JP2570929B2

JP2570929B2 - ブタのｄｎａ、ｄｎａプローブ、ベクター及びブタの雌雄判別法

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Publication number: JP2570929B2
Application number: JP3245733A
Authority: JP
Inventors: 誠岩谷; 昭三尾川; 孝之石川; 利昭細川
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1991-09-25
Filing date: 1991-09-25
Publication date: 1997-01-16
Anticipated expiration: 2012-01-16
Also published as: JPH0576367A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はブタの雌雄判別法に有用
なＤＮＡ、ＤＮＡプローブ、該ＤＮＡを含むベクター及
びブタの雌雄判別法に関する。

【０００２】

【従来の技術】家畜繁殖学の分野で胚や胎児の性別判
定、つまり雄雌の生みわけが重要視され始めている。例
えば、養豚分野においては種付けが日常的に行われてい
る。遺伝学的に優良な雄のみを選択的に得ることができ
れば、家畜繁殖の分野できわめて有用性が高いと考えら
れる。

【０００３】ほ乳類の性別が性染色体によって決定され
ることは良く知られている。発生初期にＹ染色体は未分
化の生殖腺を精巣に分化させるのに重要な役目をしてい
る。従って、Ｙ染色体に特異的な遺伝子を解析すること
によって雌雄の判別ができる。

【０００４】最近、Ｙ染色体に特異的な遺伝子やＤＮＡ
を用いた雌雄判別法が報告されている。例えば、シンク
レア(Sinclair)らは、ヒトのＹ染色体上の未分化生殖腺
を精巣に分化させるＤＮＡの塩基配列の候補を発表し
た。さらに、彼らはその塩基配列の一部が哺乳類で良く
保存されている可能性を示唆している（ネイチャー（NA
TURE）,Vol346,19 JULY1990)。また、特開昭６３−５０
０２１４号公報には雄のウシのＤＮＡとハイブリダイズ
するウシのＤＮＡプローブが記載されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前記のシンクレアらの
ＤＮＡをプローブとして雌雄判別を行うこともできる
が、該ＤＮＡは人由来のものでありその特異性に問題が
残る。また、前記の特開昭６３−５００２１４号公報記
載のプローブはその配列が長すぎる点が問題である。

【０００６】本発明は、このような状況に鑑み、より簡
易でかつ高感度にブタの雌雄判別を行うことのできる、
雌雄判別法に有用なブタのＤＮＡ、ＤＮＡプローブ及び
該ＤＮＡを含むベクターの提供並びにブタの雌雄判別法
の提供を目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、雄ブ
タのＤＮＡを下記のプライマー 5'-AAGCGACCCA TGAACGCATT CATCGTGTGGT-3' および 5'-GAGGTCGATA CTTATAATTC GGGTATTTCTCTCTGTG-3' を用いてＰＣＲ法で増幅して得られることを特徴とする
ブタのＤＮＡに関する。

【０００８】また本発明は、次式配列（Ｉ）で示される
塩基配列を持つブタのＤＮＡに関する。配列（Ｉ） 5'-CTCGTGATCA AAGGAGAAAA GTGGCTCTAG AGAACCCTCA AATGCAAAAC TCAGAGATCA GCAAGTGGCT GGGATGCAAG TGGAAAATGC TTACAGAAGC CGAAAAGCGC CCATTCTTCG AGGAGGCACA GAGGCTACAG GCGGTG-3'

【０００９】さらに本発明は、上記のブタのＤＮＡを含
有し、これを標識して得られるＤＮＡプローブ、上記の
ブタのＤＮＡを含有するベクター及び上記のブタのＤＮ
Ａに相補的なＤＮＡに関する。

【００１０】さらに本発明は、前記ＤＮＡプローブを用
いることを特徴とするブタの雌雄判別法に関する。

【００１１】本発明における、プローブとして有用なブ
タのＤＮＡ断片は、前記プライマーを用いてＰＣＲ（Po
lymerase chain reaction）法で増幅して得ることがで
きるが、その工程は、例えば以下のようにして行い得
る。まず、ブタの新鮮なまたはホルマリン等で固定した
白血球、精巣、肝臓、胸腺などの出発物質に、界面活性
剤やプロテイナーゼＫ等により酵素処理を行ないタンパ
ク質を消化した後、フェノール、クロロホルム、イソプ
ロピルアルコールで抽出し、エタノール沈澱により精製
回収してＤＮＡを抽出する。

【００１２】この抽出したＤＮＡをＰＣＲ法により増幅
する。ＰＣＲ法は公知のＤＮＡの増幅法である。このＰ
ＣＲ法に用いるプライマーは以下の通りで、ＤＮＡ合成
機（例えば、ＡＢＩ社製）で合成して用いる。 5'-AAGCGACCCA TGAACGCATT CATCGTGTGGT-3' 5'-GAGGTCGATA CTTATAATTC GGGTATTTCT CTCTGTG-3' ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ量は、テンプレートＤＮＡは１
μｇ程度とし、プライマーＤＮＡは１００ｐｍｏｌ程度
とするのが好ましい。ＰＣＲ法の条件は常法に従うこと
ができる。

【００１３】このようにして得られたＰＣＲ産物をアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、用いたプライマーから推定
される鎖長を有するＤＮＡ断片のみを得る。そして、こ
のＤＮＡ断片を適当なプラスミド等のベクターに挿入す
る（例えば、インビトロージェン社のプラスミドｐＣＲ
１０００など）。続いて、このプラスミドを大腸菌など
の適当な宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体
を適当な抗生物質が入った培地に植えて増殖させる。

【００１４】増殖後、形質転換体の有するプラスミドを
抽出し、陽性クローンを調べる。例えば、プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、挿入ＤＮＡの鎖長を調べ、目
的の長さを持つ挿入ＤＮＡを有するクローンを陽性と判
定することができる。または、精製したＰＣＲ産物を標
識してプローブとし、プラスミドとコロニーハイブリダ
イゼイションを行い陽性を決定することもできる。

【００１５】得られた陽性クローンのプラスミドを適当
な制限酵素で消化して、本発明のＤＮＡを得ることがで
きる。得られたＤＮＡの塩基配列はジデオキシ法に従っ
て決定した。その結果、使用したプライマー部分を除
き、以下の配列を持っていた（配列（Ｉ））。 5'-CTCGTGATCA AAGGAGAAAA GTGGCTCTAG AGAACCCTCA AATGCAAAAC TCAGAGATCA GCAAGTGGCT GGGATGCAAG TGGAAAATGC TTACAGAAGC CGAAAAGCGC CCATTCTTCG AGGAGGCACA GAGGCTACAG GCGGTG-3'(146bp)

【００１６】本発明のＤＮＡプローブは、前記のブタの
ＤＮＡを標識して得られる。標識化は、³²Ｐ、³Ｈ、¹⁴
Ｃ等のような放射性同位元素による標識、ビオチン化等
の化学標識など、公知の種々の標識が適用可能であり、
標識する方法も特に制限されない。

【００１７】さらに、前記配列（Ｉ）のＤＮＡに相補的
なＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれ、これらもま
たＤＮＡプローブとして使用することができる。また、
本発明のＤＮＡプローブとして、本発明のベクターであ
るプラスミド等をニックトランスレーション等により標
識してそのまま用いることもできる。

【００１８】本発明のブタの雌雄判別法は、前述のＤＮ
Ａプローブを用いることを特徴とする。該プローブを用
いて、検体のＤＮＡとハイブリダイゼーションし、ハイ
ブリダイズするものを雄性、ハイブリダイズしないもの
を雌性と判別することができる。

【００１９】ハイブリダイゼーションの方法としては、
上記判別が可能なものであれば特に制限はなく、例え
ば、ドットブロットハイブリダイゼーション法、サザン
ブロットハイブリダイゼーション法、in situ ハイブリ
ダイゼーション法等により行うことができる。

【００２０】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳述するが、本
発明はこれにより何ら制限されるものではない。実施例１雌雄のブタの血液より抽出したＤＮＡを試料としてドッ
トハイブリダイゼーションを行い雌雄判別を行った。（１）プローブの製作ブタ（雄）の末梢血５ｍｌを遠心分離し、白血球画分を
得た。得られた白血球画分をプロテイナーゼＫ、ＲＮａ
ｓｅ及びフェノール・クロロホルムで処理し、エタノー
ル沈澱法で回収、精製した。得られたブタゲノムＤＮＡ
を定量した後、−２０℃で保存した。

【００２１】この抽出したＤＮＡをＰＣＲ法により増幅
した。このＰＣＲ法に用いる２種のプライマーは以下の
通りでＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製）で合成し用いた。 5'-AAGCGACCCA TGAACGCATT CATCGTGTGGT-3' 5'-GAGGTCGATA CTTATAATTC GGGTATTTCT CTCTGTG-3 ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ量は、テンプレートＤＮＡは１
μｇ程度とし、プライマーＤＮＡは１００ｐｍｏｌ程度
とした。これらのＤＮＡをＰＣＲ緩衝液（インニスとゲ
ルファンド（Innis and Gelfand）の方法（Academic Pr
ess Inc.3-12,1990に記載）に従って調製）に最終容量
が１００μｌになるように加えた。２．５ユニットの耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ、シータ
ス社）を加えた後、プログラム式熱コントローラー（Ｍ
Ｊリサーチ社）を用いてＰＣＲ操作を行った。具体的に
は前処理としてディネーチャー工程を９５℃ １０分行
い、次に１サイクルをアニーリング工程５４℃ １
分、イクステンション工程７２℃ ２．５分、ディネー
チャー工程９５℃ １分として３０サイクル行った。

【００２２】このようにして得られたＰＣＲ産物を４％
アガロースゲル（シーケムＭＥ、ＦＭＣ社製）上で電気
泳動にかけて分画し、臭化エチジウム染色を行った（図
１）。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＰＣＲ産
物である。約２５０ｂｐのところにバンディングしてい
るバンドをアガロースゲルより切り出しＤＮＡ断片を抽
出、精製した。

【００２３】次に、インビトロージェン社のＴＡクロー
ニングキットを使用して、該キットのプロトコールに従
い、このＤＮＡ断片のクローニングを行った。まず、こ
のＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した（インビトロージ
ェン社のｐＣＲ１０００、図２）。続いて、このプラス
ミドを宿主（大腸菌）に導入した。宿主を抗生物質（カ
ナマイシン）が入った培地に植えて増殖させた。

【００２４】次に、ＰＣＲ産物より精製したＤＮＡ断片
を、ｒ−³²Ｐ（ＡＴＰ）とＴ₄ポリヌクレオチドキナー
ゼを使用し、３７℃、６０分反応させ、５’末端を³²Ｐ
でラベルし、精製してプローブとした。このプローブを
用いてコロニーハイブリダイゼイション（条件；プレハ
イブリダイゼーション５０℃ １時間、ハイブリダイゼ
ーション５０℃ １晩、洗浄５０℃ １時間で２回）を
行い、ＤＮＡ断片が挿入されているかを調べ、ＤＮＡ断
片挿入陽性クローンを決めた。その結果を図３に示す
が、４３コロニー中３０コロニーが陽性であった。

【００２５】挿入陽性クローンの有するプラスミドをア
ルカリ分解法で抽出し、制限酵素（ＥｃｏＲｌ、Ｈｉｎ
ｄ III）で切断し、４％アガロースゲルで電気泳動（条
件；ミューピッドを使用し、５０Ｖ、９０分）した後、
臭化エチジウムで染色し、紫外線照射（３０２ｎｍ）
下、写真撮影して、切断されたＤＮＡの鎖長を調べ、目
的の長さ（約２５０ｂｐ）を持つ挿入ＤＮＡを有するク
ローンを陽性とした。図４にその結果を示すが、レーン
１は分子量マーカ、レーン２〜７はＤＮＡ断片である。
図４では、レーン２、３、４、７のコロニーが陽性であ
る。

【００２６】得られたＤＮＡの塩基配列はジデオキシ法
に従って決定した。その結果、使用したプライマー部分
及びプライマーから両末端までの部分を除き以下の配列
を持っていた。 5'-CTCGTGATCA AAGGAGAAAA GTGGCTCTAG AGAACCCTCA AATGCAAAAC TCAGAGATCA GCAAGTGGCT GGGATGCAAG TGGAAAATGC TTACAGAAGC CGAAAAGCGC CCATTCTTCG AGGAGGCACA GAGGCTACAG GCGGTG-3'（１４６ｂｐ）このサイズは、電気泳動度から推定される値とほぼ同じ
であった。

【００２７】以上のように配列を決定されたＤＮＡ断片
を有するプラスミドｐＣＲ１０００をニックトランスレ
ーション（条件；〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ使用、１６℃、
１６時間）によって標識し（放射性同位元素：³²Ｐ）プ
ローブとした。

【００２８】（２）ドットブロットハイブリダイゼイシ
ョンブタ（雌雄一頭ずつ）の末梢血５ｍｌを遠心分離し白血
球画分を得た。得られた白血球画分をプロティナーゼ
Ｋ、RNase及びフェノール・クロロホルムで処理し、ＤＮ
Ａを抽出した。得られたブタゲノムＤＮＡを定量した
後、−２０℃で保存した。

【００２９】ブタゲノムＤＮＡをアルカリ変性、熱変性
処理を行った後、ニトロセルロースフィルターに吸着さ
せた。同フィルターをプレハイブリダイゼーション液
（５×ＳＳＰＥ（３．６ＭＮａＣｌ、２００ｍＭＮ
ａＨ₂ＰＯ₄，２０ｍＭＥＤＴＡを含む、ｐＨ７．
４）、５×デンハルト溶液、０．５％ｖ／ｖＳＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム））に７５℃で一時間浸漬するこ
とによって、プレハイブリダイゼーションを行った。続
いて、前述の雄のブタＤＮＡ断片を含むプラスミドを³²
Ｐで標識したプローブと共に一晩ハイブリダイゼーショ
ンを行った。

【００３０】次に、同フィルターを６×ＳＳＣ(Standar
d Saline Citrate)液で一時間洗浄した後、Ｘ線フィル
ム（コニカ社製）に−８０℃で一晩露光させた。図５は
このようにして得られたドットブロットハイブリダイゼ
ーションの結果を示している。本発明で提供したプロー
ブは雄のＤＮＡのみと反応し、雌のＤＮＡとは反応しな
いことが示され、ブタの雌雄判別が可能であることを示
している。

【００３１】

【発明の効果】本発明のブタのＤＮＡは、雄ブタのＤＮ
Ａとのみ反応し、雌ブタのＤＮＡとは反応しないので、
ブタの雌雄を判別するためのプローブとして有用であ
る。

【００３２】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１４６配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源：ブタの末梢血の白血球配列 CTCGTGATCA AAGGAGAAAA GTGGCTCTAG AGAACCCTCA AATGCAAAAC 50 TCAGAGATCA GCAAGTGGCT GGGATGCAAG TGGAAAATGC TTACAGAAGC 100 CGAAAAGCGC CCATTCTTCG AGGAGGCACA GAGGCTACAG GCGGTG 146

【００３３】配列番号：２配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ起源：核酸モノマー配列 AAGCGACCCA TGAACGCATT CATCGTGTGG T 31

【００３４】配列番号：３配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ起源：核酸モノマー配列 GAGGTCGATA CTTATAATTC GGGTATTTCT CTCTGTG 37

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＰＣＲ産物の１０％を４％アガロースゲ
ルで電気泳動した後、臭化エチジウムで染色し、紫外線
（３０２ｎｍ）照射下で撮影した結果を示す図である。
レーン１は分子量マーカーであり、レーン２はＰＣＲ産
物である。

【図２】図２はｐＣＲ１０００プラスミドのクローニン
グサイトを示す図である。

【図３】図３はコロニーハイブリダイゼイションの結果
を示す図である。

【図４】図４は抽出したプラスミドを制限酵素で切断し
４％のアガロースゲルで電気泳動した後、臭化エチジウ
ムで染色し、紫外線（３０２ｎｍ）照射下で撮影した結
果を示す図である。レーン１は分子量マーカーであり、
レーン２〜７はＤＮＡ断片である。

【図５】図５はドットブロットハイブリダイゼーション
分析の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭61−234798（ＪＰ，Ａ) ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．346 ＮＯ. 19（1990）Ｐ．240−244 ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．346 ＮＯ. 19（1990）Ｐ．245ー250

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】雄ブタのＤＮＡを下記のプライマー 5'-AAGCGACCCA TGAACGCATT CATCGTGTGG T-3' および 5'-GAGGTCGATA CTTATAATTC GGGTATTTCT CTCTGTG-3' を用いてＰＣＲ法で増幅して得られることを特徴とする
ブタのＤＮＡ。
【請求項２】次式配列（Ｉ）で示される塩基配列を持
つブタのＤＮＡ。配列（Ｉ） 5'-CTCGTGATCA AAGGAGAAAA GTGGCTCTAG AGAACCCTCA AATGCAAAAC TCAGAGATCA GCAAGTGGCT GGGATGCAAG TGGAAAATGC TTACAGAAGC CGAAAAGCGC CCATTCTTCG AGGAGGCACA GAGGCTACAG GCGGTG-3'
【請求項３】請求項１または２記載のブタのＤＮＡを
含有し、これを標識して得られるＤＮＡプローブ。
【請求項４】請求項１または２記載のブタのＤＮＡを
含有するベクター。
【請求項５】請求項１または２記載のブタのＤＮＡに
相補的なＤＮＡ。
【請求項６】請求項３記載のＤＮＡプローブを用いる
ことを特徴とするブタの雌雄判別法。