CN104031985B

CN104031985B - 检测体细胞核移植胚胎发育能力的引物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN104031985B
Application number: CN201410150697.0A
Authority: CN
Inventors: 何洪彬; 郇延军
Original assignee: Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science
Current assignee: Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science
Priority date: 2014-04-15
Filing date: 2014-04-15
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2034-04-15
Also published as: CN104031985A

Abstract

本发明公开了检测体细胞核移植胚胎发育能力（检测Thy1基因甲基化程度）的引物对，如SEQ ID NO.6～SEQIDNO.9所示，该引物对扩增的核苷酸序列为Thy1基因的一段，如SEQ ID NO.16所示。本发明还公开了一种用于检测体细胞核移植胚胎发育能力的试剂盒，包括SEQ ID NO.6～SEQIDNO.9所示的引物，以及PCR扩增反应所需要的常规试剂。本发明还公开了检测体细胞核移植胚胎发育能力的方法。本发明明确了Thy1基因的甲基化区域，并证明了根据Thy1基因甲基化程度可用来确定任一时期核移植胚胎所处的发育阶段和发育能力。

Description

检测体细胞核移植胚胎发育能力的引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及检测体细胞核移植胚胎发育能力（Thy1基因的甲基化程度）的引物、试剂盒及方法，属于早期胚胎发育领域。

背景技术

近些年来，体细胞核移植技术得到迅猛发展和广泛应用，使良种动物的生产从基础研究迈进产业化，而产业化成功的关键就在于体细胞核移植胚胎的发育。目前，体细胞核移植胚胎发育水平比较低，制约着体细胞核移植胚胎的产业化发展，研究表明，这主要与体细胞核移植胚胎的重编程程度相关，其中组织特异性基因的持续表达是核移植胚胎发育失败的重要原因，而目前对核移植胚胎中组织特异性基因的甲基化没有相关报道，因此，明确组织特异性基因在体细胞核移植胚胎中甲基化模式，进而指导克隆胚胎的产业化是十分重要的。

现已证明，体细胞核移植胚胎重编程不完全导致组织特异性基因持续表达，其中Thy1基因是成纤维细胞的标记基因，在核移植胚胎中的沉默程度决定了胚胎的发育能力，因此检测Thy1基因在核移植胚胎中的甲基化程度可预测克隆胚胎的发育潜能。目前，对于基因甲基化区域的测定通常是采用预测法，直接将预测的区域作为该基因甲基化区域。然而研究表明，采用预测法获得的甲基化区域并不一定能代表该基因的甲基化水平，而且对于一些基因，并不能预测到甲基化区域，这就需要对Thy1基因的整个甲基化区域进行测序，并进一步明确Thy1基因甲基化区域，Thy1基因甲基化区域的明确将在体细胞核移植胚胎的生产和科学研究领域中具有实际应用价值。

发明内容

针对上述现有技术，本发明所要解决的技术问题是明确组织特异性基因Thy1甲基化区域，检测该区域在核移植胚胎中的甲基化程度，用以确定核移植胚胎的发育阶段及发育能力。本发明还根据该甲基化区域，提供了用于检测的引物、试剂盒及方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

检测体细胞核移植胚胎发育能力（检测Thy1基因甲基化程度）的引物对，如SEQIDNO.6～SEQIDNO.9所示；该引物对可以扩增Thy1基因的一段甲基化区域，该段的序列如SEQIDNO.16所示。

上述引物对，可以用于制备检测体细胞核移植胚胎发育能力（检测Thy1基因甲基化程度）的试剂盒。

一种用于检测体细胞核移植胚胎发育能力的试剂盒（扩增并检测SEQIDNO.16所示序列的试剂盒），包括SEQIDNO.6～SEQIDNO.9所示的引物，以及PCR扩增反应所需要的常规试剂。比如：20μL扩增体系：10×PCRBuffer（Mg²⁺Plus）2μL，dNTPMixture（各2.5mM）1.6μL，上游和下游引物（SEQIDNO.6～SEQIDNO.9所示）各0.4μL（10μmol/L），模板5μL,TaqHS（5U/μL）0.1μL，ddH₂O12.5μL。

上述试剂盒可以用于检测体细胞核移植胚胎发育能力（检测Thy1基因的甲基化程度），具体应用时，步骤如下：

1）ProteinaseK消化待测样品；

2）待测样品的亚硫酸氢盐处理；

3）以步骤2）处理后的基因组DNA为模板，利用前述扩增引物对（SEQIDNO.6～SEQIDNO.9所示），进行热启动PCR扩增，得到PCR扩增产物；

4）对步骤3）获得的PCR产物进行测序，检测CpG位点的甲基化程度；根据CpG位点的甲基化程度评价体细胞核移植胚胎发育能力：甲基化程度为32%以下（不包括32%）时，体细胞核移植胚胎发育到囊胚的能力为32%以下；甲基化程度为32%～55%时，体细胞核移植胚胎发育到囊胚的能力为32%～55%；甲基化程度为55%以上（不包括55%）时，体细胞核移植胚胎发育到囊胚的能力为55%以上。

进一步地，检测某一阶段胚胎时，若甲基化程度为24.03～30.03%，则该胚胎发育到囊胚的概率为19.91%（接近实际比率21.37%）。更近一步地，检测核移植后36小时胚胎的甲基化程度，若为24.03～30.03%，则该胚胎发育到囊胚的概率为19.91%。

本发明的检测体细胞核移植胚胎发育能力的方法，可根据核移植胚胎各个发育阶段的检测结果，评价任一时期克隆胚胎发育阶段和发育能力。

本发明还提供了前述明确的Thy1基因甲基化区域在体细胞核移植胚胎发育过程中的应用，根据核移植后36小时胚胎的甲基化检测结果（27.33%），预测胚胎发育阶段主要是2-4细胞（2细胞、4细胞和8细胞所占比例分别为44.34%、25.74%和4.26%），胚胎发育到囊胚的概率为19.91%（接近实际比率21.37%）。

本发明的研发思路为：首先，选取了Thy1基因中的一段核苷酸序列作为甲基化区域（整个启动子区域），该甲基化区域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。具体而言，选取的是猪Thy1基因转录起始点上游1500bp下游300bp内富含CpG二核苷酸的序列，将其CG替换为YG，再将其余C碱基全部替换为T碱基。然后，将该区域分为了三段（以期寻找具有代表THY1基因甲基化的区段），并针对每一段设计了特异性扩增引物对，引物对如SEQIDNO.2～SEQIDNO.13所示。具体而言，如下：

扩增远端的扩增引物对的上游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.2和NO.3所示，下游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.4和NO.5所示；

扩增中端的扩增引物对的上游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.6和NO.7所示，下游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.8和NO.9所示；

扩增近端的扩增引物对的上游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.10和NO.11所示，下游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.12和NO.13所示。

上述各引物在SEQIDNO.1所示序列中所对应的位置如下：

SEQIDNO.2：位于SEQIDNO.1所示的序列中的204位至222位；

SEQIDNO.3：位于SEQIDNO.1所示的序列中的137位至161位；

SEQIDNO.4：位于SEQIDNO.1所示的序列中的383位至405位；

SEQIDNO.5：位于SEQIDNO.1所示的序列中的434位至457位；

SEQIDNO.6：位于SEQIDNO.1所示的序列中的536位至556位；

SEQIDNO.7：位于SEQIDNO.1所示的序列中的465位至486位；

SEQIDNO.8：位于SEQIDNO.1所示的序列中的908位至930位；

SEQIDNO.9：位于SEQIDNO.1所示的序列中的935位至961位；

SEQIDNO.10：位于SEQIDNO.1所示的序列中的1409位至1429位；

SEQIDNO.11：位于SEQIDNO.1所示的序列中的1322位至1341位；

SEQIDNO.12：位于SEQIDNO.1所示的序列中的1620位至1640位；

SEQIDNO.13：位于SEQIDNO.1所示的序列中的1631位至1651位。

然后利用上述扩增引物对检测克隆胚胎1、2、4、8细胞及囊胚中的甲基化情况，步骤如下：

1）ProteinaseK消化待测样品；

2）待测样品的亚硫酸氢盐处理；

3）以步骤2）处理后的基因组DNA为模板，利用前述扩增引物对（SEQIDNO.2～SEQIDNO.13所示），进行热启动PCR扩增，得到PCR扩增产物；

4）对步骤3）获得的PCR产物进行测序，检测CpG位点的甲基化程度，结果为：甲基化主要集中在SEQIDNO.1所示序列的中端，该段序列如SEQIDNO.16所示，即：该段最能代表THY1基因的甲基化情况。具体结果如下：

克隆胚胎1、2、4、8细胞及囊胚中的甲基化情况为18.33%、23.33%、36.67%、60.83%和65.00%，可见，甲基化程度逐步提高；而克隆胚胎（1、2、4、8细胞及囊胚）发育到囊胚的能力也是逐步提高的（21.37%、31.38%、39.47%、65.54%和100%），因此，可以明确，本发明选定的Thy1基因甲基化区域随着克隆胚胎发育能力的增强，甲基化程度逐步升高。

另外，本发明还检测了36小时克隆胚胎的甲基化情况（27.33%），根据上述结果，本发明预测胚胎发育阶段主要是2-4细胞（根据图8胚胎发育曲线，预测2细胞、4细胞和8细胞所占比例分别为44.34%、25.74%和4.26%），胚胎发育到囊胚的概率为19.91%（接近实际比率21.37%），因此，Thy1基因的甲基化程度，可以用来确定克隆胚胎所处的发育阶段和发育能力。

5）根据基因在成纤维细胞和体外受精囊胚中的表达情况确定不同胚胎时期的甲基化区域，结果：在胎儿成纤维细胞中表达确定的甲基化区域的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；在体外受精囊胚中表达确定的甲基化区域的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。

本发明通过根据Thy1基因在成纤维细胞中表达和体外受精囊胚中不表达的情况明确甲基化区域，可代表Thy1基因的甲基化状态，所设计的Thy1基因甲基化引物序列具有较强的特异性，可用于有效、准确检测Thy1基因在样品中的甲基化程度，Thy1基因在核移植胚胎中的甲基化程度可用来确定胚胎发育阶段和发育能力，该特异性引物所检测出的Thy1基因甲基化可作为新型的表观遗传分子标记，为今后体细胞核移植胚胎的生产和相关研究奠定基础。

本发明明确基因甲基化区域的方法是在Thy1基因转录起始位点上游1500bp及下游300bp内进行甲基化测序，并结合该基因在成纤维细胞和体外受精囊胚中的表达情况进行确定，明确的Thy1基因甲基化区域在基因表达的胎儿成纤维细胞中呈现低甲基化，在基因不表达的体外受精囊胚中呈现高甲基化。该明确的Thy1基因甲基化区域随着核移植胚胎发育能力的增强甲基化程度逐步升高（根据核移植胚胎发育进程图获得核移植胚胎1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞和囊胚发育到囊胚的能力分别为21.37%、31.38%、39.47%、65.54%和100%，Thy1基因甲基化分别为18.33%、23.33%、36.67%、60.83%和65.00%），可见，根据Thy1基因甲基化程度可用来确定任一时期核移植胚胎所处的发育阶段和发育能力。因此本发明明确了一个能评价核移植胚胎发育能力的方法。

附图说明

图1为猪Thy1基因甲基化预测结果，其中，A为甲基化区域远端；B为甲基化区域中端；1C为甲基化区域近端。

图2为Thy1基因的PCR扩增效果，其中，A为用于亚硫酸氢盐测序的202bpPCR片段（甲基化区域远端）；B为用于亚硫酸氢盐测序的395bpPCR片段（甲基化区域中端）；C为用于亚硫酸氢盐测序的232bpPCR片段（甲基化区域近端）；M:DL500分子量标记；1：成纤维细胞样品，2：体外受精囊胚样品。

图3为Thy1基因在成纤维细胞中甲基化情况，其中，A为甲基化区域远端甲基化情况；B为甲基化区域中端甲基化情况；C为甲基化区域近端甲基化情况；白圆圈代表CpG未甲基化；黑圆圈代表CpG甲基化。

图4为Thy1基因在体外受精囊胚中甲基化情况，其中，A为甲基化区域远端甲基化情况；B为甲基化区域中端甲基化情况；C为甲基化区域近端甲基化情况；白圆圈代表CpG未甲基化；黑圆圈代表CpG甲基化。

图5为Thy1基因在成纤维细胞和体外受精胚胎中的表达情况，其中，*表示体外受精囊胚中不表达，并且与成纤维细胞中的表达差异极显著（p＜0.01）。

图6为Thy1基因甲基化区域中端在核移植胚胎中的PCR扩增效果，其中，M:DL500分子量标记；1：核移植胚胎1细胞样品；2：核移植胚胎2细胞样品；3：核移植胚胎4细胞样品；4：核移植胚胎8细胞样品；5：核移植胚胎囊胚期样品。

图7为Thy1基因在体细胞核移植胚胎中甲基化情况，其中，A为Thy1基因在核移植胚胎1细胞中的甲基化情况；B为Thy1基因在核移植胚胎2细胞中的甲基化情况；C为Thy1基因在核移植胚胎4细胞中的甲基化情况；D为Thy1基因在核移植胚胎8细胞中的甲基化情况；E为Thy1基因在核移植胚胎囊胚中的甲基化情况；白圆圈代表CpG未甲基化；黑圆圈代表CpG甲基化。

图8为体细胞核移植胚胎发育进程。

图9为Thy1基因在核移植后36小时胚胎中的甲基化情况，其中，白圆圈代表CpG未甲基化；黑圆圈代表CpG甲基化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1Thy1基因甲基化引物设计

针对猪Thy1基因，选取其转录起始位点上游1500bp下游300bp内富含CpG二核苷酸的序列作为目标序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。利用MethylPrimerExpress软件先将目标序列的CG位点替换为YG，再把所有的C替换为T，得到Thy1基因经亚硫酸氢盐处理后的转换序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.17所示。根据亚硫酸氢盐处理后的转换序列分别针对Thy1基因上游远端、中端和近端设计扩增引物，使用PrimerPremier5.0软件进行设计，并通过Oligo6.0软件校验各项参数，进行筛选，远端的扩增引物对的上游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.2和NO.3所示，下游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.4和NO.5所示；中端的扩增引物对的上游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.6和NO.7所示，下游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.8和NO.9所示；近端的扩增引物对的上游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.10和NO.11所示，下游内外引物核苷酸序列如SEQIDNO.12和NO.13所示，所述引物均采用PAGE纯化，由上海生工合成。

实施例2样品亚硫酸氢盐处理和PCR扩增

（一）样品亚硫酸氢盐处理

利用EZDNAMethylation-DirectKit^TM试剂盒对1×10³成纤维细胞和30枚体外受精囊胚进行亚硫酸氢盐处理。具体步骤如下：将790μLM-SolubilizationBuffer、300μLM-DilutionBuffer和160μLM-ReactionBuffer添加到CTConversionReagent中，制备好CTConversionReagent；用ProteinaseK消化样品，20μL反应体系为：2×M-DigestionBuffer10μL，样品9μL，ProteinaseK1μL，在50℃下孵育20分钟；将130μLCTConversionReagent和20μL样品混合，进行PCR热循环，条件为：98℃8分钟，64℃3.5小时，4℃不要超过20小时；加入600μLM-BindingBuffer入柱，将样品移置到柱中，颠倒混匀，12000rpm离心30秒，弃滤液；添加100μLM-WashBuffer到柱中，12000rpm离心30秒，弃滤液；添加200μLM-DesulphonationBuffer到柱中，室温放置20分钟，12000rpm离心30秒，弃滤液；添加200μLM-WashBuffer到柱中，12000rpm离心30秒，弃滤液；添加10μLM-ElutionBuffer到柱中，12000rpm离心30秒洗脱DNA。

（二）PCR扩增

针对Thy1基因上游远端、中端和近端的扩增，均采用巢式PCR。第一轮扩增采用20μL扩增体系：10×PCRBuffer（Mg²⁺Plus）2μL，dNTPMixture（各2.5mM）1.6μL，上游引物（远端、中端和近端引物核苷酸序列分别如SEQIDNO.3、NO.5和NO.7所示）0.4μL（10μmol/L），下游引物（远端、中端和近端引物核苷酸序列分别如SEQIDNO.9、NO.11和NO.13所示）0.4μL（10μmol/L），亚硫酸氢盐处理后的基因组模板5μL,TaqHS（5U/μL）0.1μL，Dnase/Rnasefree水补足至20μL。反应条件为：94℃欲变性5分钟；94℃变性30秒，50-55℃退火30秒，72℃扩增1分钟，40次循环；72℃延伸10分钟。第二轮PCR采用第一轮扩增产物作为模板，采用50μL扩增体系：10×PCRBuffer（Mg²⁺Plus）5μL，dNTPMixture（各2.5mM）4μL，上游引物（远端、中端和近端引物核苷酸序列分别如SEQIDNO.2、NO.4和NO.6所示）1μL（10μmol/L），下游引物（远端、中端和近端引物核苷酸序列分别如SEQIDNO.8、NO.10和NO.12所示）1μL（10μmol/L），第一轮扩增产物模板5μL,TaqHS（5U/μL）0.25μL，Dnase/Rnasefree水补足至50μL。反应条件为：94℃欲变性5分钟；94℃变性30秒，55～60℃退火30秒，72℃扩增1分钟，45次循环；72℃延伸10分钟，获得扩增产物。

（三）PCR扩增产物检测

扩增完毕后，在1%的琼脂糖胶上进行电泳，远端、中端和近端的扩增产物如图2所示，目的片段大小分别为202bp、395bp和232bp。

实施例3亚硫酸氢盐测序

（一）胶回收

对实施例2第三步扩增产物采用凝胶回收试剂盒TIANgelMidiPurificationKit（北京天根生化科技有限公司）回收目的片断。

（二）连接

将回收到的目的片段与pEASY-T3CloningVector连接，连接条件为：PCR产物4μL和pEASY-T3CloningVector1μL，室温反应5分钟。

（三）转化

加连接产物于50μLTrans1-T1感受态细胞中，冰浴30分钟；42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟；加250μL平衡至室温的LB，200转、37℃孵育1小时；取200μL菌液涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养8-12小时。

（四）菌液鉴定和测序

挑取单克隆，接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养8-12小时，收集菌液。取1μL菌液作为PCR反应的模板，25μL反应体系中用M13正向和反向引物鉴定重组子，远端、中端和近端的重组子的大小分别为455bp、648bp和485bp，用确定包含重组子的菌液进行测序，测序引物为M13F引物，同时利用BiQAnalyzer软件对序列进行甲基化分析，如图3和4所示，Thy1基因上游远端、中端和近端在成纤维细胞中的甲基化程度分别为9.31%、24.17%和96.43%，在体外受精囊胚中甲基化程度分别为14.22%、63.33%和97.62%。

实施例4Thy1基因在成纤维细胞和体外受精囊胚中的表达

（一）Thy1基因荧光定量PCR引物设计

根据Thy1的mRNA序列（NM_001146129），使用PrimerPremier5.0软件设计引物，并通过Oligo6.0软件校验各项参数，筛选引物对，引物序列为：5'AACCCTACCATTGGCATCGCT3'(上游)和5'TGAATGGGCAGGTTGGTGGT3'（下游）（如SEQIDNO.18和NO.19所示），内参基因18SrRNA（NR_002170）引物序列为：5'AATCTCGGGTGGCTGAACGC3'(上游)和5'CCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGAT3'（下游）（如SEQIDNO.20和NO.21所示）。

（二）荧光定量PCR扩增

荧光定量PCR反应采用SYBRGreenI荧光染料法，应用SYBRPremixExTaq（TaKaRa）试剂盒。20μL反应体系为：SYBRPremixExTaq（2X）10μL，上游引物（5μM）1μL，下游引物（5μM）1μL，cDNA模板2μL,Dnase/Rnasefree水6μL。反应体系在MicroAmp^TMOptical96-WellReactionPlate中混匀并用MicroAmp^TMOpticalAdhesiveFilm封口。反应条件按ABI7500仪器使用说明书设置，95℃10秒；95℃5秒，60℃31秒（45循环）；95℃15秒，60℃30秒，95℃15秒。每组荧光定量PCR实验重复三次，反应结果使用SequenceDetectionSystem软件收集和分析。

（三）基因表达分析

扩增的荧光信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值定义为阈值，而PCR扩增反应在到达阈值时，发生的循环数定义为CT值。根据扩增曲线设定阈值，然后得到CT值，CT值通常在15-30之间，当CT值大于35时，荧光定量PCR检测无效，基因没有表达。

基因表达量分析采用2^-△△CT法：以18SrRNA作为内参，靶基因在实验组中相对于对照组的△△CT值通过以下公式计算：△△CT=（CT_靶基因-CT_18SrRNA）实验组-（CT_靶基因-CT_18SrRNA）对照组，靶基因在实验组中相对表达水平通过以下公式求出：靶基因相对表达水平=2^-△△CT，所得数据使用SPSS13.0进行分析，当P<0.05时即认为差异显著，实时定量PCR结果按照“平均值±标准差”的形式进行绘图处理。

18SrRNA在成纤维细胞和体外受精囊胚中的CT值分别为15.52和15.80，Thy1基因在成纤维细胞和体外受精囊胚中的CT值分别为17.91和34.58，可见Thy1基因在成纤维细胞中高表达，在体外受精囊胚中基本没有表达，如图5所示。

实施例5Thy1基因在核移植胚胎中的甲基化情况

（一）卵母细胞的采集与体外成熟培养

从屠宰场收集卵巢并用37℃的生理盐水运送回实验室，抽取直径为3-5mm的有腔卵泡，洗卵液中洗涤3次，实体显微镜下挑选具有完整三层以上卵丘细胞的卵母细胞，成熟液中洗涤3次后，将洗净的卵母细胞移入500μL卵母细胞体外成熟培养滴中，每滴放入40-50枚卵细胞，最后置入培养条件为38.5℃，5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养。

（二）体细胞核移植

成熟培养42h后，将卵母卵丘细胞复合物放入含有1mg/mL透明质酸酶的管内，旋涡振荡3分钟去除卵丘细胞，然后用操作液洗涤一遍，并在实体镜下挑选排出第一极体并胞质均匀的卵母细胞作为体细胞核移植的受体。

将成熟的卵母细胞和消化的胎儿成纤维细胞放入显微操作液（添加7.5μg/ml细胞松弛素B的普通操作液）中，用固定管吸住一个卵母细胞，并用注射针吸除第一极体及周围的部分胞质完成去核，并注入一个供体细胞于透明带下，使之与卵母细胞质膜紧密接触，在融合液中直流电击（1.2kv/cm、30微秒、2次脉冲）诱导体细胞与去核卵母细胞融合形成重构胚并使之被激活，然后进行胚胎培养。

（三）核移植胚胎发育和收集

重构胚放入PZM-3里进行体外培养，培养条件为：38.5℃，5%二氧化碳、95%空气和饱和湿度，体外观察胚胎发育情况，并在6、24、48、72和156小时收集150枚1细胞阶段、100枚2细胞阶段、50枚4细胞阶段和25枚8细胞阶段核移植胚胎及20枚克隆囊胚。

（四）核移植胚胎Thy1基因甲基化测序分析

采用实施例2对核移植胚胎样品进行处理，并用实施例1中的中端甲基化引物进行扩增，甲基化测序采用实施例3的方法，并利用BiQAnalyzer软件对序列进行甲基化分析，结果如图7所示，Thy1基因在核移植胚胎1、2、4和8细胞阶段及囊胚中甲基化分别为18.33%、23.33%、36.67%、60.83%和65.00%。

（五）核移植各阶段胚胎发育能力分析

核移植后在12、18、24、48、72、120和156小时统计1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚比例，绘制体细胞核移植胚胎发育进程图，结果如图8所示，并计算各阶段胚胎发育到囊胚的能力，1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚阶段胚胎发育到囊胚比例分别为21.37%、31.38%、39.47%、65.54%、85.03%和100%。

实施例6Thy1基因甲基化预测核移植胚胎发育阶段和发育能力

采用实施例5获取核移植后36小时的胚胎50枚，采用实施例2进行处理，并用实施例1中的中端甲基化引物进行扩增，甲基化测序采用实施例3的方法，并利用BiQAnalyzer软件对序列进行甲基化分析，结果如图9所示，Thy1基因在核移植后36小时胚胎中的甲基化为27.33%，根据实施例5预测胚胎发育阶段主要是2-4细胞，发育到囊胚的概率为19.91%。附录

本发明实施例5所用的液体配方（均为现有技术中已有的常规试剂）：

1、洗卵液

称取NaCl（氯化钠）6.6633g，KCl（氯化钾）0.2386g，NaHCO₃（碳酸氢钠）0.1680g，KH₂PO₄（磷酸二氢钾）0.0408g，Na-Lactate（氯酸钠）1.868mL，MgCl₂.6H₂O（六水氯化镁）0.1017g，HEPES2.3830，PenicillinG（青霉素）0.0650g，PhenolRed（苯酚红）0.0100g，CaCl₂.2H₂O（二水氯化钙）0.2940g，PVA（聚乙烯醇）0.1000g，Sorbitol（山梨糖醇）2.1860g，Gentamicin（庆大霉素）0.0250g，Na-Pyruvate（丙酮酸钠）0.0220g，调渗透压为275～280，调pH为7.0～7.2，定容1L，用0.22μm滤器过滤灭菌，并4℃保存。

2、成熟液

TCM199添加0.91mmol/LNa-Pyruvate，75μg/mlPenicillinG和50μg/mlStreptomycin（链霉素），用之前添加0.57mmol/LCysteine（半胱氨酸），0.5μg/mlLuteinizingHormone（促黄体生成素），0.5μg/mlFollicleStimulatingHormone（促卵泡生成素），10ng/mlEpidermalGrowthFactor（表皮生长因子）和10%体积的卵泡液，用0.22μm滤器过滤灭菌，现配现用。

3、操作液

TCM199添加0.91mmol/LNa-Pyruvate，75μg/mlPenicillinG和50μg/mlStreptomycin（链霉素），再添加0.3%BSA（牛血清白蛋白），用0.22μm滤器过滤后使用。

4、融合液

称取Mannitol（甘露醇）5.46g，CaCl₂.2H₂O（二水氯化钙）0.015g，HEPES0.013g，MgCl₂.6H₂O（六水氯化镁）0.002g，调pH为7.0-7.4，定容100mL，用0.22μm滤器过滤灭菌，并4℃保存，使用前37℃预平衡。

5、胚胎培养液

称取NaCl0.6312g，KCl0.0746g，NaHCO₃0.2106g，KH₂PO₄0.0048g，Na-Pyruvate（丙酮酸钠）0.0022g，MgSO₄.7H₂O（七水硫酸镁）0.0099g，Ca-(Lactate)₂.5H₂O（五水乳酸钙）0.0.0617g，L-Glutamine（左旋谷氨酰胺）0.0146g，Hypotaurine（牛磺酸）0.0546g，Gentamicin（庆大霉素）0.0050g，调渗透压为286-290，调pH为7.1-7.5，定容100mL，用0.22μm滤器过滤灭菌，并4℃保存，使用前添加体积分数为2%的BME（必需氨基酸）和1%的MEM（非必需氨基酸），再添加质量分数为0.3%的BSA,过滤，二氧化碳培养箱中37℃预平衡后使用。

Claims

1.检测体细胞核移植胚胎发育能力的引物对，其特征在于：如SEQIDNO.6～SEQIDNO.9所示；所述引物对扩增的核苷酸序列为Thy1基因的一段，如SEQIDNO.16所示。

2.权利要求1所述的检测体细胞核移植胚胎发育能力的引物对在制备检测体细胞核移植胚胎发育能力的试剂盒中的应用。

3.一种检测体细胞核移植胚胎发育能力的试剂盒，其特征在于：包括用于扩增SEQIDNO.16所示序列的如SEQIDNO.6～SEQIDNO.9所示的引物，以及PCR扩增反应所需要的常规试剂。

4.根据权利要求3所述的检测体细胞核移植胚胎发育能力的试剂盒，其特征在于：试剂盒组成为：20μL扩增体系：10×PCRBufferMg²⁺Plus2μL，dNTPMixture各2.5mM1.6μL，SEQIDNO.6～SEQIDNO.9所示的上游和下游引物各0.4μL10μmol/L，模板5μL，TaqHS5U/μL0.1μL，ddH₂O12.5μL。

5.权利要求3或4所述的检测体细胞核移植胚胎发育能力的试剂盒在非疾病诊断目的的检测体细胞核移植胚胎发育能力中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：应用时，检测方法步骤如下：1）ProteinaseK消化待测样品；2）待测样品的亚硫酸氢盐处理；3）以步骤2）处理后的基因组DNA为模板，利用SEQIDNO.6～SEQIDNO.9所示的引物对，进行热启动PCR扩增，得到PCR扩增产物；4）对步骤3）获得的PCR产物进行测序，检测CpG位点的甲基化程度。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：检测CpG位点的甲基化程度后，根据CpG位点的甲基化程度评价体细胞核移植胚胎发育能力：甲基化程度为32%以下时，体细胞核移植胚胎发育到囊胚的能力为32%以下；甲基化程度为32%～55%时，体细胞核移植胚胎发育到囊胚的能力为32%～55%；甲基化程度为55%以上时，体细胞核移植胚胎发育到囊胚的能力为55%以上。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：检测CpG位点的甲基化程度后，根据CpG位点的甲基化程度评价体细胞核移植胚胎发育能力：检测核移植后36小时胚胎时，若甲基化程度为24.03～30.03%，则该胚胎发育到囊胚的概率为19.91%。