KR101997453B1 - 한우 f11 결핍증의 진단용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한우 F11 결핍증의 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 한우 F11 결핍증을 효과적으로 진단할 수 있으며, 현장에서 신속정확하게 질병개체뿐만 아니라 보인자 개체를 선별할 수 있으므로, 청정한 한우 집단을 유지하기 위해 사용될 수 있을 것이다.

Description

한우 F11 결핍증의 진단용 조성물 및 이의 용도{Composition for diagnosis of Korean native cattle F11 deficiency and uses thereof}

본 발명은 한우 F11 결핍증의 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

F11 인자(Plasma thromboplastin antecedent, PTA)는 혈액응고 초기단계 반응에 관여하는 혈장 세린(serine) 단백질분해 조효소이다. F11 유전자는 소(Bos Taurus)의 27번 염색체 내 위치하고 있으며, 15개의 엑손과 14개의 인트론으로 구성되어 있다. F11 결핍증은 열성 상염색체의 형태로 유전되는 출혈성 질환으로, 인간, 개, 소 등과 같은 여러 포유동물에서 나타날 수 있다. F11 결핍증의 증상은 상대적으로 경미하고, 유사 혈우병들에서 나타날 수 있는 자연출혈, 관절출혈 등과 같은 증상이 드물게 나타난다.

현재까지 한우의 유전병에 관한 연구가 일부 보고되어 있지만, 이를 모니터링하는 후보유전자 체계가 확립되어 있지 않아 종모우(씨수소)와 종빈우(암소)의 유전병의 검사 및 연구가 미미한 실정으로, F11 결핍증과 같이 증상이 경미한 유전병의 존재를 판단하기 어렵다. 또한 한우는 후대검정을 통해 선발된 보증씨수소를 인공수정 기법을 통해 전국으로 공급하기 때문에 불량 유전자를 보유한 질환 개체 및 보인자 개체의 선별은 필수적이다.

기존에 알려진 F11 결핍증의 확인 방법으로는 APPT(activated partial thromboplastin) 스크리닝 검사를 통해 F11의 활성도를 측정하는 방법이 있다. APPT 검사는 질환 개체(열성동형접합체)와 정상 개체를 명확하게 구분할 수 있지만, 보인자 개체(이형접합체)의 경우 F11 활성도의 범위가 정상 개체의 범위와 일부 중복되어 명료한 구분이 어렵다.

한편, 한국등록특허 제1228224호에는 '혈우병 Ａ를 야기하는 신규한 ＦⅧ 유전자 돌연변이체 및 이의 용도'에 대해 기재되어 있고, 한국등록특허 제1667363호에는 '혈액 응고인자 Ⅷ 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제 및 이를 포함하는 혈우병 치료용 조성물'이 기재되어 있으나, 본 발명의 한우 F11 결핍증의 진단용 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 한우 F11 유전자의 엑손 9번 내에 삽입된 15 bp 크기의 InDel 서열을 확인할 수 있는 프라이머 세트 및 프로브를 제작하였고, 한우를 대상으로 상기 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 분석을 수행한 결과, F11 결핍증에 대한 정상 개체, 보인자 개체(이형접합체) 및 질환 개체(열성동형접합체)를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;와 서열번호 9 또는 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 한우의 F11 결핍증 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 한우의 F11 결핍증을 진단하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 한우의 F11 결핍증을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 한우에서 F11 결핍증에 대한 정상 개체 및 질환 개체뿐만 아니라 보인자 개체도 효과적으로 구별할 수 있으므로, 한우에서 F11 결핍증에 대한 열성대립유전자가 후대에 전달되는 것을 방지할 수 있어, 불량 형질이 없는 청정한 한우 집단 유지를 위한 유전자 검사 방법으로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 F11 결핍증의 일본흑우형(a) 또는 흘스타인형(b) 진단을 위한 프라이머 세트의 위치 정보와 PCR 결과 패턴을 모식화한 것이다.
도 2는 한우 F11 결핍증의 유형을 확인하기 위해 한우 7두를 대상으로 F11 유전자의 엑손 9(A) 및 엑손 12번(B)을 대상으로 프라이머 세트를 제작하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. (+/+); 정상 개체, (+/-); 보인자 개체.
도 3은 F11 결핍증에 대한 보인자 개체로 판정된 한우의 F11 유전자 엑손 9번의 시퀀싱 결과이다.
도 4는 본 발명의 한우 F11 결핍증 진단을 위한 실시간 PCR용 프라이머 세트 및 프로브의 위치를 엑손 9번 서열 상에 나타낸 것이다.
도 5는 한우 F11 결핍증의 유전자형을 분석하기 위해 형광물질이 결합된 프로브를 이용한 실시간 PCR의 결과이다. (A); 한우 게노믹 DNA 5 ng/㎕를 시료로 한 유전자형 분석, (B); DNA 추출과정이 없이 PrimePrep Direct PCR Reagent를 이용하여 유전자형 분석, (C); 5 ng/㎕의 게노믹 DNA를 10~60배 희석하여 유전자형 분석. Wild type; 정상 개체, Carrier type; 보인자 개체(이형접합체), Mutant type; 질환 개체(열성동형접합체), No call; 음성 시료.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;와 서열번호 9 또는 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 한우의 F11 결핍증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 한우 F11 유전자의 엑손 9번을 표적으로 하는 프라이머로, 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향(forward) 프라이머이고, 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머이다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 7 및 8의 서열 내의 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 7의 프라이머(26개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 7의 서열 내의 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 서열번호 7 및 8의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명의 서열번호 9 또는 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프로브는 대립유전자(allele) 특이적 프로브로서, 각각 한우 F11 유전자의 엑손 9번의 정상적인 대립유전자 또는 열성 대립유전자에 결합하는 프로브이고, 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프로브는 엑손 9번 상의 15 bp 크기의 삽입 서열을 포함하는 프로브이다. 또한, 상기 프로브는 형광물질과 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 한우의 F11 결핍증 진단용 조성물에 있어서, 상기 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 프로브는 한우 정상 개체; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프로브는 한우의 F11 결핍증 개체 및 보인자 개체(이형접합체)를 진단할 수 있다.

본 발명에서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명에서, "프로브"는 혼성화(hybridization) 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 다형성 여부에 따른 대립유전자 특이적으로 혼성화하게 된다.

본 발명의 일 구현예에 따른 한우의 F11 결핍증 진단용 조성물에 있어서, 상기 프로브는 정량적 PCR에 이용되는 TaqMan 프로브의 형태로 디자인된 것으로, 각기 다른 형광물질(FAM 또는 VIC)을 부착하여 제조하였다. TaqMan 프로브는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 형광물질(reporter)로, 3' 말단은 소광물질(quencher)로 태깅(tagging)된 프라이머의 일종으로, TaqMan 프로브는 결합(annealing) 단계에서 주형(template) DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브의 3' 말단에 소광물질이 있기 때문에 빛을 주어도 형광을 발하지 못하지만, 다음 과정인 신장(extension) 단계에서 Taq DNA 중합효소가 가지고 있는 5'→3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성에 의해 주형에 혼성화된 TaqMan 프로브가 분해되면 형광물질이 프로브로부터 분리되어 소광물질에 의한 억제가 해제되고 형광을 발하게 되는 원리를 통해 PCR 반응에 따른 형광이 정량적으로 발하게 된다.

상기 형광물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 또는 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등의 염료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 소광물질은 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, 또는 IRDye QC-1 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 한우의 F11 결핍증을 진단하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 한우 F11 유전자의 엑손 9번의 정상적인 대립유전자 또는 열성 대립유전자에 특이적으로 결합하는 프로브 및 상기 프로브 위치를 포함하며 엑손 9번 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 유효성분으로 포함하고 있어, 한우 정상 개체, F11 결핍증 개체 및 보인자 개체(이형접합체)를 진단할 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 PCR 키트, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있고, 바람직하게는 PCR 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, PCR 키트는, 표적 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 및 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-중합효소, DEPC-수(DEPC-water) 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 한우의 F11 결핍증 진단용 조성물 또는 상기 한우의 F11 결핍증을 진단하기 위한 키트를 이용하여 한우의 F11 결핍증을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 한우 F11 결핍증 진단은 실시간(real-time) PCR을 통해 수행될 수 있으며, 상기 실시간 PCR은 각 PCR을 지수함수적으로 증가하는 범위 내에서 비교하기 위해 매 시기의 PCR 진행 상황을 실시간으로 모니터링하는 방법이다. 본 발명에 따른 진단 방법은, 다른 종류의 형광물질이 결합된 대립유전자 특이적 프로브를 이용함으로써 형광물질의 패턴 분석을 통해 결과를 쉽게 분석할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 공시축 및 DNA 추출

공시축은 한우 보증씨수소(KPN)와 농가(영암군, 함안군 및 양구군) 자체 내 종빈우(breeding cow) 사이에서 생산한 한우 F1 집단(영암군 10개 농가; 776 마리, 함안군 15개 농가; 822 마리 및 양구군 10개 농가; 445 마리), 총 2,043 마리를 실험에 사용하였다.

우선, 상기 한우에서 채취한 혈액 샘플을 300 xg의 속도로 원심분리하여 버피코트(buffy coat)에 위치한 백혈구층을 분리하였다. 분리된 백혈구층에서 DNA를 추출하기 위해, PrimePrep^TM Genomic DNA isolation 키트(제넷바이오, 한국)를 이용하여 게노믹 DNA를 추출하였고, 상기 추출된 DNA는 Nanodrop^TM 2000c 분광광도계(Thermo Scientfic, 미국)를 이용하여 DNA의 농도와 품질을 측정하였으며, QC 과정을 거친 DNA 샘플은 동일한 PCR 증폭을 위해 25 ng/㎕의 농도로 희석하였다.

또한, 한우의 혈액 샘플에서 DNA를 추출하기 위해, PrimePrep Direct PCR Reagent(제넷바이오, 한국)를 이용하였다. 상기 원심분리하여 수득된 백혈구층 5 ㎕와 시약 용액 100 ㎕를 1:20의 비욜로 혼합하고, 10분 동안 95℃에서 반응한 후 원심분리하여 상층액을 얻어 3차 증류수에 20배 희석하여 TaqMan assay를 통해 유전자형 분석(genotyping)을 수행하였다.

2. PCR 증폭 및 유전자형 분석

소의 F11 결핍증 발병의 원인변이는 품종에 따라 크게 2가지로 나눌 수 있다. 첫 번째는 홀스타인에서 나타나는 변이로 F11 유전자의 엑손 12번 내 76 bp의 염기 삽입으로 인해 발생된 종결코돈에 의한 발병(Marron et al. 2004, Animal Genetics, 35:454-456)과, 두 번째는 일본흑우에서 나타나는 F11 결핍증으로 F11 유전자의 엑손 9번 내 15 bp의 염기 삽입 및 삽입 말단부의 사이토신(cytosine)에서 아데닌(adenine)으로 전환되는 단일염기다형(single nucleotide polymorphism, SNP)에 의한 아미노산 서열의 변화로 인한 발병이 있다(Masaki et al. 2005, Mammalian Genome, 16:383-389).

본 발명자들은 한우의 F11 결핍증의 원인변이를 확인하기 위해, 홀스타인형 F11 유전자의 엑손 12번(primer 1) 및 일본흑우형 F11 유전자의 엑손 9번(primer2 및 primer3) 염기서열 내 변이 위치를 증폭할 수 있는 3쌍의 특이적인 프라이머 세트를 제작하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다(표 1).

PCR 반응물은 엑손 12번(홀스타인형)의 경우 각 한우 개체로부터 추출된 게노믹 DNA 50 ng/㎕, Prime Taq 10X buffer 2 ㎕, 2.5mM dNTP 2 ㎕, 2.5 unit의 Prime Taq polymerase(제넷바이오, 한국), 정방향 및 역방향 프라이머 1(10 pmol/㎕) 각각 0.8 ㎕ 및 증류수를 혼합하여 총 20 ㎕이 되도록 하였으며, 9번 엑손(일본 흑우형)의 경우 2x Multi HS prime Taq Premix 10 ㎕(제넷바이오, 한국), 정방향 및 역방향 프라이머 2(10 pmol/㎕) 각각 0.5 ㎕, 또는 정방향 및 역방향 프라이머 3(10 pmol/㎕) 각각 0.65 ㎕를 제외한 나머지는 상기 엑손 12번(홀스타인형)과 같이 혼합하여 사용하였다.

PCR 증폭조건은 엑손 12번(홀스타인형)의 경우 95℃에서 5분간 전변성(pre-denaturation)한 후 95℃에서 30분간 변성(denaturation), 53℃에서 30초간 결합(annealing), 72℃에서 30초간 신장(extension) 과정을 한 사이클로 구성하였으며, 상기 사이클을 총 35번 반복한 후 72℃에서 5분간 최종 신장(final extension)을 수행하였다. 또한, 9번 엑손(일본 흑우형)의 경우 결합 단계의 온도를 64℃로 설정한 것 외에는 12번 엑손과 동일한 조건으로 증폭을 수행하였다. 각 샘플은 3.5% 아가로스겔을 150 V 전압으로 25분간 전기영동하였고, 분리된 DNA 단편을 통해 유전자형을 구분하였다.

3. 시퀀싱 및 유전자형 분석

PCR 증폭 산물의 정확한 염기서열을 확인하기 위해 직접염기서열분석법(direct sequencing; www.cosmogentech.co.kr)을 수행하였으며, 유전자형을 분석한 총 376마리의 한우 중 정상 개체 10마리와 보인자(이형접합체) 개체 3마리의 순수화된 증폭 산물의 염기서열 정보를 획득하였다. 획득된 염기서열 정보는 BioEdit Sequence Alignment Editer program(BioEdit, 미국)을 이용하여 비교·분석하였다.

4. TaqMan Genotyping 분석법 및 유전자형 분석

한우에서 확인된 F11 결핍증 진단을 신속 간편하게 확인하기 위해서, 실시간(real-time) PCR로 확인이 가능한 TaqMan Genotyping 분석을 수행하였다. 한우에서 발견된 F11 유전자의 엑손 9번 영역의 삽입변이를 확인하기 위해 형광물질인 VIC과 FAM이 각각 결합된 프로브(서열번호 9 또는 서열번호 10)를 제작하였으며, 프로브 염기서열의 정보는 상기 표 1과 같다. TaqMan Genotyping 분석을 위해, 희석된 DNA 1 ㎕, Universe Master mix 5 ㎕, 정상 대립유전자 특이적 프로브(Normal probe, 서열번호 9) 및 열성 대립유전자 특이적 프로브(Mutant probe, 서열번호 10) 각각 0.25 ㎕ 및 3차 증류수 3.5 ㎕를 혼합하여 총 10 ㎕이 되도록 하였다. 유전자형 분석은 실시간 PCR(Bio-Rad, 미국)을 통해 정상 및 질환 개체를 각각 FAM과 VIC의 형광색으로 분리하였다.

또한, TaqMan Genotyping 분석의 시간을 단축하고 효율성을 제고하기 위해, 서로 다른 실험 조건을 설계하여 유전자형 분석 결과를 비교하였다. 첫 번째는 5 ng/㎕ 농도의 게노믹 DNA로 유전자형을 분석하는 방법, 두 번째는 최소한의 DNA 농도(5 ng/㎕의 DNA를 10~60배로 희석)로 유전자형을 확인하는 방법, 세 번째는 백혈구층 시료에서 DNA 추출과정이 없이 PrimePrep Direct PCR reagent를 이용하여 바로 유전자형을 분석하는 방법, 총 3가지 방법의 효율성과 결과를 비교·확인하였다.

실시예 1. PCR을 통한 한우의 F11 결핍증 원인 분석

한우에서의 F11 결핍증의 원인을 확인하기 위해, 한우 F11 유전자의 엑손 12번 및 9번 내 염기서열의 삽입 변이를 확인할 수 있는 프라이머 세트(표 1)를 각각 이용하여 PCR 증폭과 전기영동을 수행하였다.

그 결과, 7두의 한우 개체에서 F11 유전자의 9번 엑손 내에 삽입 변이가 있는 개체들이 일부 확인되었다(도 2A). 또한, 엑손 12번 변이에 대해서는 변이가 전혀 확인되지 않아(도 2B), 한우 F11 결핍증은 홀스타인형(엑손 12번 변이)이 아닌, 일본 흑우형(엑손 9번 변이)과 같음을 확인하였다.

일본 흑우형 F11 결핍증의 전기영동의 결과는 유전자형에 따라 세 가지의 밴드 양상을 보인다. 정상 개체의 경우 프라이머 서열번호 3과 서열번호 6에 의해 485 bp의 밴드와, 서열번호 3과 서열번호 4에 의한 342 bp의 밴드를 나타내어 총 두 줄의 밴드가 확인된다. 또한, 이형접합 개체의 경우 프라이머 서열번호 3과 서열번호 6에 의해 500 bp의 밴드, 서열번호 3과 서열번호 5에 의해 342 bp의 밴드 및 서열번호 5와 서열번호 6에 의해 179 bp의 밴드를 나타내어 총 세 줄의 밴드가 확인된다. 마지막으로 질환 개체의 경우 서열번호 3과 서열번호 6에 의한 500 bp 밴드와, 서열번호 5와 서열번호 6에 의한 179 bp의 밴드를 나타내어 총 두 줄의 밴드가 확인된다. 따라서 일본 흑우형 F11 결핍증 유전형을 보유한 경우 179 bp의 밴드를 나타낸다(도 1a). 유사하게 홀스타인형 F11 결핍증 또한 유전자형에 따라 세 가지의 밴드 양상을 보이게 된다. 홀스타인형 F11 결핍증의 경우 76 bp의 염기가 삽입되는 변이로 1종의 프라이머 세트만으로도 변이 진단이 가능하다. 정상 개체의 경우 287 bp의 단일 밴드를 나타내며, 이형접합 개체의 경우 363 bp 및 287 bp의 두 줄의 밴드를 나타내며, 질환 개체의 경우 363 bp의 단일 밴드를 나타내게 된다. 따라서 홀스타인형 F11 결핍증 유전형을 보유한 경우 363 bp의 밴드가 나타난다(도 1b).

또한, 보다 정확한 결과 확인을 위해 이형접합 상태의 DNA의 염기서열을 분석한 결과, 한우의 이형접합 개체의 염기서열에서 일본 흑우에서 나타났던 변이 양상과 같이 15 bp 크기의 염기 삽입 및 삽입 말단부의 사이토신(cytosine)에서 아데닌(adenine)으로 전환되는 SNP가 이형접합체 상태로 나타났고, 삽입 말단 부위 SNP를 기점으로 이전 염기서열이 중복되어 나타나는 것으로 보아 삽입 변이가 존재함을 다시 한 번 확인할 수 있었다(도 3).

실시예 2. 한우 실험집단에서 F11 결핍증 개체 빈도 확인

한우에서 발견되는 F11 결핍증은 엑손 9번 내에 15 bp 크기의 염기가 삽입되어 발생하는 것으로, 총 2,043 마리의 한우 중 1,981 마리(96.97%)의 한우가 정상 개체, 62 마리(3.03%)의 한우가 보인자 개체(이형접합체)로 확인되었고 F11 결핍증 질환 개체(열성동형접합체)는 발견되지 않았다. 따라서, 실험집단에서 F11 결핍증은 약 1.52% 정도의 유전자 빈도를 갖는 것으로 확인되었다(표 2).

장소	개체수	표현형			유전자형 빈도 (Genotype frequency, %)
		정상개체 (wild type)	보인자 (carrier type)	질환개체 (mutant type)
영암(Yeongam)	776	752	24	0	1.546
함안(Haman)	822	796	26	0	1.581
양구(Tanggu)	445	433	12	0	1.348
합계	2,043	1,981	62	0	1.517

또한, 보인자를 나타낸 개체의 생산이력을 조사한 결과, 보인자 개체의 아비소인 보증종모우 KPN 872, 879, 919 등이 일부 중복되어 나타나는 것을 확인하였으며(표 3, 4 및 5), 이를 통해, 보인자 개체의 생성 원인이 보증종모우와 암소 모두에 있을 가능성이 있음을 알 수 있었고, 한우의 F11 결핍증에 대해 보증종모우(KPN) 및 암소의 추가적인 조사가 필요한 것으로 판단되었다.

실험집단에서 열성동형접합 개체가 발견되지 않은 것은, 본 연구의 연구집단의 샘플이 살아있는 개체를 중심으로 혈액샘플을 채취하여 사용하여 열성동형접합 개체의 번식장애 혹은 수태율의 문제로 인한 것일 수 있으므로, 한우의 F11 결핍증 표현형에 대한 정확한 측정 및 후대 생산 능력을 확인 및 검증할 필요가 있을 것으로 사료된다. 또한 실용축뿐만 아니라 보증종모우(KPN)에서도 선발 과정 중 F11 결핍증 검사를 통해 한우의 생산성을 저해하는 질병과 관련된 유전자를 보유하고 있는 개체를 도태하는 계획을 수립할 필요가 있을 것으로 판단되었다.

실시예 3. TaqMan Genotyping 분석 결과

한우의 F11 결핍증에 대한 열성동형접합뿐만 아니라 이형접합에 대한 정확한 진단을 위해, 다양한 조건에서 Taq Man genotyping 분석법을 수행하였으며, TaqMan genotyping 분석법에 사용된 프로브와 결합된 형광물질 FAM과 VIC의 색에 따라 분리하였다.

그 결과, 5 ng/㎕의 게노믹 DNA로 유전자형을 분석한 경우 정상 개체(Wild type, 주황색 동그라미)와 보인자 개체(Carrier type, 초록색 세모)가 명확하게 구분되는 것을 확인하였다(도 5A). 또한, 질병 개체로부터 DNA 추출에 소요되는 시간을 절약할 수 있는 방법을 찾기 위해 PrimePrep Direct PCR Reagent를 이용한 결과, 기존에 약 3시간가량 소요되었던 DNA 추출 시간을 약 10분 내외로 감소시킴으로써, 혈액 샘플에서 F11 결핍증 진단까지 소요되는 시간을 총 2시간 내외로 절약할 수 있었다(도 5B).

또한, 유전자형 확인에 요구되는 최소한의 DNA 농도를 확인하기 위해 5 ng/㎕의 게노믹 DNA를 3차 증류수로 10~60배 희석하여 유전자형을 분석한 결과, 약 83.3 pg/㎕ 농도의 극소량 DNA로도 한우의 F11 결핍증의 진단이 가능함을 알 수 있었다(도 5C).

이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 한우 F11 결핍증 진단 방법은 정상 개체 및 질환 개체뿐만 아니라 보인자 개체 또한 신속 정확하게 진단할 수 있는 매우 효율적인 방법인 것으로 확인되었다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Composition for diagnosis of Korean native cattle F11 deficiency and uses thereof <130> PN17322 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agcggcattt tgaatcaatc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atggactgaa aggggagctt 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 actttcaaaa tgggaactcc ttcc 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atggcagaac actgcacagc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgctgtgcag tgttatatgt gc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttgcacgatt cttgagatgg 20 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 7 gttttgcctt tcacatctca atatgt 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 8 gaaatcagtg ttgcgataga atgaag 26 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 ctgtgcagtg ttctg 15 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 10 atatgtgcag aatatatgcc 20

Claims (6)

1. 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;와 서열번호 9 또는 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 한우의 F11 결핍증 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 프로브는 한우 정상 개체; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프로브는 한우 F11 결핍증의 보인자 개체(이형접합체)를 진단하는 것을 특징으로 하는, 한우의 F11 결핍증 진단용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 형광물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 한우의 F11 결핍증 진단용 조성물.
4. 제1항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 한우의 F11 결핍증을 진단하기 위한 키트.
5. 제1항에 따른 조성물 또는 제4항에 따른 키트를 이용하여 한우의 F11 결핍증을 진단하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 진단은 실시간 PCR을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 한우의 F11 결핍증을 진단하는 방법.

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