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Beschreibung
der Erfindung
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Herkömmliche
Methoden lange DNA herzustellen (z.B. alkalische Lyse und Präzipitation,
Verfahren die Trocknungs oder Ethanolpräzipitationsschritte enthalten,
wie das Binden langer DNA Moleküle
an einen Träger,
das "spooling" genomischer DNA,
Phenolisieren und Alkoholpräzipitation,
oder die alleinige Lyse und Proteinase Behandlung von Zellen in
einer Agarosegelmatrix ohne weiteeren Reinigungsschritt, wie sie
z.B. bei YACs oder menschlichen Zellen zum Einsatz kommt), wässrige DNA
Lösungen
zu lagern (Einfrieren, 4°C in
TE) und die DNA in Reaktionen oder Zellen zu überführen (Schütten, Pipettieren, Gentransfer)
sind nicht geeignet, um praktisch 100% aller Moleküle in einer
doppelsträngig
durchgängigen
Form (über
längere
Abschnitte, z.B. > 20
kb) vorliegen zu haben. Es ist in der Fachwelt oft die Meinung verbreitet,
dass z.B. DNA spooling eine relativ gute high molecular weight DNA
für PCR
bereitstellen kann, weil sie in der Regel doppelsträngige Moleküle mit 50
oder 80 kb enthält.
Dabei wird aber nicht berücksichtigt,
dass solche herkömmliche doppelsträngige DNA
bereits in erheblichem Umfang Einzelstrangbrüche enthält, sodass die durchgängigen Einzelstränge selten
länger
als z.B. 30 kb sind, und die meisten der doppelsträngig zusammengehaltenen
Moleküle
aus wesentlich kürzeren
Einzelsträngen
von mitunter nur 2–15
kb bestehen. Durch diese allseits übliche, mangelhafte DNA Qualität ergeben
sich erhebliche Schwierigkeiten bei den verschiedensten Anwendungen langer
DNA, z.B. beim Gentransfer, in molekularen Reaktionen, bei der PCR,
für die
physikalische Stabilität beim
Handling/Schütteln
in wässriger
Lösung,
und damit für
die Rekonstruktion genomischer Genorte durch Klonieren, die funktionelle
Analyse genomischer Gene sowie für
die Herstellung von Expressionskonstrukten und Genorten für die Gentherapie.
Um funktionelle Genorte zu rekonstruieren, oder passgenaue Stücke zu isolieren,
stehen in der Regel keine geeigneten Restriktionsstellen zur Verfügung. Mit
langen PCR Reaktionen können
gewünschte
Enden definiert und Sequenzen mittels Primer eingebracht werden.
Gerade für
eine lange PCR besteht aber die Schwierigkeit, dass in herkömmlicher
DNA nur ein kleiner Teil der eingesetzten Moleküle doppelsträngig durchgängig ist.
Um aus den wenigen intakten Molekülen ein Produkt zu erhalten,
werden viele Zyklen benötigt.
Das erhöht
das Risiko von Fehlern im Produkt und die freien DNA Enden der gebrochenen Moleküle erhöhen die
Komplexität
der Reaktion, wodurch sehr lange Produkte nicht oder nur fehlerhaft
erhalten werden. Der Einsatz ausschliesslich intakter DNA dieser
Erfindung reduziert bei maximaler Ausbeute die Zykluszahl und die
Komplexität
der Reaktion und somit die Fehlerrate auf ein Minimum. Darüberhinaus
können durch
die Erfindung PCR Fragmente aus z.B. rein menschlichen DNA Sequenzen
hergestellt werden, die weit länger
als 30 kb sind. Solche DNA Fragmente sind für Klonierungen, Genanalysen
und Gendiagnostik von großem
Wert. Durch die Sicherstellung der Intaktheit praktisch aller eingesetzten
Moleküle über sehr
lange Abschnitte können
mit diesem neuen DNA Material PCR und andere Polymerasereaktionen
bis zum Maximum entwickelt werden.
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Der
entscheidende Vorteil besteht in der durch die Methode gewährleisteten
Sicherheit, 100%-ig intakte Template-Moleküle einzusetzen (praktisch alle
eingesetzten Moleküle
sind frei von Einzelstrangbrüchen ssb
und Doppelstrangbrüchen
dsb über
Längen
von 20 kb). Es handelt sich nicht nur um eine etwas höhergradige
DNA-Qualität,
als es bisher möglich
war, sondern um die Sicherstellung der bestmöglichen (!) DNA Qualität. Es wurde
festgestellt, dass menschliche PCR Produkte > 40 kb auch an verhältnismässig komplexen Genorten erhalten
werden, wenn intakte DNA eingesetzt wird. Damit werden erstmalig
Längen
erreicht, die im Bereich der genomischen Länge der meisten Gene z.B. des
Menschen liegen. Die Erfindung ist bedeutend für die Weiterentwicklung sehr
langer PCR und für
die Nutzbarmachung der Ressourcen aus dem Humangenomprojekt (z.B.
Genomengineering, Synthese künstlicher
Chromosomen mittels PCR für
funktionelle Genomanalysen und die Gentherapie).
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Bei
der sehr langen PCR handelt es sich um ein Methodenpaket das sicherstellt,
dass die bereitgestellte DNA (die auch für andere Zwecke geeignet ist)
bis zum Start der Reaktion eine bestmögliche Qualität hat und
beibehält.
Das Verfahren erlaubt, dass praktisch alle eingesetzten Moleküle in den
ersten Zyklen effizient und durchgängig an der Reaktion teilnehmen
können.
Deutliche Verbesserungen konnten bereits erreicht werden (30–64 kb verschiedener
menschlicher Genorte). Die Methoden beinhalten auch die vorteilhafte
Auswirkung der Anwesenheit einer Gelmatrix in einer langen PCR Reaktion.
Die intakte Input-DNA wird vor und gemeinsam mit dem Produkt während und
nach der Reaktion maximal geschützt,
weil die Reaktionen innerhalb der Gelmatrix optimal ablaufen und
schädliche
Molekülbewegungen
(thermisch, Scheren) effektiv verhindert werden. Damit kann PCR
bis zum Maximum entwickelt werden.
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Weitere Stichpunkte:
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- – PCR
steht auch stellvertretend für
andere Polymerasereaktionen, z.B. Primerextensionen, isothermale Polymerasereaktionen.
- – Dient
der Herstellung und Modifizierung langer genomischer DNA-Fragmente
(>20 kb).
- – Bezieht
sich auch auf die genomischen DNA Fragmente mit definierten Enden,
die mittels sehr langer Polymerasereaktionen erzeugt werden.
- – Lange
DNA-Fragmente mit sehr geringer Fehlerrate.
- – Einführung von
Modifikationen in sehr lange DNA-Fragmente mittels PCR.
- – Werkzeug
für das
Genomengineering, um Restriktionsstellen oder sequenzspezifische
Rekombinationsstellen in genomische DNA-Fragmente einzubringen.
- – Werkzeug
für die
Entwicklung von PCR, Primerextensionsreaktionen, isothermale Polymerasereaktionen bis
zum Maximum.
- – Werkzeug
für die
Entwicklung von Polymerasen, Kits mit geeigneten Antioxidantien,
Puffer, Additive, pH-Stabilisatoren, DNA-Protektoren, Denaturierungshilfsstoffe,
Maßnahmen
zur Temperatursenkung, zur Senkung des Polymerase-Slippage, zur
Abbruchvermeidung, zur Steigerung der Strand displacement activity.
- – Umfasst
Testverfahren unter Zuhilfenahme der beschriebenen oder gleichwertiger
Testmaterialien, wie z.B. ein langer Tandemrepeatarray (z.B. alpha
Satelliten DNA) als sensitiver Test für Polymerase-Slippage, oder
der funktionelle Nachweis der sehr geringen Fehlerrate mit dem selektionierbaren
menschlichen HPRT-Gen (42 kb).
- – Polymerase
Slippage findet in sehr langer PCR in quantitativem Umfang statt.
Durch die hier beschriebenen Ergebnisse ist zu erwarten, dass sehr
lange DNA auch aus Probenspuren möglich wird, wenn Polymerase
slippage verhindert wird.
- – Sehr
geringe Fehlerraten interessant für Diagnostik
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Beschreibung
des Verfahrens und der belegenden Experimente
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Beschreibung, wie von
einer Template-DNA praktisch alle Anteile mit ssb ausgeschlossen
werden
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Herstellung
von DNA in Agaroseblöckchen
für den
Einsatz in sehr lange Polymerase-Reaktionenen. Die
Verwendung von Agaroseblöckchen
zum Schutz langer DNA vor Scherkräften ist bekannt, liefert aber
per se nicht eine bestmögliche
(!) Qualität,
wie sie in dieser Erfindung zum Einsatz kommt.
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Der
entscheidende Vorteil kann erst durch den quantitativen Ausschluss
mit ssb und dsb behafteter langer DNA Fraktionen von der gesamten
in der Gelmatrix eingebetteten DNA erreicht werden. Für die Herstellung
von PACBAC-DNA in low melting Agarosegelblöckchen als Gelmatrix wurde
ein Verfahren in der deutschen Anmeldung 197 20 839.8 und dem US
Patent 6,331,397 beschrieben, bei dem durch eine Pulsfeldelektrophorese
linearisierte E. coli DNA abgetrennt wurde. Hier wird der Einsatz
eines Elektrophorese-Schritts (Konstantfeld- oder Pulsfeldelektrophorese)
beschrieben, um PACs/BACs für
den Einsatz in eine PCR bereitzustellen, die keine dsb und keine
ssb enthalten und direkt innerhalb der Gelmatrix in die PCR Reaktion
eingebracht werden. Daraus entstehen neue Voraussetzungen gegenüber herkömmlicher
langer PCR-Methoden, die
bisher nur mit nicht-menschlicher DNA mit herausragend hoher Qualität und geringer
Komplexität
(z.B. direkter Einsatz von high copy lambda Phagen DNA, die nur
maximal 25 kb menschliche Inserts tragen und eine Länge von
ca 40 kb haben) durchgeführt
wurden, oder lediglich auf herkömmlichen
DNA Präparationen
mit einem großen
Anteil nicht-intakter DNA beruhten (im wesentliche DNA, die während der
Herstellung Alkohol-präzipitiert
oder getrocknet wurde, wie z.B. beim DNA spooling oder bei Zentrifugiersäulen).
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Darüberhinaus
wird von den Erfindern erkannt, dass die Verfahren auf zelluläre und chromosomale DNA-Präparationen
aus menschlichen und tierischen Zellen oder Zellfraktionen übertragbar
sind, um sehr lange PCR aus unklonierter genomischer Chromatin-DNA
durchzuführen
(z.B. Patientenblut, Gewebe, Primärkulturen, Spermien). Durch
Elektrophorese kann aus chromosomalen DNA-Präparationen in Agarose der Anteil an
genickter (ssb) und gebrochener (dsb) DNA praktisch vollständig entfernt
werden, wodurch der Einsatz bestmöglicher DNA mit Längen von
z.B. 15 kb aber auch mit weit über
100 kb möglich
ist. Dabei sind nicht nur Spuren oder ein kleiner Anteil der Template-Moleküle intakt,
wie es bei herkömmlichen
DNA Präparationen
in wässriger
Lösung
der Fall ist. Der herausragende Vorteil ist, dass die eingesetzten
Moleküle
in ihrer Gesamtheit intakt vorhanden sind. Darüberhinaus kann durch den direkten
Einsatz der Gelmatrix in die PCR Reaktion sichergestellt werden,
dass vor der Reaktion kein Abbau auftritt. Beides konnte mit herkömmlichen
DNA-Präparationen
nicht erreicht werden. Durch den direkten Einsatz der DNA-tragenden
Agarose wird zusätzlich
eine hot-start Bedingung erhalten, die zusätzlich Sequenzinterferenzen
bei niedrigen Temperaturen verhindert (Zugänglichkeit der DNA erst nach
Schmelzen einer Agarosematrix oder erst nach Diffusion der Reaktionskomponenten
in eine Gelmatrix).
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Bei
chromosomaler DNA (z.B. Mensch) kann annähernd 100%ige Intaktheit der
Moleküle
im Bereich der Zielsequenz von z.B. 15–50 kb Länge gewährleistet werden, weil mittels
Pulsfeldgelelektrophorese alle genickten Fraktionen mit Unterbrechungen,
die über
sehr viel längere
Bereiche verteilt sind, ausgeschlossen werden, wie z. B. bei 2–12 Mb Fragmenten,
die in der Pulsfeldgelelektrophorese wandern, wenn sie ssb enthalten. Dadurch
stehen praktisch alle eingesezten Moleküle (z.B. 105–106 aus Patientenblutleukozyten, oder 107 aus einer Chromatinfraktion aus Blut oder
Gewebe/Zellkultur eines Patienten, oder z.B. 108 aus
Spermien, pro 50 Mikroliter Reaktionsansatz) bereits in den ersten
Zyklen der Reaktion zur Verfügung,
wodurch geringste Zykluszahlen und damit sehr geringe Fehlerraten
erreicht werden, die auch für
gendiagnostische Anwendungen erhebliche Vorteile bringen (Machbarkeit,
Verlässlichkeit).
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Bei
linearen chromosomalen Fragmenten im Sub-Megabasen-Bereich, wie
bei den YACs der Bäckerhefe,
kann mit den hier für
BACs und PACs beschriebenen Bedingungen die intakte DNA-Fraktion
in den Agaroseblöckchen
nicht von der schadhaften Fraktion abgetrennt werden. Dafür werden
andere Elektrophoreseparameter benötigt (z.B. höhere Spannung,
höhere
oder niederige Ionenkonzentration im Elektrophoresepuffer, stärkere Ladungsinteraktionen
mit der Gelmatrixoberfläche).
Die hier in den Experimenten beschriebenen Parameter der Reinigungsmethode
nach dem Prinzip des Ausschlusses der Anteile mit ssb kommt also
vorrangig bei zirkulären
PACs/BACs, zirkulären
Genomen (z.B aus Bakterien oder Zellorganellen) und bei sehr langen
linearen chromosomalen Fragmenten (z.B. > 1 Mb) zum Einsatz.
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Blöckchenprozedur
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Zellpräparationen
werden in low melting point Agaroseblöckchen eingebracht, wie z.B.
bei Klco und Smith beschrieben wurde, oder modifiziert in der deutschen
Patentanmeldung
DE
197 20 839 A1 (Schindelhauer, Cooke) und dem US Patent
6,331,397 (Schindelhauer, Cooke) zunächst als Standardprozedur wiedergegeben
ist. Typischerweise werden 5–50%
Zellen in das Blöckchenvolumen
eingebracht. Anschliessend werden Proteine und Zellreste enzymatisch
abgebaut. Durch Entfernen der Zellreste (z.B. durch Diffusion) wird
die DNA in den Blöckchen
gereinigt. Anschliessend wird z.B. durch Restriktion des E. coli
Genoms, die E. coli DNA linearisiert. Anschliessend wird eine Agarosegelelektrophorese
durchgeführt,
um linearisierte E. coli DNA und PACs/BACs, die dsb oder ssb über größere Abschnitte
tragen, praktisch komplett aus den Agaroseblöckchen auszuschliessen. Eine
typische Pulsfeldelektrophoresebedingung ist z.B. 1–100 sec
Switchzeit, 12 h Lauf, 6V/cm, 120° Winkel,
in 0.5 × TAE
Puffer. Bei linearen Chromosomen kann die Switchzeit erheblich verlängert werden,
bei kleineren PACs/BACs < 60
kb kann eine kürzere
Elektrophorese ohne Switch und eine höhere Spannung oder kleinere
Winkel zum Einsatz kommen. Eine gute Reinigung wird bereits in einer
Standardgelelektrophorese erreicht. Unsere in den letzten Jahren
gewonnene Erkenntnis, dass ssb in PACsBACs ausgeschlossen werden
können,
führte
schliesslich zur Vermutung, daß mit
solch intakter Template-DNA auch eine Entwicklung langer PCR möglich werden
könnte.
Das nach der Elektrophorese zurückgewonnene
Agaroseblöckchen
enthält
quantitativ intakte Template-DNA (ohne dsb, ohne ssb > 20 kb). Nach sehr
langer Blöckchen-Lagerzeit
oder der Gefahr von Lichteinwirkung oder enzymatischer Verunreinigung
kann die Elektrophorese zum Ausschluss von ssb unmittelbar vor dem
Einsatz in die PCR wiederholt werden. Ein Verfahren das quntitativ
ssb-freie DNA ermöglicht
(sowie der Wunsch danach) ist nicht allgemein bekannt. Im Gegenteil
wird in Expertenkreisen allgemein davon ausgegangen, dass intakte
PACBAC-DNA im Pulsfeldgel läuft,
wie das von supercoiled DNA herkömmlicher
Plasmide (< 20
kb) bekannt ist, und von Cosmiden (40 kb) angenommen wird. So werden
oft fälschlicherweise
sogenannte "intakte" PAC/BAC-Banden z.B.
in Katalogen gezeigt, die in ein Gel eingewandert sind. Nach unserem
neuen Kenntnisstand kann es sich dabei allenfalls um offen zirkuläre, mit
ssb behaftete DNA handeln. Supercoiled DNA von > 60 kb (teilweise schon bei 40 kb und
darunter) wird quantitativ im Gel zurückgehalten. Gleichermassen
gilt in Fachkreisen, dass intakte lineare DNA von z.B. 10 Mb mittels
Pulsfeldgelektrophorese aufgetrennt werden kann. Dabei blieb jedoch
in der Regel unerkannt, dass 10 Mb lange, doppelsträngige Fäden nur
in das Gel einlaufen können,
wenn sie über
ihre Länge
verteilt ssb tragen. Die Aufreinigung intakter DNA aus Chromosomen
durch den Ausschluss der schadhaften Fraktion, die in einer Elektrophorese
mobilisiert werden kann, ist ebenfalls Bestandteil dieser Erfindung.
Sehr lange intakte DNA läuft
entgegen dem allgemeinen Kenntnisstand bereits bei erheblich kürzeren Längen nicht
in das Gel ein, vermutlich weil es bei verdröselter Konfiguration und Zug
an den freien Strangenden zur Bildung komplexer "molekularer Knoten" kommt, die nicht durch die Elektrophoresekräfte aufgelöst werden
können,
wenn ein Drehen um die DNA-Achse mangels ssb verhindert wird.
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Diese
Erkenntnis gehört
auch in Expertenkreisen nicht zum allgemeinen Wissensstand. Sie
begründet einen
wichtigen Aspekt für
das Gelingen des hier beschriebenen Verfahrens und diente als treibende
Kraft für die
Entwicklung der sehr langen PCR.
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Durch
den zuverlässigen
Ausschluss der bislang unvermeidbaren ssb DNA-Fraktion von der Template DNA
ist die Methode sehr sicher und die PCR Reaktion sehr robust. Die
in der Gelmatrix (z.B. low melting Agarose) gewonnene Template-DNA
ist unter Lichtschutz sehr lange bei Raumtemperatur lagerbar. Ein
Blöckchen mit
eineem Volumen von 100 Mikroliter enthält typischerweise 109–1010 PAC/BAC Moleküle oder z.B. 106–108 Genomkopien höherer Eukaryonten. Ein winziges
Agarosegelstückchen
von z. B. 2–20 μl wird direkt
in eine lange PCR-Reaktion (50 μl)
eingesetzt.
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Einsatz der Gelmatrix
mit eingebetteter intakter DNA in eine PCR-Reaktion am Beispiel
einer low melting Agarose
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Zu
Beginn des ersten Zyklus schmilzt die LMP-Agarose bei ca 65°C und gibt
quantitativ die eingesetzten DNA-Fragmente frei. Es können μg Mengen
BACs/PACs eingesetzt werden, so daß bereits nach wenigen Zyklen
große
Mengen des gewünschten
Fragments erhalten werden können
(z.B. 50–500
ng eines 40 kb Produktes nach 5–7
Zyklen).
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Die
Erfindung legt nahe, dass ungeachtet anderer Faktoren, wie zum Beispiel
die Komplexität
oder Hitze-Stabilität,
immer maximale Ergebnisse zu erwarten sind, weil die bestmögliche (!)
DNA-Qualität
eingesetzt wird. Durch das Verfahren wird Intaktheit der Gesamtzahl
der eingesetzten Moleküle
gewährleistet.
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Die
Methoden ermöglichen
auch den Einsatz bestmöglicher
Präparationen
menschlicher DNA. So wurde gefunden, dass chromosomale DNA höherer Eukaryonten
von der Fraktion mit ssb in einem Agaroseblöckchen befreit werden kann,
weil die sehr lange DNA der linearen Chromosomen (>>1–10
Mb) sich quasi wie die zirkulären
(supercoiled) PACs/BACs verhalten und im Gel nur wandern, wenn ssb
vorhanden sind. Somit können
mit den beschriebenenen Methoden auch die bestmöglichen Ergebnisse aus menschlichen
Zellen oder aus einer intakten Zellkern-Fraktion erhalten werden.
Dabei können
z.B. 107–109 intakte
Moleküle
in eine Reaktion eingebracht werden, und die benötigte Zykluszahl drastisch
reduziert werden. Desweiteren bedingt die Agarosemethode, bei der
einzelne Zellen oder Bakterien räumlich
getrennt von der Agarose umschlossen vorliegen, dass die DNA-Moleküle während dem
Schmelzen getrennt frei werden, wodurch in frühen Zyklen eine Durchmischung
begrenzt ist. Unabhängig
von der optimalen Zahl der Template-Moleküle (105 könnte z.B. besser
sein als 109, um Genominterferenzen zu minimieren)
ist zu erwarten, dass die PCR immer dann optimal abläuft, wenn
ssb in der Template-DNA praktisch ausgeschlossen werden. Es wird
ausdrücklich
darauf hingewiesen, dass der Einsatz intakter chromosomaler DNA
höherer
Eukaryonten auch bei der Verwendung kleiner Kopiezahlen vorteilhaft
ist, weil z.B. die Menge interferierender Genomsequenzen kleinstmöglich gehalten werden
kann, ohne in den ersten Zyklen quantitativ durchgängige Reaktionen
zu gefährden.
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Mit
herkömmlichen
DNA-Präparationen
kann bei Längen
von z.B. 20–50
kb nicht gewährleistet
werden, dass praktisch alle eingesetzten Moleküle frei von ssb sind. Im Gegenteil
enthalten genomische DNA Fraktionen, die bei 50 kb auf einem Pulsfeldgel
laufen in der Regel auch ssb, so dass nur wenige Moleküle vorhanden
sind, die über
eine Zielsequenz von 50 kb intakt sind.
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Experimente
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Der
Reihe nach werden eine Reihe von Experimenten beschrieben, die zum
Durchbruch (> 30 kb menschliche
Zielsequenzen) führten
und die entscheidenden Vorteile des Verfahrens erklären. Beispiele
werden gezeigt, wie von verschiedenen menschlichen Genorten (CFTR,
HPRT, GASZ, CORTBP2), die in PACs/BACs kloniert sind, routinemässig und äusserst
robust menschliche Fragmente von 30–50 kb erhalten werden. Amplifikation
mit zunehmenden Zykluszahlen wird bei einer Länge von mindestens 55 kb beobachtet. Neue
Reaktionskonditionen in Anwesenheit einer Gelmatrix werden beschrieben,
die bereits 64 kb des menschlichen CFTR Genorts ermöglichen.
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Die PCR-Reaktion kann
an einem Großteil
der eingesetzten Moleküle
ablaufen
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Zuerst
wurde gezeigt, dass es erwartungsgemäss möglich ist, mit konzentrierter,
flüssiger
DNA Lösung
(frische Standard-Plasmid-Präparation
(Qiagen) des Plasmids BQ8 oder CC2 (um 12 kb), die Plasmide enthalten
die 3' Region des
CFTR Gens mit der 2 kb Zielsequenz, eine kurze PCR in wenigen Zyklen
effizient durchzuführen.
Je nach verwendetem Puffer sind mit den Beispielprimern aB2R/aMF
aus dem genomischen CFTR-Gen Zykluszahlen und Extensionszeiten nahe
am theoretischen Limit möglich
(quantitative Generierung von 2 kb in 5 Zyklen mit < 1 min Extension
mit Plasmid DNA als Template, deutliche Steigerung bis Zyklus 10, nach
Zyklus 15 kaum noch Steigerung beobachtet). Dabei wurde u.a. beobachtet,
dass eine gleiche oder höhere
Ausbeute des 2 kb Fragments bei einer Denaturierungstemperatur von
92°C statt
94°C erreicht
werden kann.
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Die geschmolzene Agarose
gibt quantitativ die enthaltene DNA frei, die in ihrer Gesamtheit
effizient amplifiziert wird
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Prinzipiell
gleiche Ergebnisse wurden bei Einsatz von 1/16-1/5 Agarose-Blöckchen (zumeist
1/12 mit etwa 8μl)
mit dem 200 kb CFTR PAC CF7'' erhalten (in diesem
PAC ist die gleiche 2 kb PCR der CFTR 3' Region enthalten, wie in den zuvor
verwendeten Plasmiden BQ8 oder CC2) (1). Dabei
war der direkte Einsatz der ungeschmolzenen Blöckchen effizienter als der
Einsatz von DNA in flüssiger
Form, die durch Agarasebehandlung oder durch PAC-Zentrifugenpräparation
aus den Blöckchen
erhalten wurde. Demnach wird die im Blöckchen enthaltene DNA quantitativ
der PCR Reaktion zugeführt.
Da der PAC sehr lang ist, müssen
hohe Konzentrationen im Blöckchen
enthalten sein, um bereits nach wenigen Zyklen eine sichtbare Menge
(ca. 5 ng) der 2 kb Bande zu erhalten.
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Bei
Verwendung 1/12 Blöckchens
hätte bei
z.B. 5-facher Amplifikation zu Beginn 1 ng des 2 kb Stücks vorhanden
sein müssen,
was 100 ng des 200 kb langen PACs entspräche. In einem ganzen Blöckchen von 100 μl wären also
100 ng × 12
= 1.2 μl
vorhanden gewesen. Da dies grob der erwarteten Menge intakter DNA im
Blöckchen
entspricht (bei 20%Vol Bakterien im Blöckchen und einem 50% Verlust
der PAC DNA während der
Herstellung), wurde geschlossen, dass die PAC Moleküle aus der
im ersten Zyklus geschmolzenen Agarose quantitativ zur Verfügung stehen.
Der erhebliche Vorteil für
die anhaltende Intaktheit während
der Reaktion bei Anwesenheit der Gelmatrix wird in 1 deutlich.
Wenn die Agarose der PAC-Blöckchen
zuvor durch Agarase verflüssigt
wird, ist bereits bei 6 Zyklen ein deutlicher Verlust der Durchgängigkeit
der Template Moleküle
sichtbar, der in den flüssigen
Reaktionen einen Schmier bei 2–20
kb zeigt. Bei dem direkten Einsatz unverdauter Agarose in die Reaktionen
bleibt die eingesetzte DNA bis mindestens zum 12. Zyklus in der
high molecular weight Fraktion > 20
kb (Pfeil in 1)
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1:
Vergleich der Effizienz einer kurzen PCR von 2 kb nach 6 Zyklen
(Bahnen a–f),
9 Zyklen (Bahnen g–l)
und 12 Zyklen (Bahnen m–r)
mit intakter DNA des PAC CF7''. Die DNA wurde entweder
direkt in der Agarosematrix zugegeben (Bahnen a,b,g,h,m,n), nach
Verflüssigen
der Agarosegelmatrix durch Agarasebehandlung und vorsichtigem Pipettieren
(Bahnen c,d,i,j,o,p) und aus einer Zentrifugier-Präparation
aus dem Blöckchen
gelöst
(e,f,k,l,q,r). In Gegenwart der Agarosematrix läuft die Reaktion mit sehr guter
Kinetik ab, so daß bereits
nach 6 Zyklen das 2 kb Produkt sichtbar wird, und nach 9 Zyklen
eine höhere
Ausbeute erreicht wird, als nach 12 Zyklen ohne Gelmatrix. Die eingesetzte
PAC DNA bleibt in den Reaktionen mit der Agarosematrix über den
gesamten Verlauf als high molecular weight Fraktion bestehen (Pfeil).
Der starke Verlust der Integrität
der eingesetzten DNA ohne Agarosegelmatrix wurde auch bei 68°C Extensionstemperatur
(gezeigt ist die Reaktion bei einer Extensionstemperatur von 72°C), festgestellt.
Ethidiumbromid gefärbtes
Agarosegel nach standard Elektrophorese. Bahn s: 1 kb Leiter (BRL).
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Die Polymerasereaktion
in der geschmolzenen Agarose läuft
mit sehr hoher Geschwindigkeit ab
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In
folgenden Experimenten wurden längere
PCRs mit dem CFTR-PAC CF7 (2,06 kb, 6,53 kb, 10,06 kb, 16,58 kb;
mit den Primern aMcF jeweils mit aB2R, aB5R, aM10R, aB 16R) getestet,
um Bedingungen für die
Extensionszeiten zu finden, bei denen keine Sättigung erreicht wird (um eine
zusätzliche
Hitzebelastung durch Pausen zu verhindern). 16,58 kb wurden quantitativ
nach 5 min Extensionszeit bei 68 °C
Extensionstemperatur erreicht. Die Reaktionsgeschwindigkeit entspricht
damit etwa der Prozessivität
der Taq-Polymerase von
ca 4 kb/min. Damit konnten deutlich mildere Bedingungen (Summe Temperaturlast)
erreicht werden, als nach bestehenden Protokollen zu erwarten war
(Kits, Long PCR Publikationen). Desweiteren wurden 25,03 kb (Primer
aMF/CF+23R) und als Durchbruch 30,96 kb (Primer CF21F/aB 16R) und
39,41 kb (Primer CF21F (Zielenski et al. 1989) und CF+23R) menschlicher
DNA mit einer Extension von 10,5–12,5 min in 6 Zyklen erzeugt. Das
zeigte, dass die Agarose die Reaktion nicht hemmt und dass die intakte
DNA, die in einer Agarosegehnatrix zugefügt wird, eine wichtige Voraussetzung
für das
Gelingen sehr langer PCR ist. Bisher wurden diese Längen nur
mit lambda-Phagen
DNA berichtet, diese enthält
aber nur ein menschliches Insert von ca 15–25 kb. Allerdings war unter
den verwendeten Bedingungen (6, 7, oder 8 Zyklen, 30'' initiale Denaturierung, 20'' 92°C, 1
min 55°C,
12,5 min 68°C,
5 min finale Extension bei 68°C)
eine Steigerung über
40 kb nicht weiter möglich, was
nahelegte, dass zusätzlich
zur Qualität
der Input DNA und dem verbesserten Aufrechterhalten der Stabilität durch
die Gelmatrix auch andere Faktoren verbessert werden müssen.
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Senkung der Extensionstemperatur
zeigt bei Einsatz intakter PAC-DNA einen positiven Effekt
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Um
die Gesamtwärmelast
weiter zu verringern, wurde die Extensionstemperatur auf 66°C gesenkt.
Da in Long-PCR Publikationen keine Verbesserung unter 68°C beobachtet
wurde, war unklar, ob bei Einsatz der intakten Input-DNA doch eine
Steigerung möglich wäre. Durch
66°C Extensionstemperatur
wurde schlagartig eine effiziente Amplifikation von > 40 kb erreicht, so
z.B. 43 kb des HPRT Genorts (Primer H3f/H5r). Das HPRT-Gen weist bezüglich interner
Repeats (interspearsed) eine sehr hohe Komplexität auf (deutlich zu sehen beim "basten" von 10 kb Sequenzabschnitten
des Genorts mit sich selbst, Blast-N mit 2 Sequenzen, z.B. online auf
der ncbi-homepage). Zwischen dem B. und 9. Zyklus wurde eine deutliche
Zunahme der Ausbeute beobachtet, was darauf hinweist, dass die PCR
von 43 kb Länge
mit einer sehr guten Kinetik abläuft
(2). Dadurch wurde gezeigt, dass bei Einsatz intakter
Input-DNA in einer Agarosematrix auch komplexe menschliche Genfragmente > 40 kb robust amplifiziert
werden können.
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2 PCR
in Gegenwart einer Agarosematrix mit intakter PAC DNA des humanen
HPRT Genorts. Reaktionen von 7 Zyklen (Bahnen a–d), 8 Zyklen (Bahnen e–h), 9 Zyklen
(Bahnen i–l)
wurden mit dem Programm (30'' 92°C initiale
Denaturierung, 10'' 92°C Denaturierung,
1' 62°C Annealing,
25' 66°C Extension) durchgeführt. Bahnen
a,e,i: 25 kb Produkt mit Primern Hof und H3r. Bahnen b,f,j: 36 kb
Produkt mit Primern H4f und H5r. Bahnen c, g, k: 43 kb Produkt mit
Primern H3f und H5r. Ethidiumbromid gefärbtes Puldfeldgel (CHEF, 2''-3.5'' switch, 6V/cm),
Bahn m: Längenstandard
24 kb Leiter (NEB, Midrange II) und 1 kb Leiter (BRL).
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Bereits nach 30 sec 92°C steht die
PAC DNA aus der Agarose quantitativ zur Verfügung
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Eine
weitere Senkung der Temperaturlast wurde durch sehr kurze initiale
Denaturierungszeiten bei 92°C
(< 30 sec) und
Denaturierungszeiten während
der Zyklen von nur 7–10
sec bei 92°C
erreicht. Dadurch wurde eine routinemässige Generierung von 30–50 kb Fragmenten
verschiedener Genorte möglich
(Primer H4f/H5r = 36 kb; Primer H3f/H5r = 43 kb; Primer CF19cF/aM2R
= 41,44 kb; Primer CF19cF/aB5R = 45.92 kb; Primer CF19cF/aM10R =
49,44 kb). Mit den Primern CF19cF/aB16R = 55,96 kb und CF19cF/CF+23R
= 64,42 kb wurden reproduzierbar Produkte des humanen CFTR-Gens
erhalten. Weitere Beispiele sind das menschliche GASZ-Gen (Primer
G5R/G2cF = 32,3 kb), das menschliche CORTBP2-Gen (Primer CO17cR/CO9cF
= 40 kb) oder Produkte, die komplette PAC Vektor-Sequenzen (16 kb)
enthalten. Beispiele in 3, 4, 5.
-
3:
PCR in Gegenwart einer Agarosegelmatrix mit intakter PAC DNA des
humanen CFTR Genorts auf PAC CF7. Reaktionen von 7 Zyklen (Bahnen
a–e),
8 Zyklen (Bahnen f–j),
9 Zyklen (Bahnen k–o)
wurden mit dem Programm (30'' 92°C initiale
Denaturierung, 10'' 92°C Denaturierung,
1' 62°C Annealing,
40' 66°C Extension)
durchgeführt.
Bahnen a,f,k: 25,03 kb Produkt mit Primern aMF und CF+23R. Bahnen
b,g,l: 34,78 kb Produkt mit Primern CF20F und aM10R. Bahnen c, h,
m: 45.92 kb Produkt mit Primern CF19F und aB5R. Bahnen d,i,n: 55.96
kb Produkt mit Primern CF19F und aB 16R. Das 64,42 kb Produkt mit
Primern CF19F und CF+23R in den Bahenen e,j,o ist nur schwach zu
sehen (*). Ethidiumbromid gefärbtes
Puldfeldgel (CHEF, 2''-3.5'' switch, 6V/cm), Bahn p: Längenstandard
24 kb Leiter (NEB, Midrange II, 24, 48, 72 und 97 kb sind sichtbar)
und darunter 1 kb Leiter von BRL (12 kb und kleiner).
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4:
PCR in Gegenwart einer Agarosegelmatrix mit intakter PAC DNA des
humanen GASZ Genorts auf PAC CF1. Reaktionen von 9 Zyklen wurden
mit dem Programm (30'' 92°C initiale
Denaturierung, 10'' 92°C Denaturierung,
1' 62°C Annealing,
28' 66°C Extension,
5' finale Extension)
durchgeführt.
Bahnen a: 27,8 kb Produkt mit Primern G5R und G3cF. Bahnen b: 22,4
kb Produkt mit Primern G4R und G3cF. Bahnen c: 32.3 kb Produkt mit
Primern G5R und G2cF. Bahnen d: 26,9 kb Produkt mit Primern G4R
und G2cF. Bahnen f: Isolierung des 27,8 kb Fragments für die Herstellung
einer FISH Probe aus 4 Reaktionsansätzen a 50 Mikroliter. Ethidiumbromid
gefärbtes
Puldfeldgel. Bahnen e: Längenstandard
24 kb Leiter (NEB, Midrange II) und 1 kb Leiter von BRL (12 kb und
kleiner). Die 10 kb Bande der 1 kb Leiter entspricht einer DNA Menge
von 30 ng (zum Mengenvergleich).
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5:
PCR in Gegenwart einer Agarosegelmatrix mit intakter PAC DNA des
humanen CORTBR2 Genorts auf PAC CF7. Herstellung einer FISH Probe
eines 40 kb Fragments mit den Primern CO17cR und CO9cF. Bahnen a:
Reaktionen mit 8 Zyklen des Programms (30'' 92°C initiale
Denaturierung, 10'' 92°C Denaturierung,
1' 62°C Annealing,
40' 66°C Extension,
7' finale Extension)
wurden auf einem Pulsfeldgel aufgetrennt, Ethidiumbromid gefärbt und
anschliessend ausgeschnitten. Bahn b: Längenstandard 24 kb Leiter (NEB, Midrange
II) und 1 kb Leiter von BRL (12 kb und kleiner).
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Sensitive Messung des
Polymerase-Slippage, das hier als bedeutende Komplikation der sehr
langen PCR identifiziert wird
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Ein
definiertes Sal I alpha Satelliten DNA Fragment des X-chromosomalen
alpha Satelliten PAC B11 (Schindelhauer and Schwarz, 2002) mit homogenen
2 kb Tandemrepeat-Einheiten wurde in einem PAC subkloniert (PAC
Subklon = B11.60 hat eine Länge
von 60 kb). Der PAC wurde in Agaroseblöckchen präpariert, und Moleküle mit ssb
und dsb wurden mittels Pulsfeldgelektrophorese ausgeschlossen. Bei
Verwendung von single copy Primern im PAC-Vektor (Primer P77/P86),
die in einem Abstand von 42 kb die Tandemrepeats umschliessen, wurde
beobachtet, dass nicht die eigentliche 42 kb Bande erhalten wird,
sondern eine Leiter mit 2 kb Abständen, die deutliche Banden
nur bis zu einer Länge
von 20–24
kb aufwies. Aus dem Ergebnis wird geschlossen, dass Polymerase-Slippage
ein stark limitierender Faktor für
sehr lange PCR ist, weil bereits in wenigen Zyklen praktisch alle
eingesetzten Moleküle
vom Slippage betroffen sind, und quantitativ verschiedene kürzere Längen erhalten
werden. Etliche kürzeren
Längen
sind bereits nach 7 Zyklen im Ethidiumbromid gefärbten Gel sichtbar, was auf
ein quantitatives Geschehen hinweist, weil bei dieser Zykluszahl
keine starke Amplifikation seltener Deletionsprodukte auftreten
kann. Dabei ist eine wichtige Beobachtung, dass Slippage zwischen
den 95–99%
homologen Repeateinheiten sehr häufig
auftritt (2 kb Leiter), aber offenbar selten zwischen den monomerischen
Repeatuntereinheiten der alpha Satelliten DNA, die nur etwa 60–90% homolog
sind (diese würden
eine 0.17 kb Leiter ergeben). Demzufolge spielt eine beachtliche
Mindestlänge
der Übereinstimmung
von Repeats zwischen zwei oder innerhalb eines Moleküls eine
wichtige Rolle für
das Polymerase Slippage. Es ist zu erwarten, dass PCR Limits, die
durch interne Repeats oder Tandemrepeats in genomischer DNA höherer Eukaryonten
und der daraus entstehenden Komplexität vorwiegend durch Hemmung
des Polymerase Slippage überwunden
werden können.
Der Amplifikation in einer Agarosegelmatrix kommt dabei eine Rolle
der Trennung der einzelnen Templatemoleküle zu, die ein freies "Rekombinieren" durch Slippage zwischen
langen, homologen Repeatelementen verschiedener Sequenzen verhindert,
und damit die Kinetik der Amplifikation des richtigen Produkts drastisch
verbessert. Für
die Entwicklung neuer Polymerasen und Reakltionsbedingunen dient
der PAC B11.60 als sensitiver Test. Durch Spaltung der entstandenen
Repeatleitern mit den neben den Primern an den PAC Vektorenden vorkommenden
unique Restriktionsstellen Not I und Sal I konnte eine erwartete
Verkürzung
um ca 100 bp (45 + 55 bp) nachgewiesen werden. Die Leitern sind
damit durch eine durchgängige
PCR mit Slippage, und nicht durch einseitige Abbrüche zu erklären.
-
Direkt eingesetzte Bakterien
sind nicht für
sehr lange PCR-Produkte geeignet
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Um
den direkten Einsatz von PAC tragenden Bakterien mit dem PAC in
der Agarosematrix (ohne ssb und ohne E coli-Genom) zu vergleichen,
wurden 36 kb PCRs des HPRT-Gens (Primer H4f/H5r) und 16 kb oder 35
kb (CF20F/aM10R) des CFTR-Gens
durchgeführt.
In wiederholten Versuchen konnten mit vergleichbaren Bakterienmengen
keine kleinsten Spuren der 16, 35 und 36 kb Banden erhalten werden.
Auch eine Salzbehandlung der Bakterienwände, wie sie vor dem Eingiessen
in Agarose erfolgt (Pett IV), erbrachte keine positive PCR. Die
vorgeschaltete Lyse mittels Erhitzen in Triton-Puffer (TTE) erlaubte
ebenfalls kein Produkt (4).
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6:
PCR in Gegenwart einer Agarosegelmatrix mit intakter PAC DNA des
humanen CFTR Genorts auf PAC CF7 im Vergleich mit PCR Reaktionen
direkt aus TE gewaschenen, nativen Bakterien (Tris 10 mM, EDTA 1mM),
oder einem Schnelllysat aus Bakterien (Überstand nach Erhitzen in einer
Tris 20 mM, Triton X100, EDTA 2 mM Lösung und Zentrifugation) in
vergleichbarer und 10-fach kleinerer Bakterienzahl. Reaktionen von
7 Zyklen (Bahnen a–f),
8 Zyklen (Bahnen h–m),
9 Zyklen (Bahnen n–u)
wurden mit dem Programm (30'' 92°C initiale
Denaturierung, 10'' 92°C Denaturierung,
1' 62°C Annealing,
30' 66°C Extension)
durchgeführt.
Bahnen a,b,h,i,o,p: Einsatz von ca 109 Bakterien
in 5ul TE. Bahnen c,d,j,k,q,r: Einsatz von ca 108 Bakterien
in 5ul TE. Bahnen e,f,l,m,s,t: Einsatz eines Schnellysats aus Bakterien
unter vorsichtigem Pipettieren. Ethidiumbromid gefärbtes Puldfeldgel
(CHEF, 2''-5'' switch, 6V/cm, 16 h). Nur in den Kontrollbahnen
n und u mit der in die Agarosematrix eingebetteten, intakten DNA
wird das 34,78 kb Produkt mit den Primern CF20F und aM10R erhalten.
Bahn g: Längenstandard
24 kb Leiter (NEB, Midrange II) und 1 kb Leiter von BRL (12 kb und kleiner).
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Materialien:
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- Kits: Standard Polymerasen, Expand (Roche) Kit mit Puffern,
Amersham Taq, modifizierte Puffer, verschiedene Polymerase-Beimischungen
(Pufferbeigaben, Reaktionszusätze,
Polymerasen, Nukleotidspezifikationen etc. sind für eine Weiterentwicklung
von Bedeutung). Sie sind nicht Bestandteil dieser Anmeldung und
werden nicht explizit benannt.
- Agarose: LMP-Agarose (Gibco BRL, 2% in H2O vor Zugabe zum Bakterienblöckchen)
Klone: PAC CF7 (CFTR, CORTBP2), PAC CF1 oder CF3 (GASZ), PAC H2c
(HPRT-Gen).
- Primer: Etliche Primer wurden mit selten schneidenden Restriktionsnuklease-Schnittstellen versehen,
mit denen die generierten Fragmente für ein Engineering modifiziert
werden und einer gezielten Klonierung zugänglich werden. Als weitere
Modifizierung kommt z.B. die Anbringung von Erkennungssequenzen
für Sequenzspezifische
Rekombinasen in Frage etc. Die meisten Primer funktionierten problemlos.
Die Primerlänge,
Annealingtemperatur, Aufreinigung scheint keine herausragende Rolle
bei der sehr langen PCR zu spielen.
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Bisherige Entwicklung
der langen PCR:
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Lange
PCR (Barnes 1994, Cheng 1994) entwickelte sich zu einem wertollen
Werkzeug für
eine Vielzahl von Anwendungen , wie der genetischen Diagnostik,
der Typisierung von Krankheitserregern, oder dem Schliessen von
Klonier- und Sequenzierlücken
in Genomen. PCR bietet eine einfache Möglichkeit, um exakte Progen
und genomische DNA Fragmente herzustellen, und könnte damit für funktionelle
Analysen und insitu Hybridisierungen und für das Engineeren genomischer
Expressionskonstrukte dienen. Die hunderttausenden genomischen BAC/PAC
Klone aus den Resourcen des Humangenomprojekts enthalten oft mehr
als ein einziges Gen, oder nur einen Teil eines Gens und seiner
regulierenden Regionen. Aus diesem Grund müssen Klone mit Regionen ergänzt werden,
oder ungewollte Bereiche müssen
ausgeschlossen werden, was mittels konventionellem Klonieren schwierig
ist, weil in der Regel keine selten schneidenden Restriktionsstellen
an den gewünschten
stellen vorkommen. Nur mit konventioneller Klonierung aus lagerbarer
DNA lassen sich zuverlässig Mutationen
in der DNA eindämmen,
weil so wiederholte Wachstumsschritte vermieden werden können. Die einführung synthetischer
Sequenzen mittels Primer wurde bereits erfolgreich beim Klonieren
von cDNA Sequenzen eingesetzt, aber Größenlimits der PCR und kritische
Ausfälle
mit existierenden Methoden verhinderten bislang einen breiten Einsatz
der PCR beim genomischen Engineeren. Zu den wichtigsten Hemmnissen gehört die Erfolglosigkeit
langer PCR bei komplexen Genomsequenzen, wie sie bei höheren Eukaryonten
vorkommen, sowie die Fehlerrate der Polymerasen. Deshalb benötigen viele
Engineering-Vorhaben arbeitsaufwändige
Strategien, wie zum Beispiel homologe Rekombination und sukzessive
Veränderung
in protrahierten Zellkulturphasen, die eine erhöhte Mutagenese aufweisen.
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Unter
normalen PCR Bedingungen mit der Taq Polymerase waren nur wenige
Kilobasen möglich.
Diese Grenze wurde durch Zugabe einer zweiten polymerase mit Exonuklease
(proof reading) Aktivität überwunden.
Dadurch konnten viel längere
Abschnitte anvisiert werden, und Parameter wurden verändert, um
Depuriierung bei niedrigem pH Wert und Hitzeinstabilität der Ingredienzien
entgegenzuwirken (Gustafson 1993, Barnes 1994, Cheng 1994). Durch
Erhöhung
und Stabilisierung des pH Werts in der Reaktion, durch Senkung der Denaturierungstemperatur
oder Zugabe von Additiven (i.e. glycol, formamide, DMSO), veränderte Salzbedingungen,
und durch eine Erniedrigung der Extensionstemperatur von 72°C auf 68°C wurden
verbesserte Bedingungen geschaffen, die eine Amplifikation von bis
zu 40 kb lambda phagen DNA zuliess. Es wurden lange PCR Kits entwickelt
(z.B. Roche, Epicentre, Eppendorf, Stratagene) und weitere Polymerasemixturen
und Additive wie Betain ergänzt.
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Die
bisherigen Längenlimits
hatten neben den Polymerasen und Reaktionsbbedingungen verschiedene
weitere Gründe.
Einer ist die Komplexität
der eingesetzten Sequenzen, dazu gehört die Verfügbarkeit spezifischer single
copy Primer, der erhebliche Anteil an nicht-Zielssequeenzen in der
eingesetzten DNA, sowie verbreitetee Repeatelemente, die zu ektopen
Priming durch Abbruchprodukte oder Replikationsstottern bei einfachen
Repeats führen
können
(Canceill 1999, Viguera EMBO J 2001, Viguera JMB 2001).
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Ein
weiteres Problem ist eine unzureichende Qualität der eingesetzten DNA. Obwohl
PCR theoretisch von degradierter DNA mit kleinerren Längen als
die Ziellänge
möglich
ist (Golenberg 1996), ist die Läge
der eingesetzten DNA für
entscheidend für
eine lange PCR. Je größer der
Anteil an einzel- und doppelsträngig gebrochenen
DNA Molekülen
ist, desto höher
ist das Problem ektopen Primens und umsomehr Zyklen sind notwendig, um
ein Produkt zu bekommen. Standard DNA Präparationen in wässriger
Lösung
enthalten kaum doppelsträngig
ddurchgängige
Moleküle über 30–50 kb,
wodurch nur sehr wenige unbeschadete Moleküle dieser Länge vorhanden sind. Damit benötigen lange
PCRs, selbst bei dem Einsatz sorgfältiger Präparationen, eine große Zykluszahl,
um ein ausreichendes Produkt zu erzeugen, und schaffen selten ausreichende
Mengen über
20–30
kb (Mukai Nippon Rhinso 1996).
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Längere Framente
von bis zu 42 kb wurden allerdings erfolgreich aus lambda Phagen
DNA generiert (Barnes 1994, Cheng 1994), die offenbar eine hohe
Qualität
aufweist, möglicherweise
weil die Phagen nur wenig (15 kb) komplexe DNA enthalten und weil
die DNA intakt bereitgestellt werden kann. Allerdings ist Imbda maximal
50 kb lang und die maximale Insertlänge von 25 kb verhinderte eine
Weiterentwicklung der PCR.
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Zusätzlich zur
problematischen DNA Qualität
birgt PCR Risiken der Mutagenese. Verschiedene proof reading Polymerasen
erlaubten eine Senkung der Fehlerrate unter 10–4–10–5 (Cariello
1991, Matilla 1991, Lundberg 1991, Cline 1996, Huang DNA Cell Biol
1996), aber mit jeddeem Zyklus können
Fehleer auuftreten und akkumulieren, wodurch es mit herkömmlichhen
Methoden schwierrig wird, PCR Produkte mit etlichen Kilobasen ohne
Fehler zu erzeugen.
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Um
beide Probleme, die mangelnde DNA Qualität und das Mutageneserisiko
zu lösen,
und Reaktionsbedingungen für
menschliche DNA über
30 kb zu entwickeln, verwednen wir eine neue DNA Präparrationsmethode
für hoch
konzentrierte und intakte DNA aus herkömmlichen Agaroseblöckchen aus
einer zuvor entwickelten Methode für die Herstellung künstlicher
Chromosomen und die stabile Lagerung großer Mengen DNA aus BAC/PAC
Klonen (Schindelhauer NAR 1997) und einem Reinigungsschritt, der
nicht-intakte DNA aus langen DNA Präparationen ausschliesst.
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Die
DNA, die in eeiner Gelmatrix hhergestellt wird kann direkt in die
PCR Reaktion eingesetzt werden, ohne die DNA aus der Matrix herauszulösen und
mit den Reaktionsingredienzzien zu vermengen. Die PCR Reaktionen
in Gegenwart der Agarosematrix warren so effektiv, dass die Mehhrzahl
der eingesetzten Moleküle tatsächlich während der
ersten wenigen Zyklen quantitativ und vollständig repliziert werden, was
eine Ausbeute nahe am theoretischen Maximum ermöglichte, bei gleichzeeitiger
dramatischer Senkung der benötigten
Zykluszahl. Die Erfindung beschreibt die ersten bahnbrechenden Erfolge
und PCR Bedingungen, die mindestens 64 kb menschlicher DNA erlauben.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet nicht nur die erfolgreiche, robuste
PCR > 30 kb verschiedner menschlichen
Sequenzen unter Bedingungen, die ein Fehleerrisiko drastisch reduzieren,
sie beinhaltet auch die Herstellung und Lagerung der ausschliesslich
intakten DNA im allgemeinen, wodurch jeglicher Umgang mit langen
DNA Fragmenten erheblich erleichtert wird. Die neuen Techniken und
Verfahhren stellen somit eine neue Technologiestufe für die Verwendung
genomischer DNA Abschnitte als zuverlässigen Werksttoff dar. Die Erfindung
schliesst auch methoden zur herstellung sehr langer DNA mit sehr
hoher Qualität
(50–500
kb und länger).
Damit werden in kleinen Volumina von 100 Mikrolitern sehr hohe Kopiezahlen
ausschliesslich intakter DNA Moleküle für den Einsatz in Reaktionen
oder einen Gentransfer möglich,
z.B. lange Plasmide, Cosmide und BACs bis über 1010 Moleküle or 108 menschliche Genome und mehr.
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Referenzen:
-
- Schindelhauer, Cooke, US patent 6,331,397
- Schindelhauer, ( DE
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Dieses kann
von der amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.
