CN115612723B - 植入前胚胎的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植入前胚胎的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：对植入前胚胎的染色体和DNA甲基化水平进行检测，根据所得检测结果从所述植入前胚胎中筛选出染色体正常、目标区域的DNA甲基化水平满足预设要求，且全基因组DNA甲基化水平在0.25‑0.27区间内的胚胎或者全基因组DNA甲基化水平在0.25‑0.27区间外的相对于其他胚胎接近于0.25‑0.27区间的胚胎作为待植入胚胎。本发明筛选方法同时以染色体信息和表观遗传信息为筛选依据，能够更加全面的反映植入前胚胎的发育质量，筛选得到的植入前胚胎在移植后对应的出生率高，患病率低，从数量和质量上实现辅助生殖效果的整体提升。

Description

植入前胚胎的筛选方法

技术领域

本发明涉及辅助生殖医学技术领域，特别涉及一种植入前胚胎的筛选方法。

背景技术

辅助生殖技术是解决不孕不育的有效临床技术，根据《Reproductive Biologyand Endocrinology》的统计，目前超过20％的不孕不育夫妻必须通过辅助生殖技术治疗。

提高辅助生殖的出生率一直是辅助生殖医学领域面临的挑战。辅助生殖过程中挑选优良的胚胎进行移植是提高出生率的有效方法。目前，临床上普遍采用形态学指标以及胚胎植入前遗传学筛查(Preimplantation genetic screening，PGS)来评价和挑选胚胎。

采用形态学指标评价和挑选胚胎主要是指根据Gardner囊胚评分系统对形成的囊胚进行评分，例如4AA、4BB、4AB等；其中，数字代表囊胚细胞的密度和分裂程度的等级，分为1到6级，6为最佳。第1个字母表示将来发育成胎儿的内细胞团的质量，第2个字母表示将来发育成胎盘的滋养层细胞的质量。质量等级最好为A，依次为B、C。

胚胎植入前遗传学筛查(PGS)是指在胚胎植入之前，通过活检3-5个细胞，来检测胚胎的染色体数目和结构，判断胚胎是否存在遗传物质异常的检测方法。PGS技术至今已经发展了30几年了，从最开始的采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)只能分析几条特定的染色体的倍数和结构情况，发展到了目前使用全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)，实现对23对染色体的检测。虽然采用形态学指标来筛选胚胎，易于操作，但形态学指标无法反映出胚胎遗传物质是否存在异常，并且不能反映胚胎的发育质量以及携带疾病的风险。研究发现，在形态学良好的囊胚中，仅42％的胚胎是染色体完全正常的；其中，仅30％的ICM评级为A的胚胎，染色体是正常的(Munnéet al.,2010)。临床研究发现，胚胎染色体发生异常的概率会随着父母年龄，尤其是女方年龄的增长而升高。研究发现，当年龄≥35岁时，卵母细胞和胚胎非整倍体发生率逐步增加(34～75％)(Franasiak et al.,2014)，因此，高龄女性的自然妊娠和IVF妊娠的概率都显著下降，并且流产率增加(Ola and Li,2006)。所以对于高龄人群，采用形态学筛查胚胎的效率进一步降低。因此在一些女方高龄(35岁以上)、复发性流产、反复着床失败的患者中，还会通过PGS技术进一步筛选胚胎(Chen et al.,2015；Rubio et al.,2017)。

PGS技术虽然在一定程度上提高了辅助生殖的出生率，目前经PGS筛查后，试管婴儿的出生率达到了40％。但是临床研究发现，大量的染色体倍数正常的胚胎仍然不能成功妊娠。并且最新的研究成果显示，对于35岁以下的女性患者人群，PGS在提高妊娠率上没有显著的效果(Yan et al.,2021)。另一方面，试管婴儿中表观遗传疾病的发病率是自然受孕的婴儿发病率的2倍，并且约有千分之一的婴儿患有印记基因疾病。然而PGS技术只是检测胚胎的基因组DNA，无法检测胚胎的表观组DNA，所以PGS无法检测胚胎是否患有表观遗传疾病。

综上所述，采用目前临床上胚胎植入前的检测方法，妊娠率低。

有鉴于此，特提出本申请。

发明内容

基于此，本申请实施例的目的包括提供一种植入前胚胎的筛选方法，能够有效提升妊娠率。

本申请实施例的目的可以通过以下技术方案实现：

本申请提供一种植入前胚胎的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：

对植入前胚胎的染色体和DNA甲基化水平进行检测，根据所得检测结果从所述植入前胚胎中筛选出染色体正常，且全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27区间内的胚胎或者全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27区间外的相对于其他胚胎接近于0.25-0.27区间的胚胎作为待植入胚胎。

在本申请的一些实施方式中，所述植入前胚胎为受精后体外发育5天-7天的胚胎。

在本申请的一些实施方式中，所述植入前胚胎为处于囊胚期的胚胎。

在本申请的一些实施方式中进行染色体和DNA甲基化水平检测的样本包括取自所述植入前胚胎的滋养层细胞样本。

在本申请的一些实施方式中，所述染色体正常包括：染色体数目正常和染色体结构正常，或者染色体属于嵌合体胚胎但嵌合度少于50％。

在本申请的一些实施方式中，在来自于同一个患者的所述待植入胚胎的数量有多个的条件下，胚胎筛选移植顺序为：

全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27区间的胚胎为第一移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.22-0.24区间的胚胎为第二移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.28-0.29区间的胚胎为第三移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.19-0.21区间的胚胎为第四移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.30-0.33区间的胚胎为第五移植顺序。

在本申请的一些实施方式中，在同一移植顺序的胚胎的数量有多个的条件下，则按照如下所示的优先筛选顺序从所述多个胚胎中筛选出胚胎作为移植胚胎：

胚胎的全基因组DNA甲基化水平与0.26相比，差的绝对值最低的胚胎优先移植。

在本申请的一些实施方式中，检测所述染色体的方法包括胚胎植入前遗传学筛查。

在本申请的一些实施方式中，所述筛选方法还包括如下步骤：

根据印记基因控制区域或/和基因启动子区域的甲基化水平状态，来筛选胚胎从而降低出生缺陷比例。

在本申请的一些实施方式中，检测所述DNA甲基化水平的步骤包括：构建甲基化文库，测序。

相对于传统技术，本申请具备如下有益效果：

本申请在植入前胚胎的筛选的过程中，不仅对植入前胚胎的染色体进行检测，还对其DNA甲基化水平进行检测，并根据检测结果筛选染色体正常且具有合适DNA甲基化水平的植入前胚胎，本申请筛选方法同时以染色体信息和表观遗传信息为筛选依据，能够更加全面的反映植入前胚胎的发育质量，筛选得到的植入前胚胎在移植后对应的妊娠率高，相应地出生率高，患病率低，从数量和质量上实现辅助生殖效果的整体提升。

并且，本申请的筛选方法，直接以植入前胚胎为检测对象，避免了母源基因组的污染，能够准确的判断胚胎染色体情况以及胚胎甲基化水平信息，其中胚胎甲基化水平信息能反映胚胎的表观遗传疾病的患病情况。

同时，本申请的筛选不违背伦理规则，也不会产生过多的检测成本，有更加广阔的临床适用范围，能够为更多的家庭提供服务。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例文库构建流程图；

图2为本发明实施例数据分析流程图；

图3为不同甲基化水平的妊娠率；

图4为不同甲基化水平的流产率；

图5为21号染色体缺失的胚胎；

图6为11号染色体片段缺失的胚胎；

图7为EMST基因启动子区域在健康出生和异常发育的胚胎中的甲基化状态对比图；

图8为CELSR2基因启动子区域在健康出生和异常发育的胚胎中的甲基化状态对比图。

具体实施方式

下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。

本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。

本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

滋养层细胞：在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步分裂，同时宫腔中的分泌液通过透明带渗入细胞而逐渐形成一囊腔，成为囊胚腔。包围在囊胚腔外的为扁平细胞层，该层细胞个体较小的，将演变为胎盘的一部分，称为滋养层细胞。

本发明实施例提供一种植入前胚胎的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：

对植入前胚胎的染色体和DNA甲基化水平进行检测，根据所得检测结果从所述植入前胚胎中筛选出染色体正常，且全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27区间内的胚胎或者全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27区间外的相对于其他胚胎接近于0.25-0.27区间的胚胎作为待植入胚胎。

在本发明的一些实施方式中，所述植入前胚胎为受精后体外发育5天-7天的胚胎。

在本发明的一些实施方式中，所述植入前胚胎为处于囊胚期的胚胎。

在本发明的一些实施方式中，检测的样本包括取自所述植入前胚胎的滋养层细胞样本。

需要说明的是，不同发育天数的囊胚，最优甲基化水平会发生偏移，任何根据囊胚DNA甲基化水平来推荐移植顺序的策略都在本发明的保护范围之内。

在本发明的一些实施方式中，所述染色体正常包括：染色体数目正常和染色体结构正常，或者染色体属于嵌合体胚胎但嵌合度少于50％。

本发明提供的筛选方法中：用于筛选的植入前胚胎中，如果存在全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27区间内的胚胎，则优选该胚胎进行移植。可以理解的是，用于筛选的植入前胚胎中，可能不存在全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27区间内的胚胎，在该情况下，筛选全基因组DNA甲基化水平相对接近该区间的胚胎以备移植，越接近，辅助生殖效果越好。

在本发明的一些实施方式中，在来自于同一个患者的所述待植入胚胎的数量有多个的条件下，胚胎筛选移植顺序为：

全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27区间的胚胎为第一移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.22-0.24区间的胚胎为第二移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.28-0.29区间的胚胎为第三移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.19-0.21区间的胚胎为第四移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.30-0.33区间的胚胎为第五移植顺序。

在本发明的一些实施方式中，在同一移植顺序的胚胎的数量有多个的条件下，则按照如下所示的优先筛选移植顺序从所述多个胚胎中筛选出胚胎作为移植胚胎：

则按照如下所示的优先筛选顺序从所述多个胚胎中筛选出胚胎作为移植胚胎：

胚胎的全基因组DNA甲基化水平与0.26相比，差的绝对值最低的胚胎优先移植。

来源于不同家庭的多个植入前胚胎(具体指父亲和母亲均不相同)的检测结果显示，按照如上区间划分的移植顺序进行胚胎移植时，对应的出生率依次升高。这当然也存在于同一家庭来源的多个植入前胚胎(具体指父亲和母亲相同)。例如，基于同一家庭，筛选到2个待植入胚胎，一个的全基因组DNA甲基化水平为0.24，另一个为0.28，则优先选择前者。

在胚胎植入过程中，当胚胎全基因组的平均DNA甲基化水平接近0.26时，胚胎植入后仍然存在不能出生或者带有出生缺陷，该情况的出现，主要是因为基因组上某些关键区域的甲基化水平发生错误；由于人类基因组上约有3000万个可发生甲基化修饰的CpG位点，当其中的某几个位点甲基化发生错误时，并不会对整体的甲基化水平造成影响，但是如果这几个位点的甲基化修饰改变恰好影响了某个关键基因的表达，那么由此带来的影响会导致胚胎植入后流产，或者胎儿带有出生缺陷。

因此，在本发明的实施过程中，我们还将考虑基因启动子区域或印记基因的控制区域的甲基化水平，来筛查表观遗传学疾病。

在本发明的一些实施方式中，所述筛选方法还包括如下步骤：

根据印记基因控制区域或/和基因启动子区域的甲基化水平状态，来筛选胚胎从而降低出生缺陷比例。

本申请所述目标区域包含人类基因组上已知的印记基因控制区域和基因的启动子区域，表2中印记基因控制区域以及表3中基因的启动子区域仅用来说明本申请的实施方式，而不限制本申请的范围。任何通过印记基因控制区域的DNA甲基化水平、启动子区域的DNA甲基化水平来筛选胚胎的方法都在本申请的保护范围之内。应理解，只通过单个或多个印记基因控制区域的DNA甲基化水平或只通过单个或多个启动子区域的DNA甲基化水平或通过单个或多个印记基因控制区域的DNA甲基化水平和单个或多个启动子区域的DNA甲基化水平组合的方式来筛选胚胎的方法都在本申请的保护范围之内。部分印记基因控制区在发育异常的胚胎的中的甲基化水平见表1。

表1、为部分印记基因控制区在发育异常的胚胎的中的甲基化水平

表2、印记基因控制区域

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表3、基因启动子区域

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在本申请的一些实施方式中，检测所述染色体的方法包括胚胎植入前遗传学筛查。

申请在本申请的一些实施方式中，检测所述DNA甲基化水平的步骤包括：构建甲基化文库，测序。

具体实施例

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

一、样本获得

本发明共招募了180个志愿家庭。受试患者签署知情同意书且经伦理委员会批准后进入临床实验组。经过超排、取卵、体外受精和胚胎体外培养等阶段，对滋养层细胞进行活检。

二、样本检测

(一)植入前胚胎的DNA甲基化水平的检测

获取的活检细胞进行全基因组DNA甲基化文库构建。文库构建流程如图1。包括如下步骤：

1.细胞裂解

从冰箱取出待测细胞样本，将装有滋养层细胞样本的PCR管短暂离心后放置于冰上；向装有滋养层细胞样本的PCR管中加入细胞裂解液，裂解两个小时。

2.DNA片段化

细胞裂解后，加入缓冲液和DNA保护液，使用超声波打断仪将DNA打断为400bp左右的片段。

3.末端修复

向装有待测细胞样本的DNA片段的PCR管中加入末端修复酶和末端修复缓冲液，混匀后放入PCR仪进行孵育；PCR程序设置：20℃，30min；75℃，20min；4℃，∞。

4.末端加A

向末端修复产物中加入dATP、DNA聚合酶、连接缓冲液和Tris-HCl，混匀后放入PCR仪进行孵育；PCR程序设置：37℃，30min；75℃，20min，4℃，∞。

5.加接头

向末端加A产物中加入甲基化接头、连接酶、连接缓冲液和Tris-HCl，混匀后放入恒温柜中，16℃连接12h。

6.重亚硫酸盐转化

向加接头产物中加入CT转化试剂，混匀后放入PCR仪中，反应2.5h；

将转化产物转移至吸附柱中，加入结合缓冲液，混匀后静置5min，离心1min，弃去收集管中液体；

向吸附柱中加入洗液，离心1min，弃去收集管中液体；

向吸附柱加入去磺化缓冲液，静置15min，离心1min，弃去液体；

向吸附柱中加入洗液，离心1min，弃去收集管中液体；

向吸附柱中加入洗液，离心1min，弃去收集管中液体；

将吸附柱转移至离心管中，开盖室温晾干5min；

向吸附柱中加入预热的洗脱液，离心1min。

7.一轮扩增

将收集到的核酸转移至新的PCR管，向其中加入测序引物和PCR酶混合液1，混匀后放入PCR仪进行扩增，PCR程序设置：98℃，45s；(98℃，15s；65℃，30s；72℃，30s)x8；72℃1min；4℃，∞。

8.纯化回收

向扩增产物中加入磁珠，混匀后静置8min；

将PCR管放入磁力架中，静置2min，弃去液体；

向管中加入现配的80％乙醇，静置30s，弃去液体；

向管中加入现配的80％乙醇，静置30s，弃去液体后开盖晾干5min；

向管中加入洗脱液，混匀后静置5min；

将PCR管放入磁力架中，静置2min，将液体转移至一个新的PCR管中。

9.二轮扩增

向PCR管中加入通用引物和PCR酶混合液2，混匀后片放入PCR仪进行扩增，PCR程序设置：98℃，30s；(98℃，10s；65℃，75s)×(9-12)；65℃，5min；4℃，∞。

10.纯化回收

向扩增产物中加入磁珠，混匀后静置8min；

将PCR管放入磁力架中，静置2min，弃去液体；

向管中加入现配的80％乙醇，静置30s，弃去液体；

向管中加入现配的乙醇含量为80％(v/v)的乙醇水溶液，静置30s，弃去液体后开盖晾干5min；

向管中加入无核酸酶水，混匀后静置5min；

将PCR管放入磁力架中，静置2min，将液体转移至收集管中。

11.文库质检

使用Qpcr仪对文库进行定量，并使用安捷伦2100确定文库片段大小。

12.文库测序

文库质检合格后，采用NGS测序平台对文库进行测序。

测序后根据图2所示的数据分析流程对测序数据进行分析。对于甲基化水平的分析，除考虑胚胎的全基因组DNA甲基化水平状况，还考虑印记基因控制区域或/和基因启动子区域的甲基化水平状态。

(二)植入前胚胎的染色体检测

对于染色体的检测分析，采用目前的PGS分析流程。

(三)植入前胚胎DNA甲基化水平检测

对于临床检测的胚胎，除了根据全基因组DNA甲基化水平来筛选胚胎之外，(以0.25-0.27区间为最优植入标准，0.25-0.27区间外的相对于其他胚胎接近于0.25-0.27区间的胚胎作为待植入胚胎)，还包括，根据印记基因控制区域或/和基因启动子区域的甲基化水平状态，来筛选胚胎从而降低出生缺陷比例。

三、胚胎移植

选择整倍体植入前胚胎进行移植，其他胚胎将按照常规方法进行冷冻。如移植失败，若患者仍有可移植的整倍体胚胎，可继续进行移植。移植后，通过对移植胚胎的追踪调查，统计不同DNA甲基化水平的胚胎的妊娠率、流产率和出生率等。当患者没有整倍体胚胎可接受移植时，在告知患者移植嵌合体胚胎的风险之后，由患者自行决定是否移植嵌合体胚胎。

本发明对来自180个志愿家庭的近250个植入前胚胎进行编号，并按照上述方法进行甲基化水平检测和非整倍性检测。检测结果包括：

妊娠率的统计结果参见图3。根据图3可知：

(1)全基因组DNA甲基化水平＜0.19的3个植入前胚胎中，移植妊娠的个数为1个，妊娠率约33％。

(2)全基因组DNA甲基化水平在0.19-0.21的15个植入前胚胎中，移植妊娠的个数为9个，妊娠率约60％。

(3)全基因组DNA甲基化水平在0.22-0.24的34个植入前胚胎中，移植妊娠的个数为21个，妊娠率约62％。

(4)全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27的43个植入前胚胎中，移植妊娠的个数为33个，妊娠率约77％。

(5)全基因组DNA甲基化水平在0.28-0.29的24个植入前胚胎中，移植妊娠的个数为16个，妊娠率约67％。

(6)全基因组DNA甲基化水平在0.30-0.33的30个植入前胚胎中，移植妊娠的个数为19个，妊娠率约63％。

(7)全基因组DNA甲基化水平＞0.34的9植入前胚胎中，移植妊娠的个数为4个，妊娠率约44％。

根据图3可知，全基因组DNA甲基化水平越靠近0.25-0.27这一区间，对应的妊娠率越高。

针对图3中的妊娠患者，进一步跟踪统计流产率，结果参见图4。根据图4可知：全基因组DNA甲基化水平越靠近0.25-0.27这一区间，对应的流产率越低，相应地，出生率就越高。

以上结合滋养层细胞全基因组DNA甲基化水平，筛选胚胎用于试管婴儿的移植。对同一个家庭，如果有甲基化水平在0.25-0.27的胚胎，则选择该胚胎进行移植，如果没有胚胎在该范围，则选择胚胎的全基因组DNA甲基化水平在0.22-0.24区间为第二移植顺序；全基因组DNA甲基化水平在0.28-0.29区间为第三移植顺序；全基因组DNA甲基化水平在0.19-0.21区间为第四移植顺序；全基因组DNA甲基化水平在0.30-0.33区间为第五移植顺序。

在同一个区间内有多个可移植胚胎时，则按照如下所示的优先筛选顺序从所述多个胚胎中筛选出胚胎作为移植胚胎：

胚胎的全基因组DNA甲基化水平与0.26相比，差的绝对值最低的胚胎优先移植。

采用本发明方法分析得到的一些家庭的植入前胚胎的染色体情况如图5和图6所示。

图7中，MEST是一个母源印记基因，该基因在胚胎发育中发挥关键作用。图7表示EMST基因在健康出生和异常发育的胚胎中的甲基化状态对比图。HM表示发育异常的胚胎，Embryo_HQ,Embryo_MQ,Embryo_LQ,表示健康出生的胚胎，图中阴影部分表示该基因的控制区域，可以发现，在出生的胚胎中，该区域有较高的甲基化水平(黑色竖线表示甲基化水平)，而在发育异常的胚胎中(HM)该区域是没有发生甲基化的。

图8中，CELSR2基因在外胚层的分化中发挥重要作用，图8表示该基因上某个区域在不同类型的胚胎中的甲基化水平，Case 103-3，Case 4-1两个胚胎是健康出生的胚胎；Case88-3，Case 85-2是两个妊娠失败的胚胎，由图8可以发现，该区域在健康出生的胚胎中表现出低甲基化水平，而在妊娠失败的胚胎中表现出较高的甲基化水平。

胚胎移植案例一

该案例中的志愿者家庭有四个植入前胚胎，其中1号和3号的染色体正常，但是3号的甲基化水平不正常(具体为＞0.34)。第一次胚胎移植过程中，临床医生移植了3号植入前胚胎，结果未怀孕。第二次移植胚胎移植过程中，临床医生选择了甲基化水平正常(位于0.25-0.27区间)的1号植入前胚胎，孩子已健康出生。

表4、胚胎移植案例一

胚胎移植案例二

该案例中的志愿者家庭有两个植入前胚胎，两个植入前胚胎的染色体都正常，但是1号的甲基化水平不正常(具体为＜0.19)。第一次胚胎移植过程中，临床医生移植了1号植入前胚胎，结果未怀孕。第二次胚胎移植过程中，临床医生移植了甲基化正常(接近0.25-0.27区间)的2号植入前胚胎，孩子已健康出生。

表5、胚胎移植案例二

以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (4)

1.一种非诊断目的的植入前胚胎的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：

对植入前胚胎的染色体和DNA甲基化水平进行检测，根据所得检测结果从所述植入前胚胎中筛选出染色体正常，且全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27区间内的胚胎或者全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27区间外的相对于其他胚胎接近于0.25-0.27区间的胚胎作为待植入胚胎；

所述植入前胚胎为受精后体外发育5天-7天的胚胎；

所述植入前胚胎为处于囊胚期的胚胎；

进行染色体和DNA甲基化水平检测的样本为取自所述植入前胚胎的滋养层细胞样本；

所述染色体正常包括：染色体数目正常和染色体结构正常,或者染色体属于嵌合体但嵌合度少于50％；

在来自于同一个患者的所述待植入胚胎的数量有多个的条件下，胚胎筛选移植顺序为：

全基因组DNA甲基化水平在0.25-0.27区间的胚胎为第一移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.22-0.24区间的胚胎为第二移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.28-0.29区间的胚胎为第三移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.19-0.21区间的胚胎为第四移植顺序；

全基因组DNA甲基化水平在0.30-0.33区间的胚胎为第五移植顺序；

在同一移植顺序的胚胎的数量有多个的条件下，则按照如下所示的优先筛选移植顺序从所述多个胚胎中筛选出胚胎作为移植胚胎：胚胎的全基因组DNA甲基化水平与0.26相比，差的绝对值最低的胚胎优先移植。

2.根据权利要求1所述的非诊断目的的植入前胚胎的筛选方法，其特征在于，检测所述染色体的方法包括胚胎植入前遗传学筛查。

3.根据权利要求1所述的非诊断目的的植入前胚胎的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法还包括如下步骤：根据印记基因控制区域或/和基因启动子区域的甲基化水平状态来筛选胚胎从而降低出生缺陷比例。

4.根据权利要求1所述的非诊断目的的植入前胚胎的筛选方法，其特征在于，检测所述DNA甲基化水平的步骤包括：构建甲基化文库，测序。

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