CN102719427A

CN102719427A - 碱性裂解提取dna的方法

Info

Publication number: CN102719427A
Application number: CN2012102428626A
Authority: CN
Inventors: 李爱强; 崔江平; 陈力清; 宋金平; 张艳霞; 赵丽; 王项华
Original assignee: 李爱强
Priority date: 2012-07-14
Filing date: 2012-07-14
Publication date: 2012-10-10

Abstract

本发明提供了一种碱性裂解提取DNA的方法，包括如下步骤：第一：将检材放入浓度为0.05-0.6M的NaOH溶液中；第二：对上述溶液进行孵化，孵化温度为90℃-99℃，孵化时间为5-10分钟；第三：对所述孵化后的溶液置于振荡器进行振荡；第四：加入浓度为0.01-0.1M、pH值为5-8的Tris-HCl溶液并进行离心振荡；第五：将提取物置于-20℃环境中冷冻保存。与现有技术相比，本发明通过改变试剂的浓度、pH值、孵化时间及孵化温度等参数，使其能满足现有的各类常规法医生物检材的需要，并能在相同的设备及实验条件下同时进行自动化DNA提取工作。

Description

碱性裂解提取DNA的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及DNA的提取方法，尤其涉及一种碱性裂解提取DNA的方法。

背景技术

随着我国DNA数据库建设的不断深入，国家库DNA数据量飞速增加，全国的生物检材检验资金消耗也与日俱增，据统计，一年全国需投入DNA检验经费约2个亿。如何在保障DNA检验结果准确的前提下，建立一种新的DNA检验方法，大幅降低DNA数据库生物检材检验成本，具有重要意义。

目前DNA数据库生物检材的检验方法主要分二类：

第一类是用Chelex-100或磁珠等方法将生物检材中DNA提取后再扩增。

第二类是直接用直扩试剂盒进行扩增。

在节约检验成本方面，两类方法在提取及扩增阶段各有优势及不足。在生物检材提取阶段，第一类方法有Chelex-100或磁珠等试剂消耗，第二类方法无需提取直接扩增，因此，第一类方法在提取阶段成本高，第二类方法具有优势。但第一类方法较第二类方法在扩增方面有明显优势，第二类方法的模板DNA为固态，具有一定的体积和吸水性，故其扩增体系不能太小，目前只能做到5微升体系，且稳定性不好，而第一类方法的模板DNA为液态，其扩增体系目前能做到1微升，且稳定性好，且由于生物检材DNA检验的扩增试剂成本远远高于提取试剂成本，因此，如果想大幅降低DNA数据库检验成本，生物检材的DNA检验应选择第一类方法。而在第一类方法中，碱性裂解法是DNA提取成本最低、所需时间最短的方法。

所谓碱性裂解提取法，即在强碱作用下，使构成细胞的蛋白质成分谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸残基等迅速发生电离，从而快速破坏蛋白质的一级结构，正因为强碱对蛋白质有强烈的变性乃至裂解作用，所以，检材在强碱性pH条件及一定温度状况下能迅速破碎细胞及核膜，使核酸酶变性及DNA释放。

但是现有的碱性裂解法也存在一些不足之处，例如：生物检材DNA不能常温保存；不适用于全部生物检材；不同种类的生物检材提取方法各不同。这些不足之处导致其不能满足现有的各类常规法医生物检材在相同的设备及实验条件下同时进行自动化DNA提取工作。

因此，确有必要提供一种能满足现有的各类常规法医生物检材的需要，并能在相同的设备及实验条件下同时进行自动化DNA提取工作的碱性裂解提取DNA的方法来解决上述技术问题。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种碱性裂解提取DNA的方法，其能有效降低成本，并能提高效率，能满足现有的各类常规法医生物检材在相同的设备及实验条件下同时进行自动化DNA提取工作。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种碱性裂解提取DNA的方法，包括如下步骤：第一：将检材放入浓度为0.05-0.6 M的NaOH溶液中；第二：对上述溶液进行孵化，孵化温度为90℃-99℃，孵化时间为5-10分钟；第三：对所述孵化后的溶液置于振荡器进行振荡；第四：加入浓度为0.01-0.1M、pH值为5-8 的Tris-HCl溶液并进行离心振荡；第五：将提取物置于-20℃环境中冷冻保存。

作为本技术方案的进一步改进，所述NaOH溶液的浓度为0.25M。

作为本技术方案的进一步改进，所述孵化温度为99℃，孵化时间为8分钟。

作为本技术方案的进一步改进，所述Tris-HCl溶液的浓度为0.05M ，PH值为6.5。

与现有技术相比，本发明通过改变试剂的浓度、pH值、孵化时间及孵化温度等参数，使其能满足现有的各类常规法医生物检材的需要，并能在相同的设备及实验条件下同时进行自动化DNA提取工作。

【附图说明】

图1为本发明所述的NaOH溶液浓度（0.05-0.6M）与峰值的变化。

图2为本发明所述的Tris-HCl溶液浓度（0.01-0.1M）与峰值的变化。

图3为本发明所述的Tris-HCl溶液PH值（5-9）与峰值的变化。

图4为本发明所述的孵化温度与峰值的变化。

图5为本发明所述的孵化时间与峰值的变化。

图6为本发明所述的提取物保存时间与峰值的变化，上方线条为冷冻保存，下方线条为室温保存。

【具体实施方式】

本发明提供一种碱性裂解提取DNA的方法，包括如下步骤：

第一：将检材放入浓度为0.05-0.6M的NaOH溶液中，其中，NaOH溶液的最佳浓度为0.25 M；

第二：对上述溶液进行孵化，孵化温度为90℃-99℃，孵化时间为5-10分钟，其中，最佳孵化温度为99℃，最佳孵化时间为8分钟。

第三：对所述孵化后的溶液置于振荡器进行振荡；

第四：加入浓度为0.01-0.1M、pH值为5-8 的Tris-HCl溶液并进行离心振荡；

第五：将提取物置于-20℃环境中冷冻保存。

对所述提取物进行的扩增，采用美国AB公司AmpFLSTR Identifiler™ PCR扩增试剂盒，总反应体系为10μl，其中DNA模板1μl。扩增条件按试剂盒说明书在9700型PCR仪扩增进行复合扩增。

本发明所述的NaOH浓度、Tris-HCl浓度及pH值、孵化温度及孵化时间对整个提取过程具有极其重要的作用，是经过复杂的、多次的试验才得到的最佳参数，也是本发明相对于现有的碱性裂解提取法的最大改良，为了阐述这些参数所带来的优势，以下结合具体试验进行阐述。

试验过程中，利用的仪器及试剂分别为AB公司9700型PCR热循环仪；AB公司3130xl测序仪；IdentifilerTM试剂盒；NaOH、Tris及HCl溶液。针对的检材主要包括：抗凝血、带毛囊毛发、血斑、精液、唾液等。

关于 NaOH 的浓度：

各取5µl抗凝血分别用浓度为0.05M、0.1 M、0.15 M、0.2 M、0.25 M、0.3 M、0.35 M、0.4 M、0.45 M、0.5 M、0.55 M、0.6 M的20µl的 NaOH及Tris-HCl（0.05M 且pH=6.5）溶液提取DNA。

实验证明，检验结果峰值随NaOH浓度增大而升高，当NaOH浓度为0.25M时，峰值达到最高，但当NaOH浓度超过0.25M时，峰值随NaOH浓度增加而降低（参图1）。当NaOH浓度小于0.15M或大于0.35M时，样本扩增产物同一荧光标记物的不同基因座之间的均衡性差，大于50%，尤其是大片段STR基因座峰值较小片段明显下降，易引起等位基因缺失。由此可见当NaOH浓度为0.25 M时，最适合抗凝血DNA的提取。经实验证明，此浓度的NaOH溶液同样适用于其它类法医生物检材的DNA提取。因此，改良后的碱性裂解法NaOH浓度最佳应采用0.25 M。同时，由于NaOH溶液可从空气中吸收二氧化碳，所以在保存NaOH溶液时需注意将瓶盖严。

关于 Tris-HCl 的浓度：

各取5µl抗凝血分别用浓度为0.01M、0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.10M的Tris-HCl（pH=6.5）溶液及0.25M的NaOH溶液提取DNA。

实验证明，检验结果峰值随Tris-HCl浓度增加(0.01-0.1M)无明显变化（参图2）。由此可见，Tris-HCl浓度在0.01-0.1M范围内适合抗凝血DNA的提取。本发明的碱性裂解法使用的Tris-HCl浓度最佳值为0.05M，经实验证明，此浓度的Tris-HCl溶液同样适用于其它类法医生物检材DNA的提取。同时，由于Tris-HCl溶液可从空气中吸收二氧化碳或挥发HCl，故在保存Tris-HCl溶液时注意将瓶盖严。

关于 Tris-HCl 的 pH 值：

各取5µl抗凝血分别用PH=5.0、PH=5.5、PH=6.0、PH=6.5、PH=7.0、PH=7.5、PH=8.0、PH=8.5、PH=9.0的Tris-HCl（0.05M）溶液及0.25M的NaOH溶液提取DNA。

实验证明，峰值随Tris-HCl PH值(5.0至8.0)增加变化不大，但当Tris-HCl PH大于8.0时，峰值随PH值的增加而明显下降（参图3），且样本扩增产物同一荧光标记物的不同基因座之间的均衡性差，大于50%，尤其是大片段STR基因座峰值较小片段明显下降，易引起等位基因缺失。由此可见，当Tris-HCl PH值在5.0至8.0范围内适合鲜血DNA的提取。改良后的碱性裂解法使用的Tris-HCl 的最佳PH值为6.5，经实验证明，此浓度的Tris-HCl溶液同样适用于其它类法医生物检材DNA的提取。

关于孵化温度：

各取5µl抗凝血用NaOH（0.05M）及Tris-HCl（0.05M pH=6.5）溶液分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、99℃时提取DNA。

实验证明，峰值随着孵化温度的增加而升高，当达到90度时达到最高值（参图4），但当孵化温度低于80℃时，样本扩增产物同一荧光标记物的不同基因座之间的均衡性差，大于50%，尤其是大片段STR基因座峰值较小片段明显下降，易引起等位基因缺失。由此可见，样本孵化温度在90℃-99℃之间适合抗凝血DNA的提取。而在室温条件下提取抗凝血，大片段STR基因座等位基因缺失严重，故用碱性提取法在室温下几乎仅需一分钟，便可有效的从全血中提出DNA的论述，是不科学的，其只适合小片段DNA的提取，不适合荧光STR检测。为了能同时适合其它类法医生物检材的提取，改良后的碱性裂解法孵化温度采用99℃，经实验证明此孵化温度适用于其它各类法医生物检材的DNA提取。

关于孵化时间：

各取5µl抗凝血用NaOH（0.05M）及Tris-HCl（0.05M、pH=6.5）溶液在99℃分别孵化1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟后提取DNA。

实验证明，样本在99℃孵化时其检验结果峰值随孵化时间的增加(1-10分钟)而无明显变化（图5），但当孵化时间低于4分钟时，样本扩增产物同一荧光标记物的不同基因座之间的均衡性较差，尤其是大片段STR基因座峰值较小片段明显下降，但不会引起等位基因缺失。由此可见孵化时间在5-10分钟范围内适合抗凝血DNA的提取。为了能同时适合其它类法医生物检材的提取，改良后的碱性裂解法孵化时间采用8分钟，经实验证明此孵化时间适用于其它各类法医生物检材的DNA提取。

关于保存温度：

取二组各10份5µl抗凝血用NaOH（0.25M）及Tris-HCl（0.05M PH=6.5）溶液提取DNA，样本DNA提取物一组室温保存，另一组冰箱-20℃冷冻保存，每天检测提取物一次。

实验证明，在室温保存的抗凝血DNA提取物在提取后的两天内，检验结果峰值未见明显改变，而从第三天开始，有部分样本出现峰值骤降或消失；在冰箱-20℃冷冻保存的抗凝血DNA提取物，随着保存时间的推移，检验结果峰值未见明显改变（参图6）。由此可见碱性裂解法提取的抗凝血DNA在室温保存是不稳定的，其适合于冰箱-20℃保存。经实验证明用改良后的碱性裂解法提取的各类法医生物检材DNA提取物，适合于冰箱-20℃的长期保存（至少一个月以上）。因此，在日常检验过程中，法医生物检材的DNA用碱性裂解法提取后，要尽快进行检验，否则需冰箱-20℃冷冻保存。

本发明所述的碱性裂解提取DNA的方法在灵敏度、适应性及适用性方面都与传统的Chelex100法提取的DNA检验结果一致，两者均衡性相似无差异，其灵敏性、适应性及适用性完全能满足常见各类法医生物检材及现有各种DNA试剂盒的需要。

以下为几种DNA提取方法的成本比较，用碱性裂解法提取DNA的试剂消耗成本远远低于DNA实验室常用的5%Chelex-100法和磁珠法。

Figure 2012102428626100002DEST_PATH_IMAGE001

另外，从提取时间来看，常用的Chelex-100法或磁珠法的DNA提取时间均在40分以上，而改良后的碱性裂解法的提取时间仅用10分钟，远远低于常规方法。

综上所述，改良后的碱性裂解法可在相同的实验条件下同时批量处理各类法医生物检材，适用于现有的各种DNA试剂盒扩增检测，其灵敏度与Chelex100法相似，但其操作更简便、使用更经济、检验更迅速，为实验室检验人员提供了一种提取法医生物检材DNA非常好的选择。

以上所述，仅是本发明的最佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，利用上述揭示的方法内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，均属于权利要求书保护的范围。

Claims

1.一种碱性裂解提取DNA的方法，包括如下步骤：

第一：将检材放入浓度为0.05-0.6 M的NaOH溶液中；

第二：对上述溶液进行孵化，孵化温度为90℃-99℃，孵化时间为5-10分钟；

第三：对所述孵化后的溶液置于振荡器进行振荡；

第五：将提取物置于-20℃环境中冷冻保存。

2.根据权利要求1所述的提取DNA的方法，其特征在于：所述NaOH溶液的浓度为0.25M。

3.根据权利要求2所述的提取DNA的方法，其特征在于：所述孵化温度为99℃，孵化时间为8分钟。

4.根据权利要求3所述的提取DNA的方法，其特征在于：所述Tris-HCl溶液的浓度为0.05M ，PH值为6.5。