CN114875117A - 检测女性不孕不育的基因文库的构建方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法和试剂盒。所述构建方法包括：获取样本的基因组DNA；对所述基因组DNA中的女性不孕不育基因进行扩增，构建检测女性不孕不育基因的文库；所述女性不孕不育基因包括33个。本发明能针对男性不孕不育的一个或者多个基因进行扩增并构建检测文库，该文库能够用于二代测序，实现二代测序在男性不孕不育基因检测中的应用，采用二代测序对男性不孕不育基因进行检测，优点包括：(1)通量高；(2)成本低；(3)效率高；(4)测序深度高。(5)可重复及可追溯性。

Description

检测女性不孕不育的基因文库的构建方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种检测女性不孕不育的基因文库的构建方法和试剂盒。
背景技术
不孕不育是指夫妻双方在无保护性措施的同居下一年及以上无法受孕。在女性中(卵子发生障碍)主要表现为早发性卵巢功能不全(POI)和卵巢发育不全，该疾病的临床特征包括女性40岁前绝经，伴有雌激素水平下降和促性腺激素水平上升，在40岁前的女性群体中发生率至少为1％，在原发闭经和继发闭经的女性中发生率分别高达10～28％和4～18％。
目前对于卵子发生障碍导致的女性不孕患者，供卵和雌激素替代治疗是主要治疗手段。但供卵除了有伦理问题外，还面临卵子来源极度匮乏的难题，通常需要等待几年时间；且由于缺乏患者本身的下丘脑-垂体-卵巢轴的调控，长期的激素替代治疗增加了患者肿瘤发生的风险。因此，明确卵子发生障碍遗传病因对于医学基础研究及临床治疗均有重要意义，能更好的为这些患者提供有效的治疗方案和生育咨询。
女性不孕的病因异常复杂，遗传缺陷可能是主要的病因之一，并有高度的遗传异质性，即多种单基因发生致病突变都可能导致女性不孕。已往的研究揭示，参与卵子发生的基因有数千个，但由于早期国际关注生殖领域的研究较少，且早期基因测序技术成本非常高昂，因此在人类女性不孕患者群体中，导致卵子发生障碍的致病基因的研究刚刚处于起步阶段，目前明确的致病基因还不到40个(例如目前已经发现的女性早发性卵巢功能不全和卵巢发育不去等相关的致病基因，包括FMR1、DIAPH2、NR5A1、STAG3、HFM1、SYCE1、ERCC6、MSH5、GDF9、FANCM、DMC1以及XRCC2等)，大量未知的女性卵子发生障碍基因有待发现。由于不同的致病基因导致的患者临床表型和通过辅助生殖技术助孕的结局也不一样。因此，在临床上明确卵子发生障碍患者的遗传病因对于助孕治疗方案的选择具有重要意义。
通过对不孕女性患者进行致病基因的扩增、测序和分析(即基因诊断)，明确患者存在的遗传基因突变，是进行有效精准的药物等治疗，进而选择合适的辅助生殖助孕方式，保证生育健康后代，避免出生缺陷的有效手段。目前基因诊断技术主要依赖于：对所有女性不孕致病基因的外显子区及其侧翼序列进行针对性的引物设计，随后进行普通一代PCR扩增，接着通过进行Sanger测序和与数据库中的正常人参考序列进行比对，最终得到患者是否存在致病基因突变的结果。该技术设计较为有针对性，通用性较低。有针对性强也意味着工作量大、周期长、成本高昂及不可避免存在漏诊，因此当前应用一代PCR-Sanger测序检测女性不孕遗传基因突变，面临极大的挑战。
发明内容
基于此，本发明的目的包括提供一种检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法，构建的文库能够用于二代测序，通用性强、诊断率高、耗时短。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
在本发明的第一方面，提供一种检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法，所述构建方法包括：
获取样本的基因组DNA；
对所述基因组DNA中的女性不孕不育基因进行扩增，构建检测女性不孕不育的二代测序基因文库；
所述女性不孕不育基因包括TBPL2、POF1B、FOXL2、BMP15、NOBOX、FIGLA、NR5A1、STAG3、HFM1、MCM8、ERCC6、SYCE1、MSH5、GDF9、FANCM、FMR1、FSHR、MRPS22、MCM9、NUP107、ESR1、ESR2、PSMC3IP、DMC1、XRCC2、LHCGR、MEIOB、BNC1、C14orf39、HSF2BP、DIAPH2、SYCP2L和ZSWIM7。
在本发明的一些实施方式中，所述样本取自FSH>10mIU/mL的女性患者。
在本发明的一些实施方式中，扩增所述女性不孕不育基因对应的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.68所示。
在本发明的一些实施方式中，所述样本为体液或者组织。
在本发明的第二方面，提供一种检测女性不孕不育基因的试剂盒，所述试剂盒包含扩增第一方面中定义的所述女性不孕不育基因的引物对。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于文库构建的反应试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述反应试剂包括多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs和PCR缓冲液中的一种或者多种。
在本发明的第三方面，提供第二方面所述的试剂盒在检测女性不孕不育基因中的应用。
在本发明的一些实施方式中，检测采用二代测序法。
相对于传统技术，本发明具有如下有益效果：本发明提供的方法，能针对合适的女性不孕不育基因进行扩增并构建二代测序文库，实现二代测序在男性不孕不育基因检测中的应用，采用二代测序对男性不孕不育基因进行检测，优点包括：(1)通量高：基于全基因组外显子测序技术，可以同时对每个患者全部基因的外显子区域进行捕获和测序分析。(2)成本低：随着全基因组外显子测序技术的不断发展及成本的降低，本发明对女性不孕患者众多致病基因突变筛查的成本也在不断下降，使其更广泛的临床应用成为可能。(3)效率高：省去了大量的引物设计和PCR和测序结果拼接分析的实验，节省了时间。(4)可靠性高：全基因组外显子测序深度高，平均测序深度100×以上，可信度强。(5)可重复及可追溯性：全基因组外显子测序技术产生的结果可以进行多维度、多水平的数据重分析，避免了患者多次重复检测和节约时间。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1基于全基因组外显子测序技术对女性不孕患者进行致病基因突变筛查的策略和流程图；
图2为2个卵巢早衰导致的女性不孕家系图及SYCP2L突变测序分析结果。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
女性不孕的致病基因数量多，基于一代PCR-Sanger测序的基因诊断成本高，耗时长，通用性低。并且，随着新的研究成果的发现，女性不孕的致病基因需要定期更新并需要补充新的扩增引物。
相较于一代PCR-Sanger测序，二代测序(NGS)以其通量高(可以同时进行多个基因乃至全部基因检测)，已成为当前具有多个致病基因的遗传病检测的主流技术，在高通量测序平台易实现自动化分析，能够同时快速高效的对女性不孕的基因进行检测。且随着近年来遗传学领域和技术的飞速发展，NGS技术的成本也正逐年降低到普通患者可以接受的程度，尤其是全基因组外显子测序已经开始能够广泛的在临床上对其他遗传疾病进行遗传基因诊断，因此一款针对女性不孕患者开展遗传基因检测也存在可行性。
本发明旨在针对女性不孕患者致病基因过多的特点，对这些患者的体液(主要为外周血)或者组织基因组DNA抽提后进行全基因组外显子测序及一次性筛查所有相关致病基因，建立一种通用性强、诊断率高、耗时短、成本低的女性不孕遗传学检测方法。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。其中，所用试剂及试剂盒：德国QIAGEN公司的外周血/组织DNA抽提试剂盒(DNA Qiamp DNA Blood Mini Kit；51106)；美国Promega公司的PCR扩增试剂盒(
Figure BDA0003666468260000031
Green PCR Master mix：REF M7123)；中国北京擎科生物公司的琼脂粉(TSJ001)、50×TAE电泳缓冲液(TSG001)、DNA荧光染料(TSJ003)和DL2000 DNA Marker(TSJ011-100)。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
在临床科研实践中，我们发现导致女性不孕患者致病基因为33个，并且随着遗传基因诊断研究的进一步发展，其数目有呈逐年增加趋势，对这类患者进行传统的临床遗传面临巨大的困难，也给患者带来巨大的经济负担，从而不利后续到的对症治疗和保障后代的优生优育。本发明中对临床上受检患者的体液或者组织样品进行全基因组DNA抽提后，样本DNA进行碎片化和建立基因组文库，并对文库中全部基因的外显子及其侧翼序列进行捕获及高通量测序，应用本发明出的一套新的分析流程，分析被评估为致病基因的编码区、编码区侧翼剪切位点，结合大样本人群数据库频率分析、患者家系共分离分析以及多种生物信息学预测分析等技术，明确了众多患者的致病基因突变，为其后续的临床治疗、保障其孩子的健康以及其他类似患者提供了依据。图1基于全基因组外显子测序技术对女性不孕患者进行致病基因突变筛查的策略和流程图，具体实验方法和结果如下：
1、临床适应证：
对临床上的女性不孕患者进行卵巢B超和外周血血清激素检测，最终诊断的FSH>10mIU/ml的患者将可入选进行该项目检测。严格的女性卵巢早衰诊断标准为FSH>25，我们实验室发现FSH>10的女性患者已经表现为卵巢早衰倾向，且在FSH<25的患者中曾检测到基因突变。为了早发性早治疗，本实验室将诊断标准定为FSH<10。
2、基因组DNA提取
采用德国QIAGEN公司的DNA抽提试剂盒(DNA Qiamp DNA Blood Mini Kit；51106)用于抽提体液(如外周血、尿液、唾液、精液等)或者组织样品DNA，步骤如下：
2.1若为组织，取绿豆大小的组织，放入1.5mL的离心(EP)管，加入180μL的组织裂解液ATL，用眼科剪剪碎组织后，加入20μl的蛋白酶K，颠倒混匀，震荡60s，56℃水浴45min。后加200μL细胞裂解液AL，颠倒混匀，震荡30s，瞬时离心，70℃水浴10min；
2.2若为体液，往1.5mL的EP管中加入200μl的体液和20μl的蛋白酶K，混匀；加200μLAL，颠倒混匀，震荡30s，瞬时离心，56℃水浴10min；
2.3加200μL无水乙醇，颠倒混匀60下，瞬时离心；
2.4将EP管内的液体倒入装有离心管的柱子中，13200×g，离心1min，弃掉滤液和废液收集管；
2.5将柱子放入新的废液收集管上，加500μL洗脱液AW1，13200×g，离心1min，弃掉滤液和废液收集管；
2.6将柱子放入新的废液收集管上，加入500μl洗脱液AW2，13200×g，离心3min，弃掉滤液和废液收集管；
2.7将柱子放入新的废液收集管上，空离心1min，弃掉滤液和废液收集管；
2.8将柱子放在新的1.5mL的EP管中，加入80μL的DNA溶剂AE，室温静置5min，13200×g，离心1min，收集EP管内DNA溶液；
2.9基因组DNA质控检测(包括浓度、完整性和纯度)合格后(操作如下)，4℃短暂保存或-70℃长期保存基因组DNA。
(1)使用QubitFluorometer检测DNA浓度，其中OD值在1.8～2.0之间，要求DNA测定浓度>20ng/μL，总量>1μg；
(2)1.5％琼脂糖凝胶电泳(AgaroseGelElectrophoresis)质控合格：配制1.5％琼脂糖(TSJ001，擎科生物)凝胶：称取1.5g琼脂糖于500mL锥形瓶中，加入100ml的1×TAE缓冲液(TSG001，擎科生物)，微波炉大火加热3min，冷却到55℃左右，加4μL滴核酸染料(TSJ003，擎科生物)，轻柔混匀后，倒入事先安好梳子的模具槽中，室温冷却凝固成型。取1μl基因组DNA与1×loading buffer混匀后进行上样，220V电泳10min，成像拍摄，要求DNA条带单一不弥散。
3、文库构建和全基因组外显子测序
3.1取患者基因组gDNA共计1000ng，按照Illumina标准建库流程进行测序文库的构建。
本项目应用安捷伦V6捕获芯片对基因组全部基因外显子及其侧翼序列进行捕获。通过将样品DNA片段化、磁珠筛选、文库纯化、末端修饰、A尾添加、接头连接和PCR富集过程，构建基因组外显子区域的DNA测序文库。检测文库的片段大小及浓度使其达到可上机测序的条件，以便完成后续对基因组DNA的序列测定；
3.2上机测序：将捕获后的样品使用对Illumina Miseq和/或X-ten高通量测序平台进行上机测序。
4、突变信息注释和致病性分析
4.1数据分析：利用trimmomatic软件对Illumina测序仪器产生的原始下机数据rawdata去除接头序列，得到cleandata；
4.2随后应用比对和分析软件工具BWA(Burrow-Wheeler-Aligne)、HaplotypeCaller和GATK+SAMtools等将读段与人类参考基因组序列比对(GRCh37)，对SNP和InDel进行识别分析(数据质量平均测序深度达到100×以上，即视为合格)；
4.3变异筛选及疾病相关性的预测：使用ANNOVAR对发现的基因变异(包括单核苷酸变异、小插入或缺失等)进行的有害性、数据库记载频率、相关记载和基因功能表型进行注释；
4.4对全外测序的注释结果进行本项目的候选致病基因突变进行筛选过滤，候选基因包括：1)人类在线孟德尔数据库OMIM(https://omim.org/)有记载的，导致女性不孕相关疾病(早发性卵巢功能不全等)的基因；2)本项目前期研究发现的可以导致女性不孕的全新致病基因；3)经评估后的NCBI Pubmed英文文献检索数据库中能检索到的最新发表的导致女性不孕的新的致病基因。
表1、人类女性不孕候选基因列表
Figure BDA0003666468260000051
4.5突变致病性分析
候选致病基因突变的筛选策略如下：1)过滤掉人群公共遗传突变数据库(1000Genomes、GnomAD以及GnomAD-EAS数据库)中频率大于1％的突变；2)选取生物信息学软件预测(Mutation taster、SIFT、PloyPhen-2和CADD)为可能致病的突变；3)隐性遗传模式基因优先考虑纯合突变或复合杂合突变。
5、PCR-Sanger测序验证和家系分析
对发现的候选基因突变位点进行针对性的引物设计，将患者、其父母及同胞的基因组DNA进行PCR扩增和Sanger测序验证。
以早发性卵巢功能不全患者Family P0001-IV-2存在的SYCP2L基因c.150_151del(p.Ser52Profs*7)纯合突变为例。所用的正反引物序列分别为：
SYCP2L-3-F(SEQ ID No:1):5′-GTTCTTGGGGAAAAAGTAATTTGC-3′，
SYCP2L-3-R(SEQ ID No:2)：ATTTTGGTCACAAAGCAAACCAAC-3′；
表2、SYCP2L基因PCR扩增体系
试剂 体积
Green Master Mix，2× 25μL
RNase-free water 22μL
DNA模板 2μL(约50ng)
SYCP2L-3-F 0.5μL(10μmol/L)
SYCP2L-3-R 0.5μL(10μmol/L)
Total 50μL
PCR扩增反应条件如下：95℃预变性5min后，94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环，最后72℃延伸5min，PCR扩增产物放置于4℃保存。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增的目的条带无误后，将剩余的PCR扩增产物送至擎科生物科技有限公司(北京，中国)进行Sanger法测序。
测序结果应用contig1和Chromas软件进行拼接，结果显示患者是真实存在的突变后，分析其父母和同胞的测序拼接结果，若结果符合基因型和表型共分离，即可得出所检测到的基因突变为患者致病基因突变。
实施例：目前已经对临床上300例特发性女性不孕患者进行基因检测和遗传病因诊断，(包括卵巢早衰和卵巢抵抗综合征等)。这些患者已经排除有毒物接触史，免疫系统疾病，感染类疾病，生殖道畸形，染色体异常。获取这些患者德基因组DNA(外周血)抽提，取质控合格德样品进行基因组全外显子测序检测。通过应用我们发明的分析流程，对本项目入选的候选基因进行过滤、致病性分析和家系分析，在多个不相关的家系中发现多个导致原发性女性不孕的基因突变，取得一系列有原创性的成果。以下面的例子为模板，展示我们的部分成果：
发现SYCP2L基因纯合突变导致卵巢早衰和女性不孕
我们收集了2个由于卵巢早衰导致女性不孕的患者，通过对患者进行全基因组外显子检测，发现第一个患者(Family P0001-IV-2)存在SYCP2L基因c.150_151del(p.Ser52Profs*7)纯合突变，其父母则分别为该基因位点的杂合突变。第二个家系的患者(Family P0005-IV-2)的SYCP2L基因存在c.999A>G(p.Ile333Met)纯合突变，其父母则分别为该基因位点的杂合突变。家系分析符合基因型和表型共分离，且进一步的细胞水平功能实验证实这两个位点突变有害，此外该基因敲除小鼠可导致雌性不孕。综上，SYCP2L基因纯合突变为导致卵巢早衰和女性不孕的全新致病基因。为后续患者的遗传咨询及生殖干预提供了依据。
图2为2个卵巢早衰导致的女性不孕家系图及SYCP2L突变测序分析。家系图中，方框表示男性，圆形表示女性，横线表示夫妻关系，竖线表示子女关系，实心表示患者，箭头表示先证者(患者)。第一个家系的患者(Family P0001-IV-2)存在SYCP2L基因c.999A>G(p.Ile333Met)纯合突变，其父母(Family P0001-III-1和III-2)分别为杂合突变。第二个家系的患者(Family P0005-IV-2)的SYCP2L基因存在c.999A>G(p.Ile333Met)纯合突变，其父母(Family P0005-III-1和III-2)为杂合突变。
表3、患者SYCP2L基因突变详细信息
Figure BDA0003666468260000061
表4、设计引物序列和PCR扩增条件
Figure BDA0003666468260000062
F：正向引物，R：反向引物
表5、全基因组外显子测序质量控制表
Figure BDA0003666468260000063
Figure BDA0003666468260000071
前期通过对大样本不同诊断标准的患者人群进行检测和分析，统计基因突变的检出阳性率，最终确定了需要进行检测的患者群体和适应证，即：FSH>10mIU/ml的女性不孕患者，避免了过度医疗和增加患者负担。
表6、女性不孕致病基因详细信息列表
Figure BDA0003666468260000072
Figure BDA0003666468260000081
AD：常染色体显性遗传；AR：常染色体隐性遗传；XL：X染色体连锁遗传；XLD：X染色体连锁显性遗传；XLR：X染色体连锁隐性遗传。
表7
Figure BDA0003666468260000082
Figure BDA0003666468260000091
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司
<120> 检测女性不孕不育的基因文库的构建方法和试剂盒
<160> 68
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
gttcttgggg aaaaagtaat ttgc 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
attttggtca caaagcaaac 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
acagatgaga aaaccagcgg at 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
cagcgcacct tctatcatac ca 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
ggcctctcct ggcatgtaaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
ttgggtgact atccaaggca 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 7
tgacttggag atgaactcgc c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 8
cccggttgct ctcaatcttt g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 9
gaaagcaaca tagggcctgc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 10
ggcaccaagg caatctgttc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 11
tgctcccagc ttctaaccca 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 12
ttgagtctag ggtcactggc t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 13
cctgtgcggc ttattcaacg 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 14
gcctcgggag ctcgaagt 18
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 15
gggcctggaa cagccag 17
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 16
ggctgacaga tggatgccg 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 17
gtggcgatcc ggctcaaaag 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 18
cctcaagctc tcaggcgtc 19
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 19
gaacccagga ttaggagctg ta 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 20
ggaaccgaac accaatcagc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 21
ctttccggcc cagacctcaa 20
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 22
agagataaaa ctttcagcct ccca 24
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 23
tgttctgaac ctctgtgtgg a 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 24
cgcccctagc gaaaaatacc 20
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 25
tgtgctatgg tgccccg 17
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 26
ccgacacaga ggcacagg 18
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 27
tgatcagaac tacttctctc tgcc 24
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 28
ccgctgttga ttggagaggc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 29
agtgaagacg tgcggatagg 20
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 30
cctcccacct acgggtca 18
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 31
gaaaccgatg gggatcggaa 20
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 32
cgctgctgct ggcaaag 17
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 33
ggccacttga agagagaggg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 34
agtccttccc tcccaacaac 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 35
gaagatccca tccgaacggt 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 36
aggaatccac aaggcgtgat 20
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 37
aaagcaccag ctgtcccc 18
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 38
taggccgaga ggccggt 17
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 39
gtcaaggcag agcagactca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 40
ggtaaagaat ggggctgggg 20
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 41
cacctgcacg aggctgt 17
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 42
tccacgccgc tgcttac 17
<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 43
ggtctccgcg gtctgc 16
<210> 44
<211> 15
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 44
gccgcgcagg tagcc 15
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 45
gacaactgct gttgcaccg 19
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 46
gaggcctgct gggaaatgg 19
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 47
gattcgttcc cgcgctttct 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 48
gaatggcgac ggttcaaaca 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 49
gtgctctgtt aggctccagt 20
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 50
ggtgcccccg tgttcaat 18
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 51
cgcactgcag gccagac 17
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 52
cagcacttcg gtccccac 18
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 53
tgccatagtg acatcccttt t 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 54
agtcccctcc gcccacctta g 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 55
tgtgccttag gtcagggtgt a 21
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 56
gggctgggga gttagttgtt 20
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 57
aagggattgt gggaagcagt t 21
<210> 58
<211> 17
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 58
gccaagcgcc tccgatt 17
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 59
ccacttagcc tgaggtcact 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 60
tgagacttct ggggctcttc 20
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 61
tcttcccagt aggagaaccc a 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 62
ggcttcttct gggagtctag t 21
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 63
ttttcccgaa agcagagatg ac 22
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 64
ttttcccgaa agcagagatg ac 22
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 65
aatctgacgc tcagcagtgg 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 66
aatctgacgc tcagcagtgg 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 67
aagtttctta gccgtgggca 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 68
cagtgatgtg gaaaacgccc 20

Claims (10)

1.一种检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
获取样本的基因组DNA；
对所述基因组DNA中的女性不孕不育基因进行扩增，构建检测女性不孕不育的二代测序基因文库；
所述女性不孕不育基因包括TBPL2、POF1B、FOXL2、BMP15、NOBOX、FIGLA、NR5A1、STAG3、HFM1、MCM8、ERCC6、SYCE1、MSH5、GDF9、FANCM、FMR1、FSHR、MRPS22、MCM9、NUP107、ESR1、ESR2、PSMC3IP、DMC1、XRCC2、LHCGR、MEIOB、BNC1、C14orf39、HSF2BP、DIAPH2、SYCP2L和ZSWIM7。
2.根据权利要求1所述的检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法，其特征在于，所述样本取自FSH>10mIU/mL的女性患者。
3.根据权利要求1或者2所述的检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法，其特征在于，扩增所述女性不孕不育基因对应的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1-SEQ IDNo.68所示。
4.根据权利要求1或者2所述的检测女性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法，其特征在于，所述样本为体液或者组织。
5.一种检测女性不孕不育基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含扩增权利要求1至4任一项中定义的所述女性不孕不育基因的引物对。
6.根据权利要求5所述的检测女性不孕不育基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。
7.根据权利要求5或者6所述的检测女性不孕不育基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于文库构建的反应试剂。
8.根据权利要求7所述的检测女性不孕不育基因的试剂盒，其特征在于，所述反应试剂包括多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs和PCR缓冲液中的一种或者多种。
9.权利要求5至8任一项所述的试剂盒在检测女性不孕不育基因中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，检测采用二代测序法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116083559A (zh) * 2023-01-17 2023-05-09 山东大学 早发性卵巢功能不全相关致病基因及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116083559A (zh) * 2023-01-17 2023-05-09 山东大学 早发性卵巢功能不全相关致病基因及其应用

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