【発明の詳細な説明】
バクテリア抗原特異核酸分子およびその用途
技術分野
本発明はバクテリア多糖抗原、特にO抗原の合成を制御する遺伝子クラスター
に位置する新規ヌクレオチド配列、ならびに特定多糖抗原(特にO抗原)を発現
するバクテリアの検出およびこれらバクテリアの多糖抗原(特にO抗原)を同定
するためのこれらヌクレオチド配列の用途に関する。
背景技術
腸内病原性大腸菌株かヒトの下痢および出血性大腸炎の原因であることは周知
であり、溶血性尿毒症症候群および血栓性血小板減少性紫斑病を含む潜在的に生
命の脅威である続発症へと導く。これら菌株のあるものは共通して家畜に見出さ
れるものであり、ヒトへの感染は通常不適切に加工処理され汚染された食肉また
は乳製品の消費の結果である。リポ多糖類のO特異多糖成分(「O抗原」)は腸
内病原性大腸菌株の主要毒性因子であることが知られている。
大腸菌O抗原は高度に多形性であり、この抗原については166種の異なる形状が
明らかにされている;エウイング(Ewing,W.H.)[エドワードおよびエウイン
グ(Edwards and Ewings)「腸内細菌の同定」エルスビアー、アムステルダム(1
986)]は128種の異なるO抗原を検討しているが、ライアー(Lior H.)(1994)
はその数を166に拡大している[「大腸菌の分類」、家畜動物およびヒトにおけ
る大腸菌、31〜72頁、ガイルス(C.L.Gyles)編集、CABインターナショナル]
。Salmonella enterica属は46種の既知O抗原型をもつ[ポポフ(Popoff,M.Y.
)ら(1992)「Salmonella enterica血液型亜型(serovars)の抗原形状」第6版、S almonella enterica
に関する参照および研究のためのWHO協力センター、パス
ツール研究所、パリ フランス]。
O抗原の生合成を決め、従って多形性のメカニズムを決める重要な一歩は、O
抗原生合成を制御する遺伝子クラスターを特性化することである。O抗原の合成
に特異的な遺伝子は一般にE.coli K-12の染色体上地図位置45分の遺伝子クラ
スターに[バックマン(Backmann,B.J.)1990「Escherichia coli K-12の連
鎖地図」、Microbiol.Rev.54:130〜197]、またSalmonella enterica LT2では
対応する位置に位置している[サンダーソン(Sanderson)ら(1995)、「Salmonell a enterica
typhimuriumの遺伝子地図」、VIII版、Microbiol.Rev.59:241〜3
03]。両例ともにO抗原遺伝子クラスターは他のE.coliおよびS.enterica株の場
合と同じ様にgnd遺伝子に近接している[リーブス(Reeves P.R.)(1994)「リ
ポ多糖類の生合成と組み立て」281〜314、ノイバーガーおよびバンディーネン(
A.Neuberger and L.L.M.van Deenen)編纂「細菌細胞膜、新総合生化学」27
巻、エルスビアー・サイエンス出版]。これらの遺伝子はヌクレオチドジリン酸
エステル糖の合成用および該糖類をオリゴ糖単位に組み上げるための酵素、また
、一般にはO抗原へ重合するための酵素をコードする。
E.coli O遺伝子クラスターは広範なE.coli O抗原についてクローン化されてい
るが、O7、O9、O16およびO111のO抗原はより詳細に研究されており、O9およ
びO16はこれまでにヌクレオチド配列に関して完全に特性化されている[キド
、トルコフ、スギヤマ、ウチヤ、スギハラ、コマツ、カトウおよびヤン(Kido N
,Torgov V.I.,Sugiyama T.,Uchiya K.,Sugihara H.,Komatsu T.,Kato N
.&Jann K.)(1995)「Escherichia coliにおけるO9多糖類の発現:E.coli O9rfb
遺伝子クラスターの配列決定、マンノシルトランスフェラーゼの特性化、および
ATP−結合カセット輸送システムの証明」、J.of Bacteriol.177、2178〜218
7;スティーブンソン、ニール、リウ、ホッブス、パッカー、バットレイ、レド
モンド、リンドガイスツ、およびリーブス(Stevenson G.,Neal B.,Liu D.,H
obbs M.,Packer N.H.,Batley M.,Redmond J.W.,Lindguist L.& Reeves PR
)(1994)「E.coli K-12 O抗原の造とそのrfb遺伝子クラスターの配列」、J.of
Bacteriol.、176、4144〜4156;ヤヤラトネ(Jayaratne,P.)ら(1991)「Escheric
hia coli O9:K30におけるGDP-マンノース形成に関与する重複rfbMおよびrfbK遺
伝子のクローニングと分析およびグループ1K 30莢膜多糖合成におけるrfb遺伝子
の関与」、J.Bacteriol.176:3126〜3139;バルバノおよびクロッサ(Valvano
,M.A.and Crosa,J.H.)(1989)「ヒト浸襲E.coli O:K1株のO7リポ多
糖抗原を決定する染色体遺伝子のE.coli K-12における分子クローニングと発現
」、Inf and Immun.57:937〜943;マロルダおよびバルバノ(Marolda,C.L.a
nd Valvano,M.A.)(1993);「VW187株(E.coli O7:K1)のO7rfb遺伝子クラ
スターによりコードされるGDP−マンノース生合成遺伝子の同定、発現および
DNA配列」、J.Bacteriol.175:148〜158]。
バスティン(Bastin,D.A.)ら(1991)[「E.coli O11株のO抗原を決定するr
fb遺伝子クラスターのE.coli K-12における分子クローニングと発現」、Mol Mi
crobiol.5:9、2223〜22231]およびバスティンおよびリーブス(Bastin,D.A
.and Reeves,P.R.)(1995)[「E.coliO111のO抗原遺伝子(rfb)クラスタ
ーの配列と分析」、Gene164:17〜233]はE.coli O111rfb領域をエンコードする
染色体DNAを離し、E.coli O 111rfbの6962bpフラグメントを特性化した6種
のオープン読み枠(orfs)が6962bpの部分フラグメントに同定され、これらorfs
の直線配列はGDP−マンノース経路の遺伝子、rfbKとrfbM、および他のrfbとc
ps遺伝子と相同であることを明らかにした。
Salmonella entericaB、A、D1、D2、D3、C1、C2およびEのO抗
原発現を制御する遺伝子座のヌクレオチド配列が特性化されている[Brown,P.
K.,L.K.Romana and P.R.Reeves((1991)「グループC2 S.entericaのrfb
遺伝子クラスターのクローニング:グループBおよびDのrfb領域との比較」、M
ol.Microbiol.5:1873〜1881;Jiang,X.M.,B.Neal,F.Santiago,S.J.L
ee,L.K.Romana,and P.R.Reeves)(1991)「Salmonella enterica血液型亜型
typhimurium(LT2)のrfb(O抗原)遺伝子クラスターの構造と配列」、Mol.Micr
obiol.5:692〜713;リー、ロマーナおよびリーブス(S.J.Lee,L.K.Roln
ana,and P.R.Reeves)(1992)「グループC1 S.enterica株からのrfb(O抗原)
遺伝子クラスターの配列および構造分析」、J.Gen.Microbiol.138:1843〜185
5;ルイ、ベルマ、ロマーナ、およびリーブス(Lui,D.,N.K.Verma,L.K.R
omana,and P.R.Reeves)(1991)「Salmonella enterica血液型亜型A、Bおよ
びDのrfb領域間の関係」、J.Bacteriol.173:4814〜4819;ベルマおよびリー
ブス(Verma,N.K.and P.Reeves)(1989)「グループAおよびグルー
プD Salmonella entericaの抗原特異性を決定するrfbSおよびrfbEの同定と配
列」、J.Bacteriol.171:5694〜5701;ワン、ロマーナおよびリーブス(Wang
,L.,L.K.Romana,and P.R.Reeves)(1992)「Salmonella enterica enter
icae グループE1rfb遺伝子クラスターの分子分析:O抗原および主要多形性
の遺伝的基礎」、Genetics130:429〜443;ワイクおよびリーブス(Wyk,P.and
P.Reeves)(1989)「グループB Salmonella entericaeに抗原特異性を付与する
アベクオース合成酵素に対する遺伝子の同定と配列:ガラクトース・エピメラー
ゼとの相同性」、J.Bacteriol.171:5687〜5693;ツイアン、ホッブス、およ
びリーブス(Xiang,S.H.,M.Hobbs,and P.R.Reeves)1994、「グループD2 S.enterica
株のrfb遺伝子クラスターの分子分析:グループEおよびD1株間の
挿入配列介在組換え事象からのその起源の証明」、J.Bacteriol.176:4357〜43
65;カード、リウおよびリーブス(Curd,H.,D.Liu and P.R.Reeves)「Salmonel la enterica
グループB、D1、D2およびD3O抗原間の関係」、J.Bacteriol.180
:1002〜1007]。
密接に関係するShigella(実際にはE.coliの一部と考えることができる)の内
、S .dysenteriaeおよびS.flexneriのO抗原は配列が完全に決定され、gndの隣
接位にある[クレナおよびシュナイトマン(Klena JD & Schnaitman CA)(1993)
「rfb遺伝子クラスターの機能およびShigella dysenteriae 1によるO抗原の合
成におけるrfe遺伝子」、Mol.Microblol.9:393〜402:モロナ、マブリス、
ファラリノおよびマニング(Morona,R.,Mavris,M.,Fallarino,A.& Manning
,P.)(1994)「Shigella flexneriのrfc領域の特性化」、J.Bacteriol.176:73
3〜747]。
腸内病原性大腸菌株のO抗原およびS.enterica株のO抗原が主要な毒性因子で
あり、高度に多形性である限り、E.coliを検出し、S.entericaを検出するための
高度に特異的な、高感度、迅速、安価な診断アッセイ法を開発することが実際に
必要である。また、E.coli株のO抗原を同定し、S.enterica株のO抗原を同定す
るための診断アッセイ法を開発することが実際に必要である。E.coliの検出に関
してこれらの必要性はEHEC(腸内病原性出血性E.coli)株にまで及ぶが、
これはもっとも必要性の高い領域である。E.coliではETEC(腸内毒性E.coli
)などの診断に興味がある。
この領域で採用された最初の診断システムでは、E.coli O抗原発現株またはS. enterica
O抗原発現株に対し作製した大量の抗血清を使用した。この技術では
、その試薬類の調製、保存および使用、ならびに意味のある診断結果を得るのに
必要な時間などと関連して本来的に困難性がある。
S.enterica株のO抗原遺伝子クラスターから誘導されるヌクレオチド配列は、
PCRアッセイにおいてS.entericaO抗原を決定するために用いられている[ル
ーク(Luk,J.M.C.)ら(1993)「S.enterica主要血清群(A、B、C2、お
よびD)同定のためのポリメラーゼ連鎖反応によるアベクオースおよびパラトー
ス合成酵素遺伝子(rfb)の選択的増幅」、J.Clin.Microbiol.31:2118
〜2123]。グループB、A、D1、C2およびE1をそれぞれ代表する血液
型亜型ティフィムリウム(Typhimurium)、パラティフィA(Paratyphi A)、ティフ
ィ(Typhi)、ミュエンヒェン(Muenchen)およびアナタム(Anatum)の全rfb遺伝
子座の先の完全ヌクレオチド配列特性化は、ルークらがこれらの血清群に特異的
なオリゴヌクレオチド・プライマーを選択するのを可能とした。かくして、ルー
クらの方法は、S.enterica血清群E1、D1、A、BおよびC2のO抗原領域内
にCDP−アデクオースおよびCDP−パラトース合成遺伝子に対応する既知の
ヌクレオチド配列をならべ、血清型特異オリゴヌクレオチドを同定するために観
察されたヌクレオチド配列の差異を利用することに基づいている。
志賀毒素様毒素産生大腸菌株のO抗原血清型を決定する試みにおいて、パトン
(Paton,A.W.)ら(1996)[「志賀毒素様毒素産生大腸菌で汚染された乾
燥醗酵ソーセージが原因の溶血性尿毒症症候群発症の分子微生物学的研究」、J
.Clin.Microbiol.34:1622〜1627]はwbdl(orf6)領域から誘導したオリゴヌ
クレオチドを用いたが、このものはE.coli O111に特異的であると信じられ
、PCR診断アッセイにおいてE.coli O111配列から誘導された。未発表論
文によると、パトンらの方法は、wbdIから誘導されたヌクレオチド配列はO11
1抗原を特異的に同定しないかも知れず、実際にも検出は擬陽性の結果となると
い
う点で欠陥があるとしている。パトンらはPCRにより5種のO111抗原単離
体を検出し、それら単離体の3種のみから実際にO111特異抗血清と反応する
バクテリアを検出したことを明らかにしている。
発明の開示
特定の仮説に拘束されることを望まないながらも、本発明者らが現在信じるの
は、パトンらの方法で見られた呈示擬陽性は、パトンらの採用した核酸分子が糖
経路遺伝子として推定される機能を有する遺伝子[バスチンおよびリーブス(Ba
stin D.A.and Reeves,P.R.)(1995)、E.coliO111のO抗原遺伝子(rfb
)クラスターの配列と分析、Gene、164:17〜23]から誘導したものであ
という事実のためであるが、現在それらはE.coliO抗原を同定するために必要な
ヌクレオチド配列特異性を欠いていると彼らも信じていることである。本発明者
らが現在信じるのは、S.entericaまたは他の腸内細菌内で発現される糖経路遺伝
子から誘導される核酸分子の多くもまた、特異O抗原または特異血清型を同定す
るのに必要なヌクレオチド配列特異性を欠いているらしいということである。
この点に関連して、多糖抗原合成のための遺伝子が、抗原に存在する糖の合成
(糖経路遺伝子)に関係するもの、および多糖類を形成するこれら糖類の取り扱
いに関するものを含むということに留意するのは重要である。本発明は後者のグ
ループの遺伝子、特に、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼおよびフリッパーゼ
遺伝子などの組立および輸送の遺伝子と主に関連する。
本発明者らは、驚くべきことに、O抗原遺伝子クラスター内の特定の組立およ
び輸送遺伝子、特にトランスフェラーゼ、wzxおよびwzy遺伝子から誘導される核
酸分子を使用すると、O抗原の検出および同定の特異性を改善し得ることを見出
した。本発明者らは、本発明が本明細書に例示された核酸分子によりコードされ
る特定のO抗原の検出に必ずしも限定されず、O抗原を発現するバクテリアの検
出および一般O抗原の同定に広く適用し得るものであると信じる。さらに、O抗
原の合成に関わる遺伝子クラスターとバクテリア莢膜抗原など他の多形性多糖抗
原のものとの間に類似性があるために、本発明の方法および分子はこれら他の
多糖抗原にも適用し得ると本発明者らは信じる。
従って、一側面において、本発明は特異バクテリア多糖抗原の検出および同定
に有用な核酸分子の同定に関する。
本発明は以下の遺伝子から誘導される核酸分子を提供する:トランスフェラー
ゼをコードする遺伝子;または多糖またはオリゴ糖単位の輸送または処理工程に
関わる酵素をコードする遺伝子、例えば、wzx遺伝子、wzy遺伝子、または同様の
機能を有する遺伝子;該遺伝子は特定のバクテリア多糖抗原の合成に関わり、そ
の場合核酸分子の配列は特定のバクテリア多糖抗原に特異的である。
多糖抗原類、例えば、E.coliの莢膜抗原(I型およびII型)、サルモエラsvティ
フィの毒性莢膜およびストレプトコッカス.ニューモニエ(Streptococcus pneu
moniae)およびスタフィロコッカス・アルブス(Staphylococcus albus)などの
種の莢膜抗原は、ヌクレオチド糖経路遺伝子、糖トランスフェラーゼ遺伝子およ
ひ多糖またはオリゴ糖単位の輸送および処理工程のための遺伝子を包含する遺伝
子によりコードされ、提供される。これらはある場合にはwzxまたはwzyであるが
、他の場合には異なる処理工程経路が用いられるために全く異なっている。他の
遺伝子クラスターの例は、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcu s thermophilus
)の細胞外多糖、リゾビウム・メリロッティ(Rhizobium melilo tti
)のエキソ多糖、およびクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumonia e
)のK2莢膜などに対する遺伝子クラスターである。これらはすべて、実験分析
、ヌクレオチド配列または予測されるタンパク質構造の比較により、ヌクレオチ
ド糖経路遺伝子、糖トランスフェラーゼ遺伝子およびオリゴ糖または多糖処理工
程のための遺伝子を含むと見ることのできる遺伝子をもっている。
E.coli K-12コラン酸(colanic acid)莢膜遺伝子クラスターの場合には[ス
ティーブンソン(Stevenson)ら(1996)「細胞外多糖コラン酸の産生に関わ
るE.coliK−12遺伝子の構築」J.Bacteriol.178:4885〜4893]
、3分類からの遺伝子が仮にあるいは確定的に同定された。コラン酸莢膜はE.co
liのI型莢膜に分類される。
本発明者らは、一般に、トランスフェラーゼ遺伝子およびオリゴ糖処理工程用
遺伝子が、かかる莢膜に存在する殆どの糖が異なる血清型の莢膜に起こるような
ヌクレオチド糖合成経路をコードする遺伝子よりも、特定の莢膜に対してより特
異的であると信じる。このように、ヌクレオチド糖合成経路遺伝子は莢膜型のも
のよりもより一般的であると現在は予測できる。
下に述べるように、本発明者らは、トランスフェラーゼ遺伝子および/または
オリゴ糖もしくは多糖用遺伝子を共有する多糖抗原遺伝子クラスターが存在し、
そのためこれらの遺伝子内からヌクレオチド配列を完全に無作為に選択すること
で交差反応がもたらされるのであろうと認識している;莢膜抗原に関する一例は
、E.coli II型莢膜であって、このものに対してはトランスフェラーゼ遺伝子の
みが十分に特異的である。しかし、それにもかかわらず本発明者らは、かれらの
これれまでの結果に照らして、トランスフェラーゼ遺伝子またはオリゴ糖もしく
は多糖処理工程を制御する遺伝子が、多糖抗原型の特異的検出および特性化のた
めにヌクレオチド配列を選択する勝れた標的であると考える。かくして、特定の
遺伝子間に類似性がある場合には、関連する遺伝子クラスター内の他のトランス
フェラーゼ遺伝子またはオリゴ糖もしくは多糖処理工程遺伝子内からヌクレオチ
ド配列を選択することがなお特異性を与えることとなろうし、あるいはヌクレオ
チド配列を組合わせて用いることが所望の特異性を与えることになろう。ヌクレ
オチド配列の組合わせは、経路遺伝子から誘導されるヌクレオチド配列とトラン
スフェラーゼ、wzxまたはwzy遺伝子から誘導されるヌクレオチド配列とをともに
包含してもよい。
このように、本発明は一群の核酸分子をも提供するが、該核酸分子はトランス
フェラーゼおよび/または多糖もしくはオリゴ糖単位の輸送または処理工程の酵
素をコードする遺伝子、例えばwzxまたはwzyの組合わせから誘導される;この場
合、遺伝子の組合わせは特定のバクテリア多糖抗原の合成に特異的であり、この
場合一群の核酸分子はバクテリア多糖抗原に特異的である。他の好適な形態にお
いて、核酸分子はトランスフェラーゼおよび/または多糖もしくはオリゴ糖単位
の輸送または処理工程の酵素をコードする遺伝子、例えはwzxまたはwzyの組合わ
せから、経路遺伝子から誘導される核酸分子とともに誘導される。
第二の側面において、本発明は診断アッセイ法におけるO抗原を発現するバク
テリアの検出およびこれらバクテリアのO抗原同定に有用な核酸分子の同定に関
する。
本発明は以下の遺伝子から誘導される核酸分子を提供する:トランスフェラー
ゼをエンコードする遺伝子;または多糖類またはオリゴ糖単位の輸送または処理
工程に関わる酵素をコードする遺伝子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子;この遺伝
子は特定のバクテリアO抗原の合成に関わり、この場合核酸分子の配列は特定の
バクテリアO抗原に特異的である。
本発明の核酸の長さは多様であってもよい。一態様において、核酸の長さは約
10ないし約20個のヌクレオチドからなる。
好適な一態様において、本発明は以下の遺伝子から誘導される核酸分子を提供
する:トランスフェラーゼをエンコードする遺伝子;または多糖類またはオリゴ
糖単位の輸送または処理工程に関わる酵素をエンコードする遺伝子、例えば、wz
xまたはwzy遺伝子であって、大腸菌により発現されるO抗原の合成に関わる遺伝
子であり、その核酸分子配列はO抗原に特異的である。
さらに好適な一態様において、核酸分子の配列はO111抗原をコードするヌ
クレオチド配列(配列番号1)に特異的である。より好ましくは、該配列はwbdH
(配列番号1のヌクレオチド位置739〜1932)、wzx(配列番号1のヌク
レオチド位置8646〜9911)、wzy(配列番号1のヌクレオチド位置99
01〜10953)、wbdM(配列番号1のヌクレオチド位置11821〜129
45)、および少なくとも10〜12ヌクレオチドの長さのこれら分子のフラグ
メントからなる群から選択される遺伝子より誘導される。特に好適な核酸分子は
上記遺伝子に関し表5および5Aに掲げたものである。
他のさらに好適な一態様において、核酸分子の配列はO157抗原をコードす
るヌクレオチド配列(配列番号2)に特異的である。より好ましくは、該配列は
wbdN(配列番号2のヌクレオチド位置79〜861)、wbdO(配列番号2のヌク
レオチド位置2011〜2757)、wbdP(配列番号2のヌクレオチド位置52
57〜6471)、wbdR(配列番号2のヌクレオチド位置13156〜1382
1)、wzx(配列番号2のヌクレオチド位置2744〜4135)、およびwzy(
配列番号2のヌクレオチド位置858〜2042)からなる群から選択される遺
伝子より誘導される。特に好適な核酸分子は表6および6Aに掲げたものである
。
本発明は、さらに好適な態様において、以下の遺伝子から誘導される核酸分子
を提供する:トランスフェラーゼをコードする遺伝子;または多糖またはオリゴ
糖単位の輸送または処理工程に関わる酵素をコードする遺伝子、例えは、wzxま
たはwzy遺伝子;該遺伝子はS.entericaにより発現されるO抗原の合成に関わる
遺伝子あって、この場合核酸分子の配列はO抗原に特異的である。
この態様のより好適な一形態において、核酸分子の配列はS.enterica C2抗原
をコードするヌクレオチド配列(配列番号3)に特異的である。より好ましくは
、該核酸分子の配列は以下の遺伝子からなる群から選択される遺伝子から誘導さ
れる:wbaR(配列番号3のヌクレオチド位置2352〜3314)、wbaL(配列
番号3のヌクレオチド位置3361〜3875)、wbaQ(配列番号3のヌクレオ
チド位置3977〜5020)、wbaW(配列番号3のヌクレオチド位置6313
〜7323)、wbaZ(配列番号3のヌクレオチド位置7310〜8467)、wz
x(配列番号3のヌクレオチド位置1019〜2359)、およびwzy(配列番号
3のヌクレオチド位置5114〜6313)。特に好適な核酸分子は表7に掲げ
たものである。
この態様のより好適なさらなる形態において、核酸分子の配列はS.entericaB
抗原をコードするヌクレオチド配列(配列番号4)に特異的である。より好まし
くは、該配列はwzx(配列番号4のヌクレオチド位置12762〜14054)
またはwbaV(配列番号4のヌクレオチド位置14059〜15060)から誘導
される。特に好適な核酸分子は、wzxおよびwbaV遺伝子から誘導される表8に掲
げたものである。
この態様のさらにより好適な形態において、核酸分子の配列はS.entericaD 3
O抗原に特異的であり、wzy遺伝子から誘導される。
この態様のさらになおより好適な形態において、核酸分子の配列はS.enterica
E1 O抗原に特異的であり、wzx遺伝子から誘導される。
トランスフェラーゼ遺伝子または多糖もしくはオリゴ糖単位の輸送または処理
工程をコードする遺伝子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子が個々のO抗原型の特異
的検出に対する勝れた標的である一方、交差反応が起こるような異なるO抗原型
間で同一であるか密接した関係にあることを証明することのできる個々の遺伝子
またはそれらの部分がこのグループ内にある。交差反応はこのグループ内で異な
る標的を選択するか、このグループ内の複数の標的を用いることにより回避すべ
きである。
さらに、O抗原遺伝子クラスターは、ユニークO抗原型が少なくとも2種の他
のO抗原型と共有する遺伝子産物の組合わせにより提供されるような少なくとも
2種の株の組換えから生じる場合のあることが認識される。この現象の認められ
た例はS.entericaO抗原血清型D2であり、このものはD1およびE1からの遺伝子を
有するが、D2にユニークなものはない。これらの状況において、O抗原型の検出
は本発明に従いなお達成し得るが、この特定のO抗原遺伝子クラスターにのみ存
在する遺伝子の特有の組合わせを検出するには、核酸分子を組合わせて使用する
必要がある。
このように、本発明は一群の核酸分子をも提供するが、この場合、核酸分子は
トランスフェラーゼおよび/または多糖もしくはオリゴ糖単位の輸送または処理
工程のための酵素をコードする遺伝子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子から誘導さ
れ、その場合一群の核酸分子はバクテリアO抗原に特異的である。好ましくは、
特定のバクテリアO抗原はS.entericaにより発現される。より好ましくは、一群
の核酸分子はD2 O抗原に特異的であり、E1 wzy遺伝子およびD1 wzx遺伝子から
誘導される。
ヌクレオチド配列の組合わせは経路遺伝子から誘導されるヌクレオチド配列を
、トランスフェラーゼから誘導されるヌクレオチド配列、wzxまたはwzy遺伝子と
ともに含んでいてもよい。
このように、本発明は一群の核酸分子をも提供するが、この場合、核酸分子は
トランスフェラーゼおよび/または多糖もしくはオリゴ糖単位の輸送または処理
工程のための酵素をコードする遺伝子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子、および糖
経路遺伝子から誘導され、その場合一群の核酸分子はバクテリアO抗原に特異的
である。好ましくは、該O抗原はS.entericaにより発現される。
さらに認められることは、疑似ハイブリッド形成は多くの異なる遺伝子に見出
される配列の最初の選択を経て生じる場合があるが、これは典型的には、例えば
、PCRゲルの対照に対するバンドの大きさを比較することにより認識し得るこ
とであり、その場合は他の替わり得る配列を選択することができる。
本発明者らは、本発明の知見および多糖抗原遺伝子クラスター(O抗原遺伝子
クラスターを含む)に関し入手し得る情報に基づき、また、実験的分析の使用、
核酸配列または予測されるタンパク質構造の比較を通して、本発明による核酸分
子は対象となる特定の多糖抗原に向けて容易に誘導することができる。適切なバ
クテリア株は一般に寄託機関から有償で入手することができる。
上述のように、現在、166種の確定したE.coliO抗原が有る一方、S.enteri ca
は46種の既知O抗原型をもつ[ポポフ(Popoff M.Y.)ら(1992)「サルモネ
ラ血液型亜型の抗原形状」第6版、S.entericaに関する参照および研究のための
WHO協力センター、パスツール研究所、パリ フランス]。多くの他のバクテ
リア属はO抗原を持つことが知られており、これらはシトロバクター(Citrobact
er)、シゲラ(Shigella)、イエルシニア(Yersinia)、プレシオモナス(Plesio
monas)、ビブリオ(Vibrio)およびプロテウス(Proteus)である。
166種の異なるE.coli O抗原血清型のサンプルは国立血清研究所、コペン
ハーゲン、デンマークから入手可能である。
46種のS.enterica血清型は医学・獣医学研究所、アデライーデ、オーストラ
リアから入手可能である。
他の側面において、本発明は1以上のバクテリア多糖抗原の存在についてサン
プルを試験する方法に関し、該方法は該サンプルを以下の遺伝子に特異的にハイ
ブリッドし得る少なくとも1種のオリゴヌクレオチド分子と接触させることから
なる:(i)トランスフェラーゼをコードする遺伝子、または(ii)オリゴ糖も
しくは多糖単位の輸送または処理工程のための酵素をコードする遺伝子、例えば
、
wzxまたはwzy遺伝子;この場合、当該遺伝子はバクテリア多糖抗原の合成に関わ
る;適切な条件は、少なくとも1種のオリゴヌクレオチド分子が、サンプル中に
存在する特定のバクテリア多糖抗原を発現するバクテリアの少なくとも1種のか
かる遺伝子に特異的にハイブリッド形成し、特異的にハイブリッド形成したオリ
ゴヌクレオチド分子を検出することを可能とする条件である。
単一の特異オリゴヌクレオチド分子が入手し得ない場合、標的領域に特異的に
ハイブリッド形成する分子を組合わせて使用してもよい。このように、本発明は
本発明の試験方法に使用する一群の核酸分子を提供するが、この場合、核酸分子
はトランスフェラーゼおよび/または多糖もしくはオリゴ糖単位の輸送または処
理工程の酵素をエンコードする遺伝子、例えばwzxまたはwzyから誘導され、この
場合、一群の核酸分子は特定のバクテリア多糖類に特異的である。一群の核酸分
子は必要により糖経路遺伝子から誘導される核酸分子を含むことができる。
他の側面において、本発明は1以上のバクテリア多糖抗原の存在についてサン
プルを試験する方法に関し、該方法は少なくとも1対のオリゴヌクレオチド分子
を有する該サンプルを以下の遺伝子に特異的にハイブリッド形成することのでき
る該対の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド分子と接触させることからなる:
(i)トランスフェラーゼをコードする遺伝子、または(ii)オリゴ糖もしくは
多糖単位の輸送または処理工程のための酵素をコードする遺伝子、例えは、wzx
またはwzy遺伝子;この場合、当該遺伝子はバクテリア多糖抗原の合成に関わる
;適切な条件は、該対分子の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド分子が、サン
プル中に存在する特定のバクテリア多糖抗原を発現するバクテリアの少なくとも
1種のかかる遺伝子に特異的にハイブリッド形成し、特異的にハイブリッド形成
したオリゴヌクレオチド分子を検出することを可能とする条件である。
対のオリゴヌクレオチド分子は双方同一の遺伝子または異なる遺伝子にハイブ
リッド形成してもよい。対の一方のオリゴヌクレオチド分子のみが特定の抗原型
に特異的な配列に特異的にハイブリッド形成する必要がある。他の分子は非特異
的領域にハイブリッド形成することができる。
特定の多糖抗原遺伝子クラスターが組換えを経て生じる場合には、オリゴヌク
レオチド分子の少なくとも1対はその多糖抗原に特異的なクラスター中遺伝子の
特定の組合わせにハイブリッド形成することが可能であるように選択するか、あ
るいは複数の対が遺伝子の特定の組合わせにハイブリッド形成するように選択し
てもよい。特定クラスター中の遺伝子がすべてユニークである場合でも、クラス
ター内で遺伝子の組合わせを認識するヌクレオチド分子を使用し、本方法を実施
することができる。
このように、本発明は本発明の試験方法に使用する核酸分子の対を含む1群を
提供するが、この場合、核酸分子の対はトランスフェラーゼおよび/または多糖
もしくはオリゴ糖単位の輸送または処理工程のための酵素をコードする遺伝子、
例えば、wzxまたはwzy遺伝子から誘導され、ここで一群の核酸分子は特定のバク
テリア多糖抗原に特異的である。一群の核酸分子は必要により糖経路遺伝子から
誘導される核酸分子の対を含むことができる。
他の側面において、本発明は1以上の特定バクテリアのO抗原の存在について
サンプルを試験する方法に関し、該方法は該サンプルを以下の遺伝子に特異的に
ハイブリッド形成することのできる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド分子と
接触させることからなる:(i)O抗原トランスフェラーゼをコードする遺伝子
、または(ii)オリゴ糖もしくは多糖単位の輸送または処理工程のための酵素を
コードする遺伝子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子;この場合、当該遺伝子は特定
O抗原の合成に関わる;適切な条件は、少なくとも1種のオリゴヌクレオチド分
子が、サンプル中に存在する特定のバクテリアO抗原を発現するバクテリアの少
なくとも1種のかかる遺伝子に特異的にハイブリッド形成し、特異的にハイブリ
ッド形成したオリゴヌクレオチド分子を検出することを可能とする条件である。
好ましくは、バクテリアはE.coliまたはS.entericaである。より好ましくは、E. coli
はO157血清型またはO111血清型を発現する。より好ましくは、S.en terica
はC2またはB血清型を発現する。好ましくは、この方法はサザンブロット
法である。より好ましくは、核酸分子は標識し、核酸分子のハイブリッド形成を
オートラジオグラフィーまたは蛍光検出により検出する。
本発明者らは単一の特異的オリゴヌクレオチド分子が入手し得ない場合を想定
する。そのような場合、標的領域に特異的にハイブリッド形成する分子の組合わ
せを用いてもよい。このように、本発明は本発明の試験方法に使用する1群の核
酸分子を提供するが、この場合、核酸分子はトランスフェラーゼおよび/または
多糖もしくはオリゴ糖単位の輸送または処理工程のための酵素をエンコードする
遺伝子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子から誘導され、ここで一群の核酸分子は特
定のバクテリアO抗原に特異的である。好ましくは、特定のバクテリアO抗原はS.enterica
により発現される。一群の核酸分子は必要により糖経路遺伝子から誘
導される核酸分子を含むことができる。
他の側面において、本発明は1以上の特定バクテリアO抗原の存在についてサ
ンプルを試験する方法に関し、該方法は少なくとも1対のオリゴヌクレオチド分
子を有する該サンプルを以下の遺伝子に特異的にハイブリッド形成することので
きる該対の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド分子と接触させることからなる
:(i)O抗原トランスフェラーゼをエンコードする遺伝子、または(ii)オリ
ゴ糖もしくは多糖単位の輸送または処理工程のための酵素をエンコードする遺伝
子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子;この場合、当該遺伝子は特定O抗原の合成に
関わる;適切な条件は、少なくとも一方のオリゴヌクレオチド分子が、サンプル
中に存在する特定のバクテリアO抗原を発現するバクテリアの少なくとも1種の
かかる遺伝子に特異的にハイブリッド形成し、特異的にハイブリッド形成したオ
リゴヌクレオチド分子を検出することを可能とする条件である。
好ましくは、バクテリアはE.coliまたはS.entericaである。より好ましくは、E.coli
はO111またはO157血清型のものである。より好ましくは、S.ente rica
はC2またはB血清型を発現する。好ましくは、この方法はポリメラーゼ連鎖
反応法である。より好ましくは、本発明方法に使用するオリゴヌクレオチド分子
は標識したものである。さらにより好ましくは、ハイブリッド形成したオリゴヌ
クレオチド分子は電気泳動法により検出する。O111に使用する好ましいオリ
ゴヌクレオチドはO111の特異検出法用となるものであるが、これらを遺伝子
wbdH、wzx、wzyおよびwbdMとの関わりで表5および5Aに記載する。O157に
使用する好ましいオリゴヌクレオチドはO157の特異検出法用となるもの
であるが、これらを表6および6Aに記載する。
血清型C2およびBに関しては、好適なオリゴヌクレオチド分子を表7および
8の第3欄に記載した適切な領域から選択することができる。
本発明者らは、稀ではあるが、血清学的に異なるO抗原をコードする2つの遺
伝的に類似する遺伝子クラスターが遺伝子の組換えまたは突然変異を介して生じ
、多形変異体を生成する場合のあることを想定する。そのような場合には、複数
対のオリゴヌクレオチドを選択し、特異的に組合わせた遺伝子にハイブリッド形
成するようにする。このように、本発明は本発明の試験方法に使用する核酸分子
の対を含む1群を提供するが、この場合、核酸分子の対はトランスフェラーゼお
よび/または多糖もしくはオリゴ糖単位の輸送または処理工程のための酵素をエ
ンコードする遺伝子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子から誘導され、ここで一群の
核酸分子は特定のバクテリアO抗原に特異的である。好ましくは、特定のバクテ
リアO抗原はS.entericaにより発現される。一群の核酸分子は必要により糖経路
遺伝子から誘導される核酸分子の対を含むことができる。
他の側面において、本発明は1以上の特定のバクテリアO抗原の存在について
食物由来サンプルを試験する方法に関し、該方法は少なくとも1対のオリゴヌク
レオチド分子を有する該サンプルを以下の遺伝子に特異的にハイブリッド形成す
ることのできる該対の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド分子と接触させるこ
とからなる:(i)O抗原トランスフェラーゼをコードする遺伝子、または(ii
)オリゴ糖もしくは多糖単位の輸送または処理工程のための酵素をコードする遺
伝子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子;この場合、当該遺伝子は特定のO抗原の合
成に関わる;適切な条件は、少なくとも一方のオリゴヌクレオチド分子が、サン
プル中に存在する特定のバクテリア多糖抗原を発現するバクテリアの少なくとも
1種のかかる遺伝子に特異的にハイブリッド形成し、特異的にハイブリッド形成
したオリゴヌクレオチド分子を検出することを可能とする条件である。好ましく
は、バクテリアはE.coliまたはS.entericaである。より好ましくは、E.coliはO
111またはO157血清型のものである。より好ましくは、S.entericaはC2
またはB血清型のものである。好ましくは、この方法はポリメラーゼ連鎖反応法
である。より好ましくは、本発明方法に使用するオリゴヌクレオチド分子は標識
したものである。さらにより好ましくは、ハイブリッド形成したオリゴヌクレオ
チド分子は電気泳動法により検出する。
他の側面において、本発明は1以上の特定バクテリアO抗原の存在について糞
便由来サンプルを試験する方法に関し、該方法は少なくとも1対のオリゴヌクレ
オチド分子を有する該サンプルを以下の遺伝子に特異的にハイブリッド形成する
ことのできる該対の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド分子と接触させること
からなる:(i)O抗原トランスフェラーゼをコードする遺伝子、または(ii)
オリゴ糖もしくは多糖単位の輸送または処理工程のための酵素をコードする遺伝
子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子;この場合、当該遺伝子は特定O抗原の合成に
関わる;適切な条件は、少なくとも一方のオリゴヌクレオチド分子が、サンプル
中に存在する特定のバクテリアO抗原を発現するバクテリアの少なくとも1種の
当該遺伝子に特異的にハイブリッド形成し、特異的にハイブリッド形成したオリ
ゴヌクレオチド分子を検出することを可能とする条件である。好ましくは、バク
テリアはE.coliまたはS.entericaである。より好ましくは、E.coliはO111ま
たはO157血清型のものである。より好ましくは、S.entericaはC2またはB
血清型のものである。好ましくは、この方法はポリメラーゼ連鎖反応法である。
より好ましくは、本発明方法に使用するオリゴヌクレオチド分子は標識したもの
である。さらにより好ましくは、ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド分子
は電気泳動法により検出する。
他の側面において、本発明は1以上の特定バクテリアO抗原の存在について患
者由来サンプルを試験する方法に関し、該方法は少なくとも1対のオリゴヌクレ
オチド分子を有する該サンプルを以下の遺伝子に特異的にハイブリッド形成する
ことのできる該対の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド分子と接触させること
からなる:(i)O抗原トランスフェラーゼをコードする遺伝子、または(ii)
オリゴ糖もしくは多糖単位の輸送または処理工程のための酵素をコードする遺伝
子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子;この場合、当該遺伝子は特定O抗原の合成に
関わる;適切な条件は、少なくとも一方のオリゴヌクレオチド分子が、サンプ
ル中に存在する特定のバクテリアO抗原を発現するバクテリアの少なくとも1種
のかかる遺伝子に特異的にハイブリッド形成し、特異的にハイブリッド形成した
オリゴヌクレオチド分子を検出することを可能とする条件である。好ましくは、
バクテリアはE.coliまたはS.entericaである。より好ましくは、E.coliはO11
1またはO157血清型のものである。より好ましくは、S.entericaはC2また
はB血清型のものである。好ましくは、この方法はポリメラーゼ連鎖反応法であ
る。より好ましくは、本発明方法に使用するオリゴヌクレオチド分子は標識した
ものである。さらにより好ましくは、ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド
分子は電気泳動法により検出する。
上記方法において理解されることは、オリゴヌクレオチドの対を用いる場合に
は、オリゴヌクレオチド配列の一方はトランスフェラーゼ、wzxまたはwzy遺伝子
からのものではない配列にハイブリッド形成するということである。さらに、双
方がこれら遺伝子産物の一つにハイブリッド形成する場合、それらはこれら遺伝
子の同一または異なるものにハイブリッド形成することができる。
さらに理解されることは、交差反応が問題となる場合、オリゴヌクレオチドの
組合わせを選択し、遺伝子の組合わせを検出して特異性を与えてもよいというこ
とである。
さらに本発明はバクテリア多糖抗原を発現するバクテリアの検出とこれらバク
テリアのバクテリア多糖型の同定に使用することのできる診断キットに関する。
このように、さらなる側面において、本発明は以下の遺伝子に特異的にハイブ
リッド形成することのできる第一核酸分子を収容する第一バイアルからなるキッ
トに関する:(i)トランスフェラーゼをコードする遺伝子、または(ii)オリ
ゴ糖もしくは多糖の輸送または処理工程のための酵素をコードする遺伝子、例え
ば、wzxまたはwzy遺伝子;この場合、当該遺伝子はバクテリア多糖類の合成に関
わる。また、キットは同一または別個のバイアル中に以下の遺伝子に特異的にハ
イブリッド形成することのできる第二特異核酸を提供する:(i)トランスフェ
ラーゼをコードする遺伝子、または(ii)オリゴ糖もしくは多糖の輸送または処
理工程のための酵素をコードする遺伝子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子;こ
の場合、当該遺伝子はバクテリア多糖類の合成に関わり、この場合、第二核酸分
子の配列は第一核酸分子の配列とは異なるものである。
さらなる側面において、本発明は以下の遺伝子に特異的にハイブリッド形成す
ることのできる第一核酸分子を収容する第一バイアルからなるキットに関する:
(i)トランスフェラーゼをコードする遺伝子、または(ii)オリゴ糖もしくは
多糖の輸送または処理工程のための酵素をコードする遺伝子、例えば、wzxまた
はwzy遺伝子;この場合、当該遺伝子はバクテリアO抗原の合成に関わる。また
、キットは同一または別個のバイアル中に以下の遺伝子に特異的にハイブリッド
形成することのできる第二特異核酸を提供する:(i)トランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子、または(ii)オリゴ糖もしくは多糖の輸送または処理工程のた
めの酵素をコードする遺伝子、例えば、wzxまたはwzy遺伝子;この場合、当該遺
伝子はO抗原の合成に関わり、この場合、第二核酸分子の配列は第一核酸分子の
配列とは異なるものである。好ましくは第一および第二核酸配列はE.coliから誘
導されたものであるか、あるいは第一および第二核酸配列はS.entericaから誘導
されたものである。
本発明者らはO157遺伝子クラスターの全長配列を初めて提供し、これまで
クローン化されていなかった全遺伝子クラスターのこの配列から組換え分子を生
成せしめ、発現のために挿入して、ワクチンなどの応用に有用な発現O157を
提供することが可能であるとを認識する。
定義
「遺伝子から誘導される核酸分子」という語句は、該核酸分子が同定された遺
伝子のすべてまたは一部と同一であるか実質的に類似するヌクレオチド配列を有
することを意味する。このように、遺伝子から誘導される核酸分子は、同定され
た遺伝子から物理的分離法により単離される分子、または人工的に合成され、同
定された遺伝子のすべてまたは一部と同一であるか実質的に類似するヌクレオチ
ド配列を有する分子であってもよい。一部の研究者は遺伝子から転写されたmR
NAと同一の配列をもつDNA鎖のみを考えるが、ここでは両鎖を意図している
。
トランスフェラーゼ遺伝子は、モノマー糖単位輸送用遺伝子産物をコードする
ヌクレオチド配列保有核酸の領域である。
フリッパーゼまたはwzx遺伝子は、一般に3ないし6個のモノマー糖単位から
なるオリゴ糖繰返し単位を膜の外表面に移動させる遺伝子産物をコードするヌク
レオチド配列保持核酸の領域である。
ポリメラーゼまたはwzy遺伝子は、一般に3ないし6個のモノマー糖単位から
なる繰返しオリゴ糖単位を重合する遺伝子産物をエンコードするヌクレオチド配
列保持核酸の領域である。
本明細書において提供されるヌクレオチド配列は、アンチセンス配列として一
覧した配列に記載する。この用語は生化学用語集および分子生物学、改訂版、ダ
ビッド・エム・グリック(David M.Glick)、1997、ポートランドプレス(株)
、ロンドン、11頁に用いられているものと同じ様式で用いる;当該文献ではこ
の用語が二重鎖DNAの二本鎖の一方を言及するものとして記載しているが、通
常これはmRNAと同じ配列をもつ。我々はmRNAと同一の配列を有するこの
鎖を記載するためにこれを用いる。
命名法
E.coli O111rfbの同義語現行名 発明者命名 バスチンら1991
wbdH orf 1
gmd orf 2
wbdI orf 3 orf 3.4*
manC orf 4 rfbM*
manB orf 5 rfbK*
wbdJ orf 6 orf 6.7*
wbdK orf 7 orf 7.7*
wzx orf 8 orf 8.9およびrfbX*
wzy orf 9
wbdL orf 10
wbdM orf 11*
命名はバスチン(Bastin D.A.)ら、1991、「E.coli O111株のO抗原決定
rfb遺伝子クラスターのE.coli K-12での分子クローニングおよび発現」、Mol.M
icrobiol.5:9、2223〜2231による。他の同義語
wzy rfc
wzx rfbX
rmlA rfbA
rmlB rfbB
rmlC rfbC
rmlD rfbD
glf orf 6*
wbbI orf 3#,E.coli K-12のorf 8*
wbbJ orf 2#,E.coli K-12のorf 9*
wbbK orf 1#,E.coli K-12のorf 10*
wbbL orf 5#,E.coli K-12のorf 11*
#命名はヤオおよびバルバノ(Yao,Z.and M.A.Valvano)1994による。
「E.coli K-12 W3110のO−特異リポ多糖生合成領域(rfb)の遺伝子分析:シゲラ
・フレクスネリ血清型Yおよび4aに群特異性を付与する遺伝子の同定」。J.B
acteriol.176:4133〜4143。
*命名はスティブンソン(Stevenson)ら、1994、による。「E.coli K-12のO
抗原の構造およびそのrfb遺伝子クラスターの配列」。J.Bacteriol.176:4144〜
4156。
・ S.entericaは1987年に採り入れられた名称であり、多くの他の名称、例
えば、サルモネラ・ティフィおよびサルモネラ・ティフィミリウムに置き換わっ
ている。従来の種名はS.enterica sv ティフィなどの血液型亜型(serovar)名
となっている。しかし、伝統的な名称はなお広く用いられている。
・ 多くの種のO抗原遺伝子はrfb名(rfbAなど)を付与され、O抗原遺伝子ク
ラスターはしばしばrfbクラスターと言われてきた。rfb遺伝子に対する新しい名
称は表に示したとおりである。本明細書では情報源に従い両方の用語を使用して
いる。
図面の簡単な説明
図1はE.coli O111 O抗原遺伝子クラスターのサブクローンであるコスミドク
ローンpPR1054、pPR1055、pPR1056、pPR1058、pPR1287のE.coli R1制限地図を示
す。太線は全クローンに共通の領域である。破線は染色体上の非連続な部分を示
す。E.coli株M92の推定制限地図を上方に示す。
図2はコスミドクローンpPR1058内のE.coli O111 O抗原遺伝子クラスターの制
限地図化分析を示す。制限酵素は以下のとおり:B:Baml;Bg:BglII;E:E.coR1;
H:HindIII;K:KpnI;P:PstI;S:SalI;およびX:Xho1。プラスミドpPR1230、pPR1
231、およびpPR1288はpPR1058の欠失誘導体である。プラスミドpPR1237、pPR123
8、pPR1239およびpPR1240はpUC19内にある。プラスミドpPR1243、pPR1244、pPR1
245、pPR1246およびpPR1248はpUC18内にあり、pPR1292はpUC19にある。プラスミ
ドpPR1270はpT7T319Uにある。プローブ1、2および3はそれぞれpPR1246、pPR1
243およびpPR1237の内部フラグメントとして単離した。点線はサブクローンDN
Aが地図の左に伸長してベクターに結合していることを示す。
図3はE.coli O111 O抗原遺伝子クラスターの構造を示す。
図4はE.coli O157 O抗原遺伝子クラスターの構造を示す。
図5は血清群C20 O抗原遺伝子クラスターをエンコードするS.enterica遺伝子
座の構造を示す。
図6は血清群BO抗原遺伝子クラスターをエンコードするS.enterica遺伝子座
の構造を示す。
図7はE.coli O111 O抗原遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を示す。注:
(1)遺伝子の先端および末尾の3塩基はそれぞれ下線とイタリック体で示す;
(2)バスチンおよびリーブス(Bastin and Reeves)(1995)、「E.coliO111
のO抗原遺伝子(rfb)クラスターの配列と分析」、Gene164:17〜23)
が以前に配列決定した領域に印を付ける。
図8はE.coli O157 O抗原遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を示す。注:
(1)遺伝子の先端および末尾の3塩基はそれぞれ下線とイタリック体で示す;
(2)ビルジ(Bilge)ら[1996、「粘着におけるE.coliO157−H7側鎖の役
割とrfb遺伝子座の分析」Inf.and Immun.64:4795〜4801]が以前に配列決定し
た領域に印を付ける。
図9はS.enterica血清群C2O抗原遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を示
す。注:(1)付与番号はブラウン(Brown)ら(1992)による。「サルモネラ血
液型亜型ミュエンヒェン(株M67)のrfb遺伝子クラスターの分子分析:グル
ープC2およびB間の多形性の遺伝的基礎」、Mol.Microbiol.6:1385〜1394。
(2)遺伝子の先端および末尾の3塩基はそれぞれ下線とイタリック体で示す。
(3)グループBと異なるグループC2遺伝子クラスターの部分のみを配列決定
し、ここに提示する。
図10はS.enterica血清群BO抗原遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を示
す。(1)付与番号はジアン(Jiang)ら(1991)による。「S.enterica血液型亜型t
yphimurium(株LT2)のrfb(O抗原)遺伝子クラスターの構造と配列」、Mol
.Microbiol.5:695〜713。O抗原遺伝子クラスターの最初の遺伝子は塩基4099
から始まるrmlBである。(2)遺伝子の先端および末尾の3塩基はそれぞれ下線
とイタリック体で示す。
本発明を実施するための最良の方法材料および方法−第1部 E.coli O111 O抗原遺伝子クラスター(3,021〜9,981位)の単離および特徴づ
けのための実験手順は、Bastin D.A.ら、1991「E.coli O111株のO抗原を決定
するrfb遺伝子クラスターの分子クローニングおよびEscherichia coli K-12にお
ける発現」Mol.Microbiol.5:9 2223-2231、ならびにBastin D.A.およびReeve
s,P.R.1995「Escherichia coli O111のO抗原遺伝子(rfb)群の配列お
よび分析」Gene 164:17-23に従う。
A.バクテリア株および増殖培地
バクテリアを、必要とされるように補充したLuriaブロス中で増殖した。
B.コスミドおよびファージ
宿主株x2819中のコスミドを、インビボで再パッケージングした。細胞を、中
程度に振とうしながら、30℃にて、30mLの培養液を含有する250mLフラスコ中で
、580nmで0.3の最適密度に増殖した。欠陥λプロファージを、45℃で15分間、水
浴中で加熱し、続いて37℃で、勢いよく振とうしながら、2時間、インキュベー
ションすることによって誘導した。次いで、細胞を0.3mLクロロホルムを添加し
、そしてさらに10分間振とうして溶解した。細胞残渣を、マイクロ遠心分離機中
、5分間のスピンによって1mLの溶解物から除去し、そして上清を、新しいマイ
クロ遠心チューブに回収した。1滴のクロロホルムを添加し、次いで、チューブ
内容物の全体を勢いよく攪拌した。
C.DNA調製
染色体DNAを、30mLの容量のLuriaブロス中で37℃にて一晩増殖したバクテリア
から調製した。遠心分離によって細胞を採集した後、洗浄し、そして10mLの50mM
Tris-HCl pH8.0中に再懸濁した。EDTAを添加し、そして混合物を20分間インキ
ュベートした。次いで、リゾチームを添加し、インキュベーションをさらに10分
間継続した。次いで、プロテイナーゼK、SDS、およびリボヌクレアーゼを添加
し、その混合物を溶解が生じる2時間インキュベートした。全てのインキュベー
ションは37℃であった。次いで、混合物を65℃に加熱し、そして8mLのフェノー
ルで、同じ温度にて、1回抽出した。混合物を、5mLのフェノール/クロロホル
ム/イソアミルアルコールで、4℃にて、1回抽出した。残存するフェノールを
、2回のエーテル抽出によって除去した。DNAを、2容量のエタノールで、4℃
にて沈殿させ、スプールし、そして70%エタノール中で洗浄し、1〜2mLのTE
中に再懸濁し、そして透析した。プラスミドおよびコスミドDNAを、Bironboimお
よびDoly法[Birnboim,H.C.およびDoly,J.(1979)組換えプラスミドDNAをスク
リーニングするための迅速なアルカリ抽出処理Nucl.Acid Res.7:1513-1523]
の修飾によって調製した。培養物の容量は10mLであり、溶解物をフェノール/ク
ロロホルム/イソ-アミルアルコールで抽出した後、イソプロパノールで沈殿し
た。ベクターとして使用されるプラスミドDNAを、1Lの培養液中で増殖した細胞
のアルカリ溶解後、連続的な塩化セシウム勾配において単離した。
D.酵素および緩衝液
制限エンドヌクレアーゼおよびDNA T4リガーゼをBoehringer Mannheim(Castle
Hill,NSW,Australia)またはPharmacia LKB(Melbourne,VIC Australia)か
ら購入した。制限酵素を、推奨される市販の緩衝液中で使用した。
E.遺伝子バンクの構築
M92染色体DNA(Stoke W株、Statens Serum Institut,5 Artillerivej,2300
Copenhagen S,Denmark)を、0.2U Sau3A1で1〜15分間部分消化した。最も大
きなが部分が約40〜50kbのサイズ範囲のフラグメントのアリコートを選択し、予
めBamHIおよびPvuIIで消化したベクターpPR691にライゲートした。ライゲーショ
ン混合物を、パッケージング抽出物を用いて、インビトロでパッケージングした
。形質導入のための宿主株はx2819であり、組換え体をカナマイシンで選択した
。
F.血清学的な手順
コロニーを、イムノブロッティングによってO111抗原の存在についてスクリー
ニングした。コロニーを一晩、プレート当たり100個まで増殖し、次いでニトロ
セルロースディスクに移し、0.5N HClで溶解した。Tween20を、ブロッキング工
程、インキュベーション工程、および洗浄工程のために、0.05%の最終濃度で、T
BSに添加した。一次抗体は、1:800に希釈したE.coli O群111抗血清であった。
二次抗体は、1:5000に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤ
ギ抗ウサギIgGであった。染色基質は、4-クロロ-1-ナフトール(napthol)であっ
た。スライド凝集を、標準的な手順に従って行った。
G.組換えDNA法
制限マッピングは、1本鎖および2本鎖消化ならびにサブクローニングを含む
標準的な方法の組み合わせに基づいた。完全なコスミドの欠失誘導体を、以下の
ように生成した:1.8μgのコスミドDNAのアリコートを、20μlの容量において、
0.25Uの制限酵素で、5〜80分間消化した。各アリコートの2分の1を使用して
、アガロースゲルにおいて、消化の程度をチェックした。フラグメントの代表的
な範囲を与えるようであるサンプルを、4℃で一晩ライゲーションし、CaCl2法
によってJM109に形質転換した。選択されたプラスミドを、同じ方法によってsφ
174に形質転換した。P4657を、エレクトロポレーションによって、pPR1244で形
質転換した。
H.DNAハイブリダイゼーション
プローブDNAを、エレクトロエリューションによってアガロースゲルから抽出
し、そして[α-32P]-dCTPを使用してニック翻訳した。染色体DNAまたはプラスミ
ドDNAを、0.8%アガロースゲルにおいて電気泳動し、ニトロセルロースメンブレ
ンに移した。ハイブリダイゼーション緩衝液およびプレハイブリダイゼーション
緩衝液は、低いまたは高いストリンジェンシーのプローブ化について、それぞれ
、30%または50%のホルムアミドを含んだ。インキュベーション温度は、プレハイ
ブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションについて、それぞれ、42℃お
よび37℃であった。フィルターの低いストリンジェンシーの洗浄は、2×SSCお
よび0.1%SDS中の3×20分間の洗浄からなった。高いストリンジェンシーの洗浄
は、室温での2×SSCおよび0.1%SDS中の3×5分間の洗浄、58℃での1×SSCお
よび0.1%SDS中の1時間の洗浄、ならびに58℃での0.1xSSCおよび0.1% SDS中の15
分間の洗浄からなった。
I.E.coli O111 O抗原遺伝子クラスター(3,021〜9,981位)のヌクレオチド配
列決定
ヌクレオチド配列決定を、ABI 373自動化シーケンサー(CA,USA)を使用して
行った。3.30と7.90とのマップの位置の間の領域を、クローンpPR1270およびpPR
1272由来の、PT7T3190において作製された欠失ファミリーの一方向性のエキソヌ
クレアーゼIII消化を使用して、配列決定した。ギャップを、M13mp18またはM13m
p19に選択されたフラグメントをクローニングすることによって、主に満たした
。7.90〜10.2のマップの位置由来の領域を、M13mp18またはM13mp19における制限
フラグメントから配列決定した。両方の領域における残りのギャップを、M13ま
たはファージミドにおける1本鎖DNA鋳型を使用して、配列に沿って決定された
位置に相補的な合成オリゴヌクレオチドから開始することによって満たした。近
接する配列を分析した後に、オリゴヌクレオチドを設計した。全ての配列決定を
、チェーンターミネイション法(chain termination method)によって行った。
配列は、SAP[Staden,R.、1982「DNA配列決定のショットガン法によって生成さ
れるゲル読み取りデータのコンピューター操作の自動化」Nuc.Acid Res.10:47
31-4751;Staden,R.、1986「私たちの配列操作ソフトウェアの現在の状態およ
び移植可能性(portability)」Nuc.Acid Res.14:217-231]を使用してアライン
した。プログラムNIP[Staden,R.1982「核酸およびアミノ酸配列を比較および
アラインメントするための相互作用的なグラフプログラム」Nuc.Acid Res.10:
2951-2961]を使用して、オープンリーディングフレームを見出し、そしてこれら
をタンパク質に翻訳した。
J.E.coli O111 O抗原遺伝子クラスターを保有するクローンの単離
E.coli O抗原遺伝子クラスターを、Bastin D.A.らの方法[1991「E.coli O111
株のO抗原を決定するrfb遺伝子クラスターの分子クローニングおよびEscherich
ia coli K-12における発現」Mol.Microbiol.5(9)2223-2231]に従って、単離
した。M92染色体DNAのコスミド遺伝子バンクを、インビボパッケージング
株x2819において樹立した。遺伝子バンクから、3.3×103個のコロニーを、イム
ノブロッティング手順を使用してE.coli O111抗血清でスクリーニングし:5個
のコロニー(pPR1054、pPR1055、pPR1056、pPR1058、およびpPR1287)がポジテ
ィブであった。これらの株からのコスミドを、インビボで、λ粒子中にパッケー
ジングし、そして全てのO抗原遺伝子を欠損するE.coli欠失変異体Sφ174に形質
導入した。この宿主系統において、全てのプラスミドは、O111抗血清とのポジテ
ィブな凝集を与えた。5個の独立したコスミドのEco R1制限マップは、それらが
共通して、約11.5kbの領域を有することを示した(図1)。コスミドpPR1058は
、O抗原遺伝子クラスターに連結されるいくつかの染色体マーカーを同定するた
めに十分な隣接DNAを含んでいたのでO抗原遺伝子クラスター領域の分析のため
に選択した。
K.コスミドpPR1058の制限マッピング
コスミドpPR1058を、2つの段階においてマップした。最初に予備的なマップ
を作製し、次いで0.00から23.10のマップ位置間の領域を詳細にマップした。な
ぜなら、これがO111抗原発現について十分であることが示されたからである。両
方の段階についての制限部位を、図2に示す。5個のコスミドクローンに共通の
領域は、pPR1058の1.35から12.95のマップ位置間であった。
pPR1058内のO抗原遺伝子クラスターを位置づけるために、pPR1058コスミドを
、S.enterica LT2およびE.coli K-12からのO抗原遺伝子クラスター隣接領域を
覆うDNAプローブでプローブした。被膜多糖(cps)遺伝子は、O抗原遺伝子クラス
ターの上流にあり、一方、グルコン酸デヒドロゲナーゼ(gnd)遺伝子およびヒス
チジン(his)オペロンは下流にあり、後者は、O抗原遺伝子クラスターからさら
に遠くにあった。使用したプローブは、LT2のgnd遺伝子を保有するpPR472(3.35
kb)、LT2のcps群の、cpsBおよびcpsGの2つの遺伝子を保有するpPR685(5.3kb)
、ならびにK-12のhisオペロンの全てを保有するK350(16.5kb)であった。プロ
ーブは、以下のようにハイブリダイズした:pPR472は、12.95〜15.1のマップ位
置に位置し得る、pPR1246(pPR1058に由来するHindIII/EcoRIサブク
ローン、図2)のPstIおよびHindIII二重消化の1.55kbおよび3.5kb(2.7kbのベ
クターを含む)フラグメントにハイブリダイズし;pPR685は、0.00〜3.05のマッ
プ位置に位置する、pPR1058の4.4kb EcoRIフラグメント(1.3kbのベクターを含
む)にハイブリダイズし;K350は、17.3〜45.90のマップ位置に位置する、pPR10
58の32kb EcoRIフラグメント(4.0kbのベクターを含む)とハイブリダイズした
。推定されるgnd領域を含むサブクローンは、gnd-edd-株GB23152を補完した。グ
ルコン酸ブロモチモールブループレートにおいて、この宿主株におけるpPR1244
およびpPR1292は、gnd+edd-遺伝子型が予測される緑色コロニーを与えた。his+
表現型は、最小培地プレートにおけるhis欠失株Sφ174おいてプラスミドpPR1058
によって回復され、プラスミドが完全なhisオペロンを保有することを示した。
O抗原遺伝子クラスター領域は、E.coliおよびS.enterica株におけるように、
gndとcpsとの間に、従っておよそ3.05から12.95のマップ位置間にあるようであ
る。このことを確認するために、pPR1058の欠失誘導体を、以下のように作製し
た:第1に、pPR1058をHindIIIで部分消化し、そしてセルフライゲーションした
。形質転換体を、カナマイシン耐性について選択し、そしてO111抗原の発現につ
いてスクリーニングした。2つのコロニーがポジティブな反応を与えた。EcoRI
消化は、2つのコロニーは、同一のプラスミドを集結することを示し、そのうち
の1つを、pPR1230と称し、これは0.00から23.10のマップの位置まで伸長するイ
ンサートを伴った。第2に、pPR1058を、SalIで消化し、そしてXhoIで部分消化
し、そして適合する末端を再連結した。形質転換体を、カナマイシンで選択し、
そしてO111抗原発現についてスクリーニングした。8個のポジティブに反応する
クローンのプラスミドDNAを、EcoRIおよびXhoI消化を使用して確認し、同一であ
るようであった。1つのコスミドを、pPR1231と称した。pPR1231のインサートは
、0.00から15.10のマップ位置間のDNA領域を含んでいた。第3に、pPR1231をXho
Iで部分消化し、セルフライゲーションし、そして形質転換体を、ストレプトマ
イシン/ストレプトマイシンプレートにおいて選択した。クローンを、カナマイ
シン感受性についてスクリーニングし、そして10個を選択し、全て
は、ベクター中のXhoI部位から4.00位でのXhoI部位までのDNA領域が欠失された
。これらのクローンは、O111抗原を発現せず、4.00位でのXhoI部位は、O抗原遺
伝子クラスター内にある。1つのクローンを選択し、pPR1288と命名した。プラ
スミドpPR1230、pPR1231、およびpPR1288を図2に示す。
L.E.coli O111 O抗原遺伝子クラスター(3,021〜9,981位)ヌクレオチド配列
データの分析
BastinおよびReeves[1995「Escherichia coli O111のO抗原遺伝子(rfb)群の
配列および分析」Gene 164:17-23]は、3,021〜9,981のマップ位置からのフラグ
メントを配列決定することによって、部分的に、E.coli O111 O抗原遺伝子クラ
スターを特徴付けした。図3は、E.coli O111 O抗原遺伝子クラスターの3,021
〜9,981位の遺伝子組織を示す。orf3およびorf6は、wcaHおよびwcaGとの非常に
高いレベルのアミノ酸同一性を有し(それぞれ、46.3%および37.2%)、かつ機能に
おいてE.coli K-12 colanic遺伝子クラスターにおける糖生合成経路遺伝子に類
似するようである。orf4およびorf5は、manCおよびmanB遺伝子に、それぞれ、
高レベルのアミノ酸相同性を示す。orf7は、abequose経路遺伝子であるrfbHと高
いレベルの相同性を示す。orf8は、12個の膜貫通セグメントを有するタンパク質
をコードし、他のwzx遺伝子に二次構造における類似性を有し、それゆえ、O抗
原flippase遺伝子であるようである。材料および方法−第2部
A.E.coli O111 O抗原遺伝子クラスターの1〜3,020および9,982〜14,516の
ヌクレオチド配列決定
新規なヌクレオチド配列を含んだサブクローンの、pPR1231(0および1,510の
マップの位置)、pPR1237(-300〜2,744のマップの位置)、pPR1239(2,744〜4,
168のマップの位置)、pPR1245(9,736〜12,007のマップの位置)、ならびにpPR
1246(12,007〜15,300のマップの位置)(図2)を、以下のように特徴付けた:
pPR1237、pPR1239、およびpPR1245のインサートの遠位末端を、ベ
クター中に位置するM13正方向および逆方向プライマーを使用して、配列決定し
た。PCRウォーキングを、配列データに基づくプライマーを使用して、各インサ
ート内に、さらに配列決定するために行い、そしてプライマーを、配列決定のた
めにM13正方向または逆方向プライマー配列でタギングした。このPCRウォーキン
グ手順を、全体のインサートが配列決定されるまで反復した。pPR1246は、12,00
7〜14,516位を特徴付けた。これらのサブクローンのDNAを、両方の方向において
配列決定した。配列決定反応を、ジデオキシターミネーション法および熱サイク
ルを使用して行い、そして反応産物を、蛍光染料およびABI自動化配列決定器(C
A,USA)を使用して分析した。
B. E.coli O111 O抗原遺伝子クラスター(配列番号1の1〜3,020および9,9
82〜14,516位)ヌクレオチド配列データの分析
BastinおよびReeves[1995「Escherichia coli O111のO抗原遺伝子(rfb)群の
配列および分析」Gene 164:17-23]によって特徴付けされなかったE.coli O111
O抗原遺伝子クラスターの領域(1〜3,020および9,982〜14,516位)の遺伝子組
成を、図3に示す。領域1において、2つのオープンリーディングフレームが存
在する。領域2において、4つのオープンリーディングフレームが予測される。
各遺伝子の位置は、表5に列挙する。
orfl(wbdH)の推定のアミノ酸配列は、Shigelladysenteriaeのrfp遺伝子のア
ミノ酸配列と、約64%の類似性を共有する。RfpおよびWbdHは、非常に類似の疎水
性プロットを有し、両方とも、対応する位置において非常に確証的な予測される
膜貫通セグメントを有する。rfpは、LPSコアの合成に関与するガラクトシルトラ
ンスフェラーゼであり、従って、wbdHは、ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子であるようである。orf2は、E.coli K-12 colanic酸遺伝子クラスターにおい
て同定されたgmd遺伝子に、アミノ酸レベルで85.7%の同一性を有し、gmd遺伝子
であるようである。orf9は、10個の予測される膜貫通セグメントおよび大きな細
胞質ループを有するタンパク質をコードする。この内部膜の位相幾何学は、全て
の公知のO抗原ポリメラーゼの特徴的な特徴であり、従って、orf9は、
O抗原ポリメラーゼ遺伝子のwzyをコードするようである。orf10(wbdL)は、Ne isseria gonorrhoea
のLsi2との低い相同性を有する、推定のアミノ酸配列を有す
る。Lsi2は、リポオリゴ糖の合成においてGlcNAcをガラクトースに付加すること
を担う。従って、wbdLは、コリトース(colitose)またはグルコーストランスフ
ェラーゼ遺伝子のいずれかであるようである。orfll(wbdM)は、Yersiniaenter ocholitica
のTrsEと、高レベルのヌクレオチドおよびアミノ酸の類似性を共有す
る。TrsEは、推定の糖トランスフェラーゼであり、従って、wbdMは、コリトース
またはグルコーストランスフェラーゼをコードするようである。
要約すると、3つの推定のトランスフェラーゼ遺伝子および1つのO抗原ポリ
メラーゼ遺伝子は、E.coli O111 O抗原遺伝子クラスターの1〜3,020および9,9
82〜14,516のマップの位置で同定された。GenBankのサーチは、3つの推定のト
ランスフェラーゼ遺伝子うちの2つおよびポリメラーゼ遺伝子について、ヌクレ
オチド配列レベルで有意な類似性を有する遺伝子は存在しないことを示した。配
列番号1および図7は、O111抗原遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を提供す
る。材料および方法−第3部
A. E.coli O157 :H7株(Statens Serum Institut,5 Artillerivej,2300
,Copenhagen S,Denmarkの株C664〜1992)由来のO157抗原遺伝子クラスターのP
CR増幅
E.coli O157 O抗原遺伝子クラスターを、O抗原遺伝子クラスターのプロモー
ター領域において通常見出されるJumpStart配列[Hobbsら、1994「JunpStart配列
:群化されるいくつかの多糖遺伝子に共通の39bpエレメント」Mol.Microbiol.
12:855-856]に基づく、一方のプライマー(プライマー番号412:att ggt agt t
gt aag cca agg gcg gta gcg t)、およびO抗原遺伝子クラスターの下流に通常
見出されるgnd遺伝子に基づく、他方のプライマー番号482(cac tgc cat acc ga
c gac gcc gat ctg ttg ctt gg)とともに、long PCR[Chengら、1994、「クロー
ン化されたインサートおよびヒトおよびゲノムDNAからの長い標的の効率的な
増幅」、P.N.A.S.USA 91:5695-569]を使用することによって、増幅した。Long
PCRを、Boehringer Mannheim(Castle Hill NSW Australia)からのExpand Long
Template PCR Systemを使用して行い、そしていくつかの反応からの14kbの長さ
の生成物を、合わせ、そしてPromega Wizard PCRプレップDNA精製系(Madison W
I USA)を使用して精製した。次いで、PCR産物をフェノールで、そしてエーテル
で2回、抽出し、70%エタノールで沈殿し、そして40μLの水中に再懸濁した。
B.ランダムなDNアーゼIバンクの構築:
約150ngのDNAを含有する2つのアリコートを、それぞれ、記載されるように改
変したプロトコルを用いて、Novagen DNアーゼI Shotgun Cleavage(Madison WI
USA)を使用するDNアーゼ消化に供した。各アリコートを、45μlの0.05M Tris-
HCl(pH7.5)、0.05mg/mL BSA、および10mM MnCl2中に希釈した。同じ緩衝液中の
5μLの1:3000または1:4500希釈のDNアーゼI(Novagen)(Madison WI USA)を、
各チューブにそれぞれ添加し、そして10μlの停止緩衝液(100mM EDTA)、30%グ
リセロール、0.5% Orange G、0.075%キシレンおよびシアノール(Novagen)(Ma
dison WI USA)を、15℃で5分間のインキュベーション後に添加した。次いで、
2つのDNアーゼI反応チューブからのDNAを合わせ、そして0.8%LMTアガロースゲ
ルにおいて分画し、そして約1kbの大きさのDNAを有するゲルセグメント(約1.5
mLアガロース)を切り出した。DNAを、Promega Wizard PCR Preps DNA Purifica
tion(Madison WI USA)を使用して抽出し、そして200μLの水中に再懸濁し、そ
の後、フェノールで、およびエーテルで2回、抽出し、そして沈殿させた。次い
で、DNAを、17.25μLの水中に再懸濁し、そしてT4DNAポリメラーゼ修復、および
Novagen Single dA Tailing Kit(Madison WI USA)を使用する単一のdAテイル
化に供した。次いで、反応混合物(約8ng DNAを含有する85μl)を、クロロホル
ム:イソアミルアルコール(24:1)で、1回抽出し、そして100μLの全容量中で
、3×10-3pmol pGEM-T(Promega)(Madison WI USA)にライゲーションした。ラ
イゲーションを、一晩、4℃で行い、そしてライゲー
ションされたDNAを沈殿させ、そして20μLの水中に再懸濁した後、E.coli株JM10
9にエレクトロポレートし、そしてBCIG-IPTGプレート上に播き、そしてバンクを
得た。
C.配列決定
バンクのクローンからのDNA鋳型を、Advanced Genetic Technologies Corpか
らの96ウェル形式のプラスミドDNAミニプレップキットを使用して、配列決定の
ために使用した。これらのクローンのインサートを、pGEM-Tベクター中に位置す
る標準的なM13配列決定プライマー部位を使用して、一方または両方の末端から
配列決定した。ABI Catalyst(CA USA)において配列決定反応を行った後、配列
決定を、上記のように、ABI377自動化シーケンサー(CA USA)において行った。
不十分な適用範囲の配列ギャップおよび領域を、既に得られた配列データに基づ
くプライマーを使用してO157染色体DNAから直接的にPCR増幅し、そしてPCRプラ
イマーに付着された標準的なM13配列決定プライマー部位を使用して、配列決定
した。
D.E.coli O157 O抗原遺伝子クラスターヌクレオチド配列データの分析
配列データを、Stadenのプログラム[Staden,R.、1982「DNA配列決定のショッ
トガン法によって生成されるゲル読み取りデータのコンピューター操作の自動化
」Nuc.Acid Res.10:4731-4751;Staden,R.、1986「私たちの配列操作ソフト
ウェアの現在の状態および移植可能性」Nuc.Acid Res.14:217-231;Staden,R
.1982「核酸およびアミノ酸の配列を比較およびアラインメントするための相互
作用的なグラフプログラム」Nuc.Acid Res.10:2951-2961]を使用して、プロセ
スおよび分析した。図4は、E.coli O157 O抗原遺伝子クラスターの構造を示す
。12個のオープンリーディングフレームが、配列データから予測され、次いで、
全てのこれらの遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を、これらの遺伝子
の潜在的な機能および特異性の同定のために、GenBankデータベースをサーチす
るために使用した。各遺伝子の位置を、表6に列挙する。ヌクレオチド配列を、
配列番号2および図8に示す。
orf10および11は、manCおよびmanBに高レベルの同一性を示し、それぞれ、man
CおよびmanBと命名した。orf7は、E.coli colanic酸被膜遺伝子クラスターのgmd
遺伝子(Stevenson G.、K.ら、1996「細胞外多糖colanic酸の生成を担う、Esche richia coli
K-12遺伝子クラスターの組成」J.Bacteriol.178:4885-4893)
に89%の同一性(アミノ酸レベルで)を示し、gmdと命名した。orf8は、E.coli
colanic酸被膜遺伝子クラスターのwcaGに、ならびにYersiniaenterocoliticaO8
O抗原遺伝子クラスター(Zhang,L.ら、1997「リポ多糖O抗原の分子的および
化学的特徴付けおよびY.enterocolitica血清型O8の病原性におけるその役割」Mo
l.Microbiol.23:63-76)]のwbcJ(orf14.8)遺伝子に、それぞれ、79%および69
%の同一性(アミノ酸レベルで)を示した。colanic酸およびYersiniaO8 O抗原
の両方は、O157 O抗原のように、フコースを含んでいる。gmd遺伝子産物の産物
であるGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノースからのGDP-L-フコース合成に必要と
される、2つの酵素学的工程が存在する。しかし、近年、ヒトFXタンパク質が、
wcaG遺伝子(その論文においてyefbとして言及される)と「有意な相同性」を有
すること、およびFXタンパク質が、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノースからGD
P-L-フコースへの転換の両方の反応を行うことが、示された(Tonetti,Mら、19
96「ヒトFXタンパク質によるGDP-L-フコースの合成」、J.Biol.Chem.271:272
74-27279)。
本発明者らは、このことは、これらの2工程を行うorf8について非常に強力な
例を作製すると考え、および遺伝子をfc1と命名することを提唱する。フコース
含有配列について、3つのバクテリア遺伝子クラスター間で類似性の類似のレベ
ルを有する遺伝子は、manB、manC、gmd、およびfc1以外は存在しないという観察
は、両方の機能を保持する1つ酵素を支援するものである。
orf5は、Vibro cholerae O1のwbeE(rfbE)に非常に類似し、これは、GDP-4-
ケト-6-デオキシ-D-マンノースをGDP-ペロサミン(perosamine)に転換する、ペ
ロサミン合成酵素であると考えられる(Stroeher,U.H.ら1995「ペロサミン生合
成についての推定の経路は、Vibro cholerae O1のrfb領域内にコードされ
る最初の機能である」Gene 166:33-42)。V.cholerae O1およびE.coli O157 O
抗原は、それぞれ、ペロサミンおよびN-アセチルーペロサミンを含む。V.choler ae
O1のmanA、manB、gmd、およびwbeE遺伝子は、E.coli O157遺伝子クラスター
の遺伝子に有意な類似性を示す、V.cholerae O1遺伝子クラスターの唯一の遺伝
子であり、本発明者らは、V.choleraeのwbeの機能についてなされる予測を確認
し、かつO157遺伝子クラスターのorf5が、GDP-ペロサミン合成酵素をコードする
ことを示すと考える。それゆえ、orf5は、perと命名される。orf5+約100bpの上
流領域(4022〜5308位)は、Bilge,S.S.ら[1996「粘着におけるEscherichia.c oli
O157-H7 O側鎖の役割およびrfb遺伝子座の分析」Infect.Immun.64:4795-4
801]によって既に配列決定されている。
orf12は、アセチルトランスフェラーゼファミリー(Lin,W.ら、1994「Staph ylococcusaureus
におけるI型カプセル多糖の生合成に必要な遺伝子の配列分析お
よび分子特徴付け」J.Bacteriol.176:7005-7016)の種々のメンバーの約50アミ
ノ酸の保存領域に非常に高いレベルの類似性を示し、本発明者らは、これは、GD
P-ペロサミンをGDP-perNAcに転換するN-アセチルトランスフェラーゼであると考
える。orf12は、wbdRと命名された。遺伝子manB、manC、gmd、fcl、per、および
wbdRは、全てのO157遺伝子クラスターの予測される生合成経路遺伝子を説明する
。
必要とされる残りの生合成工程は、UDP-GlcからのUDP-GalNAcの合成について
である。Yersiniaenterocoliticaにおいて、UDP-GalNAcは、ガラクトースエピメ
ラーゼ(GalE)の相同体によってUDP-GlcNAcから合成され、そのため、galE様遺
伝子が、Yersiniaenterocolitica O8遺伝子クラスターにおいて存在することが
、提唱されている(Zhang,L.ら1997「リポ多糖O抗原の分子的および化学的特
徴付け、ならびにYersiniaenterocolitica血清型O8の病原性におけるその役割」
Mol.Microbiol.23:63-76)。O157の場合において、遺伝子クラスター中にgalE
相同体は存在せず、どのようにUDP-GalNacが合成されるのかは明らかでない。ga
lオペロン中のgalE遺伝子によってコードされるガラクトースエピメラーゼは、U
DP-GlcからUDP-Galへの転換に加えて、UDP-GlcNacからUDP-GalNAcの転換を行い
得ることが考えられる。O157遺伝子クラスターにおいてUDP-GalNAc合成を担う任
意の遺伝子は存在しないようである。
orf4は、多くのwzx遺伝子に類似性を示し、wzxと命名され、orf2は、他のwzy
遺伝子の予測されるタンパク質における二次構造の類似性を示し、そのため、wz
yと命名される。
orfl、orf3、およびorf 6遺伝子産物は、全て、トランスフェラーゼの特徴を
有し、wbdN、wbdO、wbdPと、それぞれ命名された。O157 0抗原は、4個の糖を
有し、4つのトランスフェラーゼが予測される。作用する第1のトランスフェラ
ーゼは、ウンデカプレノールリン酸上に糖リン酸を置くと思われる。この機能を
行うことが知られる2つのトランスフェラーゼ、WbaP(RfbP)およびWecA(Rfe)
はウンデカプレノールリン酸に、それぞれ、ガラクトースリン酸、N-アセチル-
グルコサミンリン酸を転移する。これらの糖のいずれも、O157構造において存在
しない。
さらに、O157遺伝子クラスターの推定のトランスフェラーゼのいずれも、糖リ
ン酸をウンデカプレノールリン酸に転移するWecAおよびWbaPにおいて見出され、
かつ糖を、膜内に包埋されるウンデカプレノールリン酸に転移した任意のタンパ
ク質に予測される膜貫通セグメントを有しない。
GlucNac-Pをウンデカプレノールリン酸に転移するWecA遺伝子は、腸内細菌共
通抗原(ECA)遺伝子クラスターにおいて位置し、そしてこれは、大部分のおよ
びおそらく全てのE.coli株中で、ECA合成について、ならびにOユニット中の第
1糖としてGlcNAcを有する株における、O抗原合成について機能する。
WecAは、Yersiniaenterocholitica O8 O抗原について、ウンデカプレノールリ
ン酸へのGalNAc-1-Pの付加のためのトランスフェラーゼとして作用するようであ
り(Zhang,L.ら1997「リポ多糖O抗原の分子的および化学的特徴付けおよびYer siniaenterocolitica
血清型O8の病原性におけるその役割」Mol.Microbiol.23:
63-76)、そしてO157構造はGalNacを含むので、ここでもおそらくそうである。W
ecAはまた、E.coli O8および09株においてグルコース-1-Pリン酸をウンデカプレ
ノールリン酸に付加することが報告されており、そしてウンデカプレノールリ
ン酸への第1の糖の転移についての代替の可能性は、O157 O抗原中にグルコース
残基が存在するので、グルコースのWecA媒介性の転移である。いずれの場合にお
いても、トランスフェラーゼ遺伝子の必要な数が、GalNAcまたはGlcが、WecAに
よって転移される場合、および側鎖のGlcがO抗原遺伝子クラスターの外側のト
ランスフェラーゼによって転移される場合、存在する。
orf9は、E.coli colanic酸被膜遺伝子クラスターのwcaH遺伝子と高レベルの類
似性(アミノ酸レベルで44%同一性、同じ長さ)を示す。この遺伝子の機能は知
られておらず、本発明者らは、orf9に、wbdQの名称を与えた。
manBとwdbRとの間のDNAは、E.coli K12のH反復単位の1つと強力な配列類似
性を有する。この領域に隣接する反転される反復配列は共に、なお認識可能であ
り、それぞれ、11塩基のうちの2塩基が変化されている。H反復関連タンパク質
をコードする、この領域内に位置する遺伝子は、267塩基の欠失および種々の位
置における変異を有する。H反復単位は、遺伝子クラスターに転座され、おそら
く、他の場合において提唱されているように、遺伝子クラスターのアセンブリに
おいて役割を果たすことから、長期間、この遺伝子クラスターと関連づけられて
きたようである。材料および方法−第4部
トランスフェラーゼのO抗原遺伝子、およびwzx、wzy遺伝子が、診断的なPCR
について、経路遺伝子よりも特異的であるという、本発明者らの仮説を試験する
ために、本発明者らは先ず、全てのE.coli O16 O抗原遺伝子についてのプライマ
ーを使用して、PCRを行った(表4)。次いで、PCRを、E.coli O111トランスフ
ェラーゼ、wzx、およびwzyの遺伝子のPCRプライマーを使用して行った(表5、5
A)。PCRをまた、E.coli O157トランスフェラーゼ、wzx、およびwzyの遺伝子のP
CRプライマーも使用して行った(表6、6A)。
Statens Serum Institut,5 Artillerivej,2300 Copenhagen,Denmarkから
入手可能なE.coliの166個の血清型からの染色体DNAを、Promega Genomic(Madis
on WI USA)単離キットを使用して単離した。164個の血清群が、Ewing W.H.
:EdardsおよびEwing「腸内バクテリアの同定」Elsevier、Amsterdam 1986によっ
て記載されること、およびそれらが1〜171の番号を付され、番号31、47、67、7
2、93、94、および122はもはや有効ではないことに注意されたい。2つの血清群
19株のうち、本発明者らは19ab株F8188-41を使用したLior H.1994[「家畜およ
びヒトにおけるEschericia.Coli」、31〜72頁、Eschericia.coliの分類、C.L
.Gyles CAB internationalによる編集]は、さらに2つの番号付けされた172お
よび173アミノ酸を付加し、使用される166個の血清群を与えた。プール当たり、
DNAの5〜8個のサンプルを含有するプールを作製した。プール番号1〜19(表
1)を、E.coli O111およびO157アッセイにおいて使用した。プール番号20〜28
をまた、O111アッセイにおいて使用し、プール番号22〜24は、E.coli O111 DNA
を含み、そしてポジティブコントロールとして使用した(表2)。プール番号29
〜42をまた、O157アッセイにおいて使用し、またプール番号31〜36は、E.coli O
157 DNAを含有し、ポジティブコントロールとして使用した(表3)。プール番
号2〜20、30、43、および44を、E.coli O16アッセイに使用した(表1〜3)。
プール番号44は、E.coli K-12株C600およびWG1のDNAを含み、そしてそれらの間
で、それらが全てのE.coli K-12 O16 O抗原遺伝子を有するので、ポジティブコ
ントロールとして使用した。
PCR反応を、以下の条件下で行った:変性、94℃/30秒間;アニーリング、種々
の温度(表4〜8に言及)/30秒間;伸長、72℃/1分間;30サイクル。PCR反応
を、各プールについて、25μLの容量において行った。PCR反応後、各プールから
の10μLのPCR産物を、アガロースゲルにおいて泳動して、増幅されたDNAについ
て確認した。
各E.coliおよびS.enterica染色体DNAサンプルを、染色体DNAの存在についてゲ
ル電気泳動によって、および各E.coli K12またはSalmonella enterica LT2に基
づくオリゴヌクレオチドを使用する、E.coliまたはS.enterica mdh遺伝子のPCR
増幅によって[Boydら(1994)「Escherichia coliおよびSalmonella entericaの
天然の集団におけるマレイン酸デヒドロゲナーゼ(mdh)における、対立遺伝子
多型の分子遺伝学的な基礎」Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:1280-1284]、
確認した。他のバクテリアからの染色体DNAサンプルは、染色体DNAのゲル電気泳
動によって確認したのみであった。
A.E.coli O16 O抗原遺伝子クラスター配列に基づくプライマー
E.coli O16のO抗原遺伝子クラスターは、O111の配列決定の前に十分に配列決
定されていた、唯一の典型的なE.coli O抗原遺伝子クラスターであり、本発明者
らはそれを仮説の試験のために選んだ。各遺伝子についての1対のプライマーを
、E.coli染色体DNAのプール2〜20、30、および43に対して試験した。各遺伝子
についてのプライマー、アニーリング温度、および機能的な情報を、表4に列挙
する。
5つの経路遺伝子について、rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、およびglfについて、
それぞれ、17/21、13/21、0/21、0/21、0/21のポジティブプールが存在した(表
4)。wzx、wzy、および3つのトランスフェラーゼ遺伝子について、試験したE. coli
染色体DNAの21個のプールの間にポジティブは存在しなかった(表4)。各
場合において、番号44プールが、ポジティブな結果を与えた。
B.E.coli O111 O抗原遺伝子クラスター配列に基づくプライマー
O111のトランスフェラーゼ、wzxおよびwzy遺伝子のそれぞれの、1〜4個のプ
ライマー対をE.coli染色体DNAのプール1〜21に対して試験した(表5)。wbdHに
ついて、この遺伝子の様々な領域に結合する4個のプライマーの対を試験したと
ころ、試験したE.coli染色体DNAの任意のそれらの21個のプールにおいて、正確
な大きさの増幅DNAは存在しなかったので、O111に特異的であることが見出され
た。wbdMについて3対のプライマーを試験し、それらはすべて、特異的であるが
、プライマー番号985/番号986は、1つのプールから間違った大きさのバンドを
生成した。wzxについての3つのプライマーの対を試験したところ、それらはす
べて特異的であった。wzyについて2つのプライマーの対を試験し、両方とも特
異的であるが、番号980/番号983は、全てのプールにおいて間違った大きさのバ
ンドを与えた。wbdLについて1つのプライマーの対を試験し、そして非特異
的であることが見出され、それゆえさらなる試験を行わなかった。従って、wzx
、wzy、および3つのトランスフェラーゼのうちの2つの遺伝子は、O111に非常
に特異的である。増幅されたDNAにおいて見出された間違った大きさのバンドは
、E.coliにおいて広範に存在する遺伝子の偶然のハイブリダイゼーションに起因
すると推定される。各遺伝子についてのプライマー、アニーリング温度、および
位置は、(表5)にある。
O111アッセイを、O抗原を発現するYersiniapseudotuberculosis、Shigellaboy dii
、およびSalmonellaenterica株からのDNAを含むプールを使用しても行った(
表5A)。wbdH、wzx、wzy、またはwbdM由来のいずれのオリゴヌクレオチドも、
これらのプールと正確な大きさに増幅されたDNAを与えなかった。特に、プール
番号25は、E.coli O111と同じO抗原を有するS.enterica Adelaideを含み:この
プールは、試験した任意のプライマーについてポジティブなPCRの結果を与えず
、このことは、これらの遺伝子がE.coli O111に非常に特異的であることを示す
。
wbdH、wzx、wzy、およびwbdMに結合する12対のそれぞれは、O111 DNAを含有す
るプール(プール番号22〜24)と、予測されるバンドを生成する。プール22〜24
は、プール21に存在する全ての株からのDNA+O111株DNAを含んだので(表2)、
本発明者らは、12対のプライマーは全て、3つの未関連のO111株のそれぞれとポ
ジティブなPCR試験を与えるが、試験した任意の他の株とはポジティブなPCR試験
を与えないと結論した。従って、これらの遺伝子は、E.coli O111に非常に特異
的である。
C.E.coli O157 O抗原遺伝子クラスター配列に基づくプライマー
O157のトランスフェラーゼ、wzxおよびwzy各遺伝子の2または3つのプライマ
ー対を、プール1〜19、29、および30のE.coli染色体DNAに対して試験した(表
6)。wbdNについて、この遺伝子の種々の領域に結合する3つのプライマーの対
を試験し、そして試験したE.coli染色体のこれらの21個のプールのいずれにおい
てもDNAは増幅されなかったので、O157について特異的であることが見出され
た。wbdOについての3つのプライマー対を試験し、そしてこれらは全て特異的で
あったが、番号1211/番号1212は、全てのプールから間違った大きさの2つまた
は3つのバンドを生成した。3つのプライマーの対を、wbdPについて試験し、こ
れらは全て特異的であった。2つのプライマーの対をwbdRについて試験し、そし
てこれらは全て特異的であった。wzyについて、3つのプライマーの対を試験し
、そして全て特異的であったが、プライマー対番号1203/番号1204は、各プール
において間違った大きさの1つまたは3つのバンドを生成した。wzxについて、
2つのプライマーの対を試験し、両方とも特異的であったが、プライマー対番号
1217/番号1218は、2つのプールにおいて間違った大きさの2つのバンド、およ
び7つのプールにおいて間違った大きさの1つのバンドをを生成した。増幅され
たDNAにおいて見出される間違った大きさのバンドは、E.coliに広範に存在する
遺伝子の偶然のハイブリダイゼーションに起因すると推定される。各遺伝子につ
いてのプライマー、アニーリング温度、および機能情報は、表6にある。
O157アッセイを、O抗原を発現するYersiniapseudotuberculosis、Shigellaboy dii
、Yersiniaenterocolitica 09、BrucellaabortusおよびSalmonellaenterica
株からのDNAを含む、プール37〜42を使用して行った。プライマー対番号1203/番
号1204が、Y.enterocolitica 09と2つのバンドを生成し、バンドの一方が、ポ
ジティブコントロール由来のDNAと同じサイズであったことを除いては、wbdN、w
zy、wbdO、wzx、wbdP、またはwbdR由来のオリゴヌクレオチドのいずれも、これ
らのプールと特異的に反応しなかった。プライマー対番号1203/番号1204は、wzy
に結合する。Wzyのタンパク質の予測される二次構造は、全体に類似するが、配
列決定されたwzy遺伝子間のアミノ酸またはDNAレベルでの類似性は非常に低い。
従って、Y.enterocolitica 09は、E.coli O157のwzy遺伝子に密接に関連するwzy
遺伝子を有することが考えられる。このバンドは、他の2つのwzyプライマー対
(番号1205/番号1206および番号1207/番号1208)が、Y.enterocolitica 09とバ
ンドを全く生成しなかったので、別の遺伝子の偶然のハイブリダイゼーションに
起因することも考えられる。特に、プール番号37は、E.coli O157と同じO抗原を
有するS.enterica Landauを含み、プール38および39は、E.
coli
O157と血清学的に交差反応するB.abortusおよびY.enterocolitica 09を含
む。この結果は、これらの遺伝子は、1つのプライマー対は、Y.enterocolitica
09と交差反応した可能性があるものの、O157に非常に特異的であることを示す
。
wbdN、wzx、wzy、wbdO、wbdP、およびwbdRに結合する16対のそれぞれは、O157
DNAを含有するプール(プール番号31〜36)と予測される大きさのバンドを生成
する。プール29はO157株DNA以外にプール31〜36に存在する全ての株由来のDNAを
含んでいたので(表3)、本発明者らは、16個のプライマーの対の全てが、5つ
の未関連のO157株のそれぞれとポジティブなPCR試験を与えると結論した。
従って、遺伝子wbdN、wzy、wbdO、wzx、wbdP、およびwbdRに基づくプライマー
を使用するPCRは、E.coli O157に非常に特異的であり、6つの未関連のO157株の
それぞれとポジティブな結果を与えるが、1つのプライマー対のみが、E.coli O
157と血清学的に交差反応することが知られるO抗原を有する3つの株のうちの1
つと予測される大きさのバンドを与えた。
D.Salmonella enterica血清型C2およびB O抗原遺伝子クラスター配列に基づく
プライマー
本発明者らはまた、S.enterica C2およびB血清群のトランスフェラーゼ、wzx
、およびwzyの遺伝子についてのプライマーを使用してPCRを行った(表7〜9)
。C2およびB O抗原遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を、配列番号3(図9
)および配列番号4(図10)として、それぞれ列挙する。Salmonella enterica
の全ての46個の血清型由来の染色体DNA(表9)を、Promega遺伝子単離キットを
使用して単離し、プール当たり4〜8サンプルの7プールを作製した。Salmonel la enterica
血清型BまたはC2 DNAは、46個のそれぞれの血清型のプライマーを試
験するためのプールから省略したが、ポジティブコントロールとしての使用のた
めに6つの他のサンプルを含有するプールに添加し、プール番号8を与えた。
PCR反応を、以下の条件下で行った:変性、94℃/30秒間;アニーリング、種々
の温度(以下を参照)/30秒間;伸長、72℃/1分間;30サイクル。PCR反応を、
各プールについて25μLの容量において行った。PCR反応後、各プールからの10μ
LのPCR産物を、アガロースゲルにおいて泳動して、増幅されたDNAについて確認
した。正確な大きさのバンドを与えるプールについて、そのプールの個々の染色
体サンプルを使用して、PCRを反復し、アガロースゲルにおいて泳動して、各サ
ンプルから増幅されたDNAについて確認した。
Salmonella enterica血清型B O抗原遺伝子クラスター(LT2株の)は、完全に
配列決定された最初のO抗原遺伝子であり、各遺伝子の機能は実験的に同定され
ている[Jiang,X.M.、Neal,B.、Santiago,F.、Lee,S.J.、Romana,L.K.、お
よびReeves,P.R.(1991)、「Salmonella serovar typhimurium(LT2株)のrfb(
O抗原)遺伝子クラスターの構造および配列」Mol.Microbiol.5(3)、695-713;Li
u,D.、Cole,R.、およびReeves、P.R.(1996)「Wzx(Rfbx)についてのO抗原
プロセシング機能:O-単位フリッパーゼについての有望な候補」、178(7)、2102
-2107;Liu、D.、Haase,A.M.、Lindqvist,L.、Lindberg,A.A.、およびReeves
,P.R.(1993)、「S.entericaにおけるO抗原生合成のグリコシルトランスフェ
ラーゼ:群B、C2、およびE1のトランスフェラーゼ遺伝子の同定および特徴づけ
」J.Bacteriol.、175、3408-3413;Liu、D.、Lindquist,L.、およびReeves P
.R.(1995)、「Salmonella entericaにおけるO-抗原生合成のトランスフェラー
ゼ:群BおよびC2のジデオキシヘキソシルトランスフェラーゼ、ならびに群C2の
アセチルトランスフェラーゼ」J.Bacteriol.、177、4084-4088;Romana,L.K.、
Santiago,F.S.、およびReeves,P.R.(1991)「Salmonella serovar typhimuriu
m LT2からのdチミジン-ジホスホ-D-グルコース4,6デヒドラーゼ(rfbB)の高
レベルの発現および精製」BBRC、174、846-852]。経路遺伝子およびwbaPのそれ
ぞれについての1つのプライマーの対を、Salmonella enterica DNAのプールに
対して試験し、他のトランスフェラーゼおよびwzxの遺伝子のそれぞれについて
の2〜3つのプライマーの対をも試験した。各遺伝子のプライマーおよび機能的
な情報、ならびに各プライマーの対について
のPCR反応のアニーリング温度のリストについて、表8を参照のこと。
群B LT2株の経路遺伝子について、rm1B、rm1D、rm1A、rm1C、ddhD、ddhA、ddh
B、ddhC、abe、manC、およびmanBについて、それぞれ、19/45、14/45、15/45、1
2/45、6/45、6/45、6/45、6/45、1/45、9/45、8/45がポジティブであった(表9
)。
LT2 wzx遺伝子について、本発明者らは、3つのプライマー対を使用し、それ
ぞれ、1/45のポジティブを与えた。4つのトランスフェラーゼ遺伝子について、
本発明者らは、合計9つのプライマー対を使用した。wbaVについての2つのプラ
イマー対は、2/90のポジティブを与えた。wbaNの3つのプライマー対について、
11/135が、ポジティブな結果を与えた。wbaPプライマー対について、10/45が、
ポジティブな結果を与えた(表9)。
実験データは、wzxおよびwbaV群B O抗原遺伝子に由来するオリゴヌクレオチ
ドが、O群67以外の45個全てのSalmonella enterica O抗原群の間で、群B O抗
原に特異的であることを示す。Salmonella enterica B群のwbaNおよびwbaU遺伝
子由来のオリゴヌクレオチドは、B群O抗原を検出し、そしてまた、群A、D1、お
よびD3とポジティブな結果を生成した。WbaUは、マンノースα(1-4)マンノー
ス結合についてのトランスフェラーゼをコードし、群A、B、D1において発現され
るが、wbaNは、ラムノースα(1-3)ガラクトース結合についてのトランスフェ
ラーゼをコードし、群A、B、D1、D2、D3、およびE1に存在する。このことは、群
B wbaUおよびwbaN遺伝子とのポジティブな結果を説明する。群EおよびD2のwbaN
遺伝子は、群A、B、D1、およびD3のwbaN遺伝子の配列とかなりの配列の差異を有
し、このことは、群B、D1、およびD3のみとのポジティブな結果を説明する。
wzxおよびトランスフェラーゼ遺伝子に由来するSalmonella enterica Bプライ
マーは、Salmonella enterica O67とポジティブな結果を生成した。本発明者ら
は、Salmonella enterica O67は、群B O抗原群の遺伝子を全て有することを見
出した。この知見についてはいくつかの可能性のある説明があり、遺伝子クラス
ターが、変異に起因して機能せず、および群O67の抗原性は、別の抗原に起因
するか、または合成後に改変され、それによってその抗原性が変化されるという
可能性を含む。それゆえ、Salmonella enterica O67は、PCR診断アッセイにおい
てSalmonella enterica群Bとして評価される。しかし、Salmonella enterica O6
7は、まれなO抗原であり、2324個の公知の血液型亜型体のわずか1つ(血液型
亜型交差体(serovar Crossness))が、O67血清型を有するだけであり[Popoff
M.Y.ら(1992)「Salmonella enterica血液型亜型の抗原処方」第6改定版、S almonella enterica
に対する参照および研究のためのWHO共同研究センター、パ
スツールパリフランス研究所]、かつ血液型亜型交差体は、一度単離されたのみ
である[M.Propoffの私信]ので、これはほとんど重要でない。
wbaP由来のSalmonella enterica Bプライマーは、群A、C2、D1、D2、D3、E1、
54、55、67、およびE4 O抗原群と反応した。WbaPは、脂質キャリア、ウンデカプ
レノールリン酸へのガラクトースリン酸の転移によってO単位合成を開始するガ
ラクトシルトランスフェラーゼをコードする。この反応は、いくつかのO抗原の
合成に共通である。wbaPは、O抗原内に結合を作製しないので、それ自体で本発
明の他のトランスフェラーゼから区別される。
本発明者らはまた、血清型C2のwzx、wzy、および5つのトランスフェラーゼの
遺伝子についての20個のプライマー対を試験し、そして7つのプールの全てにお
いてポジティブは見出されなかった(表7)。
群A、B、D1、D2、D3、C2、およびE1は、一般に多くの遺伝子を共有する。これ
らの遺伝子のいくつかは、1つよりも多い配列とともに生じ、この場合において
、各特異的な配列は、それが生じる血清群の1つに因んで名付けられる。これら
の配列特異性の分布を、表10に示す。本発明者らは、Salmonella entericaのwzy
、wzx遺伝子、およびトランスフェラーゼの遺伝子のヌクレオチド配列をアライ
ンし、それによってSalmonellaenterica群A、B、D1、D2、D3、C2、およびE1を特
異的に検出および同定するために使用され得る核酸分子の特定の組み合わせを決
定した(表10)。結果は、多くのO抗原群が、単一の特異的な核酸分子を使用し
て検出および同定され得るが、他の群、特にD2およびE1、ならびにAおよびD1は
、遺伝子の組み合わせに由来する核酸分子のパネルを必要とすることを示
す。
食品、患者、および糞便由来のサンプルを含む特定のサンプル型の試験に関し
て、本発明の方法を行う際に、サンプルは、DNAベースの試験についてこのよう
なサンプルを調製するにおいて日常的に使用される、日常的な技術によって調製
されることを理解されたい。
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フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,
NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,L
S,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ
,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL
,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,
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E,ES,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU
,ID,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,
KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,M
D,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL
,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,
SL,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,U
Z,VN,YU,ZW