KR100441471B1

KR100441471B1 - 돼지의외피색유전자형결정방법

Info

Publication number: KR100441471B1
Application number: KR10-1998-0700721A
Authority: KR
Inventors: 앤더슨 라이프; 요한슨 몰러 마리아; 웨일즈 리차드; 윌리엄 시겐스 케네스; 스튜어트 플라스토우 그래함
Original assignee: 달제티 피엘씨
Priority date: 1995-07-27
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 2004-11-26
Also published as: DK0842296T3; MX9800775A; NZ313686A; US6183955B1; AU6621296A; DE69620413T2; PT842296E; AU726213B2; CN1196755A; JPH11514212A; WO1997005278A1; EP0842296A1; ES2175116T3; CA2227826C; KR19990036056A; EP0842296B1; ATE215610T1; BR9609912A; DE69620413D1; CA2227826A1

Abstract

본 발명은 돼지의 외피 색을 결정하는 유전자형의 측정 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 측정 방법에 사용하기에 적합한 시약을 함유하는 키트를 제공하고 PCR을 기초로 한 방법에 사용할 수 있는 특정 프라이머를 개시한다.

Description

돼지의 외피 색 유전자형 결정 방법

유럽에서 상업적으로 시판되는 돼지의 품종(예를 들면, Large White & Landrace)중에서 가장 눈에 띄는 외피 색은 백색이다. 하지만, 다수의 색과 이들 조합 색을 나타내는 것들로서 상업적으로 의미가 있는 중요 색을 지닌 품종들이 있다. 연한 고기와 관련있는 Duroc 종은 적색이고, Pietrain 종은 마른 뼈대를 가지면서 근육질이 매우 많은 동물로서 얼룩점이 있으며, 다산성의 Chinese Meishan 종은 검은색이다.

돼지의 품종산업에 있어서 외피 색은 다음과 같은 이유로 인해 중요하다. 첫째, 대부분의 시장에서는 백색 외피의 고기를 선호한다. 이는 돼지고기가 흔히 외피가 부착된 상태로 시판되고 있고, 털이 제거된 상태라 하더라도 일정 색을 가진 돼지에서 얻은 외피는 여전히 색이 드러나 보이는 모근을 나타내어 고기의 표면을 모울드에 의해 얼룩져 보이게 하므로 소비자로 하여금 부정적인 반응을 일으키기 때문이다. 그러므로, 이들 시장에서 부가의 비용상승을 불러일으키지 않으면서 도살한 짐승으로부터 외피를 제거하는 것이 필요하다. 예를 들면, 미국에서, 색을 지닌 도살된 고기는 색을 제거하기 위해 탈모와 스키닝을 필요로 하는 약 1%의 외피 결함과 관련이 있다. 그 결과 색이 있는 도살한 돼지고기는 보편적으로 할인된 가격으로 제공된다.

둘째로, 외피 색 이외의 특성에 대해 유전학적으로 일치될 것을 필요로 하는 돼지의 외관(외피 색 범위) 상 커다란 변화는 돼지 생산 소비자의 의식에 동물에 대한 일관성과 품질에 대한 의문을 야기할 수 있다.

또한, 돼지 사육업자들은 번식비율이 일정한 것을 선호하는 입장에 있고 싶어한다. 따라서, 사육업자들은 교배를 통해 품종을 개량하므로써 생산된 자손들이 언제나 백색일 것을 소망할 수 있다. 대안으로서, Pietrain 돼지 사육업자들은 품종 개량 교배가 언제나 특징적인 Pietrain 특징적 색을 확실히 제공하도록 소망할 수 있다. 과거에서 전통적인 동물의 사육에서는 돼지군으로부터 백색이외의 색은 제거하려는 시도들이 있어왔다.

동물이 발색되었는지 또는 바람직한 백색인지 여부를 결정하는 유전자를 (외피 발색의 억제를 위해) I로 명명한다. 임의 색의 발현을 방해하는 유전자형(I)은 색을 나타내도록 하는 유전자(i)에 대해서 우성이다. 백색 동물을 선별하는 종래의 방법은 i의 빈도수를 감소시켰지만, 백색 이형 접합체를 갖는 동물 개체군에 아직도 남아 있다. 이들 동물은 다른 이형 접합체 동물과 함께 교배되어 발색된 자손을 낳을 때에 한하여 식별될 수 있다. 주어진 개체군으로부터 열성 대립유전자를 제거가능하도록 하는 시험 교배의 프로그램만을 통하여 이형 접합체를 식별할 수 있다. 이러한 프로그램은 시간이 많이 소비되고 비용에 비싸므로 원가면에서 볼 때 효율적이지 않다. 따라서, i/i 동물이 불가피하게 얻어질 수밖에 없다.

또한, I^p(1-패치)라 불리는 I의 다른 대립유전자의 존재에 의하여 상황은 더욱 복잡해질 수 있다. I^p대립유전자는 I에 대해서 열성이지만, i에 대해서는 우성이다. 따라서, I^p/I^p또는 I^p/i의 유전자형을 가진 동물은 패치 색들을 나타낼 것이다.

유럽 야생 돼지와 몸집이 큰 백색 품종(스웨덴산 요크셔)간의 교배로부터 탄생된 참조 군을 사용하여, 돼지의 유전자 지도상의 I 유전자의 위치가 결정되었다. 이 유전자는 돼지의 염색체 8에 위치한 것으로서 혈소판 유래의 성장인자의 알파-서브유니트(PDGFRA) 유전자 및 알부민의 유전자에 근접해 있다(Johnasson등, Genomics 14:965-969(1992)). 마우스의 유전자 지도는 마우스의 염색체 5상에 위치한 동일한 영역을 포함한다. 이러한 영역은 마우스의 외피 색을 결정하는 역할을 하는 다수의 유전자, 즉 W(우성: 백색 얼룩점), Ph(패치) 및 Rw(엉덩이 영역이 백색인 것)를 함유한다. 마우스 W 유전자는 KIT 유전자와 함께 위치하는 것으로 알려져 왔고, W 좌위의 몇몇 변이 유전자형은 KIT 유전자 상 구조적인 변화에 의한 것이다(Chabot등, Nature 335:88-89(1988), Geissler등, Cell 55:185-192(1988) 및 Nocka 등, EMBO Journal 9:1805-1813(1990).

본 발명은 외피 색에 대한 돼지의 유전자형을 결정하기 위하여 돼지의 핵산을 스크리닝하는 방법 및 이 방법을 수행하는데 사용되는 키트에 관한 것이다.

도 1은 SSCP 분석 결과를 나타낸다.

본 발명자들은 돼지의 KIT 유전자가 외피 색 결정에 관여한다는 것을 알아냈다. 특히, I 또는 I^p와 i의 차이는 I 또는 I^p대립유전자에서 KIT 유전자 중 적어도 일부의 중복이라는 것을 알아냈다. 이러한 중복결과 KIT 유전자 중 특정 영역의 복사물이 2개 이상 존재할 수 있다.

따라서, 이러한 발견이 대립유전자 I, I^p및 i를 구별지어 외피 색에 있어서 개개의 돼지의 유전자형을 결정하는 방법을 개발하게끔 하였다.

그러므로, 첫 번째 양태로서, 본 발명은 다음을 포함하는 돼지의 외피 색 유전자형 결정 방법을 제공한다:

(i) 돼지의 핵산 샘플을 얻는 단계;

(ii) (i)에서 얻은 핵산을 분석하여 KIT 유전자 중 전부 또는 일부가 중복되어 존재하는지를 결정하는 단계.

KIT 유전자 서열이 중복되어 존재한다는 것은 I 또는 I^p대립유전자 중 어느 하나가 존재한다는 것을 나타낸다. 일부의 돼지 개체군에 있어서, I^p가 적게 존재하거나 또는 존재하지 않는다는 것을 알게 되었다. 이러한 개체군에서, 중복이 존재하느냐 부재하느냐를 결정한다는 것은 특정 돼지의 유전자형에 관한 합당한 신뢰도를 제공하기에 충분하다. 따라서, KIT 유전자(전부 또는 일부)가 중복되어 존재하는지 여부를 간단히 결정함으로써 특정 돼지의 외피 색 유전자형은 상당히 높은 확실성으로 결정될 수 있다.

하지만, 다른 개체군에서, I 및 I^p의 존재를 식별하는 것이 필요하다.

I 및 I^p모두가 KIT 유전자에 중복되어 존재한다 해도, I^p는 아니고 I만이 중복된 영역 중 어느 하나에서 결실을 나타낸다. 따라서. 이러한 것을 근거로 이들 대립유전자들을 서로 구별하는 것이 가능하다.

그러므로, 본 방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다:

(iii) 중복의 존재 여부가 I 또는 I^p존재 때문인지를 결정하는 단계.

적합하게는, 이러한 결정 단계는 중복 영역중 적어도 하나에서 결실부의 존재 또는 부재를 분석하는 것에 의해 수행된다.

바람직하게는, KIT 유전자가 중복되어 존재하는지 여부를 결정하기 위해 돼지 RNA도 분석될 수 있긴 하지만, 본 발명의 방법은 돼지의 게놈 DNA상에서 수행될 것이다.

이 유전자로부터 RNA를 생성하는 데에는 그 DNA 서열의 일부가 중복됨으로 인해 초래되는 많은 효과가 나타날 수 있다. 이들 효과로는 RNA생성의 억제, RNA의 합성 수준의 변경, RNA의 프로세싱 속도론 또는 크기의 변경 또는 동물 몸체를 통한 RNA 생산 분포율의 변경을 포함할 수 있다. 또한 중복의 상위성 효과에 의해 야기된 다른 유전자의 RNA 생산에 대한 효과도 있을 수 있다.

바람직하게는, (ii)단계에서 수행되는 결정방법은 적당한 한쌍의 프라이머를 사용한 PCR 기술을 이용하는 것을 포함한다. PCR 즉, 폴리머라제 연쇄 반응은 널리 사용되어온 방법으로서, 열 안정한 형태의 효소인 DNA 폴리머라제를 사용하면 DNA 분자의 한정된 영역을 시험관내 증폭시킬 수 있다. 증폭될 영역과 인접한 2개의 공지 서열이 선택되고, 이들 영역에 상응하여 합성되는 올리고뉴클레오티드를 프라이밍한다. 프라이머가 동일한 조각의 DNA 상에 충분히 근접하게 위치하면, 이들 사이의 영역이 증폭될 것이다. 폴리머라제 연쇄 반응은 다수의 증폭반응 사이클을 포함한다. 각 사이클은 통상 94℃에서의 변성단계로 시작하며, 여기서 주형 DNA 분자의 2 가닥이 분리된다. 이후, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 주형에 어닐링할 수 있는 온도(통상적으로 50∼60℃)로 온도를 떨어뜨린다. 주형에 비해 고농도로 존재하는 프라이머를 통하여 프라이머는 주형-주형 하이브리드를 형성하기 전에 주형에 어닐링된다. 주형내에서는 DNA의 상보적인 영역에 대해서만 어닐링이 일어나도록 하면서 불완전한 상보성을 갖는 다른 영역에서는 일어나지 않도록 하는 어닐링 온도를 선택한다. 온도를 이후에 72℃로 올리면 여기서 결합된 프라이머를 열안정성 DNA 플리머라제가 연장할 수 있게 되므로 주형에 상보적인 DNA 가닥이 생성된다.

반응의 초기 단계에 있어서, 존재하는 주형이 매 사이클마다 2배로 증폭된다. 이와 같이 새롭게 합성된 가닥 각각은 주형으로서 기능을 할 수 있기 때문에, 정해진 영역에 대응하는 분자는 지수적으로 증가한다. 그러나, 반응의 후기 단계(일반적으로 25 사이클 진행 후)에 있어서는, 반응 성분들(예, 프라이머)의 고갈로 말미암아 지수적인 증폭이 중지되며, 주형 분자의 농도가 증가함으로써 어닐링 단계에서 주형-주형 하이브리드의 형성을 유도한다. 이러한 반응에 있어서, 생성물의 양은 초기에 존재하는 주형의 양에 정비례하지만, 이는 지수적으로 증가하는 경우에만 해당한다. 본 발명에서 설명하는 바와 같은 정량적 실시에 있어서는 수행된사이클의 횟수는 반응이 지수적 반응상을 유지하도록 확실하게 하는 것이 중요하다.

KIT 유전자가 중복되어 존재하는지 여부를 확인하기 위한 여러 가지 방법에서 PCR을 사용할 수 있다. 우선, 프라이머는 i가 아니라 I 또는 I^p에 중복되어 존재하는 KIT 유전자 일부가 증폭에 사용되도록 선택할 수 있다. 이 PCR은 어떤 염색체이든지 하나의 사본에만 존재하는 것으로 알려진 대조 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하는 제2 PCR과 비교된다. 개개의 PCR 반응 생성물 비를 비교하면 KIT 영역이 중복되어 존재함을 추정할 수 있을 것이다. 당해 DNA 영역이 I 또는 I^p에는 두 개의 사본으로 존재하고 i 대립유전자에는 하나의 사본만으로 존재하는 것으로 가정한다면, KIT 생성물 대 대조 생성물의 예상되는 비율은 다음과 같을 것이다:

실제에 있어서, 얻어지는 비율은 일어나는 두 증폭 반응의 반응 속도론의 차이로 인하여 이것과 다를 수 있다.

전술한 방법에 사용하기에 적합한 프라이머 쌍에는 다음과 같은 것이 포함된다.

전술한 바와 같이, 직접적 비교를 통해 증폭 생성물의 비율을 측정할 수 있는 대조 PCR 반응을 포함하는 것이 바람직하다.

돼지 염색체는 단일 사본만을 보유하는 것으로 알려져 있기 때문에 선택된 대조 서열을 참조하여 수행하는 것이 적당하다. 즉, 대조 서열로서 적당한 프라이머를 사용함으로써, PCR 생성물을 형성시키고 정량할 수 있다. 이와 같이 KIT 유전자의 PCR 생성물과의 비교는 중복도 값을 직접적으로 제공한다.

적합한 대조 서열의 일례로는 근육 칼슘 방출 통로 유전자(CRC) 엑손의 일부가 있으며, 적당한 프라이머 쌍은 다음과 같다:

적당한 대조 서열의 다른 예는 돼지 인터페론-β 유전자(Artursson 등,Journal of Iterferon Research12: 153-160(1992))의 일부가 있으며, 적당한 프라이머 쌍은 다음과 같다:

대조 프라이머로서 적당한 다른 서열에는 돼지 뇌하수체 당단백질 호르몬(Kato 등,Journal of Molecular Endocrinology7: 27-34(1991))의 공통 α 서브유닛의 유전자로부터의 영역, 돼지 황체형성 호르몬(Ezashi 등,Journal of Molecular Endocrinology5; 137-146(1990))의 β 서브유닛의 유전자, 또는 다른 단일 사본의 돼지 유전자가 포함된다.

KIT 유전자의 PCR과 대조 서열의 PCR은 돼지 DNA의 단일 샘플 상에서 동시에 수행되는 것이 가장 바람직하다.

KIT 유전자(그 일부 포함)가 임의로 중복되어 존재하는지 여부를 확인하는 제2의 방법은 임의의 중복 영역의 경계에 I 대립유전자에 대해 특이한 뉴클레오티드 서열이 존재할 것이라는 사실에 의존한다. 따라서, 그러한 경계 뉴클레오티드 서열, 또는 연결부에 특이한 프라이머를 사용함으로써 I 대립유전자의 빈도를 측정할 수 있다.

KIT 유전자의 구조를 확인하기 위한 제3의 방법은 중복부의 존부와 밀접하게 관련이 있는 연관 유전자의 다형성을 이용하는 것이다. 그러한 다형성은 KIT 유전자 자체에서 또는 KIT 에 연관된 염색체 영역에서 일어날 수 있다. 중복부의 존부에 전적으로 관련되어 있는 연관된 단일 마커, 또는 부분적으로 관련되어 있는 마커를 병용하여 다량의 정보를 제공하는 테스트를 수행할 수 있다. 예를 들면, SSCP법(단일 가닥 입체구조 다형성: Single Strand Conformation Polymorphism)은 그러한 다형성을 제공하는데 이용할 수 있다. 이 방법의 원리는 PCR에 의해 생산된 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 변성시킨 후 비변성 겔 전기영동법에 의해 분리하는 것이다. 비변성 조건하에서 단일 가닥 DNA는 가닥 내의 상호작용에 의하여 2차 구조를 형성하지만, 단일 가닥 DNA 중 일부는 재생되어 이중 가닥 DNA를 형성할 것이다. 두 유형의 다형성이 이 방법에 의해 나타날 수 있다. 첫째, 두 대립유전자간의 뉴클레오티드 서열의 차이는 전기영동중 이동성의 차이로서 나타나는 단일 가닥 DNA의 2차 구조에 영향을 미칠 수 있다. 둘째, 뉴클레오티드 서열의 차이는 종종 헤테로듀플렉스 DNA(헤테로듀플렉스란, 상이한 대립유전자를 나타내는 2개의 단일 가닥 분자에 의해 형성된 이중 가닥 DNA 분자를 말함)의 이동성에 영향을 미치는 경우가 있다.

중복되는 영역의 사본의 수와 관련하여 KIT 유전자의 구조를 확인하는 제4의 방법은 펄스 장 겔 전기영동(pulsed field gel electroephoresis)을 이용하는 방법이다. 대형 DNA 단편의 크기를 분석할 수 있는 기술인 펄스 장 겔 전기영동을 사용할 수 있다. 본 발명에서 이 방법은 KIT 유전자의 I 대립유전자를 보유하는 동물의 DNA에 중복되어 존재하는 것으로 밝혀진 영역에 인접한 특정 부위에서 게놈성 DNA를 절단하는 제한 엔도뉴클레아제를 이용한다. 이러한 효소에 의해 절단된 게놈성 DNA는 펄스 장 겔 전기영동으로 처리된 후 DNA 결합 막으로 이동된다. 중복되어 존재하는 영역에 특이적인 프로브를 사용하여 겔상의 원래 위치를 확인할 수 있으며, 따라서 적절한 DNA 크기 표준과 비교함으로써 그 단편의 크기를 확인할 수 있다. 동물로부터 유래한 DNA에 KIT 유전자 일부가 중복되어 존재하는 경우, 이 특이 단편은 크기가 증가될 수 있다. 이형 접합성 동물은 2개의 서로 다른 크기의 특이 밴드를 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 그 중 작은 밴드는 비 중복 대립 유전자 i를 나타내는 것이고, 큰 밴드는 중복되어 존재하는 대립유전자 I 또는 I^p를 나타내는 것이다. 이 기술은 또한 중복 단위체 길이에 의해 크기가 더욱 증가한 단편의 존재를 통해 중복된 영역의 2개 이상의 사본을 함유하는 대립유전자를 나타낼 것이다.

본 발명은 또한, 하기 (i) 내지 (iv) 단계를 포함하는 돼지의 외피 색 유전자형 결정 방법을 제공한다:

(i) 돼지 게놈성 DNA 샘플을 얻는 단계;

(ii) 상기 (i)의 게놈성 DNA를 하나 이상의 적합한 프라이머와 하이브리드화시키는 단계;

(iii) 상기 (ii)에서 얻은 하이드리드화된 핵산을 사용하여 1회 이상의 PCR 사이클을 수행하는 단계; 및

(iv) PCR 반응 생성물의 양을 측정하는 단계.

상기 방법은 하기의 단계 (v)를 추가로 포함할 수 있다:

(v) I 또는 I^p의 존재로 인하여 임의의 중복부가 존재하는지 여부를 확인하는 단계.

이 확인 방법은 하나 이상의 중복 영역에 결실부가 존재하는지 여부를 분석함으로써 수행하는 것이 적합하다.

유전자 마커와 특정의 형질과 관련있는 유전자간의 연결은 유전자 재조합에 의해 파괴될 수 있다. 즉, 마커와 당해 유전자간의 물리적 거리가 가까울수록 재조합에 의해 그들이 분리될 가능성이 작을 것이다. 또한 대체 DNA 마커의 특정 대립 유전자와, 특정 형질과 관련되어 있는 것으로 이미 밝혀진 특정 유전자(예를 들면, 본 명세서에서 언급한 KIT 유전자)와 관련되어 있는 것으로 알려진 DNA 마커의 대립유전자를 서로 연결시킬 수 있다. 즉, 이러한 상황에서, KIT 유전자를 취하면, 적어도 단기간에, 대체 8번 염색체 마커의 특정 대립유전자를 선택함으로써 KIT 유전자 관련 마커의 특정 대립유전자를 선택함으로써 간접적으로 특정 외피 색을 가진 돼지를 선택하는 것이 가능하다. 돼지의 염색체 8의 KIT 유전자에 연관되어 있는 것으로 알려진 그러한 마커의 예로서는 KIT 유전자 자체 또는 혈소판 유래의 성장 인자(PDCFRA)의 α 서브유닛 및 알부민과 밀접하게 연관된 유전자에 있는 게놈의 다형성을 포함한다.

KIT 유전자와 관련된 특정 유전자 마커는 미소부수체(microsatellites)이다.이들은 거의 매 50,000개의 염기(단배체 게놈 하나 당 약 60,000개의 미소부수체)에서 게놈 둘레에 실질적으로 무작위적으로 발생하는 4개, 3개 또는 더욱 통상적으로는 2개의 뉴클레오티드의 단순한 서열 반복체이다. 복제되는 동안의 DNA 폴리머라아제의 스터터링(stuttering), 및 재조합되는 동안의 부등 교차는 반복 단위체를 잃거나 얻는 결과를 낳는다고 여겨진다. 이것은 미소부수체가 대개 다형성이며 일정 길이의 반복 대립유전자를 몇 개 가질 수 있다는 것을 의미한다.

연관된 미소부수체 서열의 예로는 S0086(Ellegren등, Genomics, 16:431-439(1993)), S0017(Coppieters 등, Animal Genetics 24:163-170(1993)), Sw527, Swr750 및 SW916(Rhorer 등, Genetics, 136:231-245(1994))를 포함한다. 임의의 상기 마커들 또는 돼지 8번 염색체의 기타 연관된 마커를 사용하여 외피 색과 관련있는 KIT 유전자의 대립유전자를 간접적으로 선택할 수 있을 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 KIT 유전자 DNA 서열 사본 수의 결정에 관한 것이다. 이 목적을 위해, 중복된 KIT 분절을 나타내는 뉴클레오티드 프로브, 또는 그것의 일부 또는 상기한 돼지의 프로브와 충분히 유사한 임의의 기타 뉴클레오티드 프로브를 사용할 수 있다. 예를 들면, 하기한 방법을 사용하여 상기 결정을 수행할 수 있다.

(i) 예를 들어, 마우스(Gokkel 등, Oncogene 7, 1423-1429(1992)) 및/또는 인간(Giebel 등, Oncogene 7, 2207-2217(1992))로부터 KIT 유전자의 DNA의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 뉴클레오티드 프로브, 및 상기 유전자로부터 유도된 RNA를 사용한다. 이러한 프로브는 보존성이 있기 때문에, 돼지의 유전자에 하이브리드화될 것이다.

(ii) 동물의 KIT 단백질의 아미노산 서열이 공지되어 있는 경우, 상기 단백질을 암호화하는 DNA의 가능한 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 일부를 추론할 수 있다. 이를 바탕으로, 혼합된 올리고뉴클레오티드 제조물은 돼지의 KIT 유전자에 대한 프로브로서 사용될 수 있다.

(iii) 상기 KIT 유전자, 예를 들면 v-KIT(Besmer 등, Nature 320:415-421(1986))의 전부 또는 일부와 기능적으로 상동성인 단백질에 대한 단백질 서열(및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열)을 기초로 하여 프로브를 고안할 수 있다.

전술한 바와 같이 유도된 모든 프로브는 서던(Southern), 노던(Nothern) 또는 점 블로팅에 의해 나일론 막(예, Hybond N Amersham Internaional)과 같은 하이브리드화용으로 적당한 매트릭스로 옮겨진 동물 유래의 핵산 제조물을 프로빙하는 데 사용될 수 있다. 매트릭스에 결합된 핵산과 하이브리드하는 KIT 및 대조군 프로브의 양의 비율을 이용하여 KIT 사본수를 측정할 수 있다. 결합된 프로브의 양은 방사능 동위 원소로 상기 프로브를 표지함으로써 정량될 수 있다. 기타의, 비-동위원소 핵산 표지 키트가 유용하며, 이를 사용할 수도 있다.

동물 유래의 핵산을 매트릭스로 하이브리드하는 공정을 역으로 수행하는 것도 가능하다. 이것에서는, 프로브를 매트릭스에 결합시켜서 하이브리드화 프로토콜을 통해 전술한 방식으로 표지된 게놈 DNA 또는 RNA를 포획하는 데 사용함으로써, 상기 결합된 분량을 정량화한다. 만약 상기 조건이 맞는다면, 결합된 양은 KIT의 총량(또는 사본수) 및 존재하는 대조군 핵산 서열과 관련이 있다.

PCR 증폭된 DNA를 정량하는 기타의 방법은 방사능 표지 방법을 포함한다. 일례로는 올리고뉴클레오티드 프라이머중의 하나 또는 둘 다를 방사능 표지하고 그 후, DNA 겔의 방사선 사진의 세기를 측정하여 PCR 생성물내 방사능을 정량화하는 것이다. 대안적인 방법은, 상이한 동위원소로 PCR 반응의 두 생성물에 대한 올리고뉴클레오티드를 차등적으로 표지함으로써 혼입되지 않은 표지된 올리고뉴클레오티드를 침전, 여과, 차등 원심분리 또는 기타의 과정을 통해 제거한 후 각각의 별도 생성물들을 정량하는 것이다. PCR 생성물은 또한 사진 농도계 또는 형광측정계와 병용하여 브롬화 에티듐 또는 SYBR 그린(Molecular Probes, Inc.)와 같은 염료를 사용하여 기타의 염색 과정을 사용함으로써 정량화될 수 있다.

본 특허명세서에 전술한 바와 같이 두 개의 PCR을 동일한 튜브내에서 진행시켜서 두 개의 별도의 생성물을 생성하는, 차등적인 PCR의 생성물을 정량화하는 또 다른 방법은 TaqMan^TM시스템(Perkin Elmer Corp.)을 사용하는 것이다. 이 시스템에서는, 증폭시키고자 하는 영역에 인접한 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 외에, 상기 증폭된 영역에 결합하는 제3의 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 상기 인접한 프라이머들은 표지되지 않은 반면, 상기 프로브는 두 개의 형광성 표지를 보유한다. 상기 프로브의 3' 말단 상에 리포터 염료가 존재하며, 그 형광성은 상기 프로브의 5' 말단에 부착된 별도의 형광단에 의해 잃게된다. PCR동안, 이 프로브는 생성물 DNA 분자에 결합한다. PCR이 진행됨에 따라, 이들 생성물은 주형으로서 사용되며, PCR 동안 치환되면서 Taq DNA 폴리머라제가 상기 프로브 중 5'칭(quenching) 염료를 잘라낸다. 이칭제의 제거는 검출하고자 하는 리포터 염료가 형광성을 나타내도록 한다. 형광강도는 비례적이므로, 생성된 PCR 생성물의 양의 척도가 된다. 반응은 두 개의 분리된 PCR 프라이머 세트 및 두 개의 프로프를 포함할 수 있는 바, 각각은 별도의 게놈 DNA 영역에 상응한다. 이러한 방식으로, 정량 PCR에 대한 상기 표준이 부합하는 한, 각각의 주형 영역의 상대적인 양을 측정할 수 있다.

하이브리드화 과정중의 어떠한 것에서도 단백질 핵산을 사용할 수 있다(PerSeptive Biosystems, Inc., Cambridge. MA).

본 발명의 세 번째 양태에서는 돼지의 외피 색 유전자형을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 하기 (i) 및 (ii) 단계를 포함한다.

(i) 돼지 KIT 단백질의 샘플을 얻는 단계; 및

(ii) (i)단계에서 얻은 단백질을 분석하여 KIT 운전자의 일부 또는 전부가 중복되어 존재하는지 여부를 결정하는 단계.

KIT의 에피토프 또는 관련 단백질에 대한 항체를 사용하여 동물내에 존재하는 c-KIT 단백질의 농도 또는 형태를 웨스턴 블로팅 또는 ELISA 방법으로 결정할 수 있다. ELISA 기술을 통해 결정되는 KIT 유전자의 다양한 대립유전자 및 그 유전자형을 포함하는 상이한 DNA 구조체에 대하여 항체가 생성될 수 있다.

본 발명의 네 번째 양태에서는 돼지 게놈 DNA내 KIT 유전자 서열의 전부 또는 일부가 중복되어 존재하는지 여부를 표시할 수 있는 하나 이상의 시약을 포함하는 돼지의 외피 색 유전자형 결정에 사용되는 키트를 제공한다.

또한 I 및 I^p간의 차이에 관하여 전술한 바로부터, 유전자형을 구별하기 위해 이와같은 차이를 이용할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 결실은 단지 I의 중복된 영역중 하나에서만 (여기서, I는 중복된 영역의 사본을 2개 포함함) 존재하며 i 내에서는 존재하지 않는 것으로 보이므로, 결실은 I의 마커를 제공한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 결실이 발견되며 PCR이 수행되어 결과적으로 두 개의 가능한 크기의 생성물을 얻는 위치의 게놈 DNA 중 어느 한쪽과 하이브리드화 되도록 고안될 수 있다.

4개의 염기 쌍 결실이 존재하는 경우에 수득한 것은 상기 결실이 존재하지 않는 동일한 영역으로부터 얻은 것보다 염기 쌍이 4개 더 짧을 것이다. 이러한 두개의 생성물의 상대적인 양은 전술한 어떠한 방법에 의해서도 결정될 수 있으나, 하나의 바람직한 방법은 올리고뉴클레오티드 프라이머중 하나를 적당한 검출 장치를 구비한 장치 또는 TaqMan 장치(Perkin-Elmer)에서, 전기 영동과 병용하여 형광 염료로 표지시키는 것을 포함한다.

PCR 성분에 관한 이러한 테스트 방법의 한 특정한 잇점은 PCR이 대수 증식기를 지남에 따라 식별력을 손실하는 데에 민감하지 않다는 것이다. 상기 프라이머, 그것의 결합부위 및 생성물은 비결실된 주형 영역 및 결실된 주형영역과 동일하거나 또는 유사하다. 그러므로 이와 달리, 하나의 생성물의 다른 생성물에 대한 생성 속도는 반응의 상이한 단계에서 다양하지 않을 것이다. 주형/주형 하이브리드의 형성이 주형/프라미어 복합체의 형성과 경쟁하기 시작함에 따라, 두가지 하위-반응모두에 동시에 영향을 줄 것이다. 전체적인 결과는 각각의 생성물의 생성 반응 속도론이 매우 유사하다.

단지 I 또는 i만을 포함하며, I^p는 함유하지 않는 돼지의 계통에서, 두 개의 수득된 생성물에 대한 비는, I 대립유전자의 각 사본이 결실된 유전자 및 비결실된 유전자를 동량으로 생성시키는 반면 i는 오직 비결실 생성물만을 생성시킨다는 사실을 바탕으로 한 하기 유전자형과 관련될 수 있다.

[표 1a]

[표 1b]

따라서, 본 발명의 제 5 양태에서 하기 (i) 및 (ii) 단계를 포함하는 돼지의 외피 색 유전자형 결정 방법을 제공한다:

(i) 돼지 핵산 샘플을 얻는 단계; 및

(ii) (i)에서 수득한 핵산을 분석하여 KIT 유전자 서열에 결실이 존재하는지여부를 확인하는 단계.

단순히 결실의 존재 또는 부재를 확인함으로써, I 및 i를 구별할 수 있다. 물론 상기 시험에서 중복되어 존재하는 I^p의 한 사본에 결실이 존재하지 않음으로 인해 I^p가 이러한 시험에서 i를 효과적으로 모방하기 때문에 I^p의 존재는 결과를 복잡하게 한다. 따라서, I^p를 보유하는 계통에서 상기 방법을 사용하면 대립 유전자로서 ii를 보유하는 동물을 오인할 수 있다. 그러나, 상기 방법은 예를 들어 I에 대하여 동종 접합성인 동물이 동정되어야 하는 특정 동물의 육종에서 여전히 사용될 수 있다.

물론, 각 개체의 유전자형은 2개의 생성물을 상이한 비율로 생성시키거나, 또는 단일 생성물 유형을 상이한 양으로 생성시킨다는 것을 또한 인지해야 한다. 따라서, 상기 시험은 또한 생성된 생성물을 정량함으로써 개개 동물의 절대 유전자형을 결정하는 수단을 제공한다. 상기 경우에, 각 시험에서 사용된 DNA의 양은 생성물 양의 차이를 정확하게 측정할 수 있다는 것을 확인할 수 있도록 조절되어야 한다.

측정 단계(ii)는 일반적으로 돼지 게놈 DNA의 샘플에서의 PCR 증폭을 포함하는 것이 바람직하다. PCR 방법에 사용될 수 있는 적절한 프라이머 쌍은 하기를 포함한다:

상기 방법에 접근하는 수 많은 대안적 방법중 하나는 결실의 존재 또는 부재를 통하여 KIT 유전자의 상기 각 영역에 형성되는 독특한 뉴클레오티드 서열에 결합하는 프라이머를 PCR에서 사용하는 것이다. 상기 프라이머는 해당 서열의 존재 하에서만 생성물을 형성하도록 고안할 수 있다. 따라서, 2개의 다른 프라이머 각각이 상이한 형광 표지로 사용되는 경우, 겔 전기이동에 의한 분리는 필요하지 않으며, 각 생성물은 이의 형광성을 기초로 하여 확인한다.

중복의 존재 및 중복된 영역의 2개 이상의 사본을 함유하는 I의 대립유전자가 특정 돼지 종에 존재하는 결실의 사본수에 대해 테스트하는 경우에 수득된 비에 대해 특정 값의 유전에 기초한 예비적인 증거가 존재한다.

이들 가변적인 형태의 I를 갖는 동물 사이의 식별은 중복된 영역의 사본수를 측정하는 것으로부터 얻어진 비와 결실의 존재의 측정으로부터 얻어진 비를 병용하여 강화될 수 있다. 2개 이상의 사본을 보유하는 중복된 버전이 존재한다면 나타낼 수 있는 대립유전자 내의 KIT 유전자의 구조는 하기 표에 나타나 있다.

[표 2]

이들 대립 유전자의 존재로부터 발생되는 가능한 유전자형 및 중복된 영역의 사본에 대한 분석에서 얻어진 각각의 비 및 결실을 함유하는 사본수에 대한 분석에서 얻어진 각각의 비는 다음과 같다:

[표 3a]

[표 3b]

2가지 테스트를 병용할 수 있는 한 방법은 TaqMan(등록상표) 시스템(퍼킨엘머 코오포레이숀)을 이용하는 것이다. TaqMan의 특정 적용에서, 2세트의 PCR 프라이머를 구비한 3가지 프로브를 이용한다. 한 프로브는 상기 프라이머 세트중 한 세트로부터 얻어진 대조용 생성물의 측정을 가능하게 하며, 다른 PCR 프라이머 세트는 결실을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있는 중복 영역의 증폭을 가능하게 한다. 나머지 프로브는 상기 증폭으로부터 얻어진 결실된 생성물 또는 결실되지 않은 생성물중 하나를 검출한다. 얻어진 자료로부터 하기하는 바와 같이 이미 기술한 2가지 별개의 테스트로부터 얻어진 바와 같은 값을 제공하도록 다음과 같이 두가지 계산을 할 수 있다.

A: KIT 유전자 영역의 사본수: 대조 영역의 사본수

[수학식 1]

B: 결실되지 않은 KIT 유전자: 결실된 KIT 유전자

[수학식 2]

본 발명의 각각의 양태의 바람직한 특징은 필요에 따라 적합한 변경을 가하여 각각 다른 양태에 적용할 수 있다.

이하, 본 발명은 하기 실시예에 의해 추가 기술될 것이다. 하기 실시예는 단순히 예시적인 것이며, 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하려는 의도는 없다.

실시예 3은 도 1에 대해 기술한다.

실시예 1

(i)DNA 제조

DNA는 세포 핵을 함유하는 모든 조직 공급원, 예를 들어 백혈구 세포, 모낭, 귀 절흔 및 근육으로부터 제조할 수 있다. 본 명세서에서 약술한 과정은 혈액 세포제조에 관한 것이며; 기타 조직은 K 완충액에 물질을 직접 현탁시킨 후 혈액 제조의 동일한 단계를 진행시켜 유사하게 제조할 수 있다. 본 명세서에서 약술한 과정은 PCR 증폭에 적합한 미정제 DNA를 포함하는 세포 용해물을 생성하는 것이다. 그러나, 정제된 또는 미정제된 DNA를 제조하는 모든 방법은 그 효과가 균등해야만 한다.

혈액은 응집을 방지하기 위해서 50mM EDTA pH 8.0에 수거해 둔다. 혈액 50μℓ를 작은 미소원심분리 관(0.5mℓ 에펜도르프 또는 등가 기구)에 분배하였다. TE 완충액 450μℓ를 첨가하여 적혈구 세포(헴 기는 PCR을 억제함)를 용해(lyse)시키고 혼합물을 2초 동안 와동시켰다. 이어서, 손상을 입지 않은 백혈구 세포 및 남은 적혈구 세포를 미소 원심분리기에서 13,000g로 12초 동안 원심분리하였다. 상등액은 저압 진공 펌프 시스템을 사용하여 조심스럽게 흡인 제거하였다. 추가의 TE 완충액 450μℓ를 첨가하여 남은 적혈구 세포를 용해시키고, 백혈구 세포를 전술한 바와 같이 원심분리시켜 수거하였다. 적색빛이 펠렛에 남아 있는 경우에는, 펠렛이 백색이 될 때까지 상기 과정을 반복하였다. 펠렛화된 백혈구 세포로부터 상등액을 모두 제거한 후에, 단백분해효소 K를 함유하는 K 완충액 100μℓ를 첨가하고 그 혼합물을 2 시간 동안 55℃에서 항온 처리하였다. 이어서, 혼합물을 8분 동안 95-100℃로 가열시키고 DNA 용해물을 필요할 때 까지 -20℃에서 저장하였다.

시약

TE 완충액: 10 mM 트리스-HCl pH 8.0

1 mM EDTA

K 완충액 : 50 mM KCl

10 mM 트리스-HCl pH 8.3

2.5 mM MgCl₂

0.5% Tween 20

용해물에 사용하기 전에, K 완충액 1.0mℓ 당 20mg/mℓ 단백분해효소 K(몰 fp큘라 프로브스 인코오포레이티드) 10μℓ를 첨가하였다.

(ii) PCR

두께가 얇은 0.25mℓ 튜브(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에 다음과 같은 반응물을 첨가하였다:

4.0μℓ의 5μM CRC 순방향 프라이머;

4.0μℓ의 5μM CRC 역방향 프라이머;

4.0μℓ의 5μM KIT1-REV 프라이머;

4.0μℓ의 5μM KIT1-FOR 프라이머;

4.0μℓ의 2mM dNTPs(파마시아);

4.0μℓ의 35mM MgCl₂.

왁스 비드(PCR Gem 50, 퍼킨 엘머)를 첨가한 후, 퍼킨 엘머 9600 가열 순환기내에 튜브를 넣었다. 이어서, 15초간 튜브를 80℃까지 상승시킨 후 4℃로 냉각시켰다. 이어서 제 2 시약 세트를 다음과 같이 튜브에 첨가했다:

4.0μℓ 10x 완충액;

9.6μℓ 무균 탈이온수;

0.4μℓ(0.5 단위)의 AmpliTaq DNA 폴리머라제(퍼킨 엘머);

2μℓ DNA 용해물.

이어서 반응 튜브를, 94℃로 예열된 퍼킨 엘머 9600 가열 순환기에 놓고 PCR을 하기 방식에 따라서 수행하였다:

94℃에서 4분;

94℃에서 30초, 62℃에서 30초 및 72℃에서 30초간의 사이클 20회;

필요할 때까지 0℃.

사이클 횟수는 DNA 공급원으로 사용된 조직에 따라 달라질 수 있다.

KIT 프라이머

순방향 GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCC KIT1-FOR

역방향 CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG KIT1-REV

CRC 프라이머

순방향 CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGT CRC-순방향

역방향 AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC CRC-역방향

역방향 KIT 프라이머 및 순방향 CRC 프라이머의 5'-말단을 ABI 형광 염료 FAM으로 표지하였다.

(iii) DNA 단편의 전기영동 및 정량

1μℓ의 PCR을 2.5μℓ의 탈이온 포름아미드, 0.5μℓ의 GS350 DNA 기준물, 0.4μℓ의 청색 덱스트란 용액과 혼합하고, 2분동안 90℃에서 가열한 후, 얼음으로급냉시켰다. 이 혼합물 3μℓ을 AB1373 DNA 서열기상에 올려놓고 DNA 단편들을 700V, 40mA, 32W하에 2시간동안 1 x TBE 완충액중의 6% 폴리아크릴아미드 겔중에서 분리시켰다. KIT 및 CRC 유전자의 생성물에 상응하는 단편들은 진스캔 소프트웨어를 사용하여 정량하고, 각 밴드의 피크 영역을 측정하였다.

(iv) 결과

표 4a 및 4b에 제시된 데이터는, 각 23마리의 동물로부터 DNA 용해물을 만들어, 각 용매물을 대상으로 2회의 PCT 테스트를 수행하는 실험을 통해 구한 결과이다. KIT 피크 영역 대 CRC 피크 영역의 비는, 동일 동물의 샘플에서 구한 각 PCR 및 평균값으로부터 계산하였다.

[표 4a]

[표 4b]

이 실험에서 다른 유전자형 II, Ii 및 ii을 가진 동물로부터 구한 비 값의 상한치 및 하한치는 다음과 같다:

이들 결과는, 상기 테스트를 사용한데 따른 유전자형의 차별화를 나타낸 것이다.

실시예 2

제 2 테스트에서는, 중복체의 한쪽 단부(또는 중복된 영역이 나머지 유전자에 대해 역방향인 경우, 또는 중복된 영역이 비-중복된 영역과 직렬로 존재하지 않는 경우에는 양쪽 단부)에 존재하는 DNA의 독특한 서열을 이용한다. PCR에 사용되는 올리고누클레오티드 프라이머는, PCR 과정에 사용된 어닐링 온도하에서 이들이중복된 영역의 단부중 접합 영역에만 어닐링 되도록 고안한다. 이어서 PCR은 2 쌍의 올리고누클레오티드를 사용하여 수행한다. 한쌍은 접합 영역에 걸쳐 존재하는 상기 언급된 프라이머와, I 대립 유전자-함유 중복부로부터만 증식이 이루어지는 제 2 프라이머가 적당한 거리를 두고 구성한다. 제 2 쌍의 프라이머는, 반수체 게놈중의 단일 사본으로서만 존재하는 일정 서열을 증식시킬 수 있다. 동일 튜브내에서 이루어지는 이 반응의 생성물은, 이전의 테스트에서와 같이 내부 기준으로서 작용한다. 접합 영역에 특이성을 가진 반응으로부터 나온 생성물의 비는, 단일 사본의 대조 서열로부터 나온 생성물과 비교하여 구한다.

이 테스트에서는, 다른 유전자형으로부터 나온 생성물의 예상되는 비율간에 더 큰 차이가 있다. 생성물의 상대적 수준 및 이들의 비율은 후술되는 바와 같다:

이와 같이 비가 큰 경우에는, 다른 유전자형에서 산출된 결과 범위간의 차이가 크며, 따라서 동물을 잘못 판정할 위험이 줄어든다.

실시예 3

(i) DNA 제조

DNA는 실시예 1에서와 같이 제조할 수 있다.

(ii) PCR

2.0μℓ 5mMKITDEL2-FOR 프라이머;

2.0μℓ 5mMKITDEL2-REV 프라이머;

1.0μℓ 2mM dNTPs(파마시아);

1.2μℓ의 25mL MgCl₂;

2.0μℓ의 10x 완충물(MgCl₂부재)

0.1μℓ(0.5 단위) AmpliTag DNA 폴리머라제(퍼킨 엘머);

2.0μℓ DNA 용해물.

9.7μℓ 무균 탈이온수.

이어서 반응 튜브를 퍼킨 엘머 9600 가열 순환기에 놓고 PCR을 하기 방식에 따라서 수행하였다:

95℃에서 1분;

95℃에서 15초, 50℃에서 20초, 및 72℃에서 40초간의 사이클 3회;

94℃에서 15초, 50℃에서 20초 및 72℃에서 50초간의 사이클 27회;

72℃에서 5분;

필요할 때까지 4℃.

사이클 횟수는 DNA 공급원으로서 사용된 조직에 따라 달라질 수 있다.

KIT 프라이머

순방향 프라이머 GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGATKITDEL2-FOR

역방향 프라이머 AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAGKITDEL2-REV

(iii) 전기 영동법

PCR 생성물 1μℓ를 적재용 완충액(95% 탈이온 포름아미드, 10mM NaOH, 20mM EDTA, 0.05% 브로모페놀블루, 0.05% 크실렌-시아놀)과 혼합하고, 3분동안 95℃로 가열한 후, 얼음으로 급냉시켰다. 이어서, 샘플을, 1 x TBE 완충액(89mM 트리스, 89mM 붕산, 2m EDTA.Na₂)중의 8%의 천연 폴리아크릴아미드 겔(프로토겔, 37.5:1 아크릴아미드:비스아크릴아미드, 내쇼날 다이아그노스틱스, 아틀란타)에 적재시켰다. DNA 단편은, 4.5시간 동안 6W하에 0.6×TBE을 작용 완충액으로 사용하고 온도는 20℃로 유지시킨 상태로 수직 슬랩 겔(SE600 회퍼 사이언티픽 인스트루먼츠, 센 프란시스코)에서 전기영동법을 통해 분리하였다.

(iv) 은 발색에 의한 DNA 단편의 가시화

전기영동 후에 겔을 서서히 교반하면서 고정 용액중에서 20분간 항온처리하거나 또는 트랙킹 염료가 더 이상 보이지 않을 때까지 항온처리하였다. 겔을 탈이온수중에서 3회(교반하면서 각각 2분씩) 세척하였다. 이어서, 겔을 교반하면서 염색 용액중에서 40분간 항온처리한 다음, 탈이온수중에서 간단히 (5 내지 10초) 세척하고, 현상 용액으로 곧장 옮겼다. 겔을 현상 용액 중에서 밴드가 명확히 보일 때까지 항온처리한 다음, 동량의 고정 용액을 첨가함으로써 현상을 종료하였다. 최종적으로, 겔을 탈이온수중에서 2분간 세척하였다.

반응시약

고정 용액: 탈이온수 중의 10% 빙초산

염색 용액: 2g 질산은(AgNO₃)

3ml의 37% 포름알데히드

2리터의 탈이온수

현상 용액: 2리터의 탈이온수중에 용해된 60g의 탄산나트륨(Na₂CO₃).

사용하기 직전에 3ml의 37% 포름알데히드와 400ml의 나트륨

티오설페이트(10mg/ml)를 첨가함. 이 용액은 10 내지 12℃의 온도에 두어야한다.

(v) 결과

SSCP 분석법은 지금까지 우성 백색 표현형(도 1)을 지닌 동물에서만 발견되었던 다형태성 정보를 알려준다. 레인 1 내지 8 분석은 우성 백색을 지닌 Swedish Landrace 돼지에서 유래한 DNA에서 수행하였고, 레인 9 및 10의 DNA는 야생형 색깔의 야생 돼지에서 유래하였다. 다형태성 밴드가 표시되었다. 다형태성은 중복된 KIT 대립 유전자형 I을 지닌 동물에서만 존재하는 두 개의 독특한 단편에 의해 특징지워진다. 이 단편들은 상기 중복된 것과 중복되지 않은 KIT 유전자의 사본을 나타내는 다른 길이의 PCR 산물에서 유래한 DNA 가닥의 이종이본체를 나타낸다. 큰 백색 돼지/야생 돼지 이종교배에서 유래한 5가지 품종, 190마리의 F2 동물로 대표되는 40마리의 비연관 동물을 사용하는 상기 마커를 이용한 선별 시험의 결과는 하기 표 5에 제시하였다.

상기 결과는 특정 다형태성이 KIT 중복체의 존재와 매우 밀접하게 연결되어 있음을 나타낸다. 일부 백색 동물이 이종이본체 패턴을 나타내지 않는 것처럼 중복과 완전히 연관된 것은 아니다. 따라서, 다형태성은 밀접하게 연관된 유전 마커의 예이며, 그 자체 또는 다른 연관된 마커와 병용하여 상기 마커는 우성 백색 외피색으로 간주되는 유전자형을 차별화하는데에 사용할 수 있다.

[표 5]

실시예 4

i) DNA 추출

DNA는 실시예 1에서와 같이 제조하였다.

ii) PCR

두께가 얇은 0.25ml 반응 튜브(퍼킨 엘머)에 하기 반응물들을 첨가하였다:

0.5ml 5μMKITDEL1-FOR 프라이머

0.5ml 5μMKITDEL1-REV 프라이머

1.0ml 2mM dNTPs (파마시아)

1.0ml 15mM MgCl₂

1.0ml 10X 완충액

4.9ml 멸균 증류수

0.1ml 앰플리택 DNA 폴리머라제

1.0ml DNA 용해물

그 다음, 반응 튜브를 퍼킨 엘머 9600 가열 순환기에 놓고 하기 규정에 따라 PCR을 수행하였다.

94℃ 4분;

94℃ 30초, 60℃ 30초의 사이클, 및 72℃ 30초간의 사이클 21회;

72℃ 4분;

필요할때까지 4℃.

사용된 사이클의 횟수는 DNA 공급원으로서 사용된 조직에 따라 달라질 수 있다.

프라이머

순방향 TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGGKITDEL1-FOR

역방향 CCAGCAGGACAATGGGAACATCTKITDEL1-REV

역방향 프라이머의 5' 말단을 ABI 형광염료 FAM으로 표지하였다.

iii) DNA 단편의 전기영동 및 정량

1μℓ의 PCR를 1.5μℓ의 탈이온화 포름아미드, 0.25μℓ의 GS350 DNA 기준물, 0.25μℓ 적재 완충액(50mg/ml 청색 덱스트란, 25mM EDTA)와 함께 혼합하고, 90℃에서 2분간 가열한 다음, 얼음으로 급랭시켰다. 이어서, 1.75μℓ의 상기 반응물을 ABI 377DNA 서열기상에 적재하고 DNA 단편을 3000V, 60mA, 200W 및 48℃ 조건하에서 두시간 동안 1x TBE 완충액 중 4.12% 폴리아크릴아미드겔상에서 분리시켰다. 각각 결실부가 없는 KIT 유전자 주형과 결실부가 있는 KIT 유전자 주형에서 유래한 산물에 상응하는 97bp 및 93bp 단편을 GeneScan 소프트웨어를 사용하여 정량하여, 각 밴드의 피크 영역을 측정하였다.

결과

하기 표에 제시된 데이터는 실험으로부터 산출된 결과를 나타내며, 여기서 DNA 용해물은 공지의 유전자형인 20마리 동물 각각에서 생성되었으며, 각각의 용해물 상에서 수행된 하나의 PCR 시험을 수행하였다. 4개의 염기 쌍 결실부를 함유하지 않는 DNA 주형 : 결실부를 함유한 DNA 주형에서 유래한 생성물의 피크 영역의 비율을 계산하였다.

[표 6a]

[표 6b]

상기 작은 샘플의 경우, 각 유전자형에 대해 예상된 비율값(Ii에 대해서는예상 비율이 2이고, II에 대해서는 1임) 사이의 중간인 수치 1.5는 동물을 두 개의 유전자형으로 채점하기 위한 분리 선으로 사용하였다. 상기 표를 통해 7/10 II와 9/10 Ii가 정확한 유전자형으로서 식별되었다.

Claims

(i) 돼지 핵산 샘플을 얻는 단계; 및

(ii) 상기 단계 (i)에서 얻은 핵산을 분석하여 KIT 유전자 전부 또는 일부가 중복되어 존재하는지를 결정하는 단계를 포함하는 돼지의 외피 색 유전자형 결정 방법.
제1항에 있어서, 상기 돼지 핵산은 게놈 DNA인 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (ii)는 1회 이상의 PCR 사이클과 다음과 같은 한쌍의 적합한 프라이머를 사용하여 KIT 유전자의 최소한 일부를 증폭시키는 것을 포함하는 것인 방법 :
제3항에 있어서, 상기 PCR의 생성물 양이 정량되는 것인 결정 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 한쌍의 프라이머는 KIT 유전자의 경계에 위치하는 고유 영역 및 중복 영역에 하이브리드화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 결정 방법은 내부 표준물과의 비교 단계를 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 내부 표준물은 한쌍의 적합한 프라이머를 사용하는 1회 이상의 PCR 사이클에 의하여 다른 뉴클레오티드 서열의 최소한 일부를 증폭시킴으로써 얻어지는 것인 결정 방법.
제7항에 있어서, 상기 내부 표준 PCR 생성물의 양이 정량되는 것인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 내부 표준 PCR 생성물은 근육의 칼슘 방출통로(CRC) 유전자의 서열 중 최소한 일부를 증폭시킴으로써 얻어지는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 내부 표준 PCR 반응에 다음과 같은 프라이머 쌍이 사용되는 것인 방법 :
제9항에 있어서, 상기 내부 표준 PCR 반응에 다음과 같은 프라이머 쌍이 사용되는 것인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 내부 표준 PCR 반응은 KIT 서열의 증폭과 동시에 수행되는 것인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 KIT 영역의 사본 : 내부 표준 영역의 사본의 비율이 측정되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (iii) 존재하는 임의의 중복부가I 또는 I^p가 존재함으로 인한 것인지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 중복 영역에 결실부가 존재하는지 여부를 결정하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 비결실 영역의 사본 : 결실 영역의 사본의 비율을 측정하는 것인 방법.
(i) 돼지 KIT 단백질의 샘플을 얻는 단계; 및

(ii) 단계 (i)에서 얻은 단백질을 분석하여 KIT 유전자의 전부 또는 일부가 중복되어 존재하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 외피 색 유전자형 결정방법.
제 17항에 있어서, 상기 단계 (ii)는 상기 단백질과 하나 이상의 항체를 반응시킴으로써 수행되는 결정 방법으로서, 상기 항체는 KIT 또는 관련 단백질의 에피토프, 또는 KIT 유전자의 다양한 대립 유전자 및 유전자형을 포함하는 상이한 DNA 구조체에 대하여 생성된 항체인 것인 방법.
제 18항에 있어서, 상기 방법은 ELISA인 것인 방법.
KIT 서열의 전부 또는 그 일부가 중복되어 존재함을 나타낼 수 있는 1종 이상의 시약을 함유하는, 돼지의 외피 색 유전자형 결정에 사용되는 키트로서, 상기 시약은 I 또는 I^p에는 중복 존재하나 i에는 중복 존재하지 않는 KIT 유전자의 일부를 증폭시키도록 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머이거나, 또는 KIT 또는 관련 단백질의 에피토프, 또는 KIT 유전자의 다양한 대립 유전자 및 유전자형을 포함하는 상이한 DNA 구조체에 대하여 생성된 항체인 것인 키트.
제20항에 있어서, 상기 키트는 돼지의 게놈 DNA 샘플이 사용될 수 있도록 맞춰진 것인 키트.
제20항 또는 제21항에 있어서, 다음과 같은 한쌍 이상의 프라이머와 함께PCR을 수행하기 위한 시약을 포함하는 것인 키트 :
제22항에 있어서, 상기 한쌍의 프라이머는 KIT 유전자의 경계에 위치한 고유 영역 및 중복 영역에 하이브리드화되는 것인 키트.
제21항에 있어서, 1회 이상의 PCR 사이클에 의하여 다른 뉴클레오티드 서열의 최소한 일부를 증폭시키는 다음과 같은 서열을 가진 제2의 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 것인 키트 :
제24항에 있어서, 상기 제2의 프라이머 쌍은 근육의 칼슘 방출 통로(CRC) 유전자 서열의 최소한 일부에 하이브리드화되는 것인 키트.
제24항에 있어서, 상기 제2의 프라이머 쌍은 돼지 인터페론-β 유전자 서열의 최소한 일부에 하이브리드화되는 것인 키트.
제26항에 있어서, 제2의 프라이머 쌍은 다음과 같은 서열을 가진 것인 키트:
제20항에 있어서, KIT 단백질과 반응할 수 있는 하나 이상의 항체를 함유하는 키트로서, 상기 항체는 KIT 또는 관련 단백질의 에피토프, 또는 KIT 유전자의 다양한 대립 유전자 및 유전자형을 포함하는 상이한 DNA 구조체에 대하여 생성된 항체인 것인 방법.
(i) 돼지 핵산 샘플을 얻는 단계: 및

(ii) 단계 (i)에서 얻은 핵산을 분석하여 KIT 유전자 서열내 결실부가 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 돼지의 외피 색 유전자형 결정 방법.
제29항에 있어서, 상기 돼지 핵산은 게놈 DNA인 것인 결정 방법.
제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 단계 (ii)는 1회 이상의 PCR 사이클과 다음과 같은 한쌍의 적합한 프라이머에 의하여 KIT 유전자의 최소한 일부를 증폭시키는 것을 포함하는 것인 방법 :
제29항 또는 제30항에 있어서, I와 i를 구별하는 데 사용되는 것인 방법.
KIT 서열내의 결실부가 존재하는지 여부를 나타낼 수 있는 1종 이상의 시약을 함유하는, 돼지의 외피 색 유전자형 결정에 사용되는 키트로서, 상기 시약은 결실부가 발견된 위치중 어느 한쪽의 게놈 DNA에 혼성화되도록 디자인되어 PCR을 수행함으로써 2가지의 가능한 크기를 갖는 생성물을 얻을 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머이거나, 또는 KIT 또는 관련 단백질의 에피토프, 또는 KIT 유전자의 다양한 대립 유전자 및 유전자형을 포함하는 상이한 DNA 구조체에 대하여 생성된 항체인 것인 키트.
제33항에 있어서, 키트가 돼지의 게놈 DNA 샘플이 사용될 수 있도록 맞춰진것인 키트.
제33항 또는 제34항에 있어서, 다음과 같은 한쌍 이상의 프라이머와 함께 PCR을 수행할 수 있는 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트 :