KR100721232B1 - 대한민국내 주요 돼지 품종의 순종 식별을 위한 품종특이DNA marker의 활용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우리나라에서 사육되고 있는 돼지 5품종의 구별을 가능하게 하기 위한 것으로써, 돼지 5품종 중 Large White, Landrace, Duroc 품종을 판별하기 위한 방법에 관한 것이다.

이를 위하여 본 발명은, 현재 알려져 있는 KIT 과 돼지 내의 모색과 밀접한 연관성이 있는 MC1R 그리고 mitrochondria DNA상에서 종 특이적인 현상을 보이는 D-loop 지역의 11-bp 중복과 ND2 유전자의 개시codon 변이를 이용하였다. 품종간의 판별을 위해 KIT 유전자 exon17의 splicing 지역 변이를 활용하여 백색종과 유색종을 분류 하였다. MC1R 유전자의 (N121D) 변이를 이용하여 유색종들로부터 Duroc 종이 분류되었다. 그러나 Duroc 이외의 유색종들 간에는 특이한 변이가 발견되지 않아 이 이상의 분류는 불가능 하였다. D-loop 지역의 11-bp 중복현상과 ND2 개시codon의 변이에 의해 백색종인 Landrace(11-bP비중복과 ATT)종과 Large White(11bp중복과 ATA)종을 분류할 수 있었다. 결론적으로 본 발명에서 설정된 판별방법을 통하여 Landrace, Large White와 Duroc종의 순종 판별이 완벽히 가능함을 입증하였다.

동정, 품종, MC1R, KIT, D-loop, 11-bp 중복, ND2, 선택적 개시codon

Description

대한민국내 주요 돼지 품종의 순종 식별을 위한 품종특이 DNA marker의 활용{Application of breed-specific DNA markers for the use of identifying major pure pig breeds maintaining in Korea}

도 1은 본 발명에서 구상한 돼지 품종의 판별 방법을 위한 대표도면이다. KIT exon17의 splicing 지역 변이를 이용하여 유·백색종을 분류하고, 유색종에서 MC1R N121D 변이를 이용하여 Duroc 품종을 분류하였다. 또한 mtDNA의 D-loop지역 내 11-bp 중복현상과 ND2의 개시codon의 변이를 이용하여 백색종인 Landrace와 Yorkshire를 분류하였다.

도 2는 KIT exon17의 splicing 지역 변이를 이용하여 유·백색을 분류한 것이다.

도 3은 MC1R N121D 변이를 이용한 Duroc 품종의 분류이다.

도 4는 mtDNA의 D-loop지역 내 11-bp 중복현상을 이용한 Landrace와 Yorkshire의 분류이다.

도 5는 ND2의 개시codon의 변이를 이용한 Landrace와 Yorkshire의 분류이다.

우리나라의 양돈업에서는 일반적으로 Duroc, Landrace, Large White 품종이 있으며, 이러한 순종이 적절하게 교잡되어 만들어진 잡종들이 일반비육돈으로 생산된다. 종돈개량을 위하여 국내 종돈 소요량의 40%를 공급할 목적으로 1996년 7개 전문종돈업체 육성이 추진되었고 현재까지 5개 전문 종돈업체를 중심으로 종돈 개량에 노력하고 있으며, 이들 전문 종돈업체 육성의 성공을 위하여 매년 사후관리를 실시하고 있다. 우수한 교배조합에 의한 비육돈 생산라인을 유지하기 위해서는 정확한 혈통을 바탕으로 순수혈통을 유지하고 균일한 순종돈을 공급할 수 있는 기반을 유지할 수 있어야 한다. 또한 표현형에 의한 종돈선발의 오류를 보완할 수 있는 유전표지인자를 이용한 품종식별 기술을 종돈장에 도입하는 것이 필요하다.

돼지의 품종구별은 일반적으로 외형적 특징인 모색이나 체형 등의 표현형을 토대로 이루어진다. 하지만 표현형으로 구별되는 돼지 품종이라 할지라도 도축 후 육의 형태로 전환되면 돼지의 품종식별은 거의 불가능하게 된다. 또한 육질개선 등을 위한 3원 교잡종 등의 F₂를 생산하는 현 육종체계에서 교잡에 사용된 종돈의 신뢰성 등 종돈으로써 고유한 특성의 보존이 문제시 되고 있다. 이러한 문제점들의 발생을 제거하기 위하여 돼지의 품종을 명확히 구분할 수 있는 DNA marker의 선정과 활용이 필요하다고 사료된다.

현재 돼지에서 나타나는 품종 특이적인 DNA marker를 개발하기 위하여 genomic DNA와 mitochondrial DNA (mtDNA) 내에 존재하는 여러 유전자들을 대상으로 활발하게 이루어지고 있다. Genomic DNA 상에 위치하는 모색관련 유전자중 KIT은 돼지의 우성백색과 유색을 조절하는 유전자이며, 이 유전자의 exon17과 intron17 사이에서 나타나는 splicing 변이와 밀접한 관련이 있다(Marklund, S. et al., Genome Res., 8:826-833, 1998). 우성백색 유전자 I는 대립유전자 I^P 와 i 에 대하여 완전 우성으로써 Landrace와 Large White는 I를 하나 이상 소유하고 있고(I/I, I/I^P , 혹은 I/i.) 백색모를 나타내게 된다(Marklund, S. et al., Genome Res., 8:826-833, 1998). 국내에서 가장 많이 사육되고 있는 착색모 품종인 Duroc은 i/i이며, 이외에 Berkshire와 Hampshire의 경우도 i/i로 추정되고 있다(Marklund, S. et al., Genome Res., 8:826-833, 1998).

포유류의 모색은 melanocyte내의 eumelanin과 phaeomelanin의 상대적인 양, 정도, 분포에 의해 조절된다고 보고되어 있다 (Evert, R.E. et al., Anim. Genet., 31:194-199, 2000). 돼지의 6번 염색체 단완의 Extension 모색 좌위(E locus)에 의해 암호화되어 있는 MC1R(melanocortin receptor 1)은 melanocyte 내 eumelanin(black/brown)과 phaeomelanin(red/yellow)의 합성과정에서 중심적인 역할을 수행한다(Kijas, J.M.H. et al., Genetics, 150:1177-1185, 1998; Pielberg, G. et al., Genetics, 160:305-311, 2002). 돼지 MC1R과 연관된 Extension의 대립유전자는 5가지(E, E ^D1, E ^P, E ^D2, e)로 분류되며, MC1R 유전자형 1/1, 2/2, 3/3, 3/4, 4/4는 Extension 유전자형 E ⁺/E ⁺, E ^D1/E ^D1, E ^P/E ^P, E ^D2/E ^D2 그리고 e/e와 각각 밀접하게 연관되어 있다(Kijas, J.M.H. et al., Genetics, 150:1177-1185, 1998). 이와 연관하여 유럽의 야생돼지는 E, Large White와 Pietrain은 E ^P, Large Black과 Meishan은 E ^D1, Hampshire는 E ^D2 대립유전자를 갖고 있는 것으로 보고 되었다 (Kijas, J.M.H. et al., Genetics, 150:1177-1185, 1998). 결과적으로 genomic DNA 상에 위치하는 KIT와 MC1R에서 나타나는 특이적인 유전자형은 돼지의 품종구분을 위한 DNA marker로서 충분히 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

Mitochondria DNA(MtDNA)는 모계유전의 특징을 보이며 (Giles, R.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 77:6715-6719, 1980; Kavar, T. et al., Anim. Genet., 30:102-105, 1999) 단일복제 핵 DNA에 비해 10배 이상 빠른 염기 치환율을 보이기 때문에 (Brown, W.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76:1967-1971, 1979; Wilson, A.C. et al., Biol. J. Linn. Soc., 26:375-400, 1985; Avise, J.C., Philos. Trans. R. Soc. Lond., B 312:325-342, 1986) DNA Polymorphism에 근거한 종간의 분석뿐만 아니라, 종래 계통 및 개체간의 식별에도 유용하게 사용되고 있다(Bowling, A.T. et al., Anim. Genet., 31:1-7, 2000; Irwin, D.M. et al., J. Mol. Evol. 32:128-144, 1991; Kim, K.I. et al., Anim. Genet. 33:19-25, 2002). 특히 mtDNA 내에 존재하는 D-loop 지역에서 Large white와 일부 Duroc종의 경우 11-bp가 중복되는 종 특이적인 현상이 보고되었다 (조인철, 경상대학교 박사학위논문, 2004). 또한 Nucleotide dehydrogenase 2(ND2)등 일부 유전자들은 변형된 개시codon인 ATA와 ATT를 사용하고 있으므로, 이 들 또한 종 특이적 양상을 보이는 것으로 밝혀졌다 (조인철, 경상대학교 박사학위논문, 2004).

따라서, 본 발명은 기존에 보고 되어 있는 돼지의 품종 특이 DNA marker, 예를들어 모색 연관 유전자인 KIT, MC1R과 mtDNA 에서 나타나는 품종 특이적인 특징들을 종합적으로 활용하여 현재 국내에서 가장 많이 사육되고 있는 주요품종들의 확실한 순종판별 방법의 정립을 목적으로 실시하였다.

기존에 보고 되어 있는 돼지의 품종 특이 DNA marker, 예를 들어 모색 연관 유전자인 KIT, MC1R과 mtDNA 에서 나타나는 품종 특이적인 특징들을 종합적으로 활용하여 현재 국내에서 가장 많이 사육되고 있는 주요품종들의 확실한 순종판별 방 법을 정립하고자 하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 Landrace 20두, Large White 20두, Duroc 20두, Hampshire 14두, 그리고 Berkshire 12두로부터 채취한 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계; 돼지의 KIT 지역을 증폭하기위한 Primer를 제작하여 증폭하는 단계; 돼지의 MC1R 지역을 증폭하기위한 Primer를 제작하여 증폭하는 단계; 돼지의 D-loop 지역을 증폭하기위한 Primer를 제작하여 증폭하는 단계; 돼지의 개시codon을 달리하는 ND2 유전자 증폭을 위한 Primer를 제작하여 증폭하는 단계; DNA로부터 증폭된 각 PCR product에 제한효소를 처리하여 절단하는 단계; Blind Test에 의한 품종간의 판별 가능성 제시 단계로 구성된다.

제1단계. 돼지 혈액으로부터 DNA 추출

본 발명에서 사용한 돼지의 genomic DNA는 제주난지농업연구소에서 제공받은 Landrace 20두, Large White 20두, Duroc 20두, Hampshire 14두, 그리고 Berkshire 12두의 혈액에서 추출하였으며, 추출 시 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, USA)를 사용하였다.
제2단계. 돼지의 KIT 지역을 증폭하기위한 Primer 제작 및 증폭

Marklund 등(1998)에 의해서 보고된 KIT의 exon 17번에서 발생하는alternative splicing 지역을 증폭하기 위하여 제작된 primer는 서열번호 1과 2에서 제시된 KIT21(5'-GTA TTC ACA GAG ACT TGG CGG C-3')와 KIT35(5'-AAA CCT GCA AGG AAA ATC CTT CAC GG-3')이다. PCR 반응은 genomic DNA 30 ng, 10×buffer(TaKaRa, Japan) 2.5㎕, 0.2 mM dNTP, 10 pmol primer 각각 1.5㎕, Taq DNA polymerase(TaKaRa, Japan) 2 unit, 증류수 14.8㎕를 첨가하여 전체 25㎕의 반응액을 제조하였으며, PCR 반응조건은 94℃에서 2분간 변성시킨 후 94℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 45초를 1 cycle로 하여 35회 반복하였다. 그 후 72℃에서 5 분간 신장시킨 후 4℃에서 종료하였다. 증폭된 PCR 산물은 2% 아가로스 겔 상에서 반응유무를 확인하였다.

제3단계. 돼지의 MC1R 지역을 증폭하기위한 Primer 제작 및 증폭

기존에 보고된 연구결과(조 등, 2004)를 바탕으로 돼지 MC1R의 N121D 변이지역을 증폭하기 위하여 2 쌍의 primer를 제작하였다. 1차 PCR은 MC1R의 전체 coding 지역을 증폭하기 위한 것으로 서열번호 3과 4에 제시된 primer인 MC1R 1F(5'-GAT GCC CGT GCT TGG CCC GG-3')와 MC1R 1R(5'-CTC ACC AGG AGC ACT GCA GC-3')을 사용하였다. 2차 PCR은 1차 PCR에 의해서 증폭된 MC1R 전체 coding 지역에서 일부 지역을 증폭하기 위한 것으로 서열번호 5와 6에 제시된 primer인 MC1R 4F(5'-GTG AGC GTG AGC AAC GTG CTG GA-3')와 MC1R 4R(5'-CAG CAT GTG GAC GTA CAG TAC-3')을 사용하였다. 1차 PCR 반응은 KIT 지역 증폭과 동일하게 수행하였으며, 2차 nested PCR 반응은 1차 PCR에 의해서 증폭된 PCR product 0.5㎕, 10×buffer(TaKaRa, Japan) 2.5㎕, 0.2 mM dNTP, 10 pmol primer 각각 1.5㎕,Taq DNA polymerase(TaKaRa, Japan) 2 unit을 첨가하여 전체 25㎕의 반응을 하였다. PCR 반응조건은 1차와 2차 nested PCR 모두 94℃에서 2분 전 처리한 후 94℃에서 1분, 68℃에서 1분, 72℃에서 1분을 40 cycle을 실행한 후 72℃에서 10분간 추가 연장반응을 1회 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 2% 아가로스 겔 상에서 반응유무를 확인하였다.

제4단계. 돼지의 D-loop 지역을 증폭하기 위한 Primer 제작 및 증폭

기존에 보고된 서열(Genbank accession number : NC_000845, AF034253)을 이용하여 돼지 mtDNA D-loop 지역 내 11-bp 중복이 발생하는 일부분의 증폭을 위한 primer pair를 제작하였다. 증폭을 위해 사용한 primer의 서열은 서열번호 7과 8에 제시된 바와 같이 SD-150F(5'-CAC ACC CTA TAA CGC CTT GC-3')와 SD-150R(5'-TAA GTG CCT GCT TTC GTA GC-3')이다. PCR 반응은 KIT 지역 증폭과 동일하게 수행하였으며, PCR 반응조건은 94℃에서 2분 전 처리한 후, 94℃에서 20초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초를 32 cycle을 실행하였으며, 72℃에서 5분간 추가 연장반응을 1회 수행하였다. 증폭된 PCR product는 5% agarose gel 상에서 전기영동하여 확인하였다.

제5단계. 돼지의 ND2 유전자 지역을 증폭하기위한 Primer 제작 및 증폭

기존에 보고 된 연구결과(Cho 등, 2004)를 바탕으로 돼지 ND2 지역을 증폭하기 위해 서열번호 9와 10에서 제시된 primer인 ND2-F0(5'-GAG GCT GTG GCT TGT GTT AG-3')와 ND2-R0(5'-GCA TCA TAC CCA CGA TTC CG-3')을 사용하였다. PCR 반응은 KIT 지역 증폭과 동일하게 수행하였으며, PCR 반응조건은 94℃에서 2분 전 처리한 후, 94℃에서 20초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초를 실행한 후 72℃에서 5분간 추가 연장반응을 1회 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 2% 아가로스 겔 상에서 반응유무를 확인하였다.

제6단계. 제한효소 (restriction enzyme) 처리

KIT, MC1R 및 ND2 유전자를 대상으로 증폭된 각각의 PCR product를 사용하여 RFLP 분석을 수행하였다. KIT의 exon17과 intron17 경계부분에서 나타나는 변이를 확인하기 위해서 제한효소 NlaIII로 절단하였으며, MC1R 및 Extension 유전자형을 확인하기 위해서 제한효소 BspHI로 절단하였다. 또한 ND2 개시codon의 변이부위를 확인하기 위해서 제한효소 VspI를 처리하여 절단하였다. 각 반응은 PCR product 3㎕, 10×buffer 1㎕, 제한효소 5 unit, 증류수를 첨가하여 전체 10㎕로 하였으며, 37℃에서 4시간동안 반응시킨 후 4% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.

[표 1] KIT의 exon17과 intron17 경계부분의 splicing mutation의 type과 빈도

[표 2] Missence mutation(N121D)을 유발하는 MC1R mutation의 type과 빈도

[표 3] Landrace와 Large White의 mtDNA D-loop지역 내 11-bp 중복의 type과 빈도

[표 4] Landrace와 Large White간의 ND2 start codon의 type과 빈도

제7단계. Blind Test 단계

KIT, MC1R 및 ND2의 RFLP 분석과 D-loop 지역의 11-bp 중복현상을 이용한 앞선 결과를 토대로 유색품종과 백색품종을 포함한 돼지 5품종의 판별을 위하여 도 1의 과정을 거쳐 blind test를 실시하였다. 각 품종별로 5두씩 총 25 sample를 선발한 후 무작위적으로 선택하여 차례로 번호를 부여하였다(1-25). 유·백색종을 구별하기 위하여 KIT 내 exon17과 intron17 사이의 경계부분을 NlaIII로 처리하였다(도 2). 그 결과 10개의 sample(1, 2, 3, 8, 9, 12, 17, 18, 20, 21)이 하나 이상의 I 대립유전자를 소유하는 형으로 나타내는 typeA 형태를 보였으며, 이 결과 백색품종인 Landrace와 Large White일 것으로 추정되었다. 유색품종으로 추정되는 나머지 15개의 sample들(4, 5, 6, 7, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 19, 22, 23, 24, 25)의 MC1R에서 missence 변이를 유발하는 변이를 확인하기 위하여 BspHI으로 절단한 결과, 도 3에서 보듯이 5개의 sample(4, 5, 15, 16, 23)이 절단되지 않았으므로 Duroc이라고 예상되었다. 나머지 10개의 sample(6, 7, 10, 11, 13, 14, 19, 22, 24, 25)은 Berkshire와 Hampshire로 추정되었다.

앞서 하나 이상의 I 대립유전자를 소유하는 형으로 확인된 10개의 sample은 백색품종인 Landrace와 Large White라고 예상되며 이 두 품종을 구별하기 위해서 11-bp 중복현상을 확인하였다. 도 4에서 각각 5 sample씩(1, 3, 9, 17, 20과 2, 8, 12, 18, 21) 밴드양상이 구분됨을 확인하였다. 11-bp 중복현상은 Large White에 보여지는 품종특이적인 현상이기 때문에 2, 8, 12, 18, 21번은 Large White, 나머지 5 sample은 Landrace라고 추정되었다. 두 품종을 더욱 명확히 구별하기 위해서 VspI를 처리하여 ND2의 개시codon을 확인하였다(도 5). ATT를 개시codon으로 갖는 1, 3, 9, 17, 20번은 Landrace로, 나머지 5 sample은 Large White로 예상되었다.

모든 blind test가 끝난 후 최종적으로 sample을 확인한 결과, 각각의 과정에서 추정했던 sample의 품종과 동일함을 확인하였다.

이상의 실 예를 통하여 명시한 바와 같이, 본 발명은 우리나라에서 사육되고 있는 돼지 5품종의 구별을 목적으로 수행하였으며, 이를 위하여 기존에 보고 되어있는 품종특이 marker 및 실험기법을 활용하였다. 그 결과, Landrace, Large White 및 Duroc종은 정확히 구분할 수 있었다. Berkshire와 Hampshire종을 구분할 수 있는 적절한 변이가 발견되어진다면 국내에서 사육되는 주요 품종들의 정확한 구분이 가능할 것이며, 특히 Hampshire종의 특이성인 백색 belt에 대한 좌위가 KIT 유전자와 밀접히 연관된 것으로 파악되어있어(Giuffra, E. et al., Mamm. Genome, 10:1132-1136, 1999), belt의 원인돌연변이가 머지않은 시점에 파악될 것으로 사료된다. 결론적으로 이러한 품종구분 방법을 사용함으로써 현재 유통되고 있는 돈육의 정확한 품종을 확인할 수 있고, 또한 여러 생산지에서 유지되고 있는 각각의 품종들에 대한 종돈의 신뢰성을 밝히고 유지하는데 유용할 것으로 사료된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (1)

1. 돼지로부터 추출한 DNA를 사용하여 KIT 유전자의 intron17의 첫번째 염기가 G에서 A로 치환되는 splicing 변이지역을 서열번호 1과 2에 기재된 primer로 증폭한 후 제한효소 NlaIII를 처리한 결과로서 유색품종과 백색품종을 구분하고, 유색품종을 대상으로 MC1R 유전자의 121번째 아미노산이 asparagine에서 aspartic acid로 치환되는 N121D 지역을 서열번호 3와 4에 기재된 primer로 증폭하고 다시 서열번호 5와 6에 기재된 primer로 재증폭한 후 제한효소 BspHI을 처리한 결과로 Duroc 품종과 Hampshire 및 Berkshire 품종 판별이 가능하며, 백색품종을 대상으로 mtDNA ND2 유전자의 변형 개시 codon(ATT/ATA) 지역을 서열번호 7과 8에 기재된 primer로 증폭한 후 VspI을 처리한 후 나타나는 결과와 mtDNA D-loop 내 11-bp 중복지역을 서열번호 9와 10에 기재된 primer로 증폭한 후 전기영동에서 나타나는 중복유무의 결과를 토대로 Landrace와 Large White를 구별함으로서, 도 1에서 보여지는 분석과정에 따라 대한민국 내 주요 돼지 품종의 순종판별을 특징으로 하는 돼지 순종식별 검사방법

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