养液，用PBS润洗2‑3次，然后往各孔板中加入含1％P/S的DMEM‑F12无血清培养基，继续于37℃、5％CO2恒温饥饿培养24h；2)吸去旧培养液，用PBS润洗2‑3次，随后往各孔中加入含0.1％FBS及1％P/S的DMEM‑F12培养液，再往其中加入稀释至10ng/μL的IL‑13，使每孔中IL‑13的终浓度为50ng/mL，继续放置37℃，含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养24、48h。

Description

大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，涉及大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型及其构建方法与应用。
背景技术
支气管哮喘(bronchial asthma，简称哮喘)，是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症；在易感者中此种炎症可引起反复发作的喘息、气促、胸闷和/或咳嗽等症状，多在夜间或凌晨发生；此类症状常伴有广泛而多变的呼气流速受限，但可部分地自然缓解或经治疗缓解；此种症状还伴有气道对多种刺激因子反应性增高。
过敏性哮喘动物模型是目前研究最广泛，也是与人类哮喘病理生理机制最接近的哮喘模型类型。其他的哮喘模型类型包括：感染性哮喘模型、肥胖哮喘模型、中性粒细胞哮喘模型、职业性哮喘模型、难治性哮喘模型、哮喘气道重塑模型、激素抵抗型哮喘模型等。每种哮喘动物模型都有其自身的优势和局限，新的动物模型的构建，对理解哮喘的发生和进展所涉及的机制至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型及其构建方法与应用。
为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型的构建方法，包括：
1)将大鼠气道平滑肌细胞含血清培养24h后吸去旧培养液，用PBS润洗2-3次，然后往各孔板中加入含1％P/S的DMEM-F12无血清培养基，继续于37℃、5％CO2恒温饥饿培养24h；
2)吸去旧培养液，用PBS润洗2-3次，随后往各孔中加入含0.1％FBS及1％P/S的DMEM-F12培养液，再往其中加入稀释至10ng/μL的IL-13，使每孔中IL-13的终浓度为50ng/mL，继续放置37℃，含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养24、48h。
优选地，所述大鼠气道平滑肌细胞通过以下方法分离得到：腹腔注射2％戊巴比妥钠麻醉大鼠，体积分数75％乙醇消毒胸腹部皮肤，无菌条件下从腹部至颈部依次剪开皮肤、肌肉，腹主动脉放血后剪开胸腔，自颈部至下迅速分离气管，撕去内外膜，将支气管组织剪成组织块，加入0.2％Ⅰ型胶原酶，吹打均匀，4℃消化过夜，隔天转入37℃消化5-10min，根据组织块的情况使用完全培养基稀释终止消化，1 000-1500r/min离心3-5min，弃去上清液，以Hank’s液清洗后，用完全培养基重悬铺板。
更优选地，所述大鼠气道平滑肌细胞接种于24或96孔板中，铺板细胞数分别为1x104个/孔、2000个/孔。
优选地，还包括设置不加IL-13的空白对照组。
优选地，上述构建方法还包括：
3)用FITC-phalloidine及DAPI染色进行细胞面积测定，模型组的细胞面积明显增大。
本发明还提供了上述构建方法构建的大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型。
本发明另提供了载药PLGA微球在大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型中的应用，包括按照载药PLGA微球与大鼠气道平滑肌细胞个数比1：1000向大鼠气道平滑肌细胞中加入载药PLGA微球作用72小时。
优选地，与模型组相比，加入载药PLGA微球的PLGA组的细胞面积明显减小。
优选地，所述载药PLGA微球通过以下方法制备：将PLGA溶解在二氯甲烷溶液中得到20mg/ml的PLGA-二氯甲烷溶液，将用水溶解的载药倒入PLGA-二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下在5000rpm高速搅拌10s，形成初乳溶液；迅速将初乳溶液倒入3％PVA中，冰浴下10000rpm搅拌10s，形成复乳溶液；将复乳溶液倒入0.5％PVA中，室温下磁力搅拌2h，减压蒸馏2h去除其中残余的有机溶剂，5000rpm离心15min，水洗两次，最后将其放在-20℃冰箱中一晚，第二天用冷冻干燥仪冻干。
本发明的有益效果在于：
本发明成功构建的大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型，并通过一种新的载药PLGA微球的方式对哮喘模型有效改善，对以后临床具有指导意义。
附图说明
图1是本发明实施例中制备的载药PLGA微球扫描电镜照片。
图2是本发明实施例中分离大鼠气道平滑肌细胞的主要步骤示意图。
图3是本发明实施例中对照组和模型组的染色结果。
图4是本发明实施例中对照组、模型组和PLGA组染色结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例
一.载药PLGA微球制备
实验原理：
PLGA(聚乳酸-CO-乙醇酸)是有乳酸和乙醇酸聚合而成，其在生物体内最终降解产物为H2O和CO2，作为一种生物可降解高分子材料，可以通过调节乳酸和乙醇酸的聚合比例来调节聚合物的降解速率。PLGA由于其良好的生物相容性，被美国的FDA批准临床应用，由于其合成方法较简单，生物相容性较好，又是可降解材料，降解速度可控性及良好的可塑性，近年来被大量应用于控制释放的载体材料。
复乳溶剂蒸发法：选择一个与水互不相溶的低沸点﹑蒸汽压比水高的有机溶剂(二氯甲烷)。将PLGA溶解在其中。将包裹物水溶液分散在上述有机溶液中，形成油包水(W/O)型乳液。另外配置一个含有稳定剂﹑保护胶的水溶液作为包裹溶液(0.5％的PVA溶液)，在搅拌情况下，将此溶液加入到上述乳液中，形成水包油包水(W/O/W)型复乳，再使溶剂挥发掉(用旋转蒸发仪)。
将蒸发后的溶液在高速离心机里离心，去除上清液，将得到的沉淀用双蒸水清洗3次，最后将所得固体冷冻干燥，干燥后将产物放在-20℃的冰箱中备用。
(一)仪器设备
冷冻干燥机(FD-1A-50，上海比朗)；旋转蒸发仪(RE-501，山东博科)；匀浆机(S10，新芝)；移液枪(Research plus 100-1000μL，eppendorf)等。
(二)试剂
PLGA(P133293，aladdin)；PVA(P105126，aladdin)；二氯甲烷(20160601，天津市大茂化学试剂厂)。
实验用试剂的配制：
6％的PVA的配制：称量12g PVA，倒入磨口锥形瓶中，在其中加入少量去离子水，过夜待其溶胀，于次日95度以上水浴锅内加热溶解，并补齐水溶液至200ml，配成6％的PVA，备用。
3％，0.5％的PVA的配制：用双蒸水将6％的PVA按一定比例稀释即可。
(三)实验方法
步骤：采用复乳溶剂蒸发法，将200mg PLGA溶解在10ml二氯甲烷溶液中，将用水溶解的载药倒入上述溶液中，在冰浴条件下用手持式匀浆机在5000rpm高速搅拌10s，形成初乳溶液；迅速将初乳溶液倒入25ml 3％PVA中，冰浴下10000rpm搅拌10s，形成复乳溶液；将复乳溶液倒入300mL 0.5％PVA中，室温下磁力搅拌2h，减压蒸馏2h去除其中残余的有机溶剂，5000rpm离心15min，水洗两次，最后将其放在-20℃冰箱中一晚，第二天用冷冻干燥仪冻干。
(四)实验结果
如图1所示，利用上述方法制备的载药PLGA微球形态均匀。
二.大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型建立
1.大鼠气道平滑肌细胞的分离：
腹腔注射2％戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠，体积分数75％乙醇消毒胸腹部皮肤，无菌条件下从腹部至颈部依次剪开皮肤、肌肉，腹主动脉放血后剪开胸腔，自颈部至下迅速分离气管腹腔注射2％戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠，体积分数75％乙醇消毒胸腹部皮肤，无菌条件下从腹部至颈部依次剪开皮肤、肌肉，腹主动脉放血后剪开胸腔，自颈部至下迅速分离气管。撕去内外模，用眼科虹膜剪将支气管组织剪成约1mm×1mm×1mm大小的组织块，加入2mL的0.2％Ⅰ型胶原酶，吹打均匀，4℃消化过夜，隔天转入37℃消化5-10min，根据组织块的情况使用完全培养基稀释终止消化。1000-1500r/min离心3-5min，弃去上清液，以Hank’s液清洗后，用完全培养基重悬铺板。
整体操作流程如图2所示。
2.细胞哮喘模型的建立：
因有效细胞代数限制，本实验中所用平滑肌细胞均为培养至5代以内的细胞，消化细胞，接种于24或96孔板中，铺板细胞数分别为1×104个/孔、2000个/孔，于500μL含10％FBS及1％P/S的DMEM-F12培养液中，37℃、5％CO2恒温培养24h。随后根据不同组别对细胞进行不同处理，具体如下(以24孔板培养为例)：
(1)哮喘模型组：[IL-13诱导组(50ng/mL IL-13)]：细胞含血清培养24h后吸去旧培养液，用200μL PBS润洗2-3次，然后往各孔板中加入500μL仅含1％P/S的DMEM-F12无血清培养基，继续于37℃、5％CO2恒温饥饿培养24h。后吸去旧培养液，用200μL PBS润洗2-3次，随后往各孔中各加入1mL含0.1％FBS及1％P/S的DMEM-F12培养液，再往其中加入5μL稀释至10ng/μL的IL-13，使每孔中IL-13的终浓度为50ng/mL，继续放置37℃，含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养24、48h。
(2)空白对照组(Control)：细胞含血清培养24h后吸去旧培养液，用200μLPBS润洗2-3次，然后往各孔板中加入500μL 仅含1％P/S的DMEM-F12无血清培养基，继续于37℃、5％CO2恒温饥饿培养24h。后吸去旧培养液，用200μL PBS润洗2-3次，随后往各孔中各加入1mL含0.1％FBS及1％P/S的DMEM-F12培养液，不加IL-13。继续放置37℃，含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养24、48h。
3.哮喘模型验证检测方法：
细胞面积测定：各组细胞，将其用FITC-phalloidine及DAPI染色进行细胞面积测定。
结果如图3所示，可见与对照组相比，模型组的细胞面积明显增大。
三.载药PLGA微球对大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型的影响
方法：建立大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型，然后向细胞中加入0.2ml的载药PLGA微球作用72小时。
结果如图4所示，可见与对照组相比，模型组的细胞面积明显增大，与模型组相比，PLGA组的细胞面积明显减小。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型的构建方法，包括：
1)将大鼠气道平滑肌细胞含血清培养24h后吸去旧培养液，用PBS润洗2-3次，然后往各孔板中加入含1％P/S的DMEM-F12无血清培养基，继续于37℃、5％CO2恒温饥饿培养24h；
2)吸去旧培养液，用PBS润洗2-3次，随后往各孔中加入含0.1％FBS及1％P/S的DMEM-F12培养液，再往其中加入稀释至10ng/μL的IL-13，使每孔中IL-13的终浓度为50ng/mL，继续放置37℃，含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养24、48h。
2.根据权利要求1所述的大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型的构建方法，其特征在于，所述大鼠气道平滑肌细胞通过以下方法分离得到：腹腔注射2％戊巴比妥钠麻醉大鼠，体积分数75％乙醇消毒胸腹部皮肤，无菌条件下从腹部至颈部依次剪开皮肤、肌肉，腹主动脉放血后剪开胸腔，自颈部至下迅速分离气管，撕去内外膜，将支气管组织剪成组织块，加入0.2％Ⅰ型胶原酶，吹打均匀，4℃消化过夜，隔天转入37℃消化5-10min，根据组织块的情况使用完全培养基稀释终止消化，1000-1500r/min离心3-5min，弃去上清液，以Hank’s液清洗后，用完全培养基重悬铺板。
3.根据权利要求2所述的大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型的构建方法，其特征在于，所述大鼠气道平滑肌细胞接种于24或96孔板中，铺板细胞数分别为1x104个/孔、2000个/孔。
4.根据权利要求1所述的大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型的构建方法，其特征在于，还包括设置不加IL-13的空白对照组。
5.根据权利要求4所述的大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型的构建方法，其特征在于，还包括：
3)用FITC-phalloidine及DAPI染色进行细胞面积测定，与空白对照组相比，模型组的细胞面积明显增大。
6.权利要求1-5任意一项所述的大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型的构建方法构建的大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型。
7.载药PLGA微球在大鼠气道平滑肌细胞哮喘模型中的应用，包括按照载药PLGA微球与大鼠气道平滑肌细胞个数比1：1000向大鼠气道平滑肌细胞中加入载药PLGA微球作用72小时。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，与模型组相比，加入载药PLGA微球的PLGA组的细胞面积明显减小。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述载药PLGA微球通过以下方法制备：将PLGA溶解在二氯甲烷溶液中得到20mg/ml的PLGA-二氯甲烷溶液，将用水溶解的载药倒入PLGA-二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下在5000rpm高速搅拌10s，形成初乳溶液；迅速将初乳溶液倒入3％PVA中，冰浴下10000rpm搅拌10s，形成复乳溶液；将复乳溶液倒入0.5％PVA中，室温下磁力搅拌2h，减压蒸馏2h去除其中残余的有机溶剂，5000rpm离心15min，水洗两次，最后将其放在-20℃冰箱中一晚，第二天用冷冻干燥仪冻干。
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曹卫军等: "IL-13对小鼠气道平滑肌细胞的促增殖作用", 《第二军医大学学报》 *
王超智: "川芎嗪对PDGF诱导大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用基分子机制", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, pages 057 - 252 *
王超智;许继德;白洪波;: "改良组织块消化法建立大鼠气道平滑肌细胞模型", 现代生物医学进展, no. 14, pages 1 *

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