KR19990036056A

KR19990036056A - 돼지의 외피 색을 결정하는 유전자형 측정 방법

Info

Publication number: KR19990036056A
Application number: KR1019980700721A
Authority: KR
Inventors: 앤더슨 라이프; 요한슨 몰러 마리아; 웨일즈 리차드; 윌리엄 시겐스 케네스; 스튜어트 플라스토우 그래함
Original assignee: 달제티 피엘씨
Priority date: 1995-07-27
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 1999-05-25
Also published as: MX9800775A; JPH11514212A; CA2227826C; CA2227826A1; BR9609912A; JP3889440B2; CN1196755A; ES2175116T3; DE69620413T2; DE69620413D1; WO1997005278A1; KR100441471B1; EP0842296B1; ATE215610T1; AU726213B2; NZ313686A; US6183955B1; AU6621296A; EP0842296A1; DK0842296T3

Abstract

본 발명은 돼지의 외피 색을 결정하는 유전자형의 측정 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 측정 방법에 사용하기에 적합한 시약을 함유하는 키트 및 PCR을 기초로 한 방법에 사용할 수 있는 특정 프라이머도 개시한다.

Description

돼지의 외피 색을 결정하는 유전자형 측정 방법

유럽에서 상업적으로 시판되는 돼지의 품종(예를 들면, Large White & Landrace)중에서 가장 눈에 띄는 외피 색은 백색이다. 하지만, 다수의 색과 이들 조합 색을 나타내는 것들로서 상업적으로 의미가 있는 중요한 색을 지닌 품종들이 있다. 연한 고기와 관련있는 Duroc 종은 적색이고, Pietrain 종은 마른 뼈대를 가지면서 근육질이 매우 많은 동물로서 얼룩점이 있으며, 다산성의 Chinese Meishan 종은 검은색이다.

돼지의 품종산업에 있어서 외피 색상은 다음과 같은 이유로 인해 중요하다. 첫째, 대부분의 시장에서는 백색 외피색의 고기를 선호한다. 이는 돼지고기가 흔히 외피가 부착된 상태로 시판되고 있고, 털이 제거된 상태라 하더라도 일정 색상을 가진 돼지에서 얻은 외피는 여전히 색상이 드러나 보이는 모근을 나타내어 고기의 표면을 모울드에 의해 얼룩져 보이게 하므로 소비자로 하여금 부정적인 반응을 일으키기 때문이다. 그러므로, 이들 시장에서 부가의 비용상승을 불러일으키지 않으면서 도살한 짐승으로부터 외피를 제거하는 것이 필요하다. 예를 들면, 미국에서, 색상을 지닌 도살된 고기는 약 1%의 외피 결함을 나타내므로 색상을 제거하기 위한 탈모와 스키닝을 요구한다. 그 결과 착색된 도살한 돼지고기는 보편적으로 불만족스러운 상태가 된다.

둘째로, 외피 색상이외의 특성과 유전학적으로 일치될 것을 요구하는 돼지의 외관(외피 색상 범위)이 크게 변화한다는 것은 돼지 생산 소비자의 의식에 동물에 대한 일관성과 품질에 대한 의문을 야기할 수있다.

또한, 돼지 사육업자들은 번식비율이 일정한 것을 선호하는 입장에 있고 싶어한다. 따라서, 사육업자들은 교배를 통해 품종을 개량하므로써 생산된 자손들이 언제나 백색일 것을 소망할 수있다. 대안으로서, Pietrain 돼지 사육업자들은 품종 개량 교배가 언제나 Pietrain 으로 하여금 특징적 색상을 확실히 제공하도록 소망할 수있다. 과거에서 전통적인 동물의 품종개량을 위해 통상 사용되어온 관행은 돼지군으부터 백색이외의 색상은 제거하려는 시도들이었다.

동물이 착색되거나 또는 바람직한 백색인지 여부를 결정하는 유전자를 I(외피에 색상이 착색되는 것을 억제하기 위함)로 명명한다. 임의 색상(I)의 발현을 방지하는 유전자의 번역물은 (i)라는 색상을 허용하는 유전자에 대해서 우성이다. 백색상의 동물을 선택하는 종래의 방법은 i의 빈도수를 감소시켰지만, 백색 이형 접합체를 운반하는 동물의 빈도수를 높게 하였다. 이들 동물은 다른 이형 접합체 동물과 함께 교배되어 착색된 자손을 낳을 때에 한하여 식별될 수있다. 시험 교배의 프로그램만을 통하여 주어진 개체군으로 부터 열성 대립형질이 용이하게 제거가능하도록 이형 접합체를 식별할 수있다. 이러한 프로그램은 시간이 많이 소비되고 비용에 비싸므로 원가면에서 볼 때 효율적이지 않다. 따라서, i/i 동물이 불가피하게 얻어질 수밖에 없다.

또한, I^p(I-패치)라 불리는 I의 다른 대립형질의 존재에 의하여 상황은 더욱 복잡해질 수있다. I^p대립형질은 I에 대해서 열성이지만, i에 대해서는 우성이다. 따라서, I^p/I^p또는 I^p/i의 유전자형을 가진 동물은 패치 색상들을 나타낼 것이다.

유럽 야생 돼지와 몸집이 큰 백색 품종(스웨덴산 요크셔)간의 교배로부터 탄생된 군을 참고적으로 사용하면, 돼지의 유전자 지도상의 I 유전자의 위치가 결정된다. 이 유전자는 돼지의 염색체 8에 위치한 것으로서 혈소판 유도의 성장인자의 알파-서브유니트(PDGFRA) 및 알부민의 유전자와 유사하다(Johnasson등, Genomics 14:965-969(1992)). 마우스의 유전자 지도는 마우스의 염색체 5상에 위치한 동일한 영역을 포함한다. 이러한 영역은 마우스의 외피 색상, 주로 W(우성: 백색 얼룩점), Ph(패치) 및 Rw(엉덩이 영역이 백색인것)를 결정하는 데 중요한 역할을 하는 다수의 유전자를 함유한다. 마우스 W 유전자는 KIT 유전자와 공동 위치하는 것으로 알려져 왔고, W 인좌좌에서 일부 변이 유전자형이 나타나는 것은 KIT 유전자에서 구조적인 변화에 기인한다(Chabot등, Nature 335:88-89(1988), Geissler등, Cell 55:185-192(1988) 및 Nocka 등, EMBO Journal 9:1805-1813(1990).

본발명은 외피 색에 대한 돼지의 유전자형을 결정하기 위하여 돼지의 핵산을 스크리닝하는 방법 및 이를 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.

도 1은 SSCP 분석 결과를 나타낸다.

본발명자들은 돼지에서의 KIT 유전자가 외피 색상 결정에 관여한다는 것을 알아냈다. 특히, I 또는 I^P와 i의 차이는 I 또는 I^p대립형질에서의 KIT 유전자의 적어도 일부가 중복되기 때문이라는 것을 알아냈다. 중복결과 KIT 유전자의 특정 영역 복사물이 2개이상 존재할 수있다.

따라서, 이러한 발견이 대립형질 I,I^p및 i를 구별지어 외피 색상에 있어서 개개의 돼지의 유전자형을 결정하려는 방법을 개발하게끔 하였다.

그러므로, 첫 번째 양태로서, 본발명은 다음을 포함하는 돼지의 외피 색상 유전자형을 결정하는 방법을 제공한다:

(i) 돼지의 핵산 샘플을 얻는 단계;

(ii) KIT 유전자의 모든 부분 또는 일부분이 중복되는 것을 결정하기 위해서 (i)에서 얻은 핵산을 분석하는 단계.

KIT 유전자 서열이 중복된다는 것은 I 또는 I^p대립형질중 어느 하나가 존재한다는 것을 나타낸다. 일부의 돼지 개체군에 있어서, I^p의 인시덴스가 낮거나 또는 존재하지 않는다는 것은 알려져 있다. 이러한 개체군에서, 중복이 존재하느냐 부재하느냐를 결정한다는 것은 특정 돼지의 유전자형에 관한 확신의 합리적인 정도를 제공하기에 충분하다. 따라서, KIT 유전자의 중복이 존재하느냐 부재하느냐를 간단히 결정하므로써 특정 돼지의 외피 색상 유전자형은 상당히 높은 확실성으로 결정될 수있다.

하지만, 다른 개체군에서, I 및 I^p의 존재를 식별하는 것이 필요하다.

I 및 I^p모두가 KIT 유전자에서 중복물을 가진다 해도, 중복된 영역중 어느 하나에서 I 및 I^p만이 결실을 나타낸다. 따라서, 이러한 것을 근거로 이들 대립형질들을 서로 구별하는 것이 가능하다.

그러므로, 본방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다:

(iii) 중복의 여부가 I 또는 I^p존재 때문인지를 결정하는 단계.

적합하게는, 이러한 결정 단계는 중복 영역중 적어도 하나에서 결실물의 존재 또는 부재를 분석하는 것에 의해 수행된다.

바람직하게는, KIT 유전자에서의 중복물의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 돼지에 대한 RNA가 분석될 수있긴 하지만 돼지의 게놈 DNA상에서 본발명의 방법이 수행된다.

이 유전자로부터의 RNA 생성에는 그 DNA 서열의 일부 중복으로부터 초래되는 많은 효과가 나타날 수 있다. 이들 효과로는 RNA생성의 억제, RNA의 합성 수준의 변경, RNA의 공정 역학 또는 크기에서의 변경 또는 동물 몸체를 통한 RNA 생산 분포율에서의 변경을 포함할 수있다. 또한 중복이 가져오는 인적성 효과에 의해 유발된 다른 유전자로부터 RNA를 생산하는 효과도 있을 수있다.

바람직하게는, (ii)단계에서 수행되는 결정방법은 적당한 프라이머 한쌍을 사용한 PCR기술을 이용하는 것을 포함한다. PCR 또는 폴리머라제 사슬 반응은 효소의 DNA 폴리머라제 열안정성 번역물을 사용하면 DNA 분자의 정의된 영역이 실험관내에서 증폭될 수있다는 점에서 널리 사용되어온 방법이다. 증폭될 영역과 접하는 2개의 공지된 서열을 선택하고 이들 영역에 상응하는 프라이밍 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 프라이머가 DNA의 동일한 단편상에 충분히 밀접하도록 위치시키면, 이들 영역은 증폭된다. 폴리머라제 사슬 반응은 다수의 증폭반응 사이클을 포함한다. 각 사이클은 일반적으로 94℃하에서 변성되기 시작하여 주형 DNA 분자의 2본쇄를 분리한다. 이후 온도를 50-60℃로 떨어뜨리면 합성 뉴클레오티드 프라이머가 주형에 어닐링할 수있다. 주형에 비해 고농도로 존재하는 프라이머를 통하여 프라이머는 주형-주형 하이브리드를 형성하기 전에 주형에 어닐링된다. 주형내에서는 DNA의 상보적인 영역에 대해서만이 어닐링이 일어나도록 하면서 불완전한 상보성이 다른 영역에서는 안일어나도록 하는 어닐링 온도를 선택한다. 온도를 이후에 72℃로 올리면 여기서 열안정성 DNA 폴리머라제가 결합된 프라이머를 연장할 수있게 되므로 주형에 상보적인 DNA 가닥이 생성된다.

반응의 초기 단계에 있어서, 매 사이클마다 존재하는 주형이 2배로 증폭된다. 이와 같이 새롭게 합성된 스트랜드 각각은 주형과 같은 기능을 할 수 있기 때문에, 규정된 영역에 대응하는 분자는 지수적으로 증가한다. 그러나, 반응의 후기 단계(일반적으로 25 사이클 진행 후)에 있어서는, 반응 성분들(예, 프라이머)의 고갈로 말미암아 지수적인 증폭이 중지되며, 주형 분자의 증가된 농도는 어니일링 단계에서의 주형-주형 혼성체의 형성을 유도한다. 이러한 반응에 있어서, 생성물의 양은 초기에 존재하는 주형의 양에 직접적으로 비례하지만, 지수적으로 증가하는 것만은 아니다. 본 발명에서 설명하는 바와 같은 정량적 적용에 있어서 사용된 사이클의 횟수는 지수적 반응상을 유지하도록 하여야 하는 것이 중요하다.

KIT 유전자의 복제가 존재하는지 여부를 확인하기 위한 여러 가지 방법에 있어서 PCR을 사용할 수 있다. 우선, 프라이머는 i가 아니라 I 또는I^p에서 복제된 KIT 유전자 일부의 증폭을 이용하도록 선택할 수 있다. 이 PCR은 어떤 염색체이든지 하나의 복제물에만 존재하는 것으로 알려진 대조 서열의 복제를 가능하게 하는 프라이머를 사용하는 제2 PCR과 비교된다. 개개의 PCR 반응 생성물 비의 비교 결과에 의하면 존재하는 KIT 영역의 복제를 추정할 수 있을 것이다. 문제의 DNA 영역에 있어서 I 또는I^p에는 두 개의 복제물이 존재하고 i 대립형질에는 하나의 복제물만이 존재하는 것으로 가정한다면, KIT 대 대조 생성물의 예상되는 비율은 다음과 같을 것이다:

유전자형 KIT/대조 생성물

I/I 2

I^p/I 2

I^p/I^p 2

I/i 1.5

I^p/i 1.5

i/i 1

실제에 있어서, 얻어지는 비율은 일어나는 두 복제 반응의 반응 역학의 차이로 인하여 이것과 다를 수 있다.

전술한 방법에 사용하기에 적합한 프라이머 쌍에는 다음과 같은 것이 포함된다.

GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCC KIT1-FOR

CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG KIT1-REV, 및

GG(C/T)AATCACATGAATATTGTGAA KIT2-FOR

TCACCATAGCAACAATATTCTGT KIT2-REV, 및

TC(A/G)TACATAGAAAGAGA(C/T)GTGACTC KIT3-FOR

CCTTT(A/G)ACCAC(A/G)TAATT(A/C)GAATC KIT3-REV, 및

GTGATG(A/G)T(G/T)CT(C/G)ACCTACAAATA KIT4-FOR

GTCTATGTAAACATAATTGTTTCC KIT4-REV

전술한 바와 같이, 직접적 비교를 통해 증폭 생성물의 비율을 측정할 수 있는 대조 PCR 반응을 포함하는 것이 바람직하다.

돼지 염색체는 단일의 복제물만을 보유하는 것으로 알려져 있기 때문에 선택된 대조 서열을 참조하여 수행하는 것이 적당하다. 즉, 대조 서열로서 적당한 프라이머를 사용하므로써, PCR 생성물을 형성시키고 정량할 수 있다. 이와 같이 KIT 유전자의 PCR 생성물과의 비교는 복제도 값을 직접적으로 제공한다.

적합한 대조 서열의 일례는 근육 칼슘 방출 통로 유전자(CRC) 엑손의 일부이며 적당한 프라이머 쌍은 다음과 같다:

CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGT CRC FORWARD

AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC CRC REVERSE

적당한 대조 서열의 다른 예는 돼지 인터페론-β 유전자(Artursson 등, Journal of Iterferon Research 12: 153-160(1992))의 일부이며, 적당한 프라이머 쌍은 다음과 같다:

GATGAACTTTGAGGTCCCTGAGGAG IFN-β FORWARD

TTTCTTCTGAGAATGCCGAAGATCTG IFN-β REVERSE

대조 프라이머로서 적당한 다른 서열에는 돼지 뇌하수체 당단백질 홀몬(Kato 등, Journal of Morecular Endocrinology 7: 27-34(1991))의 공통 α 서브유닛의 유전자로부터의 영역, 돼지 황체형성 홀몬(Ezashi 등, Journal of Morecular Endocrinology 5; 137-146(1990))의 β 서브유닛의 유전자, 또는 다른 단일 복제물의 돼지 유전자가 포함된다.

KIT 유전자의 PCR과 대조 서열의 PCR은 돼지 DNA의 단일 샘플에 동시에 지지되는 것이 가장 바람직하다.

KIT 유전자( 그 일부 포함)의 임의의 복제가 존재하는지 여부를 확인하는 제2의 방법은 임의의 복제 영역의 경계에서 I 대립형질에 대해 특이한 뉴클레오티드 서열이 존재할 것이라는 사실에 의존한다. 따라서, 그러한 경계 뉴클레오티드 서열, 또는 연결부에 특이한 프라이머를 사용하므로써 I 대립형질의 빈도를 측정할 수 있다.

KIT 유전자의 구조를 확인하기 위한 제3의 방법은 복제의 존부와 밀접하게 관련이 있는 결합 유전성 다형현상을 이용하는 것이다. 그러한 다형현상은 KIT 유전자 자체에서 또는 KIT 에 결합된 염색체 영역에서 일어날 수 있다. 복제의 존부와 완전히 관련되어 있는 단일 결합 마커 또는 부분적 관련을 보이는 복합 마커를 사용하여 고급 정보 테스트를 수행할 수 있다. 예를 들면, SSCP법(단일 스트랜드 입체구조 다형현상; Single Strand Conformation Polymorphism)은 그러한 다형현상을 수행하는데 이용할 수 있다. 이 방법의 원리는 PCR에 의해 생산된 이중 스트랜드 DNA를 단일 스트랜드 DNA로 변성시킨 후 비변성 겔 전기영동법에 의해 분리하는 것이다. 비변성 조건하에서 단일 스트랜드 DNA는 스트랜드간 상호작용에 의하여 2차 구조를 형성하지만, 단일 스트랜드 DNA중 일부는 재변성하여 이중 스트랜드 DNA를 형성한다. 첫째, 두 유전형질간의 뉴클레오티드 서열의 차이는 전기영동중 이동률의 차이로서 나타나는 단일 스트랜드 DNA의 2차 구조에 영향을 미칠 수 있다. 둘째, 뉴클레오티드 서열의 차이는 헤테로듀플렛스 DNA(헤테로듀플렉스는 다른 대립형질을 나타내는 2개의 단일 스트랜드 분자에 의해 형성된 이중 스트랜드 DNA 분자이다)의 이동성에 영향을 미치는 경우가 있다.

복제되는 영역의 복제물의 수와 관련하여 KIT 유전자의 구조를 확인하는 제4의 방법은 진동장 겔 전기영동(pulsed field gel electrephoresis)을 이용하는 방법이다. 진동장 겔 전기영동은 DNA 대형 단편의 크기를 분석할 수 있는 기술이다. 본 발명에서 이 방법은 KIT 유전자의 I 대립형질을 보유하는 동물의 DNA에서 복제되는 것으로 밝혀진 영역에 접한 특정 부위에서 게놈성 DNA를 분해하는 제한 엔도뉴클레아제를 이용한다. 이러한 효소에 의해 분해된 게놈성 DNA는 진동장 겔 전기영동으로 처리한 후 DNA 결합 멤브레인으로 이동시킨다. 복제되는 영역에 특이성을 갖는 프로브를 사용하여 겔상의 원래 위치를 확인할 수 있으며, 따라서 적합한 DNA 크기 표준과 비교하므로써 그 단편의 크기를 확인할 수 있다. 동물로부터의 DNA가 KIT 유전자 일부의 복제물을 함유하는 경우, 이 특이성 단편은 크기가 증가될 수 있다. 이형 접합성 동물은 2개의 서로 다른 크기의 특이성 밴드를 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 그 중 작은 밴드는 비 복제 대립형질 i를 나타내는 것이고, 큰 밴드는 대립형질 I 또는 I^p를 나타내는 것이다. 이 기술은 또한 복제물의 유닛 길이에 의해 크기가 추가로 증가한 단편의 존재를 통해 복제된 영역의 2개 이상의 복제물을 함유하는 대립형질을 나타낼 것이다.

본 발명은 또한, 하기 (i) 내지 (iv)단계를 포함하는 돼지의 피부색 유전형질을 결정하는 방법을 제공한다:

(i) 돼지 게놈성 DNA를 얻는 단계;

(ii) 상기 (i)의 게놈성 DNA를 하나 이상의 적합한 프라이머와 혼성화시키는 단계;

(iii) 상기 (ii)에서 얻은 혼성 핵산을 사용하여 하나 이상의 PCR 사이클을 수행하는 단계; 및

(iv) PCR 반응 생성물의 양을 측정하는 단계.

상기 방법은 하기의 단계 (v)를 추가로 포함할 수 있다:

(v) I 또는 I^p의 존재로 인하여 임의의 복제가 존재하는지 여부를 확인하는 단계.

이 확인 방법은 하나 이상의 복제 영역에서의 결실의 존부를 분석하므로써 수행하는 것이 적합하다.

유전성 마커와 특정의 특성에 응답할 수 있는 유전자간의 결합은 유전성 재조합에 의해 분해될 수 있다. 즉, 마커와 문제의 유전자간의 물리적 거리가 가까울수록 재조합에 의해 그들이 분리될 가능성이 적어진다. 또한 대체 DNA 마커의 특이성 대립형질과, 특정의 특징과 관련되어 있음이 이미 밝혀진 특정의 유전자(예를 들면, 본 명세서에서 언급한 KIT 유전자)와 관련되어 있는 것으로 알려진 DNA 마커의 대립형질간의 결합을 형성할 수 있다. 즉, 이러한 상황에서, KIT 유전자를 취하면, 적어도 단기간에, 대체 염색체 8 마커의 특정 대립형질의 선택을 통해 KIT 유전자 관련 마커의 특정 대립형질을 선택하므로써 간접적으로 특정의 피부색을 가진 돼지를 선택하는 것이 가능하다. 돼지의 염색체 8의 KIT 유전자에 결합하는 것으로 알려진 그러한 마커의 예에는 KIT 유전자 자체 또는 혈소판 유도 성장 인자(PDGFRA) 및 알부민의 α 서브유닛의 밀접 결합 유전자의 게놈성 다형현상을 포함한다.

KIT 유전자와 관련한 특정한 유전자 마커는 미소부수체이다. 이들은 거의 매 50,000개의 염기(단배체 게놈 하나 당 약 60,000개의 미소부수체)에서 유전자 둘레에 실질적으로 랜덤하게 발생하는 4, 3 또는 더욱 통상적으로는 2개의 뉴클레오티드의 단순한 서열 반복체이다. 복제되는 동안 DNA 폴리머라아제의 스터터링(stuttering) 및 재조합되는 동안 동일하지 않은 교차는 반복 유니트를 잃거나 얻는 결과를 낳는다고 여겨진다. 이것은 미소부수체가 대개 다형태이며 몇 개의 반복 길이 대립유전자를 가질 수 있다는 것을 의미한다.

연결된 미소부수체 서열의 예로는 S0086(Ellergren등, Genomics, 16:431-439(1993)), S0017(Coppieters 등, Animal Genetics 24:163-170(1993)), Sw527, Swr750 및 SW916(Rhorer 등, Genetics, 136:231-245(1994))를 포함한다. 상기한 마커들중 어느 것 또는 돼지의 염색체 8상의 실제적인 임의의 기타 연결된 마커를 사용하는 색상을 코팅하도록 연결된 상기 KIT 유전자의 대립유전자에 대하여 간접적으로 선택할 수 있을 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 KIT 유전자 DNA 서열 복제 수의 결정에 관한 것이다. 이 목적을 위해, 중복된 KIT 분절을 나타내는 뉴클레오티드 프로브, 또는 그것의 일부 또는 상기한 돼지의 뉴클레오티드 프로브와 매우 유사한 것을 보여주는 실제적인 임의의 기타 뉴클레오티드 프로브를 사용할 수 있다. 예를 들면, 하기한 방법을 사용하여 상기 결정을 수행할 수 있다.

(i) 예를 들어, 마우스(Gokkel 등, Oncogene 7, 2207-2217(1992)) 및/또는 인간(Giebel 등, Oncogene 7, 2207-2217(1992)) 로부터 KIT 유전자의 DNA, 및 그것으로부터 유도된 RNA의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 뉴클레오티드 프로브를 사용함, 이러한 프로브는 전환반응으로 인하여, 돼지의 유전자에 하이브리드화될 것이다.

(ii) 동물의 KIT 단백질의 아미노 산 서열이 공지되어 있는 경우, 상기 단백질 또는 그것의 일부를 암호화한 DNA의 가능한 뉴클레오티드 서열을 추론할 수 있다. 이를 기초로, 혼합된 올리고뉴클레오티드 제제는 돼지의 KIT 유전자에 대한 프로브로서 사용될 수 있다.

(iii) 상기 KIT 유전자, 예를 들면 v-KIT(Besmer 등, Nature 320:415-421(1986))의 전부 또는 일부에 대한 기능적 상동성을 갖는 단백질에 대한 단백질 서열(및 상응하는 뉴클레오티드 서열)을 기본으로 프로브를 고안할 수 있다.

전술한 바와 같이 유도된 모든 프로브는 서던(Southern), 노던(Nothern) 또는 점 블로팅에 의해 나일론 멤브레인(예, Hybond N Amersham Internaional)과 같은 하이브리드화용으로 적당한 매트릭스로 형질전환되는 동물 유도된 핵산 제제를 프로프하는 데 사용될 수 있다. 매트릭스 결합된 핵산에 대하여 하이브리드화하는 KIT 및 대조군 프로브의 양의 비는 KIT 복제수를 결정하는 데 사용될 수 있다. 결합된 프로브의 양은 방사능 동위 원소를 사용하여 상기 프로브를 표식하는 것을 통해 정량될 수 있다. 기타의, 비등방성 핵산 표식용 키트 또한 유용하며 또한 사용될 수도 있다.

동물 유도된 핵산의 하이브리드화를 수반하는 과정의 역 또한 가능하다. 이것에서는, 프로브를 매트릭스에 결합시켜서 이것을 하이브리드화 프로토콜을 통해 전술한 방식으로 표식된 게놈 DNA 또는 RNA를 포획하는 데 사용하므로써, 상기 결합된 분량을 정량화한다. 만약 상기 조건이 맞다면, 결합된 양은 KIT의 총량(또는 복제수) 및 존재하는 대조군 핵산 서열에 관계한다.

PCR 증폭된 DNA를 정량하는 기타의 방법은 방사능 표식 기본 방법을 포함한다. 일례로는 올리고뉴클레오티드 프라이머중의 하나 또는 둘모두를 방사능 표식하고 그 후, PCR 생성물내의 그 방사능 표식을 DNA 겔의 자동방사선 사진기의 밀도측정법을 통해 정량화하는 것이다. 대안적인 방법은 삽입되지 않은 표식된 올리고뉴클레오티드를 침전, 여과, 차동 원심분리 또는 기타의 과정을 통해 제거한 후 각각의 별도 생성물들을 정량화하는, 상이한 동위원소와의 PCR 반응의 두 생성물에 대한 올리고뉴클레오티드의 차동 표식이다. PCR 생성물은 또한 브롬화 에티듐 또는 SYBR 그린(Molecular Probes, Inc.)와 같은 염료를 사용하는 기타의 염색 과정을 사용하여 정량화될 수 있다.

본 특허문헌에 전술한 바와 같이 두 개의 PCR을 동일한 관내에서 진행시켜서 두 개의 별도의 생성물을 생성하는, 상이한 PCR의 생성물을 정량화하는 또 다른 방법은 상표명 TagMan 시스템(Perkin Elmer Corp.)을 사용하는 것이다. 이 시스템에서는, 증폭시키고자 하는 영역에 인접한 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머외에, 상기 증폭된 영역에 결합하는 제 3의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 상기 인접한 프라이머들은 표식되지 않은 반면, 상기 프로브는 두 개의 형광성 표식을 수송한다. 상기 프로브의 3'말단 상에서 리포터 염료가 존재하며, 그 형광성은 상기 프로브의 5'말단에 부착되는 별도의 형광구에 의해 급냉된다. PCR동안, 이 프로브는 생성물 DNA 분자에 결합한다. PCR이 진행됨에 따라, 이들 생성물은 대체되면서 Taq DNA 폴리머라제가 상기 프로브의 5' 급냉 염료를 열개하는 동안 주형으로서 사용된다. 이 급냉제의 제거는 감지하고자 하는 리포터 염료로부터 형광성을 허용한다. 형광성의 정도는 비례적이므로, 생성된 PCR 생성물의 양의 척도이다. 반응은 두 개의 별도의 PCR 프라이머 세트 및 두 개의 프로프를 포함할 수 있는 바, 각각은 별도의 게놈 DNA 영역에 상응한다. 이러한 방식으로, 정량 PCR에 대한 상기 표준이 순응하는 한, 각각의 주형 영역의 상대적인 양을 측정할 수 있다.

하이브리드화 과정중의 어떠한 것에서도 단백질 핵산을 사용할 수 있다(PeSeptive Biosystems, Inc., Cambridge, MA).

본 발명의 세 번째 양태에서는 돼지의 코팅 색 유전자형을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 하기 (i) 및 (ii) 단계를 포함한다.

(i) 돼지 KIT 단백질의 시료를 얻는 단계; 및

(ii) KIT 유전자의 일부 또는 전부 중복이 존재하는가를 결정하기 위해 (i)단계에서 얻은 단백질을 분석하는 단계.

KIT 또는 상관 단백질의 항체의 에피토프에 대하여 증가되는 항체를 사용하여 동물내에 존재하는 c-KIT 단백질의 농도 또는 형태를 웨스턴 블로팅 또는 ELISA 과정을 통해 결정할 수 있다. ELISA 기술을 통해 결정되는 KIT 유전자의 다양한 대립유전자 및 그 유전자형을 포함하는 상이한 DNA 구조에 대하여 항체가 증가될 수 있다.

본 발명의 제 4양태에서는 돼지 게놈 DNA내 KIT 유전자 서열의 모두 또는 일부 중복의 존재를 표시할 수 있는 하나 이상의 시약을 포함하는 돼지의 코팅 색상 유전자형을 결정하는 데 사용하는 키트를 제공한다.

또한 I 및 I^P간의 차이에 관하여 전술한 바로부터, 유전자형을 구별하기 위해 상기 차이를 연구할 수 있다. 상기 결실은 단지 중복된 영역 I중의 하나에서 (여기서, I는 중복된 영역의 두 개의 복제물을 포함함) 존재하며 I내에서는 존재하지 않는 것으로 보이기 때문에, 그것은 I의 마커를 제공한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 결실이 발견되며 PCR이 수행되어 결과적으로 두 개의 가능한 크기의 생성물을 얻는 어느 하나의 위치의 게놈 DNA 사이드로 하이브리드화되도록 고안될 수 있다.

4개의 염기 쌍 결실이 존재하는 경우에 수득한 것은 상기 결실이 존재하지 않는 동일한 영역으로부터 얻은 것 보다 짧은 4개의 염기 쌍일 것이다. 이러한 두 개의 생성물의 상대적인 양은 전술한 어떠한 방법에 의해서도 결정될 수 있으나, 하나의 바람직한 방법은 올리고뉴클레오티드 프라이머중 하나를 적당한 감지 장치를 구비한 장치 또는 TaqMan 장치(Perkin-Elmer)중에서, 전기 영동과 함께 형광 염료로 표식하는 방법을 포함한다.

PCR 성분에 관한 이러한 테스트 방법의 한 특정한 잇점은 PCR이 대수증식기를 지남에 따라 식별을 손실하는 데에 민감하지 않다는 것이다. 상기 프라이머, 그것의 결합부위 및 생성물은 비결실된 주형 영역 또는 결실된 주형영역에 대하여 동일하거나 또는 유사하다. 그러므로 이와 달리, 하나의 생성물에 대한 다른 하나의 생성물의 생성 속도는 반응의 상이한 단계에서 다양할 것이다. 주형/주형 하이브리드의 형성이 주형/프라미어 복합체의 형성과 경쟁하기 시작함에 따라, 두가지 하위-반응 모두에 동시에 영향을 줄 것이다. 전체적인 결과는 각각의 생성물의 생성 반응 속도론이 매우 높은 정도로 유사하다는 것이다.

단지 I 또는 i만을 포함하며, I^P는 함유하지 않는 돼지의 계통에서, 두 개의 수득한 생성물에 대한 비는, 각각의 I대립 유전자의 복제물이 결실된 유전자 및 비결실된 유전자를 동량으로 발생시키는 반면 i는 결실되지 않은 생성물만을 발생시킨다는 사실에 기초하여 하기한 유전자형과 관련될 수 있다.

유전자형	존재하는 비결실된 영역의 복제	존재하는 결실된 영역의 복제	비결실생성물:결실된 생성물의 비
II	2	2	1:1
Ii	2	1	2:1
ii	2	0	2:0
II^p	3	1	3:1
I^PI^P	4	0	4:0

유전자형	존재하는 비결실된 영역의 복제	존재하는 결실된 영역의 복제	비결실생성물:결실된 생성물의 비
I^Pi	3	0	3:0

따라서, 본 발명의 제 5 양태에서 하기 (i) 및 (ii) 단계를 포함하는 돼지의 코팅 색상 유전자형을 결정하는 방법을 제공한다:

(i) 돼지 핵산 시료를 얻는 단계; 및

(ii) (i)에서 수득한 핵산을 분석하여 KIT 유전자 서열에서 결실의 존재 또는 부재를 확인하는 단계.

단순히 결실의 존재 또는 부재를 확인하므로써, I 및 i를 구별할 수 있다. 물론 상기 시험에서 중복 I^p의 한 복제물에서의 결실의 부재가 i를 효과적으로 모방하기 때문에 I^p의 존재는 결과를 복잡하게 한다. 따라서, I^p를 보유하는 계통에서 상기 방법을 사용하면 대립 유전자로서 ii를 보유하는 동물을 오인할 수 있다. 그러나, 상기 방법은 예를 들어 특정 동물의 번식 양태에서 여전히 사용될 수 있으며, 필요한 모든 것은 I에 대한 동종 접합체인 동물의 양성 확인이다.

물론, 각 개체의 유전자형은 2개의 생성물을 상이한 비율로 발생시키거나, 또는 단일 생성형의 상이한 양을 생성한다는 것을 또한 인지해야 한다. 따라서, 상기 시험은 또한 생성된 생성물의 정량에 의하여 개체 동물의 절대 유전자형을 결정하는 수단을 제공한다. 상기 경우에, 각 시험에서 사용된 DNA의 양은 생성물 양의 차이를 정확하게 측정할 수 있다는 것을 보장하기 위해 조절되어야 한다.

측정 단계(ii)는 일반적으로 돼지 게놈 DNA의 시료에서의 PCR 증폭을 포함하는 것이 바람직하다. PCR 방법에 사용될 수 있는 적절한 프라이머 쌍은 하기를 포함한다:

TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG KITDEL1-FOR

CCAGCAGGACAATGGGAACATCT KITDEL1-REV, 및

GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGAT KITDEL2-FOR

AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAG KITDEL2-REV

상기 방법에 접근하는 수 많은 대안 방법중 하나는 결실의 존재 또는 부재를 통하여 KIT 유전자의 상기 영역의 각 버전에 형성되는 독특한 뉴클레오티드 서열에 결합한 프라이머를 PCR에서 사용하는 것이다. 상기 프라이머는 해당 서열의 존재하에서만 생성물을 형성하도록 고안할 수 있다. 따라서, 2개의 다른 프라이머 각각이 상이한 형광 표식으로 사용되는 경우, 겔 전기이동에 의한 분리는 필요하지 않으며, 각 생성물은 형광 물질을 기준으로 하여 확인한다.

중복의 존재 및 중복된 영역의 2개 이상의 복제물을 함유하는 I의 대립유전자가 특정 돼지 종에 존재하는 결실의 복제수에 대해 테스트하는 경우에 수득된 비에 대한 특정 값의 유전에 기초한 예비적인 증거가 존재한다.

이들 가변적인 형태의 I를 갖는 동물 사이의 식별은 중복된 영역의 복제수를 측정하는 것으로부터 얻어진 비와 결실의 존재의 측정으로부터 얻어진 비의 조합을 이용하여 강화할 수 있다. 2개 이상의 복제물을 보유하는 중복된 버전의 존재를 나타낼 수 있는 대립유전자 내의 KIT 유전자의 구조는 하기 표에 나타낸다.

대립유전자	중복된 영역의 복제물	결실을 함유하는 중복된 영역의 복제물
i	1	0
I^P(I 2.0)	2	0
I 2.1	2	1
I 3.0	3	0
I 3.1	3	1
I 3.2	3	2

이들 대립 유전자의 존재로부터 발생되는 가능한 유전자형 및 중복된 영역의 복제수에 대한 분석 측정치에서 얻어진 각각의 비 및 결실을 함유하는 복제수에 대한 분석 측정치에서 얻어진 각각의 비는 다음과 같다:

유전자형	비:KIT 영역의 복제수/대조 영역의 복제수	비:비결실된 영역의 복제수/결실된 영역의 복제수
i/i	1.0	0.0
I^p/i	1.5	0.0
I2.1/i	1.5	2.0
I3.0/i	2.0	0.0
I3.1/i	2.0	3.0
I3.2/i	2.0	1.0
I^p/I^p	2.0	0.0
I2.1/I^p	2.0	3.0
I3.0/I^p	2.5	0.0
I3.1/I^p	2.5	4.0
I3.2/I^p	2.5	1.5

유전자형	비:KIT 영역의 복제수/대조 영역의 복제수	비:비결실된 영역의 복제수/결실된 영역의 복제수
I2.1/I2.1	2.0	1.0
I3.0/I2.1	2.5	4.0
I3.1/I2.1	2.5	1.5
I3.2/I2.1	2.5	0.67
I3.0/I3.0	3.0	0.0
I3.1/I3.0	3.0	5.0
I3.2/I3.0	3.0	2.0
I3.1/I3.1	3.0	2.0
I3.2/I3.2	3.0	1.0
I3.2/I3.2	3.0	0.5

2가지 테스트를 병용할 수 있는 한 방법은 TaqMan(등록상표) 시스템(퍼킨 엘머 코오포레이숀)을 이용하는 것이다. TaqMan의 특정 적용에서, 2세트의 PCR 프라이머를 구비한 3가지 프로브를 이용한다. 한 프로브는 상기 프라이머 세트중 한 세트로부터 얻어진 대조용 생성물의 측정을 가능하게 하며, 다른 PCR 프라이머 세트는 결실을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있는 중복 영역의 증폭을 가능하게 한다. 나머지 프로브는 상기 증폭으로부터 얻어진 결실된 생성물 또는 결실되지 않은 생성물중 하나를 검출한다. 이 얻어진 자료로부터 하기하는 바와 같이 이미 기술한 2가지 별개의 테스트로부터 얻어진 바와 같은 값을 제공하도록 다음과 같이 두가지 계산을 할 수 있다.

A: KIT 유전자 영역의 복제수: 대조 영역의 복제수

B: 결실되지 않은 KIT 유전자: 결실된 KIT 유전자

본 발명의 각각의 양태의 바람직한 특징은 필요에 따라 적합한 변경을 가하여 각각 다른 양태에 적용할 수 있다.

이하, 본 발명은 하기 실시예에 의해 추가 기술될 것이다. 하기 실시예는 단순히 예시적인 것이며, 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하려는 의도는 없다.

실시예 3은 도 1에 대해 기술한다.

실시예 1

(i) DNA 제조

DNA는 세포 핵, 예를 들어 백혈구 세포, 모낭, 귀 절흔 및 근육를 포함하는 모든 조직 공급원으로부터 얻어서 제조할 수 있다. 본 명세서에서 약술한 과정은 혈액 세포 제조에 관한 것이며; 기타 조직은 K 완충액에 물질을 직접 현탁시킨 후 혈액 제조의 동일한 단계를 진행시켜 유사하게 제조할 수 있다. 본 명세서에서 약술한 과정은 PCR 증폭에 적합한 미정제 DNA를 포함하는 세포 용해물을 생성하는 것이다. 그러나, 정제된 또는 미정제된 DNA를 제조하는 모든 방법은 그 효과가 균등해야만 한다.

혈액은 응집을 방지하기 위해서 50mM EDTA pH 8.0에 수거해 둔다. 혈액 50㎕를 작은 미소원심분리 관(0.5㎖ 에펜도르프 또는 등가 기구)에 분배하였다. TE 완충액 450㎕를 첨가하여 적혈구 세포(헴 기는 PCR을 억제함)를 용해시키고 혼합물을 2초 동안 와동시켰다. 이어서, 손상을 입지 않은 백혈구 세포 및 남은 적혈구 세포를 미소 원심분리기에서 13,000g로 12초 동안 원심분리하였다. 상등액은 저압 진공 펌프 시스템을 사용하여 조심스럽게 흡인 제거하였다. 추가의 TE 완충액 450㎕는 남은 적혈구 세포를 용해하기 위해서 첨가하고, 백혈구 세포는 전술한 바와 같이 원심분리시켜 수거하였다. 적색빛이 펠렛에 남아 있는 경우에는, 펠렛이 백색이 될 때까지 상기 과정을 반복하였다. 펠렛화된 백혈구 세포로부터 상등액을 모두 제거한 후에, 프로테인아제 K를 함유하는 K 완충액 100㎕를 첨가하고 그 혼합물을 2 시간 동안 55℃에서 항온 처리하였다. 이어서, 혼합물을 8분 동안 95-100℃로 가열시키고 DNA 용해물을 필요할 때 까지 -20℃에서 저장하였다.

시약

TE 완충액: 10 mM 트리스-HCl pH 8.0

1 mM EDTA

K 완충액 : 50 mM KCl

10 mM 트리스-HCl pH 8.3

2.5 mM MgCl₂

0.5% Tween 20

용해물에 사용하기 전에, K 완충액 1.0㎖ 당 20mg/㎖ 프로테인아제 K(몰리큘라 프로브스 인코오포레이티드) 10㎕를 첨가하였다.

(ii) PCR

두께가 얇은 0.25㎖ 튜브(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에 다음과 같은 반응물을 첨가하였다:

4.0㎕의 5μM CRC 순방향 프라이머;

4.0㎕의 5μM CRC 역방향 프라이머;

4.0㎕의 5μM KIT1-REV 프라이머;

4.0㎕의 5μM KIT1-FOR 프라이머;

4.0㎕의 2mM dNTPs(파마시아);

4.0㎕의 35mM MgCl₂.

왁스 비드(PCR Gem 50, 퍼킨 엘머)를 첨가한 후, 퍼킨 엘머 9600 가열 순환기내에 튜브를 넣었다. 이어서, 15초간 튜브를 80℃까지 상승시킨 후 4℃로 냉각시켰다. 이어서 제 2 시약 세트를 다음과 같이 튜브에 첨가했다:

4.0㎕ 10× 완충액;

9.6㎕ 무균 탈이온수;

0.4㎕(0.5 단위)의 AmpliTaq DNA 폴리머라제(퍼킨 엘머);

2㎕ DNA 용해물.

이어서 반응 튜브를, 94℃로 예열된 퍼킨 엘머 9600 가열 순환기에 놓고 PCR을 하기 방식에 따라서 수행하였다:

94℃에서 4분;

94℃에서 30초, 62℃에서 30초 및 72℃에서 30초간의 사이클을 20회 순환;

필요할 때까지 0℃.

순환 횟수는 DNA 공급원으로서 사용된 조직에 따라 조절될 수 있다.

KIT 프라이머

순방향 GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCC KIT1-FOR

역방향 CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG KIT1-REV

CRC 프라이머

순방향 CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGT CRC-순방향

역방향 AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC CRC-역방향

역방향 KIT 프라이머 및 순방향 CRC 프라이머의 5'-말단을 ABI 형광 염료 FAM으로 표지하였다.

(iii) DNA 단편의 전기영동 및 정량

1㎕의 PCR을 2.5㎕의 탈이온 포름아미드, 0.5㎕의 GS350 DNA 기준물, 0.4㎕의 청색 덱스트란 용액과 혼합하고, 2분동안 90℃에서 가열한 후, 얼음으로 급냉시켰다. 이 혼합물 3㎕을 AB1373 DNA 서열기상에 올려놓고 DNA 단편들을 700V, 40mA, 32W하에 2시간동안 1 x TBE 완충액중의 6% 폴리아크릴아미드 겔중에서 분리시켰다. KIT 및 CRC 유전자의 생성물에 상응하는 단편들은 진스캔 소프트웨어를 사용하여 정량하고, 각 밴드의 피크 영역을 측정하였다.

(iv) 결과

표 4a 및 4b에 제시된 데이터는, 각 23마리의 동물로부터 DNA 용해물을 만들어, 각 용매물을 대상으로 2회의 PCT 테스트를 수행하는 실험을 통해 구한 결과이다. KIT 피크 영역 대 CRC 피크 영역의 비는, 동일 동물의 샘플에서 구한 각 PCR 및 평균값으로부터 계산하였다.

동물	유전자형	KIT/CRC 피크 영역비
1	II	3.25
2	Ii	2.45
3	II	2.94
4	ii	1.16
5	ii	1.34
6	ii	1.20
7	Ii	2.18
8	Ii	2.19
9	II	2.88
10	ii	1.30
11	Ii	1.84
12	II	2.84
13	ii	1.50
14	ii	1.30
15	Ii	2.07
16	ii	1.31
17	ii	1.14

동물	유전자형	KIT/CRC 피크 영역비
18	Ii	2.02
19	Ii	1.87
20	Ii	2.00
21	ii	0.99
22	ii	1.15
23	II	2.80

이 실험에서 다른 유전자형 II, Ii 및 ii을 가진 동물로부터 구한 비 값의 상한치 및 하한치는 다음과 같다:

유전자형 상한치 하한치

I/I 3.25 2.80

I/i 2.45 1.84

i/i 1.50 0.99

이들 결과는, 상기 테스트를 사용한데 따른 유전자형의 차별화를 나타낸 것이다.

실시예 2

제 2 테스트에서는, 중복체의 한쪽 단부(또는 복제된 영역이 나머지 유전자에 비해 역방향인 경우, 또는 복제된 영역이 비-복제된 영역과 직렬로 존재하지 않는 경우에는 양쪽 단부)에 존재하는 DNA의 독특한 서열을 이용한다. PCR에 사용되는 올리고누클레오티드 프라이머는, PCR 과정에 사용된 어니일링 온도하에서 이들이 복제된 영역의 단부중 접합 영역에만 어니일링 되도록 도안된다. 이어서 PCR은 2쌍의 올리고누클레오티드를 사용하여 수행한다. 한쌍은 접합 영역에 걸쳐 존재하는 상기 언급된 프라이머와, I 대립 유전자-함유 중복체로부터만 증식이 이루어지는 제 2 프라이머가 적당한 거리를 두고 구성한다. 제 2 쌍의 프라이머는, 하플로이드 게놈중의 단일 중복체로서만 존재하는 일정 서열을 증식시킬 수 있다. 동일 튜브내에서 이루어지는 이 반응의 생성물은, 이전의 테스트에서와 같이 내부 기준으로서 작용한다. 접합 영역에 특이성을 가진 반응에 따른 생성물의 비는, 단일 중복체의 대조 서열을 기준으로 하여 구한다.

이 테스트에서는, 다른 유전자형을 가진 생성물의 예상되는 비율간에 상당한 차이가 있다. 생성물의 상대적 수준 및 이들의 비율은 후술되는 바와 같다:

유전자형 접합 영역 대조 생성물 비

II 2 2 1:1

Ii 1 2 1:2

ii 0 2 0:2

이와 같이 비가 큰 경우에는, 다른 유전자형에서 산출된 결과 범위간의 차이가 크며, 따라서 동물을 잘못 판정할 위험이 줄어든다.

실시예 3

(i) DNA 제조

DNA는 실시예 1에서와 같이 제조할 수 있다.

(ii) PCR

2.0㎕ 5mM KITDEL2-FOR 프라이머;

2.0㎕ 5mM KITDEL2-REV 프라이머;

1.0㎕ 2mM dNTPs(파마시아);

1.2㎕의 25mL MgCl₂;

2.0㎕의 10x 완충물(MgCl₂비-함유)

0.1㎕(0.5 단위) AmpliTag DNA 폴리머라제(퍼킨 엘머);

2.0㎕ DNA 용해물.

0.7㎕ 무균 탈이온수.

이어서 반응 튜브를 퍼킨 엘머 9600 가열 순환기에 놓고 PCR을 하기 방식에 따라서 수행하였다:

95℃에서 1분;

95℃에서 15초, 50℃에서 20초, 및 72℃에서 40초간의 사이클을 3회 순환;

94℃에서 15초, 50℃에서 20초 및 72℃에서 50초간의 사이클을 27회 순환;

72℃에서 5분;

필요할 때까지 4℃.

KIT 프라이머

순방향 프라이머 GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGAT KITDEL2-FOR

역방향 프라이머 AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAG KITDEL2-REV

(iii) 전기 영동법

PCR 생성물 1㎕를 적재용 완충액(95% 탈이온 포름아미드, 10mM NaOH, 20mM EDTA, 0.05% 브로모페놀블루, 0.05% 크실렌-시아놀)과 혼합하고, 3분동안 95℃로 가열한 후, 얼음으로 급냉시켰다. 이어서, 샘플을, 1 x TBE 완충물(89mM 트리스, 89mM 붕산, 2m EDTA.Na₂)중의 8%의 천연 폴리아크릴아미드 겔(프로토겔, 37.5:1 아크릴아미드:비스아크릴아미드, 내쇼날 디아그노스틱스, 아틀란타)에 부하시켰다. DNA 단편은, 4.5시간 동안 6W하에 0.6×TBE을 작용 완충액으로 사용하고 온도는 20℃로 유지시킨 상태로 수직 슬랩 겔(SE600 회퍼 사이언티픽 인스트루먼츠, 샌 프란시스코)에서 전기영동법을 통해 분리하였다.

(iv) 은 착색에 의한 DNA 분획의 가시화

전기이동후에 겔을 서서히 교반하면서 고정 용액중에서 20분간 배양하거나 또는 트랙킹 염료가 더 이상 보이지 않을때까지 배양하였다. 상기 겔을 탈이온수중에서 3회(교반하면서 각각 2분씩) 세척하였다. 이어서, 상기 겔을 교반하면서 착색 용액중에서 40분간 배양한 다음, 탈이온수중에서 간단히 (5 내지 10초) 세척하고, 전개 용액으로 곧장 옮겼다. 상기 겔을 전개 용액중에서 밴드가 명확히 보일때가지 배양한 다음, 동량의 고정 용액을 첨가함으로써 전개를 완료하였다. 최종적으로, 겔을 탈이온수중에서 2분간 세척하였다.

반응시약

고정 용액: 탈이온수중에 용해된 10% 빙초산

착색 용액: 2g 질산은(AgNO₃)

3ml의 37% 포름알데히드

2리터의탈이온수

전개 용액: 2리터의 탈이온수중에 용해된 60g의 탄산나트륨(Na₂CO₃).

사용하기 직전에 3ml의 37% 포름알데히드와 400ml의 나트륨

티오설페이트(10mg/ml)를 첨가함. 이 용액은 10 내지 12℃의

온도에서 사용해야한다.

(v) 결과

SSCP 분석법은 지금까지 우성 백색 표현형(도 1)을 지닌 동물에서만 발견되었던 다형태성 정보를 알려준다. 레인 1 내지 8 분석은 우성 백색을 지닌 Swedish Landrace 돼지에서 유래한 DNA에서 수행하였고, 레인 9 및 10의 DNA는 야생형 색깔의 야생 돼지에서 유래하였다. 다형태성 밴드가 표시되었다. 다형태성은 중복된 KIT 대립 유전자형 I을 지닌 동물에서만 존재하는 두 개의 독특한 분획에 의해 특징지워진다. 상기 중복된 것과 중복되지 않은 KIT 유전자의 중복체를 나타내는 다른 길이의 PCR 산물에서 유래한 DNA 가닥의 이종이본체를 나타낸다. 큰 백색 돼지/야생 돼지 이종교배에서 유래한 5가지 품종, 190마리의 F2 동물로 대표되는 40마리의 비관련 동물을 사용하는 상기 마커를 이용한 선별 시험의 결과는 하기 표 5에 제시하였다.

상기 결과는 특정 다형태성이 KIT 중복체의 존재와 매우 밀접한 관계가 있음을 나타낸다. 일부 백색 동물이 이종이본체 패턴을 나타내지 않는 것처럼 중복과 완전히 관련이 있는 것은 아니다. 따라서, 다형태성은 밀접하게 관련된 유전 마커의 예이며, 그 자체 또는 다른 연결 마커와 결합체인 상기 마커는 우성 백색 외피색으로 간주되는 다른 유전자형에 사용할 수 있다.

품종	색상	동물의 수	이종이본체
품종	색상	동물의 수	존재	부재
SWEDISH LANDRACE	백색	10	10	0
SWEDISH LAGE WHITE	백색	8	8	0
SWEDISH HAMPSHIRE	유색	10	0	10
SWEDISH DUROC	유색	10	0	10
야생 돼지	유색	2	0	2
큰 백색/야생 돼지이종교배	백색패치유색	131950	10600	25950

실시예 4

i) DNA 추출

DNA는 실시예 1에서와 같이 제조하였다.

ii) PCR

0.25ml들이 박벽 반응 튜브(퍼킨 엘머)중에 하기 반응물들을 장입하였다:

0.5ml 5μM KITDEL1-FOR 프라이머

0.5ml 5μM KITDEL1-REV 프라이머

1.0ml 2mM dNTPs (제약용)

1.0ml 15mM MgCl₂

1.0ml 10X 완충액

4.9ml 멸균 증류수

0.1ml 앰플리택 DNA 폴리머라제

1.0ml DNA 용해물

그 다음, 반응 튜브를 퍼킨 엘머 9600 서멀 사이클러에 넣고 하기 규정에 따라 PCR을 수행하였다.

94℃ 4분;

94℃ 30초, 60℃ 30초의 사이클, 및

72℃ 30초;

72℃ 4분;

4℃ 필요할때까지.

사용된 사이클의 횟수는 DNA 제공원으로서 사용된 조직에 따라 달라질 수 있다.

프라이머

순방향 TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG KITDEL1-FOR

역방향 CCAGCAGGACAATGGGAACATCT KITDEL1-REV

역방향 프라이머를 5' 말단에서 ABI 형광염료 FAM으로 표지화하였다.

iii) DNA 분획의 전기영동 및 정량

1㎕의 PCR를 1.5㎕의 탈이온화 포름아미드, 0.25㎕의 GS350 DNA 가닥, 0.25㎕ 적재 완충액(50mg/ml 청색 덱스트란, 25mM EDTA)와 함께 혼합하고, 90℃에서 2분간 가열한 다음, 얼음으로 급속히 냉각시키고, 이어서, 1.75㎕의 상기 반응물을 ABI 377DNA 순서결정장치에 넣고 DNA 분획을 3000V, 60mA, 200W 및 48℃ 조건하에서 두시간 동안 1x TBE 완충액중에서 4.12% 폴리아크릴아미드겔상에서 분리시켰다. 각각 결실부가 없는 KIT 유전자 주형과 결실부가 있는 KIT 유전자 주형에서 유래한 산물에 상응하는 97bp 및 93bp 분획을 밴드의 각 피크 영역을 측정하는 GeneScan 소프트웨어를 사용하여 정량하였다.

결과

하기 표에 제시된 데이터는 시험편에서 수득된 결과를 나타내며, DNA 용해물은 각각의 용해물에 대하여 수행되는 PCR 시험에 의해 공지의 유전자형인 20마리 동물 각각에서 생성되었다. 4개의 기본 쌍 결실부를 함유하지 않는 DNA 주형 : 결실부를 함유한 DNA 주형에서 유래한 생성물의 피크 영역의 비율을 계산하였다.

동물	유전자형	피크 영역 비율(결실부 부재/결실부 존재)
1	II	1.347
2	II	1.21
3	II	1.33
4	II	2.267
5	II	0.444
6	II	0.713
7	II	8.387
8	II	0.994
9	II	1.673
10	II	1.056

동물	유전자형	피크 영역 비율(결실부 부재/결실부 존재)
11	Ii	1.751
12	Ii	1.73
13	Ii	1.83
14	Ii	0.631
15	Ii	1.975
16	Ii	2.147
17	Ii	1.901
18	Ii	1.749
19	Ii	2.103
20	Ii	2.026

상기 작은 시료에 대하여 각각의 유전자형에 대한 규정 비율값(Ii에 대해서는 예상 비율이 2이고, II에 대해서는 1임) 사이의 중간인 수치 1.5를 동물을 두 개의 유전자형으로 구분하기 위한 수치로 사용하였다. 상기 표를 통해 7/10 II와 9/10 Ii가 정확한 유전자형으로서 식별되었다.

Claims

(i) 돼지 핵산 샘플을 얻는 단계; 및

(ii) 상기 단계 (i)에서 얻은 핵산을 분석하여KIT유전자 전체 또는 일부분의 복사체가 존재하는지를 측정하는 단계를 포함하여 돼지의 외피 색을 결정하는 유전자형의 측정 방법.
제1항에 있어서, 돼지 핵산이 게놈 DNA인 측정 방법.
제2항에 있어서, 단계 (ii)가 1회 이상의 PCR 사이클과 한쌍의 적합한 프라이머를 사용하여KIT유전자의 일부분 이상을 증폭하는 것을 포함하는 측정 방법.
제3항에 있어서, PCR 생성물의 양이 정량되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 한쌍의 프라이머가 다음 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.

GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCC

CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG;

GG(C/T)AATCACATGAATATTGTGAA

TCACCATAGCAACAATATTCTGT;

TC(A/G)TACATAGAAAGAGA(C/T)GTGACTC

CCTTT(A/G)ACCAC(A/G)TAATT(A/C)GAATC; 또는

GTGATG(A/G)T(G/T)CT(C/G)ACCTACAAATA

GTCTATGTAAACATAATTGTTTCC.
제3항 또는 제4항에 있어서, 한쌍의 프라이머가KIT유전자의 경계에 위치한 고유 영역 및 중복 영역에 하이브리드하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제3항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, 측정 방법이 내부 표준물과의 비교 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제7항에 있어서, 내부 표준물이 한쌍의 적합한 프라이머를 사용하는 1회 이상의 PCR 사이클에 의하여 다른 뉴클레오티드 서열의 일부분 이상을 증폭시키므로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제8항에 있어서, 내부 표준 PCR 생성물의 양이 정량되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 내부 표준 PCR 생성물이 근육의 칼슘 방출 통로(CRC) 유전자의 서열중 일부 이상을 증폭시키므로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제10항에 있어서, 내부 표준 PCR 반응에 하기와 같은 프라이머 쌍이 사용되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.

CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGT 및

AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC.
제10항에 있어서, 내부 표준 PCR 반응에 하기와 같은 프라이머 쌍이 사용되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.

GATGAACTTTGAGGTCCCTGAGGAG 및

TTTCTTCTGAGAATGCCGAAGATCTG.
제8항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 내부 표준 PCR 반응이KIT서열의 증폭과 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서,KIT영역의 복사체 : 내부 표준 영역의 복사체의 비가 측정되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서, 추가로 (iii) 존재하는 모든 중복체가 I 또는 I^P의 존재에 의한 것인지를 결정하는 단계를 포함하는 측정 방법.
제14항에 있어서, 하나 이상의 중복 영역에 있어서의 결실부의 존재 유무가 결정되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제16항에 있어서, 비결실 영역의 복사체 : 결실 영역의 복사체의 비가 결정되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
(i) 돼지의 게놈 DNA 샘플을 얻는 단계;

(ii) 단계 (i)의 게놈 DNA를 하나 이상의 적합한 프라이머와 하이브리드하는 단계;

(iii) 단계 (ii)에서 하이브리드화된 핵산을 사용하여 1회 이상의 PCR 사이클을 수행하는 단계; 및

(iv) PCR 반응 생성물의 양을 측정하는 단계를 포함하여 돼지의 외피 색을 결정하는 유전자형을 측정하는 방법.
제18항에 있어서, 추가로 (v) 존재하는 모든 중복체가 I 또는 I^P의 존재에 의한 것인지를 결정하는 단계를 포함하는 측정 방법.
제19항에 있어서, 하나 이상의 중복 영역에 있어서의 결실부의 존재 유무가 결정되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제18항 내지 제20항중 어느 한 항에 있어서, 제6항 내지 제14항에 기재된 특징중 어느 하나 이상의 특징으로 변화된 것을 특징으로 하는 측정 방법.
(i) 돼지KIT단백질의 샘플을 얻는 단계; 및

(ii) 단계 (i)에서 얻은 단백질을 분석하여KIT유전자 전체 또는 그 일부분의 중복체가 존재하는지를 측정하는 단계를 포함하여, 돼지의 외피 색을 결정하는 유전자형의 측정 방법.
제22항에 있어서, 단계 (ii)가 상기 단백질과 하나 이상의 항체를 반응시키므로써 수행되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제23항에 있어서, 상기 방법이 ELISA인 것을 특징으로 하는 측정 방법.
KIT서열 전체 또는 그 일부분의 중복체가 존재함을 나타낼 수 있는 1종 이상의 시약을 함유하여 돼지의 외피 색을 결정하는 유전자형을 측정하기 위한 키트.
제25항에 있어서, 키트가 돼지의 게놈 DNA 샘플이 사용될 수 있도록 맞춰진 것임을 특징으로 하는 키트.
제25항 또는 제26항에 있어서, 한쌍 이상의 프라이머와 함께 PCR을 수행하기 위한 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
제27항에 있어서, 한쌍의 프라이머가 다음과 같은 군중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 키트.

GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCC

CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTG;

GG(C/T)AATCACATGAATATTGTGAA

TCACCATAGCAACAATATTCTGT;

TC(A/G)TACATAGAAAGAGA(C/T)GTGACTC

CCTTT(A/G)ACCAC(A/G)TAATT(A/C)GAATC; 또는

GTGATG(A/G)T(G/T)CT(C/G)ACCTACAAATA

GTCTATGTAAACATAATTGTTTCC.
제27항에 있어서, 한쌍의 프라이머가KIT유전자의 경계에 위치한 고유 영역 및 중복 영역에 하이브리드하는 것을 특징으로 하는 키트.
제26항 내지 제29항중 어느 한 항에 있어서, 1회 이상의 PCR 사이클에 의하여 다른 뉴클레오티드 서열의 일부 이상을 증폭시키는 제2의 프라이머 쌍을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
제30항에 있어서, 제2의 프라이머 쌍이 근육의 칼슘 방출 통로(CRC) 유전자 서열의 일부 이상에 하이브리드하는 것을 특징으로 하는 키트.
제31항에 있어서, 제2의 프라이머 쌍이 다음과 같은 서열을 가진 것을 특징으로 하는 키트.

CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGT 및

AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTC.
제30항에 있어서, 제2의 프라이머 쌍이 돼지 인터페론-β 유전자 서열의 일부 이상에 하이브리드하는 것을 특징으로 하는 키트.
제33항에 있어서, 제2의 프라이머 쌍이 다음과 같은 서열을 가진 것을 특징으로 하는 키트.

GATGAACTTTGAGGTCCCTGAGGAG 및

TTTCTTCTGAGAATGCCGAAGATCTG.
제25항에 있어서,KIT단백질과 반응할 수 있는 1종 이상의 항체를 함유하는 키트.
(i) 돼지 핵산 샘플을 얻는 단계; 및

(ii) 단계 (i)에서 얻은 핵산을 분석하여KIT유전자 서열내의 결실부의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하여 돼지의 외피 색을 결정하는 유전자형의 측정 방법.
제36항에 있어서, 돼지 핵산이 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서, 단계 (ii)가 1회 이상의 PCR 사이클과 한쌍의 적합한 프라이머에 의하여KIT유전자의 일부 이상을 증폭시키는 것임을 특징으로 하는 측정 방법.
제38항에 있어서, 한쌍의 프라이머가 다음과 같은 것임을 특징으로 하는 측정 방법.

TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG

CCAGCAGGACAATGGGAACATCT; 또는

GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGAT

AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAG.
제36항 내지 제39항중 어느 한 항에 있어서, I와 i를 구별하는데 사용되는 것임을 특징으로 측정 방법.
KIT서열내의 결실부의 존재 유무를 나타낼 수 있는 1종 이상의 시약을 함유하여, 돼지의 외피 색을 결정하는 유전자형을 측정하기 위한 키트.
제41항에 있어서, 키트가 돼지의 게놈 DNA 샘플이 사용될 수 있도록 맞춰진 것임을 특징으로 하는 키트.
제41항 또는 제42항에 있어서, 한쌍 이상의 프라이머와 함께 PCR을 수행할 수 있는 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
제43항에 있어서, 한쌍의 프라이머가 다음중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 키트.

TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG

CCAGCAGGACAATGGGAACATCT; 또는

GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGAT

AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAG.