CN104962551B - 一种焦磷酸测序文库的构建方法 - Google Patents

一种焦磷酸测序文库的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种焦磷酸测序文库的构建方法。构建方法包括以下步骤：样品DNA提取及定量，DNA片段化、纯化及片段选择，末端补平，加A尾，Y接头连接，在接头上设计多个标签，小片段去除，PCR扩增，获得扩增产物，即为DNA文库，变性为单链。使用本发明的方法得到的文库纯度高，用以测序得到的结果准确度高。

Description

一种焦磷酸测序文库的构建方法
技术领域
本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种焦磷酸测序文库的构建方法。
背景技术
焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。
该技术进行改进后可以满足上百个核苷酸序列的测序工作，这样该技术又可以满足对重要微生物的鉴定与分型，特定DNA片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。焦磷酸测序技术是由3种或4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在几种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。
现有技术中，构建高通量测序文库的方法包括：将基因组DNA片段化；将DNA片段进行末端修复；在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A；将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连；利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段；将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；将经过转换的目的片段进行PCR扩增；分离纯化扩增产物，该扩增产物构成高通量测序文库。采用本发明的构建高通量测序文库的方法及其应用，能够方便有效地构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库。现有技术还存在建库效率较低，试剂、样品损耗大，信息不完整的问题，需要构建新方法来解决。
发明内容
本发明的一个目的是一种焦磷酸测序文库的构建方法，包括以下步骤:
（1）样品DNA提取及定量；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：DNA片段化，进行目的片段的纯化、回收，片段的定量和选择；
（3）末端补平，加A尾：对DNA进行末端补平，在3’端加A尾；
（4）Y接头连接：接头包括正向接头和反向接头，正向接头和反向接头退火形成一个部分互补配对的Y型接头；
（5）在接头上设计多个标签，可以一次处理多个样品；
（6）小片段去除；
（8）PCR 扩增，获得扩增产物，即为双链DNA文库；
（9）变性为单链，使双链DNA文库变为焦磷酸测序文库。
所述回收为2.5%琼脂糖凝胶电泳胶回收或Double SPRI方法回收，优选为2.5%琼脂糖凝胶电泳胶回收。
所述接头为接头a:
正向接头：5′GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3′，
反向接头：3′GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp5′。
所述接头a的标签为GCATCACT和CGTAGTGA。
所述接头为接头b:
正向接头：5′GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT 3′，
反向接头：3′CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5′。
所述接头b的标签为TCACTAGT和AGTGATCT。
所述的标签为96个。
所述定量使用Qubit荧光仪，定量检测的标准为50μg/μl以上。
所述DNA片段化使用Covaris超声波打断仪。
所述目的片段的纯化采用Qiagen PCR纯化试剂盒。
所述小片段去除使用磁珠纯化法，磁珠纯化后的DNA，A260/A280的比值在1.85以上。
所述PCR 扩增的扩增混合液中包含Mn2+和Mg2+，Mn2+的浓度为0.60-1.10 mmol/L，Mg2+的浓度为0.80-1.20mmol/L。
所述变性的温度为93-95℃，时间为3分钟以上，优选为3-5分钟。
所述小片段去除使用磁珠纯化法，所述磁珠为AMPure磁珠。
本发明中的Y接头，节省了筛选不同连接产物的时间，提高了建库效率。本发明构建的文库容量大，与待测核酸配对的成功率高。测序接头序列长度较长，连接效率高。使用本发明构建的测序文库，能够简单、高效地构建高通量测序文库，高效的利用测序板，提高了文库构建的成功率，降低了样品和试剂的损耗。得到的测序文库纯度高、信息完整，能够高效地捕获目的片段，获得精确的测序结果。
具体实施方式
实施例1
（1）样品DNA提取及使用Qubit荧光仪定量，浓度为81μg/μl；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：使用Covaris超声波打断仪使DNA片段化，进行目的片段的纯化、回收，片段的定量和选择，纯化采用Qiagen PCR纯化试剂盒，使用Qubit荧光仪定量，浓度为64μg/μl；
（3）末端补平，加A尾：对DNA进行末端补平，在3’端加A尾；
（4）Y接头连接，接头为接头b：
正向接头：5′GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT3′，
反向接头：3′CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5′。
标签为TCACTAGT和AGTGATCT，正向接头和反向接头退火形成一个部分互补配对的Y型接头；
（5）在接头上设计96个标签，可以一次处理96个样品；
（6）使用AMPure磁珠纯化法去除小片段，磁珠纯化后的DNA，A260/A280的比值为1.92；
（7）PCR扩增，每1ml扩增混合液中包含0.90×10-3mmol MgCl2和0.80×10-3 mmolMnCl2，还包括60μl DNA聚合酶、150μl dNTP、150μl引物、180μl emPCR助剂和100μl 10×反应液，余量为水，获得的扩增产物，即为双链DNA文库；
（8）温度为95℃，时间为4分钟，使双链DNA文库变为单链DNA文库。
实施例2
（1）样品DNA提取及使用Qubit荧光仪定量，浓度为96μg/μl；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：使用Covaris 超声波打断仪使DNA片段化，进行目的片段的纯化、回收，片段的定量和选择，纯化采用Qiagen PCR纯化试剂盒，使用Qubit荧光仪定量，浓度为71μg/μl；
（3）末端补平，加A尾：对DNA进行末端补平，在3’端加A尾；
（4）Y接头连接，接头为接头a：
正向接头：5′GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3′，
反向接头：3′GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp 5′，
标签为GCATCACT和CGTAGTGA，正向接头和反向接头退火形成一个部分互补配对的Y型接头；
（5）在接头上设计96个标签，可以一次处理96个样品；
（6）使用AMPure磁珠纯化法去除小片段，磁珠纯化后的DNA，A260/A280的比值为1.89；
（7）PCR扩增，每1ml扩增混合液中包含1.20mmol/L MgCl2和0.60mmol/L MnCl2，还包括60μl DNA聚合酶、150μl dNTP、150μl引物、180μl emPCR助剂和100μl 10×反应液，余量为水，获得的扩增产物，即为双链DNA文库，获得的扩增产物，即为双链DNA文库；
（8）温度为93℃，时间为3分钟，使双链DNA文库变为单链DNA文库。
实施例3
（1）样品DNA提取及使用Qubit荧光仪定量，浓度为51μg/μl；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：使用Covaris超声波打断仪使DNA片段化，进行目的片段的纯化、回收，片段的定量和选择，纯化采用Qiagen PCR纯化试剂盒，使用Qubit荧光仪定量，浓度为50μg/μl；
（3）末端补平，加A尾：对DNA进行末端补平，在3’端加A尾；
（4）Y接头连接，接头为接头b：
正向接头：5′GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT3′，
反向接头：3′CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5′。
标签为TCACTAGT和AGTGATCT，正向接头和反向接头退火形成一个部分互补配对的Y型接头；
（5）在接头上设计96个标签，可以一次处理96个样品；
（6）使用AMPure磁珠纯化法去除小片段，磁珠纯化后的DNA，A260/A280的比值为1.86；
（7）PCR扩增，扩增混合液中包含0.80mmol/L MgCl2和1.10mmol/L MnCl2，获得的扩增产物，即为双链DNA文库；
（8）温度为94℃，时间为5分钟，使双链DNA文库变为单链DNA文库。
实施例4
（1）样品DNA提取及使用Qubit荧光仪定量，浓度为74μg/μl；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：使DNA片段化，进行目的片段的纯化、回收，片段的定量和选择，纯化采用Qiagen PCR纯化试剂盒，使用Qubit荧光仪定量，浓度为58μg/μl；
（3）末端补平，加A尾：对DNA进行末端补平，在3’端加A尾；
（4）Y接头连接，接头为接头b：
正向接头：5′GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT3′，
反向接头：3′CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5′。
标签为TCACTAGT和AGTGATCT，正向接头和反向接头退火形成一个部分互补配对的Y型接头；
（5）在接头上设计96个标签，可以一次处理96个样品；
（6）使用AMPure磁珠纯化法去除小片段，磁珠纯化后的DNA，A260/A280的比值为1.98；
（7）PCR扩增，扩增混合液中包含1.10mmol/L MgCl2和0.70mmol/L MnCl2，获得的扩增产物，即为双链DNA文库；
（8）温度为94℃，时间为6分钟，使双链DNA文库变为单链DNA文库。
实施例5
（1）样品DNA提取及使用Qubit荧光仪定量，浓度为62μg/μl；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：使DNA片段化，进行目的片段的纯化、回收，片段的定量和选择，纯化采用Qiagen PCR纯化试剂盒，使用Qubit荧光仪定量，浓度为65μg/μl；
（3）末端补平，加A尾：对DNA进行末端补平，在3’端加A尾；
（4）Y接头连接，接头为接头a：
正向接头：5′GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3′
反向接头：3′GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp 5′。
标签为GCATCACT和CGTAGTGA，正向接头和反向接头退火形成一个部分互补配对的Y型接头；
（5）在接头上设计96个标签，可以一次处理96个样品；
（6）使用AMPure磁珠纯化法去除小片段，磁珠纯化后的DNA，A260/A280的比值为1.96；
（7）PCR扩增，扩增混合液中包含1.10mmol/L MgCl2和0.70mmol/L MnCl2，获得的扩增产物，即为双链DNA文库；
（8）温度为94℃，时间为6分钟，使双链DNA文库变为单链DNA文库。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品DNA提取及定量；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：DNA片段化，进行目的片段的纯化、回收，片段的定量和选择；所述回收为2.5%琼脂糖凝胶电泳胶回收；所述DNA片段化使用Covaris超声波打断仪；
（3）末端补平，加A尾：对DNA进行末端补平，在3’端加A尾；
（4）Y接头连接：接头包括正向接头和反向接头，正向接头和反向接头退火形成一个部分互补配对的Y型接头；
所述接头为接头a或接头b:
接头a的序列为：
正向接头：5′ GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3′，
反向接头：3′ GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp5′；
接头b的序列为:
正向接头：5′ GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT 3′，
反向接头：3′ CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5′；
（5）在接头上设计多个标签，可以一次处理多个样品；
（6）小片段去除；所述小片段去除使用磁珠纯化法，磁珠纯化后的DNA，A260/A280的比值在1.85以上；
（7）PCR 扩增，获得扩增产物，即为双链DNA文库；所述PCR 扩增的扩增混合液中包含Mn2 +和Mg2+，Mn2+的浓度为0.60-1.10 mmol/L，Mg2+的浓度为0.80-1.20mmol/L；
（8）变性为单链，使双链DNA文库变为焦磷酸测序文库；所述变性的温度为93-95℃，时间为3-5分钟。
2.如权利要求1所述的焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述的标签为96个。
3.如权利要求1所述的焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述定量使用Qubit荧光仪，定量检测的标准为50μg/μl以上。
4.如权利要求1所述的焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述目的片段的纯化采用Qiagen PCR纯化试剂盒。
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