KR102313174B1 - 순환 핵산의 수집 및 증폭을 위한 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

생물학적 샘플의 비-세포 분획으로부터 순환 핵산의 수집 및 증폭 방법이 본원에 제공된다. 순환 핵산은 비-세포 분획으로부터 추출되고, 원형화되어 단일-가닥 핵산 환을 생성하고, 이는 그 다음 랜덤 프라이머를 사용한 롤링 서클 증폭에 의해 후속 증폭되어 증폭된 라이브러리를 생성한다. 생물학적 샘플로부터 비-세포 분획의 수집을 위한 장치도 또한 제공된다. 장치는 여과막 및 여과막과 직접 접촉하는 건조 고체 매트릭스를 포함한다.

Description

순환 핵산의 수집 및 증폭을 위한 방법 및 장치{METHOD AND DEVICE FOR COLLECTION AND AMPLIFICATION OF CIRCULATING NUCLEIC ACIDS}
본 출원은 일반적으로 생물학적 샘플로부터 순환 핵산(CNA)의 수집 및 증폭에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 출원은 생물학적 샘플로부터 순환 핵산의 분리, 수집, 증폭, 및 추가적인 검출에 관한 것이다.
순환 핵산은 다양한 조직으로부터 방출되어 체액에 축적된다. 다양한 무손상 및/또는 단편화된 핵산이 mRNA, miRNA, 미토콘드리아 DNA, 게놈 DNA, 및 레트로트랜스포존을 포함한 CNA에서 동정되었다. CNA는 질환의 초기 검출 뿐만 아니라 예후 및 치료진단 응용에 매우 적절하다. CNA의 진단 잠재력은 종양 형성, 염증, 심근 경색, 자가면역성 질환, 및 임신성 합병증을 포함한 광범위한 스펙트럼의 질환에 대해 입증되었다.
순환 핵산은 체액을 샘플로 취하는 최소한의 침습적 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 그러나, CNA는 체액에 매우 적은 양으로 존재한다. 따라서, CNA의 분석은 일반적으로 다량(밀리리터 또는 리터)의 체액의 수집 및 처리를 흔히 필요로 한다. 그러나, 많은 경우, 오직 매우 소량의 체액 샘플(마이크로리터)가 특히 체외 진단, 병리학, 및 포렌식(forensic) 분야의 분석에서 이용가능할 수 있다. 더욱이, 다량 샘플 수집은 흔히 상당한 설치 비용, 운송/취급 비용, 및 샘플 인공물을 초래한다. 부가적으로, CNA는 체액 내 세포의 외부에 존재하기 때문에, 핵산의 이 순환 풀은 체액 내 정주 세포의 용해를 통해 방출되는 세포내 DNA 또는 RNA에 의해 점진적으로 희석될 수 있다. 이 희석 또는 오염은 시간, 온도, 안정화를 위한 처리의 유형, 및 체액의 단리를 위해 사용된 분리력의 멀티-파라미터 함수일 수 있다. 이들 사전-분석 변수는 체액 내에 존재하는 정주 세포에서 비롯된 바람직하지 않은 게놈 오염을 발생시킬 수 있다. 예컨대, 전혈 샘플에서, DNA 또는 RNA는 저장 및 처리 동안 혈액 세포에서 혈장 또는 혈청으로 방출될 수 있다. 이는 혈장 또는 혈청에 존재하는 세포외, 순환 핵산의 분석을 방해할 수 있다. 순환 핵산 풀의 게놈 오염은 4 ℃로 혈액 샘플을 유지하고 2 시간 이내에 샘플을 처리함으로써 감소될 수 있다. 그러나, 이러한 조건은 많은 응용에서 흔히 실현할 수 없고/없거나 비용 효율적이지 않다.
전체 게놈 증폭은 순환 핵산의 자연 풀을 확장하는데 사용될 수 있다. 그러나, 다중 분리 증폭(MDA) 기법을 사용한 CNA의 전체 게놈 증폭의 이전의 시도는 체액 내 열악한 질과 소량의 CNA에 관한 특유의 문제점을 드러냈다. 일반적으로, 본래, CNA는 세포사멸/괴사 세포로부터 유래했기 때문에 매우 단편화된다. CNA의 핵산 단편화 패턴은 종래의 전체 게놈 증폭을 행하기 위해 이상적이지 않아서, 대립유전자 탈락(allelic drop-out) 및/또는 서열 편향된 증폭 패턴을 초래한다. 부가적으로, 많은 종래의 전체 게놈 증폭 기법은 나노그램 수준의 핵산 투입을 필요로 한다. 따라서, CNA는 이들 주형 농도 요구량을 충족시키기 위해 다량의 비-세포 분획으로부터 정제되어야만 한다. 위의 관점에서, 특히 피코그램 수준의 CNA를 함유하는 소량의 샘플을 분석하는 경우, 생물학적 샘플로부터 순환 핵산의 분리, 수집, 안정화, 및/또는 증폭을 간소화하는 기술이 지극히 필요하다.
본 발명은 생물학적 샘플로부터 CNA의 수집 및 후속 증폭에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은 생물학적 샘플의 비-세포 분획에 존재하는 순환 핵산의 증폭 방법에 관한 것이다. 방법은 생물학적 샘플을 여과하여 무손상 세포로부터 비-세포 분획을 분리하는 단계, 건조 고체 매트릭스에 분리된, 비-세포 분획을 수집하는 단계, 및 수집된, 비-세포 분획으로부터 CNA를 추출하는 단계를 포함한다. 방법은 추출된 CNA를 원형화시켜 단일-가닥의 핵산 환을 형성하는 단계, 및 랜덤 프라이머에 의한 롤링 서클 증폭에 의해 단일-가닥 핵산을 증폭시켜 증폭된 CNA 생성물을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. CNA가 이중-가닥 형태로 존재한다면, 방법은 단일-가닥 핵산 환을 만들기 위한 분자내 라이게이션 반응 전에 이중-가닥 CNA를 단일-가닥 형태로 변성시키는 단계도 또한 포함한다. 선형 단일-가닥 CNA의 원형화는 단일-가닥 핵산의 분자내 라이게이션이 가능한 리가제에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 현장 진단(point-of-collection)에서 순환 핵산을 함유하는 혈장 또는 혈청을 수집하기 위해 전혈을 처리하는 방법에 관한 것이다. 방법은 현장 진단에서 전혈을 여과하여 전혈로부터 혈장 또는 혈청을 분리하는 단계, 분리된 혈장 또는 혈청을 건조 고체 매트릭스 상에 수집하는 단계, 및 고체 매트릭스 상에 수집된 혈장을 건조하는 단계를 포함한다. 고체 매트릭스는 어떠한 세제도 없다.
본 발명의 또다른 측면은 혈장 또는 혈청의 건조된 샘플로부터 CNA를 검출하는 방법에 관한 것이다. 방법은 건조된 혈장 또는 혈청으로부터 CNA를 추출하는 단계, 추출된 순환 핵산의 전체 게놈 증폭을 수행하여 증폭된, 순환 핵산(CNA) 생성물을 형성하는 단계, 및 증폭된, CNA 생성물에서 특이적인 순환 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함한다. 전체 게놈 증폭은 먼저 단일-가닥 핵산의 분자내 라이게이션이 가능한 리가제를 사용하여 추출된 CNA를 원형화시켜 단일-가닥 핵산 환을 형성하고, 랜덤 프라이머를 이용하여 롤링 서클 증폭으로 단일-가닥 핵산 환을 증폭함으로써 수행된다. CNA가 이중-가닥 형태라면, 방법은 분자내 라이게이션 반응 전에 이중-가닥 CNA를 그의 단일-가닥 형태로 변성시키는 단계도 또한 포함한다.
본 발명의 또다른 측면은 순환 핵산을 포함하는 생물학적 샘플의 비-세포 분획을 수집하는 장치에 관한 것이다. 장치는 무손상 세포로부터 생물학적 샘플의 비-세포 분획을 분리하도록 구성된 여과막, 및 분리된, 비-세포 분획을 수집하도록 구성된 건조 고체 매트릭스를 포함한다. 여과막 및 고체 매트릭스는 이들 사이에 직접 접촉이 확립되도록 구성된다. 또한, 고체 매트릭스는 어떠한 세제도 없다.
기재된 발명의 이들 및 다른 특징, 측면, 및 이점은 도면에서 각각의 부호가 해당 부분을 나타내는 상응하는 도면을 참조로 하여 하기 상세한 설명을 읽을 때 보다 잘 이해될 것이며, 여기서:
도 1은 본 발명의 방법의 실시양태를 보여주는 흐름도를 도시한다.
도 2는 생물학적 샘플의 비-세포 분획의 분리 및 수집을 위한 측방 유동 장치의 개략도를 도시한다.
도 3은 생물학적 샘플의 비-세포 분획의 분리 및 수집을 위한 측방 유동 장치를 만들기 위한 실시양태의 개략도를 도시한다.
도 4는 생물학적 샘플의 비-세포 분획의 분리 및 수집을 위한 수직 유동 장치의 개략도를 도시한다.
도 5는 인간 전혈의 측방 또는 수직 분리 이후 건조 고체 매트릭스의 혈장 DNA 수집을 도시한다.
도 6은 측방 또는 수직 유동에 의해 전혈로부터 분리된 혈장 DNA(즉, 혈장으로부터 추출된 순환 DNA)에서 4 개의 상이한 염색체 유전자좌의 검출을 가능하게 하는 리가제 이용 전체 게놈 증폭을 도시한다.
도 7은 선형 이중 가닥 DNA의 리가제 이용 전체 게놈 증폭의 실시양태의 개략도를 보여준다.
도 8은 건강한 개인의 혈장으로부터 단리된 순환 DNA의 크기 프로파일을 보여준다.
도 9a는 서크리가제(CircLigase)TM II를 사용한, 전혈의 비-세포 분획으로부터 추출된 순환 DNA의 리가제 이용 전체 게놈 증폭을 보여준다.
도 9b는 T4 DNA 리가제를 사용한, 전혈의 비-세포 분획으로부터 추출된 순환 DNA의 리가제 이용 전체 게놈 증폭을 보여준다.
도 9c는 이. 콜라이(E. coli) 리가제를 사용한, 전혈의 비-세포 분획로부터 추출된 순환 DNA의 리가제 이용 전체 게놈 증폭을 보여준다.
도 10은 4 개의 상이한 CODIS 유전자좌의 민감하고 균형잡힌 DNA 증폭을 위한 리가제 이용 전체 게놈 증폭의 효율을 보여준다.
도 11은 12 개의 상이한 CODIS 유전자좌의 민감하고 균형잡힌 DNA 증폭을 위한 리가제 이용 전체 게놈 증폭의 효율을 보여준다.
도 12는 상이한 반응 및 완충제 조건에서 리가제 이용 전체 게놈 증폭의 각기 다른 효율을 보여준다.
도 13은 리가제 이용 전체 게놈 증폭에서 고분자량 게놈 DNA의 증폭의 억제를 보여준다.
도 14는 DYS14 남성-특이적 표지가 투입 CNA로부터 생성된 라이브러리를 사용하여 검출되는, 남성-여성 혈장/혈액을 사용한 단일-튜브 리가제 이용 증폭 반응을 보여준다.
하기 상세한 설명은 예시적인 것으로, 청구된 발명 또는 청구된 발명의 용도를 제한하도록 의도되지 않는다. 또한, 청구된 발명 또는 하기 상세한 설명의 전술된 배경지식에 나타난 어떠한 이론에 의해서도 제한되도록 의도되지 않는다.
하기 명세서 및 이하 청구항에서, 단수 형태는 맥락상 명백히 달리 언급되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 명세서 및 청구항을 통해 본원에 사용되는 근사 용어는 관련된 기본 기능을 변하게 하지 않으면서 허용되는 변화가능한 임의의 정량적 표시를 수정하기 위해 적용될 수 있다. 따라서, "약"과 같은 용어에 의해 수정되는 값은 명시된 정확한 값에 제한되지 않는다. 달리 표시되지 않는 한, 적어도 명세서 및 청구항에서 사용된 분자량, 반응 조건과 같은 성분, 특성의 양을 표현하는 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 모든 예시에서 수정되는 것으로 이해해야 한다. 일부 예시에서, 근사 용어는 값을 측정하기 위한 기구의 정밀도에 대응할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 진핵세포 기원의 생물학적 대상체로부터 얻은 임의의 유형의 생물학적 유체를 의미한다. 생물학적 샘플의 비-제한적 예시는 전혈, 소변, 침, 땀, 눈물, 양수, 모유, 세비액, 또는 기관지 폐포 세척 유체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유류(예컨대, 래트, 마우스, 소, 개, 당나귀, 기니 피그, 또는 토끼)에서 유래된 것이다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 인간에서 유래된 것이다.
본원에 사용된 용어 "무손상 세포"는 생물학적 샘플(즉, 생물학적 유체)에 존재할 수 있는 파괴되지 않은 세포를 의미한다. 무손상 세포는 파괴되지 않은 것이기 때문에, 어떠한 핵산 및/또는 핵산 단편도 무손상 세포의 내부로부터 생물학적 샘플의 비-세포 분획으로 방출되지 않는다. 무손상 세포는 정주하는 진핵 세포(예컨대, 전혈 내 혈액 세포) 및/또는 순환 세포(예컨대, 전혈 내 순환 종양 세포)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 무손상 세포는 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 다른 병리학적 세포(예컨대, 박테리아 또는 바이러스성 세포)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "비-세포 분획"은 무손상 세포가 없는 생물학적 샘플의 성분을 의미한다. 예컨대, 전혈의 비-세포 분획은 무손상 혈액 세포(예컨대, 백혈구, 적혈구, 및 혈소판)가 없는 혈장 및 혈청을 포함한다. 비-세포 분획의 생성을 위해 사용된 여과막의 세공 크기에 따라, 비-세포 분획은 진핵 세포, 원핵 세포, 및/또는 바이러스성 세포 입자가 없을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "순환 핵산" 또는 "CNA"는 생물학적 샘플의 비-세포 분획에서 발견되는, 세포에서 유리된 핵산을 의미한다. 세포 유리 핵산은 생물학적 세포의 내부 세포 구획(예컨대, 핵, 미토콘드리아 등)에 국한되지 않는 핵산이다. 순환 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "직접 접촉"은 두 부품 사이의 인접한 접촉을 의미한다. 두 부품 사이의 직접 접촉은 이들이 서로 직접 접촉하도록 두 부품을 위치시킴으로써 달성된다.
본원에 사용되는 용어 "ss리가제(ssLigase)" 또는 "단일-가닥 특이적 리가제"는 단일-가닥 핵산의 분자내 라이게이션이 가능한 리가제를 의미한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플로부터 CNA를 수집하고 증폭하기 위한 방법에 관한 것이다. CNA의 농도 상승은 건강한 개체와 비교할 때 몇몇 질환을 갖는 환자로부터 수집된 생물학적 샘플의 비-세포 분획에서 흔히 발견되어, 질병 생물표지로서의 그의 잠재력을 시사한다. 예컨대, 전혈의 혈장 또는 혈청 분획에서 발견되는 종양-유래 순환 핵산은 암 및 전암성 상태를 검출하거나, 모니터링하거나, 또는 평가하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 생물학적 샘플의 비-세포 분획의 CNA의 증폭 방법은 신생물 질병, 염증, 심근 경색, 자가면역성 질환, 이식된 장기/조직 거부반응, 임신성 합병증 등과 같은 질병의 검출, 진단, 모니터링, 치료, 및/또는 평가를 도울 수 있다. 신생물 질환은 초기 암, 전암성 상태, 또는 진행성 암을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태는 순환 핵산을 함유하는 생물학적 샘플의 비-세포 분획의 분리 및 수집을 위한 방법 및 장치에 관련된다. 무손상 세포로부터 비-세포 분획을 분리하고 수집한 후, 방법은 비-세포 분획으로부터 순환 핵산을 추출하는 단계, 및 이들 핵산을 증폭하여 증폭된 CNA 라이브러리를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 방법 및 장치는 CNA 수집 및 증폭을 위한 단순화되고 통합된 해법을 제공한다. 방법 및 장치는 현장 진단에 사용하기에 적합할 수 있고, 소량(예컨대, 약 150 μL 미만)의 샘플로 이용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 장치 및 관련 방법은 샘플 처리 기간을 단축하고, 게놈 DNA 또는 RNA 오염에 관련된 샘플 인공물을 최소화하고, CNA 증폭 및/또는 검출의 민감도를 증가시키는데 도움을 준다.
일부 실시양태에서, CNA는 종양-유래 순환 핵산일 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, CNA는 태아, 이식 후 기증받은 조직, 이식된 세포, 이식된 조직, 또는 질병 상태로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 순환 핵산은 순환 DNA 또는 순환 RNA를 포함한다. 순환 DNA는 종양-유래 DNA, 태아-유래 DNA, 기증받은 기관-유래 DNA, 이식 세포-유래 DNA, 이식된 조직-유래 DNA, 또는 그의 조합을 포함할 수 있지만, 그에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 한 측면은 생물학적 샘플의 비-세포 분획에 존재하는 순환 핵산의 증폭 방법에 관련된다. 방법은 생물학적 샘플을 여과하여 무손상 세포로부터 비-세포 분획을 분리하는 단계, 건조 고체 매트릭스에 분리된, 비-세포 분획을 수집하는 단계, 및 수집된, 비-세포 분획으로부터 CNA를 추출하는 단계를 포함한다. 방법은 단일-가닥-특이적 리가제를 사용하여 추출된 순환 핵산을 원형화시켜 단일-가닥 핵산 환을 형성하는 단계, 및 랜덤-프라이머에 의한 롤링 서클 증폭에 의해 단일-가닥 핵산 환을 증폭시켜 증폭된, CNA 생성물을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 비-세포 분획에서 종양-유래된 순환 DNA의 증폭 및 검출 방법이 제공된다.
도 1은 본 발명의 실시양태를 보여주는 흐름도를 표시한다. 생물학적 샘플은 무손상 세포로부터 비-세포 분획을 분리하도록 구성된 여과막, 및 분리된 비-세포 분획을 수집하도록 구성된 건조 고체 매트릭스를 포함하는 장치에 적용된다. 도 1에서 보여지는 것처럼, 생물학적 샘플은 여과막(102)에 적용된다. 여과 이후, 생물학적 샘플의 무손상 세포는 여과막의 상부측/표면에 보유되고, 비-세포 분획은 (측방 유동 장치에서) 하부측 또는 (수직 유동 장치에서) 하부 표면에 위치될 수 있는 건조 고체 매트릭스(104)에 수집된다. 그 다음, 비-세포 분획을 함유하는 건조 고체 매트릭스는 저장될 수 있거나(106) 또는 순환 핵산의 추출을 위해 바로 사용될 수 있다(108). 그 다음, 추출된 순환 핵산은 단일-가닥 핵산의 분자내 라이게이션이 가능한 리가제에 의해 후속 원형화되어 단일-가닥 핵산 환을 형성한다(110). 일부 실시양태에서, 방법은 추출 전에 실질적으로 건조 상태로 수집된 비-세포 분획을 건조하는 것을 추가로 포함한다. CNA가 이중-가닥 형태라면, 순환 핵산의 사전 변성이 라이게이션 반응 전에 필요할 수 있다. 그 다음, 단일-가닥 핵산 환은 랜덤 프라이머에 의한, 롤링 서클 증폭에 의해 후속 증폭되어 증폭된, CNA 생성물을 형성한다.
도 2는 생물학적 샘플의 비-세포 분획을 분리하기 위해 사용될 수 있는 장치의 한 실시양태의 개략도를 도시한다. 여과막(202)은 샘플 적용 구역(210) 및 전달 구역(212)을 갖는다. 여과막은 전달 구역(212)을 통해 고체 매트릭스(204)와 직접 접촉한다. 여과 단계는 여과막의 샘플 적용 구역에서 생물학적 샘플을 제공하는 것, 및 여과막을 통해 생물학적 샘플을 통과시키는 것을 포함한다. 여과막은 복수의 세공을 갖는다. 일단 생물학적 샘플이 여과막을 통과하면, 생물학적 샘플 내에 정주하는 무손상 세포는 여과막에 의해 대부분 샘플 적용 구역(210) 자체에 보유되고, 비-세포 분획은 세공을 통과하여 전달 구역(212)에 도달하고 건조 고체 매트릭스에 전달되고 수집된다. 일부 실시양태에서, 약 0.01 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터의 범위의 세공 크기를 갖는 여과막이 이용될 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 여과막의 세공 크기는 약 0.22 마이크로미터에서 약 2 마이크로미터까지 변할 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 여과막은 약 1 마이크로미터 내지 약 2 마이크로미터의 세공 크기를 갖는다. 1 마이크로미터 세공 크기의 여과막이 사용되면, 1 마이크로미터 초과의 직경을 갖는 임의의 다른 순환 진핵 세포 및/또는 병리학적 세포는 여과막에 보유될 것이고, 따라서 여과 후 건조 고체 매트릭스에 도달하지 않을 것이다.
일부 실시양태에서, 비-세포 분획은 현장 진단 내에서 생물학적 샘플로부터 여과될 수 있다. 여과는 생물학적 샘플의 어떠한 전처리 없이도 수행될 수 있다. 추가적 여과는 임의의 안정화제 없이 수행될 수 있다. 여과 이후, 분리된, 비-세포 분획은 물리적 상호작용에 의해 건조 고체 매트릭스 상에 수집될 수 있다. 비-세포 분획은 흡착 또는 흡수에 의해 건조 고체 매트릭스 상에 수집될 수 있다.
여과막은 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다. 여과막을 형성하는데 사용되는 물질은 천연 물질, 합성 물질, 또는 합성 개질된 천연 발생적 물질일 수 있다. 여과막을 만드는데 사용될 수 있는 적합한 물질은 유리 섬유, 폴리비닐 알콜-결합된 유리 섬유, 폴리에테르술폰, 폴리프로필렌, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리카보네이트, 셀룰로스 아세테이트, 니트로셀룰로스, 친수성 발포성 폴리(테트라플루오로에틸렌), 애노딕 알루미늄 옥시드, 트랙-에칭된 폴리카보네이트, 전기방사 나노섬유, 또는 폴리비닐피롤리돈을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다. 한 예에서, 여과막은 폴리비닐 알콜-결합된 유리 섬유 필터(MF1TM 멤브레인, 지이 헬스케어(GE Healthcare))로부터 형성된다. 또다른 예시에서, 여과막은 비대칭 폴리에테르술폰(비비드(Vivid)TM, 폴 코포레이션(Pall Corporation))으로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 여과막은 둘 이상의 상이한 중합체의 조합에 의해 형성될 수 있다. 예컨대, 여과막은 폴리에테르술폰 및 폴리비닐피롤리돈(프라임케어(Primecare)TM, iPOC)의 조합에 의해 형성될 수 있다.
그 다음, 여과 이후 건조 고체 매트릭스 상에 수집되는 비-세포 분획은 실질적으로 건조 상태로 건조되고 나중의 분석을 위해 저장된다. 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 건조 상태"는 건조된 샘플이 약 10%(wt/wt) 미만의 물 함량을 함유하는 조건을 의미한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 약 5% 미만의 물을 함유하도록 건조될 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 샘플은 약 2% 미만의 물을 함유하도록 건조될 수 있다. 이 방식으로, 생물학적 샘플의 비-세포 분획에 존재할 수 있는 CNA는 나중의 후속 분석에 적합한 건조된 형태로 저장될 수 있다. 건조된 비-세포 분획은 장기간 동안, 예컨대, 24 시간 이상, 7 일 이상, 30 일 이상, 90 일 이상, 180 일 이상, 1 년 이상, 또는 10 년 이상 저장될 수 있다. 한 실시양태에서, 비-세포 분획은 30 분 이상 건조 고체 매트릭스에 저장된다. 통상적으로, 샘플은 -80 ℃ 내지 40 ℃의 범위의 온도로 저장된다. 또한, 샘플은 임의적으로, 건조 또는 말린 조건 하에서, 또는 비활성 대기 하에서 저장될 수 있다. 건조는 대기 조건 하에서 공기-건조에 의해, 또는 진공을 이용한 증발에 의해 행해질 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-세포 분획은 정상 증발에 의해 대기 조건 하에서 건조되고 저습 환경에서 유지된다. 수집된 비-세포 분획으로부터 물의 제거는 비-세포 분획에 존재하는 순환 핵산을 안정화시키는 것을 도와준다.
이 목적에 적합한 건조 고체 매트릭스는 천연 물질, 합성 물질, 또는 합성 개질된 천연 발생적 물질을 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 건조 고체 매트릭스로 작용할 수 있는 적합한 물질은 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 니트로셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 쿼츠 섬유, 친수성 중합체, 폴리테트라플루오로에틸렌, 섬유 유리 및 다공성 세라믹을 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 친수성 중합체는 폴리에스테르, 폴리아미드, 또는 탄수화물 중합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 건조 고체 매트릭스는 셀룰로스로 구성된다. 셀룰로스-기반 건조 고체 매트릭스는 어떠한 세제도 없다. 일부 실시양태에서, 셀룰로스-기반 건조 고체 매트릭스는 어떠한 시약으로도 함침되지 않을 수 있다. 다른 실시양태에서, 셀룰로스-기반 건조 고체 매트릭스는 카오트로픽(chaotropic) 염으로 함침될 수 있다. 카오트로픽 염의 예시는 구아니딘 티오시아네이트, 구아니딘 클로라이드, 구아니딘 히드로클로라이드, 구아니딘 이소티오시아네이트, 소듐 티오시아네이트, 및 소듐 아이오다이드를 포함하지만, 그에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 셀룰로스-기반 건조 고체 매트릭스는 FTATM 엘루트(Elute)(지이 헬스케어)이다.
건조 고체 매트릭스의 비-세포 분획의 수집 이후, CNA는 이 수집된 비-세포 분획으로부터 추출된다. 추출은 임의의 종래 핵산 추출 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 추출 방법의 비-제한적 예시는 전기용출, 젤라틴 추출, 실리카 또는 유리 비드 추출, 구아니딘-티오시아네이트-페놀 용액 추출, 구아니디늄 티오시안산-기반 추출, 소듐 아이오다이드 또는 유사 구배를 통한 원심분리, 또는 페놀-클로로포름-기반 추출을 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 추출 단계는 단백질과 같은 불순물을 제거하는데 도움을 주고, 순환 핵산을 농축한다. 추출된 순환 핵산은 아가로스 겔 전기영동, 분광측광, 형광측정, 또는 액체 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하여 검사될 수 있다.
그 다음, 추출된 CNA는 추출 이후 분자내 라이게이션 반응을 통해 단일-가닥 핵산 환으로 전환된다. CNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥 형태일 수 있다. 또한, CNA는 흔히 매우 단편화될 수 있다. 이중-가닥 CNA는 분자내 라이게이션 반응 전에 단일-가닥 형태로 변성된다. 이중-가닥 핵산의 단일-가닥 형태로의 이 변성은 관련분야에 알려진 임의의 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다. 예컨대, 이중-가닥 핵산은 열적으로 변성되거나, 화학적으로 변성되거나, 또는 열적이면서 화학적으로 변성될 수 있다. 이중-가닥 핵산은 이중-가닥 핵산의 융점을 감소시키는 변성제(예컨대, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 포름아미드, 또는 그의 조합)을 사용하여 화학적으로 변성될 수 있다. 변성제는 반응 혼합물에 첨가되는 매 10%(부피/부피)의 변성제마다 5 ℃ 내지 6 ℃ 만큼 융점을 감소시킬 수 있다. 변성제 또는 변성제의 조합(예컨대, 10% 글리세롤 및 6-7% 에틸렌 글리콜)은 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%의 반응 혼합물(부피/부피)을 포함할 수 있다. 예컨대, 혼성화 강화성(stringency)을 감소시키는 염은 저온에서 이중-가닥 순환 DNA를 화학적으로 변성시키기 위해 저 농도로 반응 완충제에 포함될 수 있다. 이중-가닥 순환 DNA는 또한, 95 ℃에서 가열함으로써 열적으로 변성되어 단일-가닥 DNA(ssDNA)를 형성할 수 있다. 변성 단계 이후, 생성된 단일-가닥 핵산은 단일-가닥 핵산 기질의 분자내 라이게이션이 가능한 단일-가닥 특이적 리가제로 처리되어 단일-가닥 핵산 환을 형성할 수 있다.
단일-가닥 순환 핵산의 분자내 라이게이션은 단일-가닥 핵산의 분자내 라이게이션을 위해 사용되는 임의의 종래 방법을 이용함으로써 주형이 있거나 또는 없는 상태에서 수행될 수 있다. 예컨대, 선형, 단일-가닥 DNA 분자에서 단일-가닥 DNA 환으로의 전환은 T4 RNA 리가제와 같은 라이게이션 효소를 사용하여 주형-의존성 분자내 라이게이션 반응을 통해 통상적으로 수행된다. 그러나, 단일-가닥 DNA 또는 단일-가닥 RNA의 주형-의존성 분자내 라이게이션은 특히 단일-가닥 DNA 분자의 원형화가 미지의 서열 및/또는 크기의 단일-가닥 DNA 분자의 집단에서 수행될 경우 오직 제한된 성공률을 갖는다. 박테리오파지 T4RNA 리가제 I은 주형-비의존성 분자내 라이게이션 활성을 나타내지만, 이 활성은 선형, 단일-가닥 DNA 분자로부터 원형 단일-가닥 DNA 분자를 생성하기 위한 실용적 용도에 있어서 너무 낮아 비효율적이다. 일부 예시에서, 추출된 단일-가닥 순환 핵산의 분자내 라이게이션은 임의의 주형 없이 수행된다. 예컨대, 500 뉴클레오티드보다도 짧은 단일-가닥 DNA 서열은 주형-비의존성 분자내 라이게이션을 사용하여 원형화될 수 있다. 또한, 표적 서열에 대한 어떠한 선행 지식도 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 라이게이션이 주형-비의존성 방식으로 수행될 때 DNA 환을 생성하기 위해 필요하지 않다.
일부 실시양태에서, 선형 단일-가닥 순환 핵산에서 단일-가닥 핵산 환으로의 전환은 5' 포스포릴 및 3' 히드록실 기를 갖는 선형 단일-가닥 DNA 및/또는 단일-가닥 RNA 기질에 대한 양호한 주형-비의존성, 분자내 라이게이션 활성을 갖는 열안정성 RNA 리가제에 의해 수행된다. 추출된 단일-가닥 순환 핵산의 주형-비의존성 분자내 라이게이션을 위해 사용될 수 있는 적합한 리가제는 TS2126 RNA 리가제, T4 DNA 리가제, T3 DNA 리가제 또는 E. 콜라이 DNA 리가제를 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 예컨대, 호열성 박테리아인 써무스 스코토두크투스(Thermus scotoductus)를 감염시키는 써무스 박테리오파지 TS2126로부터 유래된 TS2126 RNA 리가제가 원형, 단일-가닥 DNA를 생성하기 위한 선형 순환 ssDNA의 주형-비의존성 원형화를 위해 이용될 수 있다. TS2126 RNA 리가제는 T4 RNA 리가제와 같은 많은 중온성 RNA 리가제보다 열안정적이다(약 75 ℃ 이하에서 안정적임). 그 결과, TS2126 RNA 리가제는 보다 높은 온도에서 사용될 수 있고, 이는 ssDNA의 바람직하지 않은 이차 구조를 추가로 줄여준다. 8.0의 pH를 갖는 HEPES 완충제가 TS2126 RNA 리가제-매개 분자내 라이게이션의 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 추출된 단일-가닥 순환 DNA의 원형화는 TS2126 RNA 리가제 외의 리가제를 사용하거나, 또는 토포이소머라제와 같은 DNA 접합 활성을 갖는 임의의 다른 효소를 이용해서도 또한 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, ssDNA 분자의 원형화는 선형, 단편화된 단일 가닥 DNA 분자를 원형화시키기 위한 높은 주형-비의존성 리가제 활성을 갖는 호열성 아케아박테리아인 메타노박테리움 써모아우토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth1)으로부터 유래된 RNA 리가제 1에 의해 달성될 수 있다.
그 다음, 단일-가닥 핵산 환은 롤링 서클 증폭(RCA) 방법을 이용함으로써 등온 조건 하에서 증폭될 수 있다. 단일-가닥 핵산 환의 증폭은 분자내 라이게이션이 수행되는 동일한 반응 용기 내에서 수행될 수 있다. 단일-가닥 핵산 환의 단리 또는 정제 및/또는 리가제의 제거는 증폭 반응 이전에 필요하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일-가닥 핵산 라이게이션 및 증폭의 전체 과정은 임의의 중간 정제 또는 단리 단계 없이 단일 튜브 내에서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 증폭된, 순환 핵산 생성물로부터 핵산을 검출하는 것을 추가로 포함한다. 증폭된, 순환 핵산 생성물에서의 핵산의 검출은 관련분야에 공지된 방법에 의해 행해진다. 증폭된 생성물의 다양한 검출 방법은 PCR, RT-PCR, qPCR, RT-qPCR, 제한 효소-기반 방법, 아가로스 겔 전기영동, ELISA 검출 방법, 전기화학적 발광, 고성능 액체 크로마토그래피, 써던 블롯 혼성화, 노던 블롯 혼성화, 또는 역 도트 블롯(reverse dot blot) 방법을 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 검출은 순환 핵산 증폭 생성물 내의 특정 표적을 증폭하는 특이적 프라이머를 사용한 정량 PCR에 의해 수행된다. 검출은 증폭된, 순환 핵산 생성물 내의 특이적 순환 핵산 서열의 존재, 부재, 및/또는 양을 확인하기 위해 수행될 수 있다.
본원에 개시된 전체 게놈 증폭 방법은 증폭 민감도를 개선하고, 서열 탈락을 줄여주며, 보다 균형잡힌 증폭을 가능하게 한다. 기재된 방법은 특히 제한된 양의 생물학적 샘플이 이용가능할 경우 유리하다. 일부 실시양태에서, 비-세포 분획은 약 10 μL 내지 약 500 μL 부피의 전체 생물학적 샘플로부터 단리된다. 또한, 원형화 및 증폭 반응 둘 모두는 임의의 중간 정제 또는 단리 단계 없이 단일 반응 용기에서 수행될 수 있고, 따라서 오염의 기회를 줄이고 증폭 워크플로우을 단순화시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 전유전체 증폭(MDA)을 통한 단편화된, 순환 DNA의 전체 게놈 증폭이 제공된다. 순환 DNA는 그의 본래 속성상, 흔히 매우 단편화된다. 또한, 생물학적 샘플의 비-세포 분획 내 순환 DNA의 양은 일반적으로 매우 낮다. 선형 단편화된 DNA에서 시도될 경우, MDA의 종래 방법은 감소된 증폭 속도, 상당한 서열 탈락을 일으키고, 매우 서열-편향된 증폭을 초래한다. 건조 고체 매트릭스로부터 순환 DNA의 추출 이후 이들 제한을 극복하기 위해, 단편화된 이중-가닥 순환 DNA는 먼저 그의 단일-가닥 형태로 전환된다. 그 다음, 단일-가닥 순환 DNA는 주형-비의존성 분자내 라이게이션 반응을 통해 단일-가닥, DNA 환으로 전환되고, 이로써 문제가 되는 DNA 말단을 제거한다. 단편화된 단일-가닥 순환 DNA의 원형화 이후, MDA는 원형화된 DNA 상에서 수행된다.
추출된 순환 DNA의 MDA 반응은 롤링 서클 증폭(RCA) 방법을 이용하여 등온 조건 하에서 수행될 수 있다. 단일-가닥 DNA 환의 증폭을 위해, DNA 폴리머라제, 프라이머, 및 dNTP를 포함한 증폭 시약이 라이게이션이 수행되는 동일한 반응 용기에 첨가되어 RCA 반응을 개시하기 위한 증폭 반응 혼합물을 생성할 수 있다. 증폭 반응 혼합물은 단일-가닥 DNA 결합 단백질 및/또는 적합한 증폭 반응 완충제와 같은 시약을 추가로 포함할 수 있다. RCA는 Phi29 DNA 폴리머라제와 같은 관련분야에 공지된 임의의 가닥 분리 DNA 폴리머라제를 사용하여 수행될 수 있다. RCA는 템플리파이(TempliPhi)TM RCA 키트(지이 헬스케어)와 같은 시판되는 RCA 증폭 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 템플리파이TM 롤링 서클 증폭은 보다 높은 민감도와 증폭 균형을 제공하는, 고정된 핵산을 함유하는 랜덤 프라이머를 이용한다. 일부 실시양태에서, 랜덤 프라이머가 RCA 반응을 위해 사용된다. 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체(예컨대, LNA 뉴클레오티드)를 포함하는 프라이머 서열이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-저항성 프라이머(예컨대, 적절한 위치의 포스포로티오에이트 기를 포함하는 프라이머 서열)이 증폭 반응을 위해 이용된다(예컨대, NNNN*N*N, 여기서 *N은 포스포로티오에이트 연결을 갖는 랜덤 뉴클레오티드를 표시함). 일부 실시양태에서, 롤링 서클 증폭은 단일-가닥 DNA 환을 랜덤 프라이머 혼합물을 포함하는 프라이머 용액에 접촉시켜 DNA 주형-프라이머 복합체를 형성하는 것; DNA 주형-프라이머 복합체를 DNA 폴리머라제 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트에 접촉시키는 것; 및 DNA 주형을 증폭하는 것에 의해 수행될 수 있다. 단일-가닥 DNA의 단일 주형-비의존성 원형화는 저농도에서조차 짧은 서열에서 달성될 수 있기 때문에, 리가제 이용 전체 게놈 증폭이 매우 단편화된 순환 DNA(예컨대, 전혈 내에 존재하는 순환 DNA)의 증폭을 위해 이용되는 경우, 보다 빠른 동역학 및 개선된 서열 커버리지를 갖는 보다 균형잡힌 DNA 증폭이 달성될 수 있다.
도 7은 단편화된 이중-가닥 순환 DNA의 리가제 이용 전체 게놈 증폭의 실시양태의 개략도를 도시한다. 이중-가닥 DNA의 지속 길이는 단일-가닥 DNA보다 훨씬 높고(~150 bp), 그의 본래 강도는 500 bp 미만의 단편의 원형화를 매우 비효율적으로 만든다. 또한, 약 250 bp 범위의 작은 이중-가닥 단편화된 DNA 분자에서, 원형화는 말단이 적절한 정렬(~10.5 bp/회전)을 갖추지 않는 한 비효율적이다. 반대로, 단일-가닥 단편화된 DNA의 원형화의 지속 길이는 대략 15 뉴클레오티드로, 이중-가닥 단편화된 DNA에 비해 매우 작다. 도 7에 도시된 것처럼, 리가제 이용 전체 게놈 증폭에서, 단편화된 이중-가닥 순환 DNA는 먼저 단일-가닥 DNA 환으로 전환된다. 이것은 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 변성시키기 위해 충분한 기간 동안 95 ℃에서 단편화된 이중-가닥 순환 DNA를 인큐베이션함으로써 달성될 수 있다. 그 다음, 단편화된 단일 가닥 순환 DNA는 단일-가닥 DNA 환을 생성하기 위한 단일-가닥 순환 DNA 기질의 주형-비의존성, 분자내 라이게이션이 가능한 DNA 또는 RNA 리가제로 처리된다. 그 다음, DNA 폴리머라제, 랜덤 프라이머, 및 dNTP를 포함하는 증폭 시약이 단일-가닥 DNA 환에서 RCA 반응을 개시하기 위해 첨가된다. 이 리가제 이용 전체 게놈 RCA 증폭은 종래의 전체 게놈 증폭 방법과 반대로 서열 탈락 및 증폭 편향성이 감소된 다량의 DNA를 생성한다. 따라서, 이것은 심지어 매우 단편화된 순환 DNA를 증폭시키고 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, RCA에 의한 단일-가닥 DNA 환의 생성 및 그의 후속 증폭의 전체 과정은 임의의 중간 정제 단계 없이 단일 튜브에서 행해진다.
단일-가닥 순환 DNA 단편에서 DNA 환으로의 사전 라이게이션 후 롤링 서클 증폭을 포함하는, 본원에 제공된 라이게이션 이용 전체 게놈 증폭 방법은 고분자량 게놈 DNA에 비해 단편화된 CNA의 우선적인 증폭을 제공한다. 예컨대, CNA를 포함하는 혈장 시료는 정제 과정 도중 혈액 세포로부터 방출된 게놈 DNA로 흔히 오염될 수 있다. MDA를 통한 전체 게놈 증폭의 종래 방법은 순환 DNA 및 게놈 DNA 둘 모두를 증폭한다. 반대로, 단편화된, CNA 분자가 먼저 TS2126 RNA 리가제를 사용하여 원형화된 후 Phi29 DNA 폴리머라제를 이용한 RCA를 통해 증폭되면, 순환 DNA는 고분자량 게놈 DNA보다 우선적으로 증폭되었다. 게놈 DNA에 비해 단편화된 순환 DNA의 이러한 우선적인 증폭은 진단학적으로 관련된 DNA가 다운스트림 분석을 위해 우선적으로 증폭될 수 있기 때문에 진단적 응용에 특히 적합하다(도 13). 또한, 리가제 이용 전체 게놈 증폭은 종래 MDA-기반 전체 게놈 증폭에 비해 단편화된 DNA가 보다 강한 증폭이 되게 한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 비-세포 분획에서 순환 DNA 증폭 및 검출의 민감도는 ssDNA 라이게이션 단계 및 RCA 이전에 폴리뉴클레오티드 키나제(PNK)에 의해 추출된 순환 DNA를 인산화시킴으로써 추가로 증가될 수 있다. DNA의 분자내 라이게이션은 ssDNA 주형이 5' 포스페이트 기 및 3' 히드록실 기를 갖지 않으면 실현될 수 없다. 다양한 조건(예컨대, 혈액 내 DNase II 효소 절단, 및 포스파타제 활성)은 5' 히드록실 기 또는 3' 포스페이트 기 또는 둘 모두를 갖는 라이게이션 가능하지 않은 DNA 서열을 갖는 순환 DNA의 생성을 초래할 수 있다. PNK 처리는 5' 말단을 인산화하거나 또는 3' 말단을 탈인산화함으로써 이들 라이게이션 가능하지 않은 DNA 서열을 라이게이션 가능한 DNA 서열로 전환한다. 이것은 롤링 서클 증폭된 CNA 라이브러리의 다양성을 개선한다. 워크플로우에 PNK 단계를 도입한 후, 본원에 표시된 리가제 이용 전체 게놈 증폭 방법은 1% 수준으로 첨가될 때 여성 전혈에서 남성 순환 DNA를 검출할 수 있었다(3회 반복, 도 14).
한 실시양태에서, 전혈에 존재하는 순환 핵산의 증폭 및 검출 방법이 제공된다. 전혈은 세포 분획(즉, 백혈구, 적혈구, 및 혈소판) 및 비-세포 분획(예컨대, 혈장 또는 혈청)을 포함한다. 순환 DNA는 전혈의 비-세포 분획(예컨대, 혈장 또는 혈청)으로부터 증폭된다. 바람직한 실시양태에서, 혈장 또는 혈청은 한 방울 부피의 혈액으로부터 분리된다. 방법은 전혈의 비-세포 분획을 수집하는 단계, 비-세포 분획으로부터 순환 DNA(대부분 그의 본래 이중-가닥 형태로 존재함)를 추출하는 단계, 이중-가닥 순환 DNA를 변성시켜 단일-가닥 DNA를 생성하는 단계, 순환 단일-가닥 DNA를 원형화시켜 단일-가닥 DNA 환을 생성하는 단계, 및 롤링 서클 증폭을 통해 단일-가닥 DNA 환을 증폭시켜 증폭된 순환 핵산 생성물을 형성하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 장치를 사용하여 전혈을 여과하는 동안, 혈장 또는 혈청은 여과막의 세공을 통과하고 건조 고체 매트릭스 상에 수집된다. 무손상 혈액 세포는 여과막에 보유된다. 혈장 또는 혈청은 항응고제의 부재 하에서 여과에 의해 전혈 샘플로부터 분리될 수 있다. 따라서, 여과 전에 전혈 샘플의 온전성을 유지하기 위해 어떠한 가외 단계도 필요하지 않다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 여과 전에 항응고제와 같은 시약으로 전처리될 수 있다. 무손상 혈액 세포에 의한 게놈 오염은 현장 진단에서 전혈을 여과함으로써 최소화될 수 있다. 한 실시양태에서, CNA를 함유하는 분리된 혈장 또는 혈청은 수동 위킹(wicking)에 의해 건조 고체 매트릭스로 흡착된다. 한 실시양태에서, 순환 DNA는 소듐 아이오다이드 및 알콜을 사용하여 고체 매트릭스에 미리 수집된 혈장 또는 혈청으로부터 추출된다(DNA 익스트렉터(Extractor) SPTM, 와코 케미칼(Wako Chemical)). 한 예에서, 혈장은 150 μL 미만의 전혈로부터 분리된다.
150 bp 미만의 서열 길이를 갖는 이중-가닥 DNA를 원형화하는 것은 흔히 불가능하고, DNA가 200 bp보다 길 때까지 이중 가닥 DNA를 원형화하는 것은 매우 어렵다. 반대로, 15개 이상의 뉴클레오티드의 서열 길이를 갖는 선형 단일 가닥 DNA 분자는 5' 말단이 인산화되고 3' 말단이 히드록실화되는 한 적합한 리가제에 의해 매우 효율적으로 원형화된다. 단일-가닥 DNA 환을 생성하기 위한 단일-가닥 DNA의 원형화는 단일-가닥 DNA의 주형-비의존성 분자내 라이게이션이 가능한 리가제를 이용함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일-가닥 DNA 분자의 원형화는 서크리가제 IITM와 같은 RNA 리가제로 단일-가닥 선형 DNA를 처리함으로써 수행된다.
본 발명의 또다른 측면은 혈장 또는 혈청을 수집하기 위해 현장 진단 내에서 전혈을 처리하는 방법에 관한 것이다. 방법은 샘플 수집시 전혈을 여과하여 혈장 또는 혈청을 분리하는 단계, 분리된 혈장 또는 혈청을 건조 고체 매트릭스 상에 수집하는 단계(여기서 고체 매트릭스는 어떠한 세제도 없음), 및 고체 매트릭스 상에 수집된 혈장 또는 혈청을 건조하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 여과는 MF1TM 멤브레인을 사용하여 행해지고, 수집은 MF1TM 멤브레인의 측방으로 배열된 셀룰로스-기반 고체 매트릭스를 사용하여 행해진다. 다른 실시양태에서, 비비드TM 또는 프라임케어TM 멤브레인 및 셀룰로스-기반 고체 매트릭스가 수직으로 배열된다. 한 예에서, 전혈 또는 여과막은 어떠한 항응고제로도 전처리되지 않는다. 또다른 예시에서, 혈액 및/또는 여과막은 항응고제로 전처리된다. 일부 실시양태에서, 카오트로픽 염으로 함침된 셀룰로스 매트릭스가 현장 진단에서 혈장 또는 혈청을 수집하기 위해 사용될 수 있다. 이용될 수 있는 적합한 카오트로픽 염은 구아니딘 티오시아네이트, 소듐 티오시아네이트, 포타슘 티오시아네이트, 또는 구아니딘 히드로클로라이드를 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 건조된 혈장 또는 혈청을 함유하는 고체 매트릭스는 보다 장기간 저장될 수 있고, 순환 핵산이 적기의 나중 시점에서 이 건조된 혈장 또는 혈청으로부터 추출되고, 증폭되고, 검출될 수 있다.
일부 측면에서, 혈장 또는 혈청의 건조된 샘플로부터 순환 핵산을 검출하는 방법이 제공된다. 방법은 건조된 혈장 또는 혈청 샘플로부터 순환 핵산을 추출하는 단계, 추출된 순환 핵산의 전체 게놈 증폭을 수행하여 증폭된 순환 핵산 생성물을 생성하는 단계, 및 그 다음 증폭된 순환 핵산 생성물 내의 특이적인 순환 핵산 서열의 존재, 부재, 또는 양을 검출하는 단계를 포함한다. 추출된 순환 핵산의 전체 게놈 증폭은 먼저 단일-가닥 특이적 리가제에 의해 추출된 순환 핵산을 원형화시켜 단일-가닥 핵산 환을 형성하고, 랜덤 프라이머에 의한 롤링 서클 증폭에 의해 단일 가닥 핵산 환을 증폭시켜 증폭된 순환 핵산 생성물을 형성함으로써 달성될 수 있다. 증폭된 라이브러리 내의 특정 순환 핵산 서열의 검출은 임의의 종래의 핵산 검출 기술에 의해 달성될 수 있다. 방법은 단일-가닥 특이적 리가제에 의해 분자내 라이게이션 반응 이전에 이중-가닥 CNA를 그의 단일-가닥 형태로 변성시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 순환 핵산을 함유하는 생물학적 샘플의 비-세포 분획을 수집하는 장치에 관한 것이다. 장치는 무손상 세포로부터 생물학적 샘플의 비-세포 분획을 분리하도록 구성된 여과막, 및 분리된 비-세포 분획을 수집하도록 구성된 건조 고체 매트릭스를 포함한다. 고체 매트릭스는 어떠한 세제도 없고 여과막과 직접 접촉한다. 장치는 측방 유동 장치 또는 수직 유동 장치일 수 있다.
도 2는 본 발명의 한 실시양태에 기재된 것과 같은 측방 유동 장치(200)의 개략도를 도시한다. 측방 유동 장치는 여과막(202) 및 건조 고체 매트릭스(204)를 포함한다. 여과막 및 건조 고체 매트릭스는 생물학적 샘플의 비-세포 분획이 측면 방향으로 여과막을 거쳐 고체 매트릭스로 통과하도록 측방으로 배열된다. 여과막은 샘플 적용 구역(210) 및 전달 구역(212)을 갖는다. 여과막은 전달 구역을 통해 고체 매트릭스와 직접 접촉한다. 본질적으로, 여과막의 전달 구역은 여과막이 고체 매트릭스와 직접 접촉할 때 건조 고체 매트릭스와 접촉하는 여과막의 일부분이다. 샘플 적용 구역은 생물학적 샘플을 받기 위해 사용되고, 전달 구역은 생물학적 샘플의 비-세포 분획을 건조 고체 매트릭스로 전달하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 여과막 및 건조 고체 매트릭스는 이들이 서로 부분적으로 겹칠 수 있도록 배열된다. 다른 실시양태에서, 여과막 및 건조 고체 매트릭스는 이들이 서로 겹치지 않지만 여전히 생물학적 샘플이 측면 방향으로 고체 매트릭스로 여과막을 거쳐 통과하도록 배열된다. 이러한 경우, 건조 고체 매트릭스는 여과막에 접촉하지만 겹치지는 않게 여과막의 하부에 위치된다. 일부 실시양태에서, 여과막은 제1 고체 지지체(206)에 배치되고, 건조 고체 매트릭스는 제2 고체 지지체(208)에 배치된다. 일부 실시양태에서, 제1 고체 지지체 및 제2 고체 지지체는 서로 반대편을 향하도록 배열된다. 다른 실시양태에서, 제1 고체 지지체 및 제2 고체 지지체는 나란히 배열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 여과막 및 건조 고체 매트릭스는 고체 지지체(206)에 측방으로 배치된다. 일부 실시양태에서, 제2 고체 지지체(208)는 예컨대, 도 2에서와 같이, 건조 고체 매트릭스 위에 포함되어, 여과막과 함께 건조 고체 매트릭스를 포개고 효과적인 전달 구역을 확립한다.
제1 고체 지지체는 여과막과 건조 고체 매트릭스의 직접 접촉을 확립하기 위한 수단을 통해 제2 고체 지지체와 연결될 수 있다. 직접 접촉을 확립하기 위한 수단은 힌지, 접이식 인덴테이션, 또는 달리 유연한 연결부일 수 있다. 일부 실시양태에서, 측방 유동 장치는 도 3에 보이는 것과 같은 과정(300)에 의해 구성될 수 있다. 제1 고체 지지체(306) 및 제2 고체 지지체(308)는 접이식 힌지(310)를 통해 서로 연결된다. 제1 고체 지지체는 위에는 여과막(302)이 배치되고, 제2 고체 지지체 위에는 건조 고체 매트릭스(304)가 배치된다. 여과막은 여과막과 건조 고체 매트릭스가 서로 부분적으로 겹치도록 힌지를 접음으로써 건조 고체 매트릭스와 직접 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 측방 유동 장치는 MF1TM 여과막 및 셀룰로스-기반 건조 고체 매트릭스를 포함한다. 혈장/혈청이 전혈로부터 수집되는 실시양태에서, 전혈이 적용되어 여과막을 통과하고, 비-세포 혈장 또는 혈청이 건조 고체 매트릭스 상에 수집되거나 또는 위킹된다.
일부 실시양태에서, 장치는 수직 유동 장치일 수 있다. 수직 유동 장치(400)의 개략도가 도 4에 보여진다. 장치(400)는 여과막(402) 및 건조 고체 매트릭스(404)를 포함하고, 여기서 여과막은 건조 고체 매트릭스 위에 배치된다. 여과막은 고체 매트릭스에 직접 접촉한다. 여과막은 샘플 적용 구역(406) 및 전달 구역(408)을 갖는다. 샘플 적용 구역은 생물학적 샘플을 받기 위해 사용되고, 전달 구역은 건조 고체 매트릭스로 여과된 생물학적 샘플의 비-세포 분획을 전달하기 위해 사용된다. 여과막의 전달 구역은 건조 고체 매트릭스와 접촉하는 구역으로 정의된다. 보다시피, 여과막 및 건조 고체 매트릭스는 생물학적 샘플의 비-세포 분획이 수직 방향으로 여과막을 거쳐 고체 매트릭스로 통과할 수 있도록 배열된다. 일부 실시양태에서, 건조 고체 매트릭스는 제3 고체 지지체(410) 위에 배치된다. 일부 실시양태에서, 수직 유동 장치는 비비드TM 또는 프라임케어TM 여과막 및 셀룰로스-기반 건조 고체 매트릭스를 포함한다. 혈장/혈청이 전혈로부터 수집되는 실시양태에서, 전혈이 적용되어 여과막을 통과하고, 비-세포 혈장 또는 혈청이 건조 고체 매트릭스 상에 수집되거나 또는 위킹된다.
상술된 것처럼, 제1 고체 지지체는 여과막을 지지할 수 있고, 제2 및 제3 고체 지지체는 건조 고체 매트릭스를 지지할 수 있다. 고체 지지체는 도 2, 도3, 또는 도 4에서 보이는 것처럼 여과막 또는 건조 고체 매트릭스 막에 직접 인접하여 위치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 중간 층이 고체 지지체 및 여과막 및/또는 건조 고체 매트릭스 사이에 위치될 수 있다. 고체 지지체는 여과막 및/또는 건조 고체 매트릭스를 지지할 수 있는 임의의 물질로부터 형성될 수 있다. 지지체는 투명성 또는 광학 확산(예컨대, 반투명) 물질과 같이 빛에 투과성인 물질로부터 형성될 수 있다. 고체 지지체는 막이나 고체 매트릭스를 통해 흐르는 유체가 고체 지지체에서 새지 않도록 액체 불투수성 것이 바람직할 수 있다. 고체 지지체에 적합한 물질의 예시는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카보네이트, 에폭시드, 메타크릴레이트, 또는 폴리멜라민과 같은 중합체 물질을 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 막 또는 고체 매트릭스에 충분한 구조적 골격을 제공하기 위해, 고체 지지체는 일반적으로 특정 최소 두께를 갖도록 선택된다. 예컨대, 고체 지지체는 약 1/16 인치 내지 약 1/4 인치의 범위의 두께를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 고체 지지체는 약 0.10 인치의 두께를 갖는 폴리카보네이트-기반(클리어 렉산(Clear Lexan)TM)이다.
세제는 상술된 핵산 침전 방법을 이용하는 동안 용액으로부터 침전될 수 있고, 따라서 핵산 침전 및 분석의 방법을 방해할 것이다. 따라서, 본원에 기재된 장치의 건조 고체 매트릭스는 소듐 도데실 술페이트(SDS), SLS(라우릴), 알킬 아릴 술포네이트, 장쇄 알콜 술페이트, 올레핀 술페이트, 술포숙시네이트, 포스페이트 에스테르, 소듐 2-에틸헥실술페이트, 폴리비닐 술페이트, 폴리아크릴레이트, 폴리포스페이트, 소듐 폴리아크릴레이트, 또는 소듐 폴리비닐 술페이트와 같은 어떠한 세제도 없다. 일부 실시양태에서, 건조 고체 매트릭스는 카오트로픽 염으로 함침될 수 있다.
일부 실시양태에서, 장치는 코어링 또는 펀칭과 같은 어떠한 추가적 처리 없이도 건조 고체 매트릭스가 직접 다운스트림 분석(예컨대, 핵산 추출법)에 잘 맞도록 설계된다. 특히, 장치의 건조 고체 매트릭스는 표준 연구실 추출 용기(예컨대, 미세원심분리 튜브, 원심분리 튜브)에 완전히 피팅하기에 적합하게 만드는 치수를 갖는다. 한 실시양태에서, 건조 고체 매트릭스의 폭 치수는 추출 용기 내부에 완전히 피팅되도록 약 8 밀리미터 이하이다. 이러한 장치 설계는 샘플 추출 전에 물질의 코어링 또는 펀칭에 필요한 사항을 제거하는 것을 돕고, 따라서 전체 게놈 증폭에 반영될 수 있는 주위 샘플 환경으로부터의 DNA 오염을 최소화한다.
일부 실시양태에서, 여과막은 또한, 고체 매트릭스에서 위킹한 고른 샘플을 확립하기 위해 8 mm의 최대 폭 치수에 비례하여 크기조정될 수도 있다. 여과막 및 고체 매트릭스의 치수 길이는 생물학적 샘플의 원하는 투입량에 의해 좌우된다. 한 실시양태에서, 100 μL 전혈의 측방 유동 분리의 경우, MF1TM 여과막의 최적 최수는 8 mm 폭 x 20 mm 길이이다. 이 치수에서, 적혈구 프런트는 고체 매트릭스의 경계면 근처에서 붙잡히고, 따라서 여과막에 보유된 혈장의 부피를 최소화하고 건조 고체 매트릭스에의 혈장의 전달을 최대화한다. 100 μL 전혈의 수직 유동 분리의 경우, 비비드TM 또는 프라임케어TM 여과막의 최적 치수는 8 mm 폭 x 32 mm 길이이다.
일부 실시양태에서, 고체 매트릭스는 상부 여과막으로부터 탈커플링되어 샘플 여과 및 고체 매트릭스로의 비-세포 분획의 전달 이후 장기간 저장을 위해 주위 온도에서 저장될 수 있다. 또한, 건조 고체 매트릭스로 전달되는 비-세포 분획은 그 안에 존재하는 순환 핵산을 손상시키지 않고 보다 장기간 저장될 수 있도록 건조될 수 있다. 분석할 때에, 순환 핵산은 종래 추출 용기(예컨대, 미세원심분리 튜브)로 고체 매트릭스를 전달하고 적합한 추출용 완충제에서 매트릭스를 재수화시킴으로써 고체 매트릭스로부터 추출될 수 있다.
상술된 장치는 생물학적 샘플의 현장 진단에서 상기 생물학적 샘플의 비-세포 분획을 수집하기 위해 사용될 수 있다. 생물학적 샘플은 샘플 수집의 시점에서 어떠한 전처리 없이도 여과막에 직접 제공될 수 있다. 일단 여과 단계가 완결되면, 비-세포 분획은 건조 고체 매트릭스 상에 수집되고 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치를 사용하여 전혈로부터 혈장 또는 혈청을 수집하는 방법이 기재된다. 방법은 여과막의 샘플 적용 구역에 전혈을 제공하여 전혈이 여과막을 통과해 혈액 세포로부터 혈장 또는 혈청을 분리하는 단계, 및 건조 고체 매트릭스에 분리된 혈장 또는 혈청을 수집하는 단계를 포함한다. 일단 수집되면, 혈장 또는 혈청은 장기간 저장을 위해 고체 매트릭스에서 건조될 수 있다. 전체 과정은 전혈 샘플의 현장 진단에서 행해질 수 있다. 나중에, 순환 핵산을 갖는 건조된 혈장 또는 혈청 분획은 다운스트림 분석을 위해 본원에 기재된 방법에 의해 추가 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 100 μL 미만의 전혈 샘플이 혈장 또는 혈청을 수집하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 나타난 장치는 장치의 기본적인 기능, 즉, 생물학적 샘플로부터 순환 핵산을 갖는 비-세포 분획의 수집에 영향을 미치지 않는 부가적인 기능적 요소를 포함할 수 있다. 예컨대, 상이한 세공 크기를 갖는 부가적 여과막이 장치에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치는 무손상 세포로부터 비-세포 분획을 분리하도록 구성된 단일 여과막 및 분리된 비-세포 분획을 수집하도록 구성된 단일 건조 고체 매트릭스를 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 장치는 무손상 세포로부터 비-세포 분획을 분리하도록 구성된 여과막, 분리된 비-세포 분획을 수집하도록 구성된 건조 고체 매트릭스, 및 장치의 기본적 기능을 변경하지 않는 다른 기능적 요소를 포함할 수 있다. 이러한 다른 기능적 요소의 예시는 고체 지지체, 장치용 케이스, 고정용 고리, 및/또는 덮개막을 포함하지만 그에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시는 오직 보기의 용도로 본원에 나타나고, 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되지 않아야 할 하기 실시예로부터 보다 완전하게 이해될 것이다. 실시예 부문에서 사용되는 일부 약어는 다음과 같다: "mg": 밀리그램; "ng"; 나노그램; "pg": 피코그램; "fg": 펨토그램; "mL": 밀리리터; "mg/mL": 밀리리터 당 밀리그램; "mM": 밀리몰농도; "mmol": 밀리몰; "pM": 피코몰농도; "pmol": 피코몰; "μL": 마이크로리터; "min.": 분, 및 "h.": 시간.
<실시예>
실시예 1: 인간 전혈의 측방 또는 수직 분리 이후 혈장 수집 막에서 순환 DNA 수집:
측방 유동 장치의 경우, MF1TM 멤브레인을 여과막으로 사용했고, 903 셀룰로스 페이퍼를 건조 고체 매트릭스로 사용하였다. 수직 유동 장치의 경우, 프라임케어TM 및 비비드TM 멤브레인을 여과막으로 사용했고, 903 셀룰로스 페이퍼를 건조 고체 매트릭스로 사용하였다. 100 μL의 인간 전혈을 측방 또는 수직 유동 장치의 여과막에 적용했고, 혈장을 건조 고체 매트릭스 상에 수집하였다. 수집된 혈장을 데시케이터 캐비넷에 놓고, 상온에서 건조시켜 건조된 혈장 샘플을 형성시켰다. 24 시간의 저장 후, 혈장 DNA를 DNA 익스트렉터 SP(와코 케미칼)의 적용에 의해 각 고체 매트릭스로부터 추출했고, 침전된 혈장 DNA를 겔 전기영동을 사용하여 분석하였다. 비교 목적에서, 이와 병행하여, 전혈을 3 단계의 온화한 프로토콜(1600 x g, 10 분; 1600 x g, 10 분에서의 혈장 수집 및 재스핀; 세포-무함유 혈장에 대한 16,000 x g, 10 분에서의 수집 및 스핀)로 원심분리하고, 50 μL의 원심분리된 혈장을 동일한 903 셀룰로스 페이퍼에 스폿팅하고, 추출하고, 분석하였다. 도 5는 순환 혈장 DNA가 시판되는 여과막의 하부에 겹쳐져 있는 건조 고체 매트릭스로부터 효율적으로 수집되고 안정화됨을 입증한다. 혈장-순환 DNA의 수율을 피코그린(PicoGreen) 분석법으로 측정했고, 이는 MF1-여과된 전혈(175 pg/μL) 및 원심분리된 혈장(179 pg/μL) 간의 유사한 DNA 회수율을 입증하였다. 반대로, 소량의 게놈 오염(DNA > 10kB)이 프라임케어TM 및 비비드TM 멤브레인을 사용한 여과(수직 유동 여과) 이후 보였다. 그러나, MF1 측면-유동 여과 또는 온화한 원심분리 후에는 어떠한 게놈 오염도 보이지 않았다.
실시예 2: 측면 또는 수직 유동에 의해 전혈로부터 분리된 혈장 DNA로부터 4 개의 상이한 염색체 유전자좌의 검출을 위한 리가제 이용 전체 게놈 증폭:
실시예 1에서 건조 고체 매트릭스(903 셀룰로스 페이퍼)로부터 추출된 혈장 DNA를 시판용 단일 가닥-특이적 리가제(서크리가제, 에피센터(EpiCentre))가 있거나 또는 없는 상태에서 롤링 서클 증폭 기법을 사용하여 증폭시켰고, 4 개의 랜덤 STR 염색체 유전자좌(vWA, TPOX, D8S1129, 및 D13S317)를 조사하여 게놈 커버리지를 평가하였다. 도 6은 단일-가닥-특이적 리가제 활성을 갖춘 롤링 서클 증폭 기법이 피코그램 수준의 혈장-순환 DNA로부터 모두 4 개의 염색체 STR 유전자좌를 민감하게 검출할 수 있음을 입증한다. 전통적 STR 프라이머 쌍은 통상적으로 순환 DNA 자체보다는 더 큰 DNA의 영역을 증폭하기 때문에, 실험은 미니-STR 프라이머 세트를 사용하여 수행되었다. 롤링 서클 증폭 기법과 조합된 단일-가닥 특이적 리가제 활성은, 원심분리에 의해 단리되고 QIAamp DNA 혈액 미니 키트(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 추출된, 버피 코트 분획으로부터의 증폭되지 않은 게놈 DNA의 값에 근접한 qPCR CT 값을 갖는 혈장 STR 유전자좌의 검출을 가능하게 하였다(도 6). 단일-가닥-특이적 리가제 활성이 없으면, 4 개의 혈장 STR 표지 중 오직 두 개만 롤링 서클 증폭 기법만을 사용하여 검출할 수 있었다. 리가제 이용 전체 게놈 증폭을 사용하면, 혈장으로부터의 STR 검출 수준은 막-여과된 혈액 및 원심분리된 혈액 간에 유사하게 나타났다.
실시예 3: 혈액 혈장으로부터 순환 핵산의 전체 게놈 증폭:
순환 DNA를 와코 DNA 익스트렉터 SP 키트(와코 퓨어 케미칼 인더스트리스(Wako Pure Chemical Industries))를 사용하여 건강해 보이는 개인의 시트레이트-포스페이트-덱스트로스(CPD) 안정화된 혈액 혈장으로부터 단리하였다. 대략 1.3 ng을 TBE 완충제를 사용한 2% 아가로스 겔을 통한 전기영동법으로 분석하고, SYBR 골드(Gold)로 염색하고 타이푼(Typhoon) 이미저를 사용하여 시각화하였다. 도 8에 도시된 것처럼, 순환 DNA의 대부분은 대략 180 bp 길이였고, 부가적으로 대략 370 bp 길이의 소량의 서열 및 실질적으로 더 큰 분자량을 갖는 보다 소량의 서열이 포함되었다.
혈장으로부터 350 pg 순환 DNA를 95 ℃에서 가열하여 주형을 변성시켰다. 그 다음, 변성된, 단일-가닥 DNA 주형을 RNA 또는 DNA 리가제로 처리하여 단일-가닥 DNA 환을 생성하였다. ATP-의존성 T4 DNA 리가제, 세포-코딩된 NAD-의존성 E. 콜라이 DNA 리가제 또는 열안정성 RNA 리가제(서크리가제 II)를 이들 라이게이션 반응을 위해 사용하였다. 그 다음, 100 pg의 라이게이션된 단일-가닥 DNA 환을 Phi29 DNA 폴리머라제를 이용한 게놈이파이(GenomiPhi) 키트(지이 헬스케어)를 사용하여 전체 게놈 증폭이 되게 하였다. 증폭을 프라이머 혼합물 +N+N(at N)(at N)(at N)*N을 사용하여 수행하였다(여기서 +N은 LNA 뉴클레오티드를 표시하고, "at N"은 2-아미노 dA, 2-티오 dT, 통상의 G 및 통상의 C를 함유한 랜덤 혼합물을 표시함). 표적 핵산의 증폭 및 정량화가 동시에 수행되는 실시간 증폭을 증폭 혼합물에 소량의 SYBR 그린 I를 첨가하고 테칸(Tecan) 플레이트 리더(테칸 스니퍼(Tecan Sniper), 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmecia Biotech)에서 시간에 따른 형광 신호 증가량을 모니터링함으로써 수행하였다. 비교를 위해, 동농도의 비처리된 게놈 DNA, 비처리된 혈장 DNA, 및 DNA 주형이 없는 샘플(주형 증폭이 일어나지 않음)을 포함시켰다.
도 9에 도시된 것처럼, 비처리된, 단편화된 혈장 DNA의 증폭 동역학은 동량의 고분자량 게놈 DNA에 비해 훨씬 낮아서, 증폭의 결함을 시사하였다. 그러나, 단편화된 혈장 DNA를 서크리가제TM II를 사용하여 전처리하여 단일-가닥 DNA 환으로 전환시키면, 신속한 증폭 동역학이 달성되었다(도 9a). ATP-의존성 T4 DNA 리가제(도 9b) 및 세포-코딩된 NAD-의존성 E. 콜라이 DNA 리가제(도 9c)를 포함한 다른 리가제도 단편화된 혈장 DNA의 증폭 동역학을 회복시키는데에 또한 효과적이었다. 이들 실시예에서, 증폭 동역학의 상대적 증가는 단일-가닥 DNA 주형의 분자내 라이게이션을 촉진하는데에 있어서 각각의 리가제의 효율성을 시사한다.
실시예 4: 리가제 이용 전체 게놈 증폭에 의해 혈액 혈장으로부터 증폭된 순환 핵산의 분석.
민감하고 균형잡힌 DNA 증폭을 촉진하기 위한 리가제 이용 전체 게놈 증폭 방법의 효율성을 샘플링하기 위해, 실시예 3에서 생성된 증폭된 DNA를 4 개의 상이한 CODIS 유전자좌(vWA, TPOX, D8S1129, 및 D13S317)를 표적화하는 프라이머를 사용한 정량 PCR로 추가 분석하였다. DNA 농도를 비증폭된 DNA의 값과 비교하여 증폭 이후 상대적 대표 수준을 결정하였다. 도 10에 보이는 것과 같이, 양 예시 모두에서, 비처리된 혈장 DNA의 qPCR 분석은 테스트된 유전자좌에서 서열 탈락 또는 매우 미약하게 생성된 DNA을 나타냈다. 반대로, 방법에 서크리가제TM II 또는 T4 DNA 리가제의 포함하면, 4 개의 유전자좌의 서열 탈락이 없어지고, 증폭된 고분자량 게놈 DNA와 더 유사하게 나타나는 DNA를 생성하였다. 정량 PCR(qPCR)에 의해 테스트된 12 개의 상이한 CODIS 중에서, 단일-가닥 DNA 리가제로서 서크리가제TM II를 사용한 추가 예시에서, 리가제 이용 전체 게놈 증폭 이후 11 개가 검출된 반면, 비처리된 혈장 DNA에서는 오직 4 개만 나타났다(도 11). 도 11에서, 보고된 Ct 값은 두 복제물의 평균치이다. Ct 값이 결정되지 않은 PCR 반응은 "X"로 표시됐다.
실시예 5: 리가제 이용 전체 게놈 증폭을 위한 반응 조건의 최적화.
TS2126 RNA 리가제에 의한 단일-가닥 DNA 분자의 라이게이션 반응의 효율을 최적화함으로써 리가제 이용 DNA 증폭 반응을 추가로 최적화하였다. 표준 제조업체의 추천 완충제로부터 망간을 제거하면 증폭 속도를 배경 수준으로 줄일 수 있었기 때문에, 금속 이온의 존재는 라이게이션 반응을 위해 필수적이었다. 비처리된 게놈 DNA 및 비처리된 혈장 DNA를 수정된 완충제 조건을 사용하여 서크리가제 IITM 처리된 혈장 DNA 샘플과 비교하였다. 모든 완충제 조건은 33 mM KoAc, 0.5 mM DTT, 및 1M 베타인을 함유하였다. 표시된 곳에서, 완충제는 33 mM 트리스-아세테이트(pH 7.5) 또는 33 mM HEPES-KOH(pH 8.0)을 함유했고, 부가적으로 2.5 mM MgCl2 또는 2.5 mM MnCl2를 함유하였다. 소량의 SYBR 그린 I을 증폭 혼합물에 첨가하고 테칸 플레이트 리더에서 시간에 따른 형광 증가량을 모니터링함으로써 실시간 증폭을 수행하였다. 증폭 역치는 형광이 배경 수준(2000 RFU) 이상으로 상승할 때의 시간이다.
리가제 이용 전체 게놈 증폭 반응(순환 DNA의 100 pg 투입)의 증폭 동역학의 비교가 도 12에 도시된다. 마그네슘 및 망간 둘 모두는 표준 TRIS 완충제가 존재할 때 유사한 효과를 발생시켰다. 그러나, HEPES 완충제, pH 8.0의 존재시 망간 및 마그네슘의 조합은 보다 높은 증폭 속도를 촉진하였다. HEPES 완충제는 TRIS 완충제에 비해 망간 양이온의 산화 속도를 감소시킴으로써 이들 반응에서 혈장 DNA의 원형화 효율을 증가시켰다.
실시예 6: 리가제 이용 전체 게놈 증폭에서 고분자량 게놈 DNA의 증폭의 억제.
비처리된 게놈 DNA의 전체 게놈 증폭의 증폭 동역학을 서크리가제TM I 및 서크리가제TM II-처리된 게놈 DNA 샘플(100 pg DNA 투입)과 비교하였다. 결과는 도 13에 나타난다. 도 13에 도시된 것처럼, 단일-가닥 게놈 DNA의 서크리가제TM 처리는 (도 9a에 보여지는 것과 같은 혈장 DNA에서의 양(positive)의 효과와 달리) 고분자량 게놈 DNA의 증폭 속도의 억제 효과를 발생시켰다. 억제는 서크리가제TM I 및 서크리가제TM II 둘 모두에서 뚜렷하였다.
Phi29-기반 증폭이 리가제에 의해 억제되는지 조사하기 위해, 비처리된 이중-가닥 게놈 DNA를 활성 리가제의 존재 하에서 증폭시켰다. 소량의 SYBR 그린 I을 증폭 혼합물에 첨가하고 테칸 플레이트 리더에서 시간에 따른 형광 증가량을 모니터링함으로써 실시간 증폭을 수행하였다. 증폭 역치는 형광이 배경 수준(2000 RFU) 이상으로 상승할 때의 시간이다. 게놈 DNA 증폭 억제는 증폭 동안 존재하는 활성 리가제의 결과가 아님을 관찰하였다.
혈액 세포의 게놈 DNA가 흔히 순환 핵산의 시료를 오염시키고, 진단 값 미만이기 때문에, 고분자량 게놈 DNA에 비해 순환 DNA의 증폭이 우선하는 것은 특정 응용을 위해 장점일 수 있다.
실시예 7: 리가제 이용 전체 게놈 증폭을 이용한 단편화된 DNA의 단일-튜브 증폭 - 분자내 라이게이션 이전의 키나제에 의한 순환 DNA 단편의 인산화의 효과.
키나제에 의한 순환 DNA 단편의 인산화가 혈액 혈장에서 순환 DNA의 보다 민감한 검출을 유도하는 것으로 발견됐다. 남성-여성 혈장/혈액 혼합 실험은 키나제로 처리된 투입 CNA로부터 생성된 DNA 라이브러리가 보다 대표성을 가져서, DYS14 남성-특이적 표지의 보다 민감한 검출을 가능하게 함을 입증하였다(3/3 복제물, 반면 인산화가 되지 않는다면 오직 1/3이 검출되었음). 100 μL의 혈액/혈장 혼합물을 다음과 같이 제조하였다: 100A: 100% 남성 혈장; 5A-C: 5% v/v로 여성 전혈에 남성 혈장이 첨가됨; 1A-C: 1% v/v로 여성 전혈에 남성 혈장이 첨가됨; 및 0A: 100% 여성 혈액. MF1 멤브레인을 통한 측방 유동 후 903 셀룰로스 패드에서의 수집에 의해 혈장을 혈액 세포로부터 분리하고, 이것을 후속 건조하고 밤새 저장하였다. 그 다음, 순환 DNA를 표준 소듐 아이오다이드/세제 기반 방법인 수정된 와코 익스트렉터 SP 키트(와코 퓨어 케미칼 인더스트리스)에 의해 셀룰로스 패드로부터 추출하였다. 그 다음, 대략 1.8 ng의 DNA를 GTP, 망간, 및 베타인의 존재 하에서 T4 폴리뉴클레오티드 키나제가 있거나 또는 없는 상태에서 처리하고, 그 다음 서크리가제 IITM으로 처리하여 단일-가닥 DNA 단편을 원형화시켰다. 그 다음, DNA가 게놈이파이 전체 게놈 증폭(지이 헬스케어)을 받게 했고, 생성물을 정량 PCR로 분석하여 두 개의 표지: Y-염색체 상에 좌위된 멀티-카피 유전자이고 오직 남성 분획으로부터만 검출되는 Dys14, 및 염색체 16번 상에 좌위된 STR 유전자좌이고 남성 및 여성 분획 둘 모두에서 검출되는 D16S539의 검출량을 평가하였다. 워크플로우에서 임의의 중간 정제 또는 단리 단계 없이 단일 반응 용기에서 반응을 수행하였다. 이것은 상대적으로 저농도의 GTP로 인산화 반응을 수행함으로써 달성됐다.
도 14는 반응에서 키나제의 포함이 5' 포스페이트를 함유할 필요가 없는 CNA 단편의 원형화 및 증폭을 가능하게 하여, 보다 대표성을 갖는 라이브러리를 생성하는 것을 보여준다. 이것은 세포 사멸 도중 DNase II 소화작용에 의해 특이적으로 생성되는 5' 히드록실을 함유하는 DNA 단편을 포함할 것이다. 남성-여성 혈장/혈액 혼합 실험을 사용하면, 키나제로 처리된 투입 DNA로부터 생성된 라이브러리가 보다 대표성을 띄어서, DYS14 남성-특이적 표지의 보다 민감한 검출(3/3 복제물, 반면 인산화가 되지 않으면 오직 1/3이 검출됨)을 가능하게 한다는 점이 입증된다.
청구된 발명은 그의 정신 또는 본질적 특성에서 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 실시될 수 있다. 전술한 실시양태는 다양한 모든 가능한 실시양태 또는 예시로부터 선택된 실시양태 또는 예시이다. 따라서, 전술한 실시양태는 본원에 기재된 발명을 제한하기보다는 보여주는 것으로 모든 점에서 고려되어야 한다. 청구된 발명의 오직 특정한 특징이 본원에서 보여지고 기재되었지만, 관련 분야의 숙련자는 본 개시를 통해, 이들 및 다른 유형의 응용을 위해 적합한, 본 발명의 원리에 따른 방법을 사용하기 위한 적합한 조건/파라미터를 식별하거나, 선택하거나, 최적화하거나, 또는 수정할 수 있을 것이다. 정확한 용도, 시약의 선택, 농도, 부피, 인큐베이션 시간, 인큐베이션 온도 등과 같은 변수의 선택은 의도된 구체적인 응용에 대부분 의존할 수 있다. 따라서, 첨부된 청구항은 본 발명의 진정한 정신의 범위 내에서 모든 수정 및 변화를 커버하는 것으로 의도된다. 또한, 본 청구항과 동등한 의미 및 범위에 속하는 모든 변화가 본원에 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (32)

  1. 생물학적 샘플을 여과하여 무손상 세포로부터 비-세포 분획을 분리하는 단계;
    분리된, 비-세포 분획을 어떠한 세제도 없는 건조 고체 매트릭스 상에 수집하는 단계;
    수집된, 비-세포 분획으로부터 순환 핵산을 추출하는 단계;
    추출된, 순환 핵산을 원형화하여 단일-가닥 핵산 환(circle)을 형성하는 단계; 및
    단일-가닥 핵산 환을 랜덤 프라이머에 의한 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification)을 통해 증폭하여 증폭된, 순환 핵산 생성물을 형성하는 단계를 포함하고,
    상기 여과, 수집, 추출, 원형화 및 증폭 단계가 임의의 중간 단리 또는 정제 단계 없이 단일 반응 용기 내에서 수행되는,
    생물학적 샘플의 비-세포 분획에 존재하는 순환 핵산의 증폭 방법.
  2. 제1항에 있어서, 추출 이전에 수집된, 비-세포 분획을 건조시킴으로써 건조된 샘플이 10%(wt/wt) 미만의 물 함량을 함유하도록 하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 원형화 이전에 추출된, 순환 핵산을 변성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 원형화가 TS2126 RNA 리가제를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 증폭된, 순환 핵산 생성물에서 특이적 순환 핵산 서열의 존재, 부재, 또는 양을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 전혈이고, 비-세포 분획이 혈장 또는 혈청인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 혈장 또는 혈청이 150 μL 미만의 전혈로부터 수집되는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 혈장 또는 혈청이 항응고제의 부재 하에서 전혈로부터 분리되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 순환 핵산이 순환 DNA 또는 순환 RNA인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 순환 DNA가 종양-유래 DNA, 태아-유래 DNA, 기증받은 기관-유래 DNA, 이식된 세포-유래 DNA, 이식된 조직-유래 DNA, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 순환 DNA가 종양-유래 DNA를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플의 여과가 0.01 마이크로미터 내지 5 마이크로미터의 세공 크기를 갖는 막을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 생물학적 샘플의 여과가 1 마이크로미터 내지 2 마이크로미터의 세공 크기를 갖는 막을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 건조 고체 매트릭스가 어떠한 세제도 없는 셀룰로스 매트릭스인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 건조 고체 매트릭스가 카오트로픽(chaotropic) 염으로 함침되는 것인 방법.
  16. 제4항에 있어서, 생물학적 샘플이 전혈이고, 순환 핵산이 전혈에 존재하는 순환 DNA이고, 건조 고체 매트릭스가 어떠한 세제도 없는 셀룰로스 매트릭스이고, 여기서 전혈의 비-세포 분획이 1 마이크로미터 내지 2 마이크로미터의 세공 크기를 갖는 여과막을 통한 여과에 의해 분리되는 것인 방법.
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  22. 혈장 또는 혈청을 어떠한 세제도 없는 건조 매트릭스 상에 수집함으로써 순환 핵산을 함유하는 혈장 또는 혈청의 건조된 샘플을 제공하는 단계;
    혈장 또는 혈청의 건조된 샘플로부터 순환 핵산을 추출하는 단계;
    추출된 순환 핵산의 전체 게놈 증폭을 수행하여 증폭된, 순환 핵산 생성물을 생성하는 단계; 및
    증폭된, 순환 핵산 생성물에서 특이적 순환 핵산 서열의 존재, 부재, 또는 양을 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 수집, 추출 및 증폭 단계가 임의의 중간 단리 또는 정제 단계 없이 단일 반응 용기 내에서 수행되고,
    상기 추출된 순환 핵산의 전체 게놈 증폭 단계가, 단일 가닥 특이적 리가제를 사용하여 추출된 순환 핵산을 원형화하여 단일 가닥 핵산 환을 형성하는 단계; 및 단일-가닥 핵산 환을 랜덤 프라이머에 의한 롤링 서클 증폭을 통해 증폭하는 단계를 포함하는 것인,
    혈장 또는 혈청의 건조된 샘플로부터 순환 핵산을 검출하는 방법.
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