CN111218505A - 一种tbx5基因多态性检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种TBX5基因多态性检测试剂盒及其检测方法，属于分子生物学技术领域。所述试剂盒包括TBX5基因SNP位点rs883079基因型上游引物、下游引物、G/G型阳性参考品、A/A型阳性参考品、G/A型阳性参考品和其他必不可少的实现试剂盒功能的试剂；本发明的检测方法具有样本用量少、省时、省力、准确度高、成本低的特点，能够快速、简便地检测TBX5的基因多态性。

Description

一种TBX5基因多态性检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种TBX5基因多态性检测试剂盒及其检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)是胎儿时期心脏血管发育异常所致的心血管畸形，也是小儿最常见的心脏病，是由于心脏、血管在胚胎发育过程中发生障碍所致的形态、结构、功能或代谢上的异常。国内外研究报道，CHD占据了出生缺陷疾病的1/3，根据WHO的最新统计资料，世界上每年大约有150万新生儿出生时患有心脏病。中国的先天性心脏病发病率约为2‰～5‰，每年新增先心病病例在15～20万，其发病率在新生儿中达0.4％～0.8％，是发病率最高的出生缺陷类型，在早产儿、死产和流产报道病例中发病率更高。在中国，先心病的发生率约为32.74/万，是常规监测报告显示的最常见的出生缺陷类型，也是目前婴幼儿死亡的首要原因。先天性心脏病预后严重，通常导致流产、死胎、死产、新生儿死亡，以及儿童、青少年和成人残疾，给社会和家庭带来沉重的负担。

目前对于单纯性先天性心脏病的病因并不清楚，多数认为是遵循一种多基因的遗传方式，是遗传因素和环境因素相互作用的结果。转录因子是较早发现的与先心病相关的基因。心脏发育过程是由特定的信号分子所激发的，需要诸多转录因子的介导，这些转录因子能够调控编码心肌细胞结构蛋白和调节蛋白基因的表达，对心肌细胞的形成、迁移分化和心瓣膜及房室间隔发育等极为重要。各种转录因子通过协同作用，共同调控下游基因的表达。如果其出现异常就会导致下游基因的表达出现异常，从而导致CHD。转录因子的突变是单纯性先天性心脏病遗传学主要病因。

人TBX5位于染色体12q24区，cDNA全长2241bp，有9个外显子，全长513个氨基酸，是T-Box转录因子家族成员，在多个器官发育中起重要作用。TBX5开始表达于新月形生心区和心管中，随着心管的发育，其表达局限在心脏后部区域，这些区域将来发育成静脉窦、心房和左心室。TBX5基因突变将引起Holt-Oram综合征(HOS)，表现为CHD和上肢发育异常，提示TBX5的突变会影响TBX5转录因子与靶DNA序列结合的不同部位，从而在不同组织中影响不同的下游基因表达。

中国专利文献CN108472318A(申请号201680050242.9)公开了一种产生表达人NKX2-5、HANDII、TBX5基因或其组合基因的嵌合非人动物的方法，其包括：a)产生NKX2-5、HANDII、TBX5或其组合无效的非人动物细胞，其中非人NKX2-5、HANDII、TBX5基因或其组合的两个拷贝均携带突变，所述突变防止在所述非人动物中产生功能性NKX2-5、HANDII、TBX5蛋白或其组合；b)通过体细胞核转移产生NKX2-5、HANDII、TBX5或其组合无效的非人胚泡，包括将来自a)的所述NKX2-5、HANDII、TBX5或其组合无效的非人动物细胞的细胞核融合进去核的非人卵母细胞中，并激活所述卵母细胞以分裂从而形成NKX2-5、HANDII、TBX5或其组合无效的非人胚泡；c)将人干细胞引入b)的NKX2-5、HANDII、TBX5或组合无效的非人胚泡中；以及d)将来自c)的所述胚泡植入假孕替代非人动物以产生表达人NKX2-5、HANDII、TBX5或其组合的嵌合非人动物。该技术方案说明TBX5基因是参与人源化心脏肌肉形成的重要基因。但如何检测或用于先天性心脏病的风险评估，并未给出解决方式。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因组DNA序列中发生单个核苷酸替换而引起的基因多态，在人类基因组中广泛分布。近年来研究发现3’端非翻译区的SNP会影响microRNA的靶向结合，进而影响靶基因的表达和功能，导致相关疾病的发生。

高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)是近年被广泛应用的检测SNP的技术，主要原理是在实时荧光定量PCR基础上通过饱和荧光染料监测核酸熔解曲线的变化而发现某基因片段是否存在SNP位点突变，而进行基因分型。HRM分析法因成本低、操作简便、灵敏度高而成为当前较为流行的一种检测突变或SNP的新方法。该技术不需要探针，只需在反应中加入饱和荧光染料，在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性，在同一个平台上进行基因分型和突变扫描，绘制温度熔解曲线，并据之区分野生型和突变型。整个过程闭管操作，也降低了污染的可能，能有效地区分不同基因型。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种用于检测先天性心脏病的引物及其应用。

发明人通过研究发现TBX5基因rs883079位点是位于基因3’端非翻译区的SNP，携带等位基因A的个体患先天性心脏病的危险性升高，突变等位基因A为先天性心脏病的危险性等位基因，因此通过设计检测TBX5基因rs883079位点的引物及试剂盒，可以评估罹患先天性心脏病的风险程度。

本发明技术方案如下：

用于检测先天性心脏病的SNP rs883079位点，处于TBX5基因3’端UTR区，12号染色体的第114355435位，当该位点均为G时，为未突变基因型，当该位点均为A时，为全突变基因型，当该位点既有G也有A时，为部分突变基因型。

一种用于检测先天性心脏病的引物，该引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

上游引物：5’-GGCCTGCTTCACAACAGACAT-3’，SEQ ID NO.1

下游引物：5’-CAGCATCCAGCGACCTTGAG-3’；SEQ ID NO.2

上述用于检测先天性心脏病的引物在制备用于检测先天性心脏病的试剂盒中的应用。

本发明提供一种用于检测TBX5基因3’端SNP rs883079位点的试剂盒，所述试剂盒包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物；

核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；

其他必不可少的实现试剂盒功能的试剂。

根据本发明优选的，所述其他必不可少的实现试剂盒功能的试剂包括：

qPCR的反应体系溶液、G/G型阳性样品、A/A型阳性样品和G/A型阳性样品。

根据本发明进一步优选的，所述试剂盒的反应体系如下，按总体积20μl计：

HRM Master Mix 10μl，浓度为30ng/μl的样品(基因组DNA模板)1μl，浓度为25mM/μl的Mg²⁺溶液1.6μl，浓度为6pmol/μl的上游引物1.0μl，浓度为6pmol/μl的下游引物1.0μl，ddH₂O5.4μl；

根据本发明进一步优选的，所述G/G型阳性样品、A/A型阳性样品和G/A型阳性样品，浓度均为1000拷贝/μl；

所述G/G型阳性样品为含有SEQ ID NO.3所述核苷酸序列的重组阳性质粒；

5’-ACTCTATCCCCTCATCAGTACCACTCTGTGCACGGAGTTGGCATGGTGCCAGAGTGGAGCGACAATAGCTAAAGTGAGGCCTGCTTCACAACAGACATTTCCTAGAGAAAGAGAGAGAGAGAGGAGAAAGAGAGAGAAGGAGAGAGACAGTAGCCAAGAGAACCCCACGGACAAGATTTTTCATTTCACCCAATGTTCACATCTGCACTCAAGGTCGCTGGATGCTGATCTAATCAGTAGCTTGAAACCACAATTTTAAAAATGTGACTTTCTTGTTTTGTCTCAAAACTTAAAAAAACAAACACAAAAAGATGAGTCCCACCCCCCACTACCACCACACCCATCAACCAGCCACATTCA-3’，SEQ IDNO.3

所述A/A型阳性样品为含有SEQ ID NO.4所述核苷酸序列的重组阳性质粒；

5’-ACTCTATCCCCTCATCAGTACCACTCTGTGCACGGAGTTGGCATGGTGCCAGAGTGGAGCGACAATAGCTAAAGTGAGGCCTGCTTCACAACAGACATTTCCTAGAGAAAGAGAGAGAGAGAGGAGAAAGAGAGAGAAGGAGAGAGACAGTAGCCAAGAGAACCCCACAGACAAGATTTTTCATTTCACCCAATGTTCACATCTGCACTCAAGGTCGCTGGATGCTGATCTAATCAGTAGCTTGAAACCACAATTTTAAAAATGTGACTTTCTTGTTTTGTCTCAAAACTTAAAAAAACAAACACAAAAAGATGAGTCCCACCCCCCACTACCACCACACCCATCAACCAGCCACATTCA-3’，SEQ IDNO.4

所述G/A型阳性样品是将等浓度的G/G型阳性样品和A/A型阳性样品等比例混合配制而成。

上述用于检测先天性心脏病的试剂盒中的使用过程，步骤如下：

(1)提取待测样品中的基因组DNA，制得模板：

(2)将步骤(1)制得的模板配制成特定浓度，然后加入试剂盒中，经PCR扩增和HRM检测，制得待测样品曲线；

(3)将G/G型阳性样品、A/A型阳性样品和G/A型阳性样品按步骤(2)的PCR扩增和HRM检测条件，分别制得G/G型阳性样品、A/A型阳性样品和G/A型阳性样品熔解曲线；

(4)将步骤(2)制得的待测样品熔解曲线分别与步骤(3)制得的G/G型阳性样品、A/A型阳性样品和G/A型阳性样品熔解曲线比对，待测样品曲线与G/G型阳性样品、A/A型阳性样品或G/A型阳性样品之一的熔解曲线重合，得出待测样品为对应的基因型。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增条件为：

预变性95℃3min；变性95℃10sec，退火65℃15sec，延伸60℃15sec，45个循环；

所述PCR扩增体系如下，体系总体积20μl：

HRM Master Mix 10μl，浓度为25mM/μl的Mg²⁺溶液1.6μl，浓度为6pmol/μl的TBX5-f溶液1μl，浓度为6pmol/μl的TBX5-r溶液1μl，浓度为30ng/μl的模板，ddH₂O 5.4μl。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，HRM检测条件为：

95℃1min，40℃1min，65℃1sec；然后以0.07℃/sec的速度升温到97℃，连续监测荧光，每秒检测15次；37℃30sec，冷却。

所述步骤(1)中，提取待测样品中的基因组DNA采用血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN)进行DNA的提取，使用前按瓶上的标签先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入适量无水乙醇，根据试剂盒说明书进行，具体步骤如下：

1)从冰箱取出保存的抗凝血，放置于室温颠倒混匀，将其按编号顺序放置于EP管架上。取相同数量的EP管对应放置并进行相同编号，将移液器设定为200μl，从盛有血液的EP管中吸取200μl抗凝血转移至对应的空EP管中。

2)向各个EP管中加入20μl蛋白酶K溶液(20mg/ml)，颠倒混匀。

3)打开EP管盖，加入200μl缓冲液GB(目的为裂解细胞)，充分颠倒混匀，将管放入浮架并置于数显恒温水浴箱中，56℃放置10min，期间颠倒数次使其水浴均匀，至溶液变清亮。

4)将EP管放入微型掌上离心机中旋转离心数秒，以甩下管壁附着的溶液，然后取出，打开管盖。注意离心时离心机盖关闭。

5)向管中加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时管中可出现白色絮状沉淀。

6)将吸附柱CB3放入配套的收集管中，并在盖上标注对应编号，换1000μl移液器，调整吸液量为620μl，将上一步所得的溶液和絮状沉淀都转移至CB3吸附柱中，放入低温高速离心机中以12,000rpm离心30s。

7)倒掉收集管中离心所得废液，将吸附柱重新放入收集管中。按说明书要求向缓冲液GD中加入无水乙醇并混匀，然后吸取500μl加入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。这一步的作用是去除蛋白质。

8)按说明书要求向漂洗液PW中加入无水乙醇并颠倒混匀。从其中吸取600μl加入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。此步为去除剩余杂质。

9)重复步骤8，将吸附柱放入收集管中。

10)将吸附柱和收集管放入离心机中，12000rpm离心2min，将吸附柱中的液体甩到收集管底，倒掉废液。拿出吸附柱CB3，将其放在滤纸上轻轻蘸数次，放置在室温中放置10min，彻底晾干吸附柱中的吸附材料残余的漂洗液。如果漂洗液残留较多会影响后续的酶反应(包括PCR、酶切等)实验。

11)取出配套的1.5mlEP管，对应吸附柱CB3编号，放置在EP管架上。将吸附柱放入管中，使用100ul移液器，吸取70μl洗脱缓冲液H2O加入管中，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到EP管中。此步将DNA溶解并转移至EP管中。

12)取出EP管，弃吸附柱，将DNA溶液置于-20℃保存。

有益效果

本发明所述试剂盒可以简单快速、准确地检测TBX5位点SNP rs883079的基因型，灵敏度高，特异性强，应用本发明的试剂盒对TBX5 SNP rs883079位点的分型与测序结果完全一致，可以用于先天性心脏病的风险评估。

附图说明

图1为本发明实施例的TBX5 SNP rs883079位点HRM分析结果曲线图：

其中：左图为TBX5基因SNP位点三种基因型熔解曲线图；右图为TBX5基因SNP三种基因型差异图；

图2.为本实施例的TBX5基因SNP rs 883079位点三种基因型测序图；

图中：A为野生型基因型G/G；B为杂合突变G/A型；C为纯和突变A/A型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中的样本为外周静脉血，采集2-3ml，加入EDTA抗凝管颠倒混匀备用；

实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为市售分析纯；所用G/G型阳性参考品、A/A型阳性参考品中的DNA序列是采用载体质粒构建的，所用引物合成、载体质粒构建与测序均由山东博尚生物公司完成。所用实验方法，如无具体条件，均按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》(科学出版社，2002年)所述条件，或根据试剂生产商建议的条件；

待测样品中的基因组DNA采用血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，购自TIANGEN公司)进行DNA的提取；

HRM Master Mix购自Roche公司，其含有荧光染料ResoLight。

DNA浓度测定方法

以微量分光光度计(Nanodrop-2000，THERMO，美国)测定DNA的浓度，采用软件进行分析，具体步骤如下：

1)在主菜单中选择核酸模式，显示波长校准窗口，放下基座臂点击OK；

2)选择检测的样品类型为DNA-50；

3)选择浓度单位为ng/μl；

4)默认的校准波长为340nm，重新选择一个校准波长或者去选择Baseline来不选择校准波长；

5)选择Add to Report自动把检测结果添加到当前报告中去，默认设置是把每个样品都添加到报告中；

6)选择Overlay spectra可以在同一时间显示多个光谱；

7)取1-2μl洗脱缓冲液TB加到基座上，放下检测臂，点击Blank键；

8)取1.5μl待测DNA滴加到基座上，放下检测臂，点击Measure读取DNA浓度值及OD260/280值并记录；

9)检测后使用干净的擦镜纸擦干净上下基座，等待进行下一个样品检测。

实施例1

1.先天性心脏病相关转录因子基因突变检测

先天性心脏病(Congenital Heart Disease,CHD)是临床最常见的一组出生缺陷，是由环境因素与遗传因素交互作用引起的一种多基因病，心脏转录因子是较早发现的与CHD相关的基因，这些转录因子能够调控编码心肌细胞结构蛋白并调节蛋白基因的表达，对心肌细胞的形成、迁移分化、心瓣膜及室间隔发育等极为重要，各种转录因子共同调控下游基因的表达。因此，认识和了解CHD相关转录因子在CHD发生中的作用，对于评估CHD风险预防CHD的发生具有非常重要的意义。

发明人在前期工作中首先采用Sanger测序技术检测了69例CHD患儿中多种转录因子如CITED2、GATA4、GATA6、NKX2.5、TBX5、TBX1和PITX2C的突变情况，并与62例正常对照儿童做比较，发现2例CHD患儿存在CITED2突变，其中1例位于编码区(CDS)，1例位于5’UTR区的已知SNP rs191856368位点；1例CHD患儿存在GATA4已知SNP rs771381966位点变异；1例CHD患儿存在GATA6编码区突变；2例CHD患儿存在NKX2.5突变，均为5’UTR区的已知SNP位点(rs3729753和rs202071628)；CHD患儿中未检测到TBX1和PITX2C的突变；而TBX5基因3’UTR区SNP rs883079位点的多态性在CHD病例组和正常对照组的分布存在差异，发现的突变位点如表1。

表1.先天性心脏病患儿中相关转录因子基因突变检测列表

2.TBX5基因SNP rs 883079位点基因型HRM分析

在前期工作基础上，发明人设计了TBX5基因SNP rs 883079位点基因型分析的HRM方法：

所述的TBX5基因SNP rs 883079位点野生G/G型和纯合突变A/A型阳性参考品包含TBX5基因SNP rs 883079位点的G/G型和A/A型DNA序列，是以人TBX5基因SNP rs 883079位点G/G型和A/A型为模板而分别设计合成的线性DNA序列(360bp)，以基因重组技术将其克隆至pMD18-T载体中，再行PCR和测序鉴定获得。

G/G型序列如下：

5’-ACTCTATCCCCTCATCAGTACCACTCTGTGCACGGAGTTGGCATGGTGCCAGAGTGGAGCGACAATAGCTAAAGTGAGGCCTGCTTCACAACAGACATTTCCTAGAGAAAGAGAGAGAGAGAGGAGAAAGAGAGAGAAGGAGAGAGACAGTAGCCAAGAGAACCCCACGGACAAGATTTTTCATTTCACCCAATGTTCACATCTGCACTCAAGGTCGCTGGATGCTGATCTAATCAGTAGCTTGAAACCACAATTTTAAAAATGTGACTTTCTTGTTTTGTCTCAAAACTTAAAAAAACAAACACAAAAAGATGAGTCCCACCCCCCACTACCACCACACCCATCAACCAGCCACATTCA-3’，其中红色下划线标示人TBX5基因SNP位点rs883079的G/G型。

A/A型序列如下：

5’-ACTCTATCCCCTCATCAGTACCACTCTGTGCACGGAGTTGGCATGGTGCCAGAGTGGAGCGACAATAGCTAAAGTGAGGCCTGCTTCACAACAGACATTTCCTAGAGAAAGAGAGAGAGAGAGGAGAAAGAGAGAGAAGGAGAGAGACAGTAGCCAAGAGAACCCCACAGACAAGATTTTTCATTTCACCCAATGTTCACATCTGCACTCAAGGTCGCTGGATGCTGATCTAATCAGTAGCTTGAAACCACAATTTTAAAAATGTGACTTTCTTGTTTTGTCTCAAAACTTAAAAAAACAAACACAAAAAGATGAGTCCCACCCCCCACTACCACCACACCCATCAACCAGCCACATTCA-3’，其中红色下划线标示人TBX5基因SNP位点rs883079的A/A型。

采用天根生化科技有限公司的质粒提取试剂盒提取重组阳性参考品质粒，以超微量分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo Scientific公司)测定质粒浓度和纯度。

所述G/G型阳性参考品中含有G/G型DNA序列的浓度为1000拷贝/μl；，所述A/A型阳性参考品中含有A/A型DNA序列的浓度为1000拷贝/μl；所述G/A型阳性参考品是将G/G型阳性参考品与A/A型阳性参考品等体积混合配制而成，其含有G/G型DNA序列和A/A型DNA序列的浓度均为1000拷贝/μl。

3.TBX5基因SNP rs 883079位点基因型的检测方法

所述样本为外周血，采集2ml外周血加入EDTA抗凝管中，颠倒混匀，采用血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取血液基因组DNA，超微量分光光度计测定质粒浓度和纯度。

所述引物为根据人TBX5基因SNP rs 883079位点上下游DNA序列(NM_181486.4)设计而成，

上游引物序列为TBX5-f:5’-GGCCTGCTTCACAACAGACAT-3’，

下游引物序列为TBX5-r:5’-CAGCATCCAGCGACCTTGAG-3’，

扩增片段长度为：150bp。

3.HRM检测反应体系与条件

反应体系为：

PCR反应条件为：预变性95℃3min；变性95℃10sec,退火65℃15sec，延伸60℃15sec；45个循环；

HRM分析条件为：95℃1min，40℃1min，65℃1sec，以0.07℃/sec的速度升温到97℃(连续监测荧光，每秒检测15次)；37℃30sec冷却。

根据重组阳性参考品的熔解曲线判断待测样本TBX5基因SNP rs 883079位点的基因型：与重组G/G阳性参考品的熔解曲线重合的待测样本为TBX5基因G/G型；与重组A/A阳性参考品的熔解曲线重合的待测样本为TBX5基因A/A型；介于两者之间与G/A阳性参考品熔解曲线重合的待测样本为TBX5基因G/A型，结果见图1。

根据HRM结果，针对每种基因型随机选择1个样本进行Sanger测序验证，结果见图2。

实施例2

采用实施例1所述的检测方法，对153例先天性心脏病患儿(病例组)和151例正常对照儿童(对照组)进行了TBX5基因SNP rs 883079位点的基因分型，发现与携带G/G野生纯合子基因型相比，携带突变纯合子基因型A/A的个体患先天性心脏病的几率显著升高，OR为2.424(95％CI＝1.181-4.975,P＝0.01442)，A/A可能为先天性心脏病的危险基因型，结果如表1所示：

表1：TBX5 rs 883079位点基因型频率与先天性心脏病危险性的关系

本发明的检测方法具有样本用量少、省时、省力、准确度高、成本低的特点，能够快速、简便地检测TBX5的基因多态性，用于先天性心脏病的辅助诊断。

说明：以上所述仅为本发明的优选实施例，目的在于说明本发明的技术特点，并不以此限制本发明的保护范围，本领域技术人员依据本发明的技术特点与原则对该技术方案进行的任何调整修改与替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 济南市儿童医院

<120> 一种TBX5基因多态性检测试剂盒及其检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

ggcctgcttc acaacagaca t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

cagcatccag cgaccttgag 20

<210> 3

<211> 360

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

actctatccc ctcatcagta ccactctgtg cacggagttg gcatggtgcc agagtggagc 60

gacaatagct aaagtgaggc ctgcttcaca acagacattt cctagagaaa gagagagaga 120

gaggagaaag agagagaagg agagagacag tagccaagag aaccccacgg acaagatttt 180

tcatttcacc caatgttcac atctgcactc aaggtcgctg gatgctgatc taatcagtag 240

cttgaaacca caattttaaa aatgtgactt tcttgttttg tctcaaaact taaaaaaaca 300

aacacaaaaa gatgagtccc accccccact accaccacac ccatcaacca gccacattca 360

<210> 4

<211> 360

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

actctatccc ctcatcagta ccactctgtg cacggagttg gcatggtgcc agagtggagc 60

gacaatagct aaagtgaggc ctgcttcaca acagacattt cctagagaaa gagagagaga 120

gaggagaaag agagagaagg agagagacag tagccaagag aaccccacag acaagatttt 180

tcatttcacc caatgttcac atctgcactc aaggtcgctg gatgctgatc taatcagtag 240

cttgaaacca caattttaaa aatgtgactt tcttgttttg tctcaaaact taaaaaaaca 300

aacacaaaaa gatgagtccc accccccact accaccacac ccatcaacca gccacattca 360

Claims (10)

1.用于检测先天性心脏病的SNP rs883079位点，处于TBX5基因3’端UTR区，12号染色体的第114355435位，当该位点均为G时，为未突变基因型，当该位点均为A时，为全突变基因型，当该位点既有G也有A时，为部分突变基因型。

2.一种用于检测先天性心脏病的引物，该引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求2所述用于检测先天性心脏病的引物在制备用于检测先天性心脏病的试剂盒中的应用。

4.一种用于检测TBX5基因3’端SNP rs883079位点的试剂盒，所述试剂盒包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物；

核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；

其他必不可少的实现试剂盒功能的试剂。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述其他必不可少的实现试剂盒功能的试剂包括：

qPCR的反应体系溶液、G/G型阳性样品、A/A型阳性样品和G/A型阳性样品。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系如下，按总体积20μl计：

HRM Master Mix 10μl，浓度为30ng/μl的样品1μl，浓度为25mM/μl的Mg²⁺溶液1.6μl，浓度为6pmol/μl的上游引物1.0μl，浓度为6pmol/μl的下游引物1.0μl，ddH₂O 5.4μl；

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述G/G型阳性样品、A/A型阳性样品和G/A型阳性样品，浓度均为1000拷贝/μl；

所述G/G型阳性样品为含有SEQ ID NO.3所述核苷酸序列的重组阳性质粒；

所述A/A型阳性样品为含有SEQ ID NO.4所述核苷酸序列的重组阳性质粒；

所述G/A型阳性样品是将等浓度的G/G型阳性样品和A/A型阳性样品等比例混合配制而成。

8.权利要求4所述用于检测先天性心脏病的试剂盒中的使用方法，其特征在于，步骤如下：

(1)提取待测样品中的基因组DNA，制得模板：

(2)将步骤(1)制得的模板配制成特定浓度，然后加入试剂盒中，经PCR扩增和HRM检测，制得待测样品曲线；

(3)将G/G型阳性样品、A/A型阳性样品和G/A型阳性样品按步骤(2)的PCR扩增和HRM检测条件，分别制得G/G型阳性样品、A/A型阳性样品和G/A型阳性样品熔解曲线；

(4)将步骤(2)制得的待测样品熔解曲线分别与步骤(3)制得的G/G型阳性样品、A/A型阳性样品和G/A型阳性样品熔解曲线比对，待测样品曲线与G/G型阳性样品、A/A型阳性样品或G/A型阳性样品之一的熔解曲线重合，得出待测样品为对应的基因型。

9.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增条件为：

预变性95℃3min；变性95℃10sec，退火65℃15sec，延伸60℃15sec，45个循环；

所述PCR扩增体系如下，体系总体积20μl：

HRM Master Mix 10μl，浓度为25mM/μl的Mg²⁺溶液1.6μl，浓度为6pmol/μl的TBX5-f溶液1μl，浓度为6pmol/μl的TBX5-r溶液1μl，浓度为30ng/μl的模板，ddH₂O 5.4μl。

10.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)中，HRM检测条件为：

95℃1min，40℃1min，65℃1sec；然后以0.07℃/sec的速度升温到97℃，连续监测荧光，每秒检测15次；37℃30sec，冷却。

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