KR100318089B1

KR100318089B1 - 에드와드시엘라타르다16srrna의검출에사용되는프로브와그제작방법

Info

Publication number: KR100318089B1
Application number: KR1019980049662A
Authority: KR
Inventors: 심두생; 김재호; 김형락; 이주석; 손상규
Original assignee: 대한민국(관리청:특허청장, 승계청:국립수산진흥원장)
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1998-11-19
Publication date: 2002-05-13
Also published as: KR20000033007A

Abstract

본 발명은 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)의 16S rRNA 검출에 사용되는 올리고 뉴클레오타이드 프로브 (probe) 및 그 제작방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)로부터 분리한 서열 10의 16S rRNA, 이로부터 얻어진 특정 서열의 올리고 뉴클레오타이드를 포함하여 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)를 검출하는 올리고 뉴클레오타이드 프로브(probe)는 기존의 올리고 뉴클레오타이드 프로브에 비해 교차 반응이 현저히 감소된, 감도가 높고 특이성이 향상된 프로브이며, 본 발명의 PCR을 이용하는 다중체 프로브의 제조방법은 간단하고 신속하게 특이성이 우수한 다중체 프로브를 제조할 수 있는 경제적인 프로브 제조방법이다.

Description

에드와드시엘라 타르다 16ＳｒＲＮＡ의 검출에 사용되는 프로브와 그 제작방법

본 발명은 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)의 16S rRNA 검출에 사용되는 올리고 뉴클레오타이드 프로브 (probe) 및 그 제작방법에 관한 것으로, 구체적으로 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)로부터 분리한 서열 10의 16S rRNA, 이로부터 얻어진 특정 서열의 올리고 뉴클레오타이드를 포함하여 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)를 검출하는 올리고 뉴클레오타이드 프로브(probe) 및 PCR을 이용하는 다중체 프로브의 제조방법에 관한 것이다.

에드와드시엘라 (Edwardsiella)속은 1962년 일본에서 처음으로 사카자키(Sakazaki)에 의해 크기는 1×2∼3㎛이고 그람 음성인 비포자형성균으로 보고되었다 (Sakazaki, R.,Japanese J. Bac.,17, 616∼617, 1962). 이들 에드와드시엘라 속 중에서 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)와 에드와드시엘라 이크탈루리르 (Edwardsiella ictalurir)가 주요 병원성 세균으로 해양과 냉혈동물에서 많이 발견되고 있다 (Hawke, J. P.,Journal of the Fisheries Research Board of Canada,36, 1508∼1512, 1979; Hoshinae, T.,Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries,28, 162∼164, 1962). 특히 E. 타르다는 아시아와 미국의 온난성 어류에서 주로 발견되는 병원성 세균으로 해양 동물과 진흙 속에 분포하고 있으며, 이 세균에 의해 감염된 양식어나 어류를 사람이 섭취할 경우 식중독을 비롯한 다른 여러 가지 질병을 유발하게 된다. 특히 E. 타르다에 치어가 감염될 경우에는 치어의 사망률이 증가하므로 이를 방제하기 위해 항생제가 남용되고 있으며, 이로 인한 환경 오염이 초래되고 있다. 따라서, 양식장에서의 E. 타르다의 초기 감염시에 이를 진단할 수 있는 신속한 진단법이 시급히 요구되고 있다.

이러한 병원성 균의 동정을 위하여 사용되는 기존의 방법은 그람 염색, 다양한 성분을 함유하는 배지에서의 성장, 생화학적 방법에 의한 분류 등의 방법들이 사용되어 왔으나 이와 같은 방법을 이용하여 균을 동정할 경우 많은 시간과 비용이 요구된다 (Amann, R. L.,et al.,Microbiol. Rev.,59, 143∼169, 1995; P. Vandamme, B. POT. M,MIcrobiol. Rev.,60, 407∼438, 1996). 또한, 세포의 성장 및 기능에 기초를 둔 표현형 (phenotype)을 이용하는 방법은 기본적으로 순수배양이 되어야 하지만, 현재까지의 배양기술로 순수 배양할 수 있는 미생물은 전체 미생물 중 단지 0.1% 이하로 그 범위가 한정되어 있다. 이와 같은 이유들로 인해 기존의 표현형에 기초를 둔 방법들은 한계를 나타내고 있다.

최근에는 DNA 염기 조성, DNA-DNA 하이브리디제이션 (hybridization), 염색체 서열 분석 (gene sequencing), 내열성 DNA 중합효소를 이용한 PCR (polymerase chain reaction) 등과 같은 기술의 발달로 인해 이들 기술을 이용한 새로운 동정 방법들이 개발되고 있다 (Edward F. Delong,TIBTECH,15, 203∼207, 1997; Greene C. J.,et al.,Gene,37, 261∼266, 1985; Philip Hugenholtz and Norman R. Pace,TIBTECH,14, 190∼198, 1996). 이들 방법 중 16S 또는 18S 등의 소단위 리보솜 RNA (small-subunit ribosomal RNA, rRNA) 유전자에 기초를 둔 DNA 프로브 (probe)의 설계 및 하이브리디제이션에 의한 검출 방법은 현장에서 용이하게 적용할 수 있어 이미 이를 이용한 여러 가지 프로브들이 개발되어 상업화되었다 (Johnson, J. L.,Bergey's manual of systematic bacteriology, vol.4, The williams & Wilkins Co., Baltimore, 1989;Plasmodium falciparumdetection kit, Bioneer, KOREA). 특히, 소단위 rRNA는 미생물의 세포 내에 수천 개의 복제수가 존재하기 때문에 하이브리디제이션시 정확성이 높고 짧은 시간에 진단할 수 있으므로 이를 이용한 프로브의 검색 및 이용에 대하여 많은 연구가 진행되고 있다 (Edward F. Delong,TIBTECH,15, 203∼207, 1997).

미생물의 16S rRNA 염색체의 염기 서열은 원핵 생물 사이에서 유사성을 지니고 있으며 각각의 박테리아에 대해 특이적인 염기 서열 부분이 존재한다 (Hoshina, S.,et al.,Diagn Microbiol. Infect. Dis.,13, 473∼479, 1990; Relman, D. A.,et al.,N. Engl. J. Med.,327, 293∼301; Angert, E. R.,et al.,Nature,326, 239∼241, 1993) . 특히 16S rRNA 유전자의 진화 속도는 다른 유전자들에 비해 늦기 때문에 이들 유전자의 염기서열을 분석함으로써 특정 생물에 특이적으로 DNA-DNA 하이브리디제이션을 하는 올리고 뉴클레오타이드 (oligo nucleotide) 프로브를 제작할 수 있다 (Amann, R. L.,et al.,Microbiol. Rev.,59, 143∼169, 1995; DeLong, E. F.,et al.,Science,243, 1360∼1363, 1989). 이러한 올리고뉴클레오타이드 프로브는 핵산이나, 현미경 기술을 이용하여 세포 내에 존재하는 특정균을 감지할 수 있다 (Edward F. Delong,TIBTECH,15, 203∼207, 1997).

또한 프로브 제작에 있어 기초가 되는 16S rRNA 염기 서열 데이터베이스가 급속도로 증가하고 있는 추세로 주요 데이터베이스 중의 하나인 진뱅크 (GenBank, EMBL)의 경우 약 5,000개 이상의 소단위 rRNA 염기 서열이 보관되어 있으므로 이를 이용한 프로브의 설계가 용이하게 되었다 (Philip Hugenholtz and Norman R. Pace,TIBTECH,14, 190∼198, 1996). 이들 프로브의 표지 방법으로는³²P,³⁵S 등의 방사성 동위원소를 이용한 표지 방법이 많이 사용되고 있다. 그러나 방사성 동위원소의 반감기나 폐기상 등의 문제로 하여 바이오틴 (biotin), 디곡시제닌 (digoxigenin)등의 비방사성 동위원소를 이용한 표지 방법을 사용하고 있다. 그러나 비방사성 표지를 이용한 올리고뉴클레오타이드 프로브는 검출시 감도에 한계가 있고, 합성시 많은 경비가 소요되므로 그 사용이 의료 분야에만 제한되어 있는 상황이다.

이에 본 발명자들은 E. 타르다의 16S rRNA 지역과 유사성이 높은 유박테리아 (eubacteria)로부터 얻어진 시발체를 이용하여 E. 타르다의 16S rRNA 지역을 증폭한 후, E. 타르다에 특이성을 가진 올리고뉴클레오타이드 프로브를 제작한 다음, PCR을 이용하여 상기 프로브의 다중체 (multimer)를 형성시키는 새로운 프로브의 제작방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 E. 타르다의 16S rRNA에 대한 특이성이 우수한 프로브 및 그 프로브를 간편하고 경제적으로 제작할 수 있는 프로브의 제작방법을 제공하는 것이다.

도 1은 PCR에 의해 증폭된 E. 타르다의 16S rDNA를 0.1% 아가로오스 겔에서 전기영동한 결과이고,

레인 1 : 1kb 래더

레인 2 : 대장균 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물

레인 3 : E. 타르다 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물

도 2는 E. 타르다의 16S rRNA 유전자를 포함하는 플라스미드의 제한지도이며,

도 3은 클론된 E. 타르다 16S rRNA 유전자의 염기서열이고,

도 4는 선택된 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 특이성을 나타내는 하이브리디제이션 결과이며,

1 : 대장균 2 : 비브리오 앙겔라룸

3 : E. 타르다 3 : 스트렙토코크스 종

5 : 스타필로코크스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis)

도 5는 PCR을 이용하여 다중체 프로브를 제작하는 과정을 개략적으로 나타내는 것이고,

도 6은 PCR을 이용한 다중체 프로브의 제작 과정 중 온도 변화에 따른 다중체 형성의 변화를 나타내는 것이며,

1 : 접합 온도 40℃ 2 : 접합 온도 44℃

3 : 접합 온도 47℃ 4 : 접합 온도 50℃

5 : 접합 온도 53℃

도 7은 PCR을 이용하여 제작된 다중체 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 특이성을 나타내는 하이브리디제이션 결과이다.

1 : 대장균 2 : 비브리오 앙겔라룸

3 : E. 타르다 3 : 스트렙토코크스 종

5 : 스타필로코크스 에피더미스

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)로부터 분리한 서열 10의 16S rRNA, 특정 서열의 올리고 뉴클레오타이드를 포함하여 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)를 검출하는 올리고 뉴클레오타이드 프로브(probe) 및 이의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

우선, 본 발명에서는 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)로부터 분리한 서열 10의 16S rRNA를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 서열 4 및/또는 서열 5의 올리고 뉴클레오타이드를 포함하여 에드와드시엘라 타르다 (Edwardsiella tarda)를 검출하는 올리고 뉴클레오타이드 프로브(probe)를 제공한다.

이 때, 상기 올리고 뉴클레오타이드 프로브는 서열 4, 서열 5 또는 서열 4-서열 5의 올리고 뉴클레오타이드를 단일체 (monomer)로 또는 다중체 (multimer)로 포함할 수 있다.

또한, 상기 올리고 뉴클레오타이드 프로브는 비방사성 표지를 포함할 수 있다. 이 때, 비방사성 표지로는 DIG-11dUTP를 사용할 수 있다.

본 발명에서는 또한, PCR (polymerase chain reaction)을 이용하여 상기 다중체 올리고 뉴클레오타이드 프로브를 얻는 다중체 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 제조방법을 제공한다. 이 때, 상기 프로브의 제작방법에서는 다중체 올리고 뉴클레오타이드를 주형으로 1차 PCR을 수행하여 이중가닥 주형으로 증폭시킨 다음 2차 PCR을 수행할 수 있다. 그리고 다중체 올리고 뉴클레오타이드는 60bp∼200bp 의 길이를 가질 수 있다. 또한, 2차 PCR은 시발체 : 주형의 비율이 50 : 1이 바람직하며, 2차 PCR의 접합반응의 온도는 53℃로 하는 것이 바람직하다. PCR 반응액에는 DIG-11-dUTP와 dTTP의 비율을 0.7 : 1.3으로 혼합하여 표지할 수 있다.

E. 타르다로부터 분리한 서열 번호 4의 올리고 뉴클레오타이드를 단일체로 또는 다중체로 갖는 올리고 뉴클레오타이드 프로브 및 서열 번호 5의 올리고 뉴클레오타이드를 단일체로 또는 다중체로 갖는 올리고 뉴클레오타이드 프로브를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 PCR을 이용하여 상기 올리고 뉴클레오타이드 프로브를 제작하는 프로브의 제작방법을 제공한다.

E. 타르다의 16S rDNA 지역을 증폭하기 위하여 사용된 시발체는 PCGENE을 이용하여 유박테리아 (eubacteria)의 16S rRNA 서열을 토대로 하여 제작하였다. 대부분의 16S rRNA의 서열은 중간에 하나의EcoRⅠ 위치가 있으므로 16S rRNA의 유전자 복제수를 알아내는데 사용된다. 이를 이용하여 용이한 서브클로닝 (subcloning)을 위하여 한 개의 시발체에EcoRⅠ 위치를 첨가하여 사용하고, 이에 사용된 시발체는 서열 1의 시발체와 서열 2의 시발체로PstⅠ,EcoRⅠ 위치를 포함하고 있다.

미생물의 16S rRNA 유전자의 유사성이 높은 부위인 시발체를 합성한 후, 상기에서 추출한 E. 타르다의 염색체 DNA와 합성된 시발체를 혼합하여 PCR을 이용하여 16S rRNA 지역의 일부를 증폭하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동을 이용하여 확인한 결과 1,300bp근처에서 뚜렷한 유전자의 증폭을 확인하였다 (도 1).

클론된 유전자는 여러 가지의 제한효소로 잘라서 아가로오스 겔 전기영동을 실시한 후 제한 지도를 제작하여 본 결과 기존에 박테리아의 16S rRNA에 공통적으로 가지고 있다고 알려진EcoRⅠ 위치 이외에PstⅠ,HindⅢ와SmaⅠ을 가지고 있는 것을 확인하였다 (도 2).

염기 서열을 분석하기 위해서, 한번의 서열분석에 의하여 결정할 수 있는 염기의 수는 반응의 문제, 전기 영동상의 문제 등 여러 가지의 제한요힌으로 인해 400∼700bp 정도이므로, 제한지도를 토대로 해서 두 개의 조각을 잘라내서 서열 분석에 많이 사용되는 플라스미드 벡터인 pUC18 벡터에 연결하여 서브클론 (subclone)을 만든다. 증폭된 E. 타르다의 16S rDNA 유전자를EcoRⅠ과PstⅠ으로 절단한 후, pUC18을 각각EcoRⅠ,EcoRⅠ과PstⅠ 위치에 연결한 결과 pUC18의EcoRⅠ,PstⅠ 위치에 서브클론된 3.3kb의 pKBF101과 pUC18의EcoRⅠ 위치에 삽입된 3.4 kb의 pKBF102 두 개의 서브클론을 얻었다. E. 타르다 16S rRNA의 염기서열이 현재까지 밝혀져 있지 않기 때문에 본 연구에서 이 유전자의 염기서열을 분석하였다 (도 3). 서브클론을 자동 서열분석기를 이용하여 염기서열을 분석하고 제공된 ALF win 프로그램을 이용해서 염기서열을 결정하여 서열 번호 10의 1,345bp의 염기서열을 얻었다.

특이적 프로브의 선정방법은 기존에 밝혀진 다른 병원성 미생물의 16S rRNA의 염기서열과 대상 균의 염기서열을 비교분석함으로써 특이적으로 결합하는 프로브를 선정하게 된다.

밝혀진 E. 타르다에서의 특이적 염기서열인 서열 4의 프로브와 서열 5의 프로브를 기존에 발표된 병원성 미생물의 16S rRNA의 염기서열 중 해양에서 주로 발견되는 예르시니아 루케리 (Yersinia ruckeri), 아에로모나스 소브리아 (Aeromonas sobria), 비브리오 앙겔라룸, 비브리오 오르달리 (Vibrio ordalii), 파스테렐라 카니스 (Pasteurella canis), 스타필로코크스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis)와 대장균의 염기서열과 비교 분석한 결과, 서열 4의 프로브에서는 상동한 지역이 발견되었으나, 서열 5의 프로브에서는 유사 지역이 발견되지 않았다.

이 두가지 프로브를 3개의 염기서열이 미스매치 (mismatch)가 허용한 조건에서 진뱅크의 블라스트 프로그램 (BLAST program)에 의해 기존에 발표된 30만개의 염기서열과 특이성을 조사한 결과, 서열 4의 프로브는 하에모필라스 종 (Hameophilassp.), 파스테렐라 아에로게네스 (Pasteurella aerogenes), 파스테렐라 다그마티스 (Pasteurella dagmatis) 및 파스테렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida)와 유사성이 있는 것으로 나타났으며, 서열 5의 프로브는 유사성이 있는 영역이 발견되지 않았다.

그리고, 슬롯 블럿 하이브리디제이션에 의해 서열 4의 프로브와 서열 5의 프로브의 특이성을 조사한다. 특이성을 분석하기 위해 대장균, 비브리오 앙겔라룸, 스트렙토코크스 종, 스타필로코크스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis)의 염색체 DNA를 E. 타르다의 염색체 DNA와 같이 동일양을 로딩하였다. 각각의 하이브리디제이션과 검출 방법에 의해 특이성을 실험한다. 서열 4의 프로브는 비브리오 앙겔라룸, 스트렙토코크스 종과 교차 반응이 발견되었으나, 서열 5의 프로브는 스타필로코크스 에피더미스와 약간의 교차 반응이 관찰되어 서열 5의 프로브가 서열 4의 프로브에 비해 특이성이 높은 것으로 밝혀졌다 (도 4).

슬롯 블럿 하이브리디제이션에 의하여 합성된 다중체인 헤테로-모노머 (hetero-monomeric) 서열4-서열5-서열4 주형 (A)와 호모 모노머 (homo-monomeric) 서열4-서열4-서열4 주형 (B) 및 서열5-서열5-서열5 주형 (C)를 3'-말단 표지된 주형 (A), (B) 및 (C)와 비교를 한 결과 다중체 A는 주형 A에 비하여 3∼5배의 감도의 증가를 확인할 수 있었다. 특히 주형 A에서 관찰되는 교차-하이브리디제이션이 감소되어 선택성이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같이 선택성이 향상되는 것은 서열 4의 프로브와 다중체 (B)를 비교하였을 때 보다 현저히 나타났으며, 이러한 특이성의 향상과 함께 다중체 (A)는 서열 5의 프로브에 비하여서는 그 감도가 약 5∼8배 향상됨을 확인할 수 있었다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> E. 타르다의 16S rRNA 지역의 분리

본 발명에서는 병원성 미생물로 E. 타르다, 비브리오 앙글리럼 (Vibrio angullirum), 스타필로코크스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis) 및 스트렙토코크스 종 (Streptococcussp.)과 대장균으로 DH5αf'를 배양하였다. 대장균, 에드와드시엘라 타르다, 스타필로코크스 에피더미스 및 스트렙토코크스 종 등은 BHI (brain heart infusion, DIFCO)와 TSB (tryptic soy broth) 배지를 사용하여 37℃에서 배양하였으며, 비브리오 앙글리럼은 BHI와 TSB 배지를 사용하여 30℃에서 배양하였다.

사용된 배지 성분

배지	성분	함량 (g)
LB	박토 트립톤 (bacto tryptone)	10
	박토 효모 추출물 (bacto yeast extract)	5
	NaCl	10
BHI	송아지 뇌 (calf brains)	200
	소 심장 (beef heart)	250
	박토 프로테아제 (bacto protease)	10
	박토 덱스트로스 (bacto dextrose)	2
	NaCl	5
	Na₂HPO4	2.5
TSB	박토 트립톤	17
	박토 소이톤 (bacto soytone)	3
	K₂HPO4	2.5
	박토 덱스트로스	2.5
	NaCl	5

마머 (Marmur)의 방법에 의해 그로부터 순수한 DNA를 분리하였다 (Marmur,J.,J. Mol. Biol.,3, 208∼218, 1961). 구체적으로 OD₆₀₀= 4.0이 될 때까지 배양시키고 원심 분리한 후 SET 완충용액 (75mM NaCl, 25mM EDTA, 20mM Tris, pH 7.5)에 녹였다. 여기에 2.0㎎/㎖의 리소자임 (lysozyme, Sigma)을 첨가한 후, 37℃에서 5분간 반응시켜 세포벽을 제거한 다음, 10% SDS, 5M NaCl, 클로로포름 (chloroform, Sigma)을 가하여 바로 원심 분리하였다. 상등액을 페놀로 처리한 후, 에탄올 침전에 의해 DNA를 얻었다. 프로티나제 K (proteinase K, Boehringer Mannheim), RNase A (Sigma)를 37℃에서 15분간 반응시켜 순수한 염색체 DNA (chromosomal DNA)를 얻었다.

E. 타르다의 16S rRNA 지역을 증폭하기 위하여 사용된 시발체는 PCGENE을 이용하여eubacteria의 16S rRNA 서열을 분석하여 제작하였다. 대부분의 16S rRNA의 서열은 중간에 하나의 EcoRⅠ 위치가 있으므로 16S rRNA의 유전자 복제수를 알아내는데 사용이 된다. 이를 이용하여 용이한 서브클로닝 (subcloning)을 위하여 한 개의 시발체에 EcoRⅠ 위치를 첨가하여 사용하였다. 이에 사용된 시발체는 서열 1의 시발체와 서열 2의 시발체로PstⅠ,EcoRⅠ 위치를 포함하고 있다.

염색체 DNA 및 16S rRNA에서 유사성이 높은 부위를 토대로 하여 합성한 서열 1의 시발체, 서열 2의 시발체를 각각 100pmole (1㎕)씩 혼합한 후 10×Taq DNA 중합효소 반응 완충용액 (100mM Tris pH 8.3, 400mM KCl, 15mM MgCl₂, 10mM DTT, 500㎍/㎖ BSA) 5㎕를 가하고 2.5mM dNTP를 4㎕를 가하였다. H₂O 35㎕를 가하여 최종 부피를 50㎕로 맞춘 후 미네랄 오일 (mineral oil, Sigma)을 100㎕ 가하였다. 이반응 혼합액을 94℃에서 10분간 가열시킨 후 1㎕ (1 unit) Taq DNA 중합효소 (Bioneer)를 첨가하여 PCR (fine PCR, Robot PCR)을 30회 수행하였다. 1∼29회는 각각 94℃에서 1분 변성 (denaturation), 48℃에서 2분 접합 (annealing), 72℃에서 3분간 중합 (polymerization)하였으며, 마지막 회에서는 72℃에서 10분간 중합 반응을 수행하였다. 증폭된 DNA는 1.0% 아가로오스 겔 (agarose gel)상에서 확인한 후 클로로포름 추출과 에탄올 침전에 의해 순수한 DNA를 분리하였다.

전술한 바와 같이 미생물의 16S rRNA 유전자의 유사성이 높은 부위인 시발체를 합성한 후, 상기에서 추출한 E. 타르다의 염색체 DNA와 합성된 시발체를 혼합하여 PCR을 이용하여 16S rRNA 지역의 일부를 증폭하여 1.0% 아가로오스 겔 전기영동을 이용하여 확인한 결과 1,300bp근처에서 뚜렷한 유전자의 증폭을 확인하였다 (도1).

<실시예 2> 재조합 DNA의 제작

한번의 서열분석에 의하여 결정할 수 있는 염기의 수는 반응의 문제, 전기 영동상의 문제 등 여러 가지의 제한요인으로 인해 400∼700bp 정도이므로, 제한지도를 토대로 해서 두 개의 조각을 잘라내서 서열 분석에 많이 사용되는 플라스미드 벡터인 pUC18 벡터에 연결하여 서브클론 (subclone)을 만들었다.

재조합 DNA를 제작하기 위하여 pUC18 벡터를 사용하였다. 삽입될 DNA와 벡터 준비를 위하여 DNA 1㎍, 제한효소 10 unit과 10× 완충용액 1㎕를 마이크로 튜브에 가하고, 증류수로 최종 부피를 10㎕로 맞춘 후, 제한효소 반응 온도에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응액에 최종부피가 100㎕ 되게 증류수를 가하고 동량의P/C/I (페놀 : 클로로포름 : 이소프로판올 = 25 : 24 : 1)를 첨가하여 1분간 격렬히 섞었다. 이것을 1분간 원심분리하여 플라스미드 층을 새로운 마이크로튜브로 옮긴 후, DNA 회수를 위하여 에탄올 침전을 거쳐 최종적으로 10㎕ 증류수에 녹였다.

상기에서 준비된 DNA를 OD₂₆₀에서 흡광도를 측정하여 다음의 계산 방법에 의해 농도를 결정하였다.

1 OD₂₆₀= 50㎍ 플라스미드 DNA/㎖

또한, 1.0% 아가로오스 전기영동을 실시하여 농도를 알고 있는 DNA와 비교하였다.

상기에서 준비된 벡터 4㎕와 삽입될 DNA 4㎕를 섞은 후 리가아제 (ligase) 0.5㎕ (1.5 unit), 리가아제 완충용액 1㎕를 가하여 15℃에서 약 16시간 동안 반응시켰다.

증폭된 E. 타르다의 16S rDNA 유전자를EcoRⅠ과PstⅠ으로 절단한 후, pUC18을 각각EcoRⅠ,EcoRⅠ과 PstⅠ 위치에 연결하였다. 그 결과 pUC18의EcoRⅠ,PstⅠ 위치에 서브클론된 3.3kb의 pKBF101과 pUC18의 EcoRⅠ 위치에 삽입된 3.4 kb의 pKBF102 두 개의 서브클론을 얻었다.

제한지도를 작성하기 위하여 우선 여러 가지 종류의 제한효소를 이용하여 클론된 DNA를 절단하고, 0.8% 아가로오스 겔에 전기영동하여 어떤 제한효소 위치가 존재하는지를 조사하였다. 그리고 제한효소 위치가 존재하는 것들을 복합적으로절단하여 0.8% 아가로오스 겔에 전기영동하여 각각의 제한효소 자리를 결정하였다.

그 결과, 기존에 박테리아의 16S rRNA에 공통적으로 가지고 있다고 알려진EcoRⅠ 위치 이외에PstⅠ,HindⅢ와SmaⅠ을 가지고 있는 것이 관찰되었다 (도 2).

<실시예 3> 대장균 형질전환

대장균 형질전환은 코헨 (Cohen)등의 방법을 변형하여 수행하였다 (Cohen, S. N.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,69, 2110, 1972). LB 배지에서 하루동안 배양한 배양액 1㎖을 100㎖ LB배지에 접종하여 OD₆₀₀값이 0.4가 될 때까지 배양한 후, 얼음에서 최소한 15분간 냉각시킨 다음 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 세포 침전물을 CCB1 (70mM CaCl₂, 5mM MgSO₄) 40㎖로 현탁한 후, 다시 같은 조건으로 원심분리하여 세포 침전물을 CCB1 2㎖로 현탁하였다. 현탁액을 4℃에서 하루동안 배양한 후, CCB2 (70mM CaCl₂, 5mM MgSO₄, 36% 글리세롤) 2㎖를 첨가하여 적당량으로 나누어 -70℃에서 보관하거나 형질전환을 위해 즉시 사용하였다.

차가운 유리 튜브에 DNA 1㎕를 첨가한 후 준비된 컴피턴트 세포 (competent cell) 200㎕를 넣어 섞는다. 얼음에서 15분간 배양한 후, 42℃, 90초간 열충격 (heat-shock)을 가하였다. 열충격 과정을 끝낸 후 곧바로 얼음에서 15분간 배양한 후 LB 액체배지 800㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이를 100㎕씩 암피실린 (ampicillin)이 50 ㎍/㎖ 농도로 첨가된 LB 고체배지에 도말한 후 37℃에서 하루 동안 배양하였다.

한편, 플라스미드를 분리하기 위해 암피실린이 50㎍/㎖의 농도로 들어 있는 LB 액체배지 5㎖에 균을 접종하였고, 37℃ 진탕배양기에서 정지기까지 하룻밤 동안 배양하였다. 이 세포 배양액 중 1.5㎖을 마이크로튜브에 옮겨서 원심분리하여 균체를 침전시켰다. 수확된 균체에 4℃의 TEGL (50mM 글루코오스, 10mM EDTA, 25mM Tris-HCl pH 8.0, 4㎎/㎖ 리소자임) 용액을 100㎕ 가하여 현탁시키고, 실온에 5분간 방치하였다. 이 현탁액에 4℃의 NaOH-SDS 용액 (0.2N NaOH, 1% SDS)을 200㎕ 가한 후, 얼음에 5분간 방치하였다. 이 현탁액에 4℃의 3M 아세트산 나트륨 (sodium acetate) 150㎕를 가한 후, 얼음에 5분간 방치하였다. 이 현탁액을 5분간 원심분리한 후, 상등액을 새로운 마이크로튜브에 옮겨 담았다. 이 상등액에 P/C/I를 450㎕ 가한 후, 단백질을 제거하기 위해 원심분리하여 상등액을 취하였다. 이 상등액에 2배 부피의 100% 에탄올을 가하고, -70℃에서 30분간 방치한 후 원심분리하여 DNA를 침전시켜켰다. 상등액을 제거하고, 70% 에탄올로 세척한 후, 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 다시 상등액을 제거하고, 진공상태에서 건조시킨 후, RNase A (Sigma)가 20㎍/㎖로 들어 있는 TE 완충용액 40㎕에 현탁하였다.

<실시예 4> 자동 서열분석기를 이용한 염기서열 결정

분리된 플라스미드를 주형으로 하여 두 가닥의 DNA로부터 단일 가닥을 분리하였다. 우선 주형의 농도를 0.5㎍/㎕로 조절한 후 여기에 2M NaOH 8㎕를 넣어 총 부피가 40㎕로 되도록 조절하였다. 이를 혼합하여 원심분리한 후, 상온에서 10분간 방치하였다. 그리고 3M 아세트산 나트륨 (pH 4.8)을 7㎕ 가하고 다시 4㎕의 증류수를 넣었다. 99% 에탄올 120㎕를 넣은 후 -70℃에서 15분간 침전시킨 후 15분간 원심분리하였다. 조심스럽게 상층액을 버리고 침전물을 70% 에탄올로 닦은 후 10분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 37℃에서 방치하여 펠렛을 건조한 후 10㎕의 증류수에 녹였다.

단일가닥으로 분리된 DNA를 마이크로튜브에 넣고 전진 시발체 (forward primer)와 역행 시발체 (reverse primer)를 2㎕ (4∼10 pmol)를 넣은 후 다시 여기에 접합 완충용액을 2㎕ 넣어 최종 부피를 14㎕가 되게 하였다. 37℃에서 10분간 접합 반응을 시켜 상온에서 적어도 10분 동안 둔 후, A mix, C mix, G mix, T mix를 2.5㎕씩 넣었다. 효소 희석용 완충용액을 이용하여 T7 DNA 중합효소를 6∼8 unit/2㎕로 희석하여 사용하였다. 그리고 접합 혼합액에 1㎕의 익스텐션 완충용액 (extention buffer)와 DMSO (dimethylsulfoxide)를 넣고 섞은 후 간단히 원심분리하였다. 이와 같이 얼음에 넣어 두었던 각각 4개씩의 시퀀싱 믹스들을 37℃에서 적어도 1분간 반응을 시켰다. 접합 혼합액에 희석시킨 T7 DNA 중합효소를 2㎕씩 넣은 후 37℃에서 반응중인 시퀀싱 혼합액들에 4.5㎕씩을 넣고 37℃에서 5분동안 반응을 시켰다. 마지막으로 5㎕의 반응중단 용액을 넣고 반응을 정지시켰다. 이렇게 준비된 염기서열 결정 반응액은 85∼90℃에서 3분 정도 가열 후 얼음에 넣었다가 4∼6㎕씩을 겔의 웰에 로딩하였다.

폴리아크릴아미드 겔 (polyacrylamide gel) 전기영동과 자동 서열분석기를 이용하여 염기서열을 결정하였다.

그 결과, 서열 번호 10의 1,345bp의 염기서열을 얻었다 (도 3).

<실시예 5> E. 타르다에 특이적인 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 결정

DNA 염기서열 분석에 의해 클론된 유전자의 염기 서열을 리보솜 데이터베이스 프로젝트 (Ribosomal Database Project)와 진뱅크의 현재까지 밝혀진 16S rRNA의 염기서열과 피씨진 프로그램 (PCGENE Program, IntelliGentics, USA)을 이용하여 비교 분석하여 E. 타르다에 특이성을 가진 올리고뉴클레오타이드 지역을 선정하였다.

프로브의 특이성을 조사하기 위해 다이슨 (Dyson, N.J.)의 알칼리 처리에 의한 슬롯 블럿 하이브리디제이션 방법을 사용하였으며, 1 슬롯 당 0.5㎍의 염색체 DNA를 양극화된 멤브레인 (positive charged membrane, Hybond N., Amersham International. Little Chalfont, UK)에 슬롯 블럿 하이브리디제이션 기구 (Hoefer Scientific INstruments. San Francisco. Calif, USA)를 이용하여 로딩하였다. 하이브리디제이션과 검출 방법은 '필터 하이브리디제이션을 위한 DIG 시스템 사용자의 가이드' (The DIG Systems's User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim, Germany)를 참조하여 DIG 루미니슨트 키트 (DIG Luminescent Kit, Boehringer Mannheim)를 사용하여 실험하였다.

선정된 올리고뉴클레오타이드 서열 4의 프로브와 서열 5의 프로브를 슬롯 블럿 하이브리디제이션에 의해 특이성을 조사하였다. 특이성을 분석하기 위해 대장균, 비브리오 앙겔라룸, 스트렙토코크스 종, 스타필로코크스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis)의 염색체 DNA를 E. 타르다의 염색체 DNA와 같이 동일양을 로딩하였다. 각각의 하이브리디제이션과 검출 방법에 의해 특이성을 실험하였다. 서열 4의 프로브는 비브리오 앙겔라룸, 스트렙토코크스 종과 교차 반응이 발견되었으나, 서열 5의 프로브는 스타필로코크스 에피더미스와 약간의 교차 반응이 관찰되었다. 그러므로 서열 5의 프로브가 서열 4의 프로브에 비해 특이성이 높은 것으로 밝혀졌다 (도 4).

<실시예 6> PCR을 이용한 E. 타르다의 다중체 프로브의 제작

각각 서열4-서열5-서열4, 서열4-서열4-서열4, 서열5-서열5-서열5의 염기서열을 가진 주형 100ng (2 pmole)과 각각 서열 6, 서열 7, 서열 8 및 서열 9를 시발체로 사용하여 100pmole (1㎕)을 섞은 후 (표 2), 10× Taq 중합효소 반응 완충용액 (100mM Tris-HCl pH 8.3, 400mM KCl, 15mM MgCl₂, 10mM DTT, 500㎍/㎖ BSA)를 5㎕ 가하고 2.5mM dNTP를 4㎕ 가하였다. H₂O 35㎕를 가하여 최종 부피를 50㎕로 맞춘 후, 미네랄 오일을 100㎕ 가하였다. 이들 시료을 94℃에서 10분간 가열하여 상온에서 5분간 방치하였다. 그 후, 1㎕ (1 unit) Taq DNA 중합효소 (BIONEER)를 가한 후 30회 PCR을 수행하였다. 1회는 48℃에서 2분 접합, 72℃에서 3분간 중합시켰으며, 2∼29회는 각각 94℃에서 1분 변성, 48℃에서 2분 접합, 72℃에서 3분간 중합시켰으며 마지막 회에서는 중합반응을 72℃에서 10분간 수행하였다. PCR 반응이 끝난 후, 여기서 얻어진 산물 1㎕를 상기 반응 조성과 같은 조건으로 다시 한번 더 PCR을 수행하였다.

그 후, 클로로포름을 사용하여 미네랄 오일을 제거한 후 1.75% 아가로스 겔을 이용하여 결과를 확인하였다. PCR DIG 프로브 합성 키트 (PCR DIG Probe Synthesis Kit, Boehringer Mannheim)를 사용하여 PCR 과정 중 PCR DIG 프로브 합성 혼합액 (2mM dATP, 2mM dCTP, 2mM dGTP, 1.3mM dTTP, 0.7mM-alkali labile DIG-11-dUTP, pH 7.0)을 2.5mM dNTP 대신에 사용하여 PCR 과정중 DIG-11-dUTP로 표지하였다.

헤테로-모노머 (hetero-monomeric) 서열4-서열5-서열4 주형 (A)와 호모 모노머 (homo-monomeric) 서열4-서열4-서열4 주형 (B) 및 서열5-서열5-서열5 주형 (C)를 이용하여 원하는 크기의 다중체를 합성하기 위하여 상기에서 제작된 시발체를이용하여 PCR을 실시하였다. 이를 위하여 1차 PCR은 과량의 시발체를 사용하여 원하는 단일 가닥 주형 (single strand template)으로부터 이중 가닥 단량체 주형 (double strand monomeric template)으로 증폭을 시킨 후, 다시 2차 PCR을 통하여 이중 가닥 단량체 주형으로부터 다중체 프로브를 제작하였다. 2차 PCR에 의한 다중화 (multimerization)는 센스 (sense), 안티센스 (antisense) 가닥 사이의 부분 접합 및 시발체에 의하여 다중화 및 증폭이 동시에 일어날 수 있다.

구체적으로 인 시츄 (in situ) 하이브리디제이션시 세포내의 침투를 위하여는 프로브의 크기가 약 200bp 이하로 제한이 되어야 하므로 이러한 크기의 다중화를 위하여 2차 PCR시 최적 접합 온도를 결정하였다. 2차 PCR시 다중화는 시발체 : 주형 비율 및 접합 온도에 의하여 결정이 되는데 본 실험에서는 주어진 시발체 : 주형의 비율이 50 : 1에서는 53℃의 접합 온도에서 최적 최대의 다중화 및 증폭효과를 얻었다. 이 결과를 바탕으로 반응액 중 DIG-11-dUTP와 dTTP 비율을 0.7 : 1.3으로 혼합하여 표지하여 프로브로 사용하였다.

슬롯 블럿 하이브리디제이션에 의하여 합성된 다중체 (A), (B) 및 (C)를 3'-말단 표지된 주형 (A), (B) 및 (C)와 비교를 한 결과 다중체 A는 주형 A에 비하여 3∼5배의 감도의 증가를 관찰할 수 있었다. 특히 주형 A에서 관찰되는 교차-하이브리디제이션이 감소되어 선택성이 향상되는 것을 관찰할 수 있었다.

이러한 선택성의 향상은 특히 서열 4의 프로브와 비교하였을 때 현저한 향상을 관찰할 수 있었다. 이러한 선택성의 향상은 서열 4의 프로브와 다중체 (B)를 비교하였을 때 그 차이를 보다 분명하게 관찰할 수 있었다. 이러한 특이성의 향상과 함께 다중체 (A)는 서열 5의 프로브에 비하여서는 약 5∼8배의 감도의 향상이 관찰되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 E. 타르다의 16S rDNA에 대한 프로브는 기존의 올리고 뉴클레오타이드 프로브에 비해 교차 반응이 현저히 감소된, 감도가 높고 특이성이 향상된 프로브이며, 본 발명의 PCR을 이용하는 다중체 프로브의 제조방법은 간단하고 신속하게 특이성이 우수한 다중체 프로브를 제조할 수 있는 경제적인 프로브 제조방법이다.

[서열목록]

서열번호 : 1

서열의 길이 : 29

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고뉴클레오타이드)

[서열 1]

GGCTGCAGAA CACATGCAAG TCGAACGGT 29

[서열목록]

서열번호 : 2

서열의 길이 : 29

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고뉴클레오타이드)

[서열 2]

GGCTTAAGTG TTCCGGGCCC TTGCATAAG 29

[서열목록]

서열번호 : 3

서열의 길이 : 18

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고뉴클레오타이드)

[서열 3]

GCTGCCTCCC GTAGGAGT 18

[서열목록]

서열번호 : 4

서열의 길이 : 26

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고뉴클레오타이드)

[서열 4]

CAGCGGAGAA AGCAAGCTTT CTCCCT 26

[서열목록]

서열번호 : 5

서열의 길이 : 22

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고뉴클레오타이드)

[서열 5]

ATTGTGAGCG CTATTAACGT TC 22

[서열목록]

서열번호 : 6

서열의 길이 : 18

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고뉴클레오타이드)

[서열 6]

CAGCGGAGAA AGCAAGCT 18

[서열목록]

서열번호 : 7

서열의 길이 : 19

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고뉴클레오타이드)

[서열 7]

AAGCTTGCTT TCTCCTCCG 19

[서열목록]

서열번호 : 8

서열의 길이 : 15

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고뉴클레오타이드)

[서열 8]

ATTGTGAGCG CTATT 15

[서열목록]

서열번호 : 9

서열의 길이 : 16

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고뉴클레오타이드)

[서열 9]

ATAGCGCTCA CAATTG 16

[서열목록]

서열번호 : 10

서열의 길이 : 1345

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고뉴클레오타이드)

[서열 10a]

AACACATGCA AGTCGAACGG TAGCAGGGAG AAAGCTTGCT TTCTCCGCTG ACGAGCGGCG 60

GACGGGTGAG TAATGTCTGG GGATCTGCCT GATGGAGGGG GATAACTACT GGAAACGGTA120

GCTAATACCG CATAACGTCG CAAGACCAAA GTGGGGGACC TTCGGGCCTC ATGCCATCAG 180

ATGAACCCAG ATGGGATTAG CTAGTAGGTG GGGTAATGGC TCACCTAGGC GACGATCCCT 240

AGCTGGTCTG AGAGGATGAC CAGCCACACT GGAACTGAGA CACGGTCCAN ACTCCTACGG 300

GAGGCAGCAG TGGGGAATAT TGCACAATGG GCGCAAGCCT GATGCAGCCA TGCCGCGTGT 360

ATGAAGAAGG CCTTCGGGTT GTAAAGTACT TTCAGTAGGG AGGAAGGTGT GAACGTTAAT 420

AGCGCTCACA ATTGACGTTA CCTACAGAAG AAGCACCGGC TAACTCCGTG CCAGCAGCCG 480

CGGTAATACG GAGGGTGCAA GCGTTAATCG GAATTACTGG GCGTAAAGCG CACGCAGGCG 540

GTTTGTTAAG TTGGATGTGA AATCCCCGGG CTTAACCTGG GAACTGCATC CAAGACTGGC 600

AAGCTAGAGT CTCGTAGAGG GAGGTAGAAT TCCAGGTGTA GCGGTGAAAT GCGTAGAGAT 660

CTGGAGGAAT ACCGGTGGCG AAGGCGGCCT CCTGGACGAA GACTGACGCT CAGGTGCGAA720

[서열 10b]

AGCGTGGGGA GCAAACAGGA TTAGATACCC TGGTAGTCCA CGCTGTAAAC GATGTCGATT 780

TGGAGGTTGT GCCCTTGAGG CGTGGCTTCC GAAGCTAACG CGTTAAATCG ACCGCCTGGG 840

GAGTACGGCC GCAAGGTTAA AACTCAAATG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG 900

CATGTGGTTT AATTCGATGC AACGCGAAGA ACTTACCTAC TCTTGACATC CAGCGAATCC 960

TGTAGAGATA CGGGAGTGCC TTCGGGAACG CTGAGACAGG TGCTGCATGG CTGTCGTCAG 1020

CTCGTGTTGT GAAATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTAT CCTTTGTTGC 1080

CAGCGGTTCG GCCGGGAACT CAAAGGAGAC TGCCAGTGAT AAACTGGAGG AAGGTGGGGA 1140

TGACGTCAAG TCATCATGGC CCTTACGAGT AGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGCGTATA 1200

CAAAGAGAAG CGAACTCGCG AGAGCAAGCG GACCTCATAA AGTACGTCGT AGTCCGGATT 1260

GGAGTCTGCA ACTCGACTCC ATGAAGTCGG AATCGCTAGT AATCGTGGAT CAGAATGCCA 1320

CGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGT 1345

Claims

서열 4, 서열 5또는 서열4-서열5의 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 에드와드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)동정용 올리고 뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 서열 4의 올리고 뉴클레오타이드를 단일체(monomer)로 또는 다중체(multimer)로 포함하는 올리고 뉴클레오타이드.
제 1항에 있어서, 서열 5의 올리고 뉴클레오타이드를 단일체로 또는 다중체로 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고 뉴클레오타이드 프로브.
제 1항에 있어서, 서열 4-서열 5의 올리고 뉴클레오타이드를 단일체 (monomer)로 또는 다중체(multimer)로 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고 뉴클레오타이드 프로브.
제 1항에 있어서, 상기에 더하여 비방사성 표지를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드 프로브.
제 5항에 있어서, 비방사성 표지로 DIG-11dUTP를 갖는 올리고 뉴클레오타이드.
PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 제2항 내지 제5항의 다중체 올리고 뉴클레오타이드 프로브를 얻는 다중체 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 제조방법.
제 7항에 있어서, 제1항의 다중체 올리고 뉴클레오타이드를 주형으로 1차 PCR을 수행하여 이중가닥 주형으로 증폭시킨 다음 2차 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 다중체 올리고 뉴클레오타이드의 제조방법.
제 7항 또는 제8항에 있어서, 다중체 올리고 뉴클레오타이드는 60bp∼200bp의 길이를 갖는 것으로 특징으로 하는 다중체 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 제조방법.
제 7항 또는 제8항에 있어서, 2차 PCR은 시발체 : 주형의 비율이 50 : 1인 것을 특징으로 하는 다중체 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 제조방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 2차 PCR의 접합반응의 온도를 53℃로 하는 것을 특징으로 하는 다중체 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 제조방법.
제 7항 또는 제8항에 있어서, PCR 반응액에 DIG-11-dUTP와 dTTP의 비율을 0.7 : 1.3으로 혼합하여 표지하는 것을 특징으로 하는 다중체 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 제조방법.