JP4238282B2 - バクテリア抗原特異核酸分子およびその用途 - Google Patents
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Description
背景技術
腸内病原性大腸菌株がヒトの下痢および出血性大腸炎の原因であることは周知であり、溶血性尿毒症症候群および血栓性血小板減少性紫斑病を含む潜在的に生命の脅威である続発症へと導く。これら菌株のあるものは共通して家畜に見出されるものであり、ヒトへの感染は通常不適切に加工処理され汚染された食肉または乳製品の消費の結果である。リポ多糖類の O特異多糖成分(「O抗原」)は腸内病原性大腸菌株の主要毒性因子であることが知られている。
特定の仮説に拘束されることを望まないながらも、本発明者らが現在信じるのは、パトンらの方法で見られた呈示擬陽性は、パトンらの採用した核酸分子が糖経路遺伝子として推定される機能を有する遺伝子[バスチンおよびリーブス(Bastin D. A. and Reeves, P. R.)(1995)、E.coliO111のO抗原遺伝子(rfb)クラスターの配列と分析、Gene、164:17〜23]から誘導したものであという事実のためであるが、現在それらはE.coliO抗原を同定するために必要なヌクレオチド配列特異性を欠いていると彼らも信じていることである。本発明者らが現在信じるのは、S.entericaまたは他の腸内細菌内で発現される糖経路遺伝子から誘導される核酸分子の多くもまた、特異O抗原または特異血清型を同定するのに必要なヌクレオチド配列特異性を欠いているらしいということである。
より好ましくは、本発明方法に使用するオリゴヌクレオチド分子は標識したものである。さらにより好ましくは、ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド分子は電気泳動法により検出する。
定 義
「遺伝子から誘導される核酸分子」という語句は、該核酸分子が同定された遺伝子のすべてまたは一部と同一であるか実質的に類似するヌクレオチド配列を有することを意味する。このように、遺伝子から誘導される核酸分子は、同定された遺伝子から物理的分離法により単離される分子、または人工的に合成され、同定された遺伝子のすべてまたは一部と同一であるか実質的に類似するヌクレオチド配列を有する分子であってもよい。一部の研究者は遺伝子から転写されたmRNAと同一の配列をもつDNA鎖のみを考えるが、ここでは両鎖を意図している。
命名法
E.coli O111rfbの同義語
現行名 発明者命名 バスチンら1991
wbdH orf 1
gmd orf 2
wbdI orf 3 orf 3.4*
manC orf 4 rfbM*
manB orf 5 rfbK*
wbdJ orf 6 orf 6.7*
wbdK orf 7 orf 7.7*
wzx orf 8 orf 8.9 およびrfbX*
wzy orf 9
wbdL orf 10
wbdM orf 11
* 命名はバスチン(Bastin D. A.)ら、1991、「E.coli O111 株のO抗原決定rfb遺伝子クラスターのE.coli K-12 での分子クローニングおよび発現」、Mol. Microbiol. 5:9 、2223〜2231による。
他の同義語
wzy rfc
wzx rfbX
rmlA rfbA
rmlB rfbB
rmlC rfbC
rmlD rfbD
glf orf 6*
wbbI orf 3#, E.coli K-12 のorf 8*
wbbJ orf 2#, E.coli K-12 のorf 9*
wbbK orf 1#, E.coli K-12 のorf 10*
wbbL orf 5#, E.coli K-12 のorf 11*
# 命名はヤオおよびバルバノ(Yao, Z. and M. A. Valvano)1994による。
「E.coli K-12 W3110 のO−特異リポ多糖生合成領域(rfb)の遺伝子分析:シゲラ・フレクスネリ血清型Yおよび4aに群特異性を付与する遺伝子の同定」。J. Bacteriol. 176:4133〜4143。
* 命名はスティブンソン(Stevenson)ら、1994、による。「E.coli K-12 のO抗原の構造およびそのrfb 遺伝子クラスターの配列」。J. Bacteriol.176: 4144〜4156。
・ S.entericaは1987年に採り入れられた名称であり、多くの他の名称、例えば、サルモネラ・ティフィおよびサルモネラ・ティフィミリウムに置き換わっている。従来の種名はS.enterica sv ティフィなどの血液型亜型(serovar)名となっている。しかし、伝統的な名称はなお広く用いられている。
・ 多くの種のO抗原遺伝子はrfb 名(rfbAなど)を付与され、O抗原遺伝子クラスターはしばしばrfb クラスターと言われてきた。rfb 遺伝子に対する新しい名称は表に示したとおりである。本明細書では情報源に従い両方の用語を使用している。
材料および方法−第1部
E.coli O111O抗原遺伝子クラスター(3,021〜9,981 位)の単離および特徴づけのための実験手順は、Bastin D.A. ら、1991「E.coli O111 株のO抗原を決定するrfb 遺伝子クラスターの分子クローニングおよびEscherichia coli K-12における発現」Mol. Microbiol. 5:9 2223-2231 、ならびにBastin D.A. およびReeves,P.R. 1995 「Escherichia coli O111 のO抗原遺伝子(rfb)群の配列および分析」Gene 164:17-23に従う。
A.バクテリア株および増殖培地
バクテリアを、必要とされるように補充したLuriaブロス中で増殖した。
B.コスミドおよびファージ
宿主株x2819 中のコスミドを、インビボで再パッケージングした。細胞を、中程度に振とうしながら、30°Cにて、30mLの培養液を含有する250mL フラスコ中で、580nm で0.3 の最適密度に増殖した。欠陥λプロファージを、45°Cで15分間、水浴中で加熱し、続いて37°Cで、勢いよく振とうしながら、2時間、インキュベーションすることによって誘導した。次いで、細胞を0.3mL クロロホルムを添加し、そしてさらに10分間振とうして溶解した。細胞残渣を、マイクロ遠心分離機中、5分間のスピンによって1mLの溶解物から除去し、そして上清を、新しいマイクロ遠心チューブに回収した。1滴のクロロホルムを添加し、次いで、チューブ内容物の全体を勢いよく攪拌した。
C.DNA 調製
染色体DNA を、30mLの容量のLuria ブロス中で37°Cにて一晩増殖したバクテリアから調製した。遠心分離によって細胞を採集した後、洗浄し、そして10mLの50mM Tris-HCl pH8.0 中に再懸濁した。EDTAを添加し、そして混合物を20分間インキュベートした。次いで、リゾチームを添加し、インキュベーションをさらに10分間継続した。次いで、プロテイナーゼK、SDS 、およびリボヌクレアーゼを添加し、その混合物を溶解が生じる2時間インキュベートした。全てのインキュベーションは37°Cであった。次いで、混合物を65°Cに加熱し、そして8mLのフェノールで、同じ温度にて、1回抽出した。混合物を、5mLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールで、4°Cにて、1回抽出した。残存するフェノールを、2回のエーテル抽出によって除去した。DNA を、2容量のエタノールで、4°Cにて沈殿させ、スプールし、そして70% エタノール中で洗浄し、1〜2mLのTE中に再懸濁し、そして透析した。プラスミドおよびコスミドDNA を、BironboimおよびDoly法[Birnboim, H.C. およびDoly, J.(1979)組換えプラスミドDNA をスクリーニングするための迅速なアルカリ抽出処理 Nucl. Acid Res. 7:1513-1523] の修飾によって調製した。培養物の容量は10mLであり、溶解物をフェノール/クロロホルム/イソ- アミルアルコールで抽出した後、イソプロパノールで沈殿した。ベクターとして使用されるプラスミドDNA を、1L の培養液中で増殖した細胞のアルカリ溶解後、連続的な塩化セシウム勾配において単離した。
D.酵素および緩衝液
制限エンドヌクレアーゼおよびDNA T4リガーゼをBoehringer Mannheim (Castle Hill, NSW, Australia)またはPharmacia LKB (Melbourne, VIC Australia)から購入した。制限酵素を、推奨される市販の緩衝液中で使用した。
E.遺伝子バンクの構築
M92 染色体DNA (Stoke W 株、Statens Serum Institut, 5 Artillerivej, 2300 Copenhagen S, Denmark )を、0.2U Sau3A1 で1〜15分間部分消化した。最も大きなが部分が約40〜50kbのサイズ範囲のフラグメントのアリコートを選択し、予めBamHI およびPvuII で消化したベクターpPR691にライゲートした。ライゲーション混合物を、パッケージング抽出物を用いて、インビトロでパッケージングした。形質導入のための宿主株はx2819 であり、組換え体をカナマイシンで選択した。
F.血清学的な手順
コロニーを、イムノブロッティングによってO111抗原の存在についてスクリーニングした。コロニーを一晩、プレート当たり100 個まで増殖し、次いでニトロセルロースディスクに移し、0.5N HClで溶解した。Tween20 を、ブロッキング工程、インキュベーション工程、および洗浄工程のために、0.05% の最終濃度で、TBS に添加した。一次抗体は、1:800に希釈したE.coli O群111 抗血清であった。
二次抗体は、1:5000 に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ウサギIgG であった。染色基質は、4-クロロ-1- ナフトール(napthol)であった。スライド凝集を、標準的な手順に従って行った。
G.組換えDNA 法
制限マッピングは、1本鎖および2本鎖消化ならびにサブクローニングを含む標準的な方法の組み合わせに基づいた。完全なコスミドの欠失誘導体を、以下のように生成した:1.8 μg のコスミドDNA のアリコートを、20μl の容量において、0.25U の制限酵素で、5〜80分間消化した。各アリコートの2分の1を使用して、アガロースゲルにおいて、消化の程度をチェックした。フラグメントの代表的な範囲を与えるようであるサンプルを、4°Cで一晩ライゲーションし、CaCl2法によってJM109 に形質転換した。選択されたプラスミドを、同じ方法によってs φ174 に形質転換した。P4657 を、エレクトロポレーションによって、pPR1244 で形質転換した。
H.DNA ハイブリダイゼーション
プローブDNA を、エレクトロエリューションによってアガロースゲルから抽出し、そして[α-32P]-dCTPを使用してニック翻訳した。染色体DNA またはプラスミドDNA を、0.8%アガロースゲルにおいて電気泳動し、ニトロセルロースメンブレンに移した。ハイブリダイゼーション緩衝液およびプレハイブリダイゼーション緩衝液は、低いまたは高いストリンジェンシーのプローブ化について、それぞれ、30% または50% のホルムアミドを含んだ。インキュベーション温度は、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションについて、それぞれ、42°Cおよび37°Cであった。フィルターの低いストリンジェンシーの洗浄は、2×SSC および0.1% SDS中の3×20分間の洗浄からなった。高いストリンジェンシーの洗浄は、室温での2×SSC および0.1% SDS中の3×5分間の洗浄、58°Cでの1×SSC および0.1% SDS中の1時間の洗浄、ならびに58°Cでの0.1xSSC および0.1% SDS中の15分間の洗浄からなった。
I.E.coli O111O抗原遺伝子クラスター(3,021〜9,981 位)のヌクレオチド配列決定
ヌクレオチド配列決定を、ABI 373 自動化シーケンサー(CA, USA )を使用して行った。3.30と7.90とのマップの位置の間の領域を、クローンpPR1270 およびpPR1272 由来の、PT7T3190において作製された欠失ファミリーの一方向性のエキソヌクレアーゼIII 消化を使用して、配列決定した。ギャップを、M13mp18 またはM13mp19 に選択されたフラグメントをクローニングすることによって、主に満たした。7.90〜10.2のマップの位置由来の領域を、M13mp18 またはM13mp19 における制限フラグメントから配列決定した。両方の領域における残りのギャップを、M13 またはファージミドにおける1本鎖DNA 鋳型を使用して、配列に沿って決定された位置に相補的な合成オリゴヌクレオチドから開始することによって満たした。近接する配列を分析した後に、オリゴヌクレオチドを設計した。全ての配列決定を、チェーンターミネイション法(chain termination method) によって行った。配列は、SAP[Staden,R.、1982「DNA 配列決定のショットガン法によって生成されるゲル読み取りデータのコンピューター操作の自動化」Nuc. Acid Res. 10:4731-4751 ;Staden,R.、1986「私たちの配列操作ソフトウェアの現在の状態および移植可能性(portability) 」Nuc. Acid Res. 14:217-231]を使用してアラインした。プログラムNIP[Staden,R. 1982 「核酸およびアミノ酸配列を比較およびアラインメントするための相互作用的なグラフプログラム」Nuc. Acid Res. 10:2951-2961]を使用して、オープンリーディングフレームを見出し、そしてこれらをタンパク質に翻訳した。
J.E.coli O111O抗原遺伝子クラスターを保有するクローンの単離
E.coliO抗原遺伝子クラスターを、Bastin D.A. らの方法[1991 「E.coli O111 株のO抗原を決定するrfb 遺伝子クラスターの分子クローニングおよびEscherichia coli K-12 における発現」Mol. Microbiol. 5(9) 2223-2231] に従って、単離した。M92 染色体DNA のコスミド遺伝子バンクを、インビボパッケージング株x2819 において樹立した。遺伝子バンクから、3.3 ×103 個のコロニーを、イムノブロッティング手順を使用してE.coli O111 抗血清でスクリーニングし:5個のコロニー(pPR1054 、pPR1055 、pPR1056 、pPR1058 、およびpPR1287 )がポジティブであった。これらの株からのコスミドを、インビボで、λ粒子中にパッケージングし、そして全てのO抗原遺伝子を欠損するE.coli欠失変異体S φ174 に形質導入した。この宿主系統において、全てのプラスミドは、O111抗血清とのポジティブな凝集を与えた。5個の独立したコスミドのEco R1制限マップは、それらが共通して、約11.5kbの領域を有することを示した(図1)。コスミドpPR1058 は、O抗原遺伝子クラスターに連結されるいくつかの染色体マーカーを同定するために十分な隣接DNA を含んでいたのでO抗原遺伝子クラスター領域の分析のために選択した。
K.コスミドpPR1058 の制限マッピング
コスミドpPR1058 を、2つの段階においてマップした。最初に予備的なマップを作製し、次いで0.00から23.10 のマップ位置間の領域を詳細にマップした。なぜなら、これがO111抗原発現について十分であることが示されたからである。両方の段階についての制限部位を、図2に示す。5個のコスミドクローンに共通の領域は、pPR1058 の1.35から12.95 のマップ位置間であった。
これらのクローンは、O111抗原を発現せず、4.00位でのXhoI部位は、O抗原遺伝子クラスター内にある。1つのクローンを選択し、pPR1288 と命名した。プラスミドpPR1230 、pPR1231 、およびpPR1288 を図2に示す。
L. E.coli O111O抗原遺伝子クラスター(3,021〜9,981 位)ヌクレオチド配列データの分析
BastinおよびReeves[1995 「Escherichia coli O111 のO抗原遺伝子(rfb)群の配列および分析」Gene 164:17-23] は、3,021〜9,981 のマップ位置からのフラグメントを配列決定することによって、部分的に、E.coli O111O抗原遺伝子クラスターを特徴付けした。図3は、E.coli O111O抗原遺伝子クラスターの3,021〜9,981 位の遺伝子組織を示す。orf3およびorf6は、wcaHおよびwcaGとの非常に高いレベルのアミノ酸同一性を有し(それぞれ、46.3% および37.2%)、かつ機能においてE.coli K-12 colanic 遺伝子クラスターにおける糖生合成経路遺伝子に類似するようである。orf4およびorf 5は、manCおよびmanB遺伝子に、それぞれ、高レベルのアミノ酸相同性を示す。orf7は、abequose経路遺伝子であるrfbHと高いレベルの相同性を示す。orf8は、12個の膜貫通セグメントを有するタンパク質をコードし、他のwzx 遺伝子に二次構造における類似性を有し、それゆえ、O抗原flippase遺伝子であるようである。
材料および方法−第2部
A.E.coli O111O抗原遺伝子クラスターの1〜3,020 および9,982〜14,516のヌクレオチド配列決定
新規なヌクレオチド配列を含んだサブクローンの、pPR1231 (0および1,510のマップの位置)、pPR1237 (-300〜2,744 のマップの位置)、pPR1239 (2,744〜4,168 のマップの位置)、pPR1245 (9,736〜12,007のマップの位置)、ならびにpPR1246 (12,007〜15,300のマップの位置)(図2)を、以下のように特徴付けた:pPR1237 、pPR1239 、およびpPR1245 のインサートの遠位末端を、ベクター中に位置するM13 正方向および逆方向プライマーを使用して、配列決定した。PCR ウォーキングを、配列データに基づくプライマーを使用して、各インサート内に、さらに配列決定するために行い、そしてプライマーを、配列決定のためにM13 正方向または逆方向プライマー配列でタギングした。このPCR ウォーキング手順を、全体のインサートが配列決定されるまで反復した。pPR1246 は、12,007〜14,516位を特徴付けた。これらのサブクローンのDNA を、両方の方向において配列決定した。配列決定反応を、ジデオキシターミネーション法および熱サイクルを使用して行い、そして反応産物を、蛍光染料およびABI 自動化配列決定器(CA, USA )を使用して分析した。
B. E.coli O111O抗原遺伝子クラスター(配列番号1の1〜3,020 および9,982〜14,516位)ヌクレオチド配列データの分析
BastinおよびReeves[1995 「Escherichia coli O111 のO抗原遺伝子(rfb)群の配列および分析」Gene 164:17-23] によって特徴付けされなかったE.coli O111O抗原遺伝子クラスターの領域(1〜3,020 および9,982〜14,516位)の遺伝子組成を、図3に示す。領域1において、2つのオープンリーディングフレームが存在する。領域2において、4つのオープンリーディングフレームが予測される。各遺伝子の位置は、表5に列挙する。
材料および方法−第3部
A. E.coli O157 :H7株(Statens Serum Institut, 5 Artillerivej, 2300, Copenhagen S, Denmarkの株C664〜1992)由来のO157抗原遺伝子クラスターのPCR 増幅
E.coli O157O抗原遺伝子クラスターを、O抗原遺伝子クラスターのプロモーター領域において通常見出されるJumpStart 配列[Hobbsら、1994「JunpStart 配列:群化されるいくつかの多糖遺伝子に共通の39bpエレメント」Mol. Microbiol. 12:855-856] に基づく、一方のプライマー(プライマー番号412 :att ggt agt tgt aag cca agg gcg gta gcg t)、およびO抗原遺伝子クラスターの下流に通常見出されるgnd 遺伝子に基づく、他方のプライマー番号482 (cac tgc cat acc gac gac gcc gat ctg ttg ctt gg) とともに、long PCR[Chengら、1994、「クローン化されたインサートおよびヒトおよびゲノムDNA からの長い標的の効率的な増幅」、P.N.A.S. USA 91:5695-569] を使用することによって、増幅した。Long PCRを、Boehringer Mannheim (Castle Hill NSW Australia)からのExpand Long Template PCR System を使用して行い、そしていくつかの反応からの14kbの長さの生成物を、合わせ、そしてPromega Wizard PCRプレップDNA 精製系(Madison WI USA)を使用して精製した。次いで、PCR 産物をフェノールで、そしてエーテルで2回、抽出し、70% エタノールで沈殿し、そして40μL の水中に再懸濁した。
B. ランダムなDNアーゼI バンクの構築:
約150ng のDNA を含有する2つのアリコートを、それぞれ、記載されるように改変したプロトコルを用いて、Novagen DNアーゼI Shotgun Cleavage(Madison WI USA)を使用するDNアーゼ消化に供した。各アリコートを、45μl の0.05M Tris-HCl(pH7.5)、0.05mg/mL BSA 、および 10mM MnCl2 中に希釈した。同じ緩衝液中の5μL の1:3000または1:4500希釈のDNアーゼI (Novagen)(Madison WI USA)を、各チューブにそれぞれ添加し、そして10μlの停止緩衝液(100mM EDTA)、30%グリセロール、0.5% Orange G、0.075%キシレンおよびシアノール(Novagen)(Madison WI USA)を、15°Cで5分間のインキュベーション後に添加した。次いで、2つのDNアーゼI反応チューブからのDNA を合わせ、そして0.8% LMTアガロースゲルにおいて分画し、そして約1kbの大きさのDNA を有するゲルセグメント(約1.5mL アガロース)を切り出した。DNA を、Promega Wizard PCR Preps DNA Purification (Madison WI USA)を使用して抽出し、そして200 μL の水中に再懸濁し、その後、フェノールで、およびエーテルで2回、抽出し、そして沈殿させた。次いで、DNA を、17.25 μL の水中に再懸濁し、そしてT4DNA ポリメラーゼ修復、およびNovagen Single dA Tailing Kit (Madison WI USA)を使用する単一のdAテイル化に供した。次いで、反応混合物(約8ng DNA を含有する85μl)を、クロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)で、1回抽出し、そして100 μL の全容量中で、3×10-3pmol pGEM-T (Promega)(Madison WI USA)にライゲーションした。ライゲーションを、一晩、4°Cで行い、そしてライゲーションされたDNA を沈殿させ、そして20μL の水中に再懸濁した後、E.coli株 JM109にエレクトロポレートし、そしてBCIG-IPTG プレート上に播き、そしてバンクを得た。
C. 配列決定
バンクのクローンからのDNA 鋳型を、Advanced Genetic Technologies Corpからの96ウェル形式のプラスミドDNA ミニプレップキットを使用して、配列決定のために使用した。これらのクローンのインサートを、pGEM-Tベクター中に位置する標準的なM13 配列決定プライマー部位を使用して、一方または両方の末端から配列決定した。ABI Catalyst(CA USA)において配列決定反応を行った後、配列決定を、上記のように、ABI377自動化シーケンサー(CA USA)において行った。不十分な適用範囲の配列ギャップおよび領域を、既に得られた配列データに基づくプライマーを使用してO157染色体DNA から直接的にPCR 増幅し、そしてPCR プライマーに付着された標準的なM13 配列決定プライマー部位を使用して、配列決定した。
D.E.coli O157O抗原遺伝子クラスターヌクレオチド配列データの分析
配列データを、Stadenのプログラム[Staden ,R.、1982「DNA 配列決定のショットガン法によって生成されるゲル読み取りデータのコンピューター操作の自動化」Nuc. Acid Res. 10:4731-4751 ;Staden,R.、1986「私たちの配列操作ソフトウェアの現在の状態および移植可能性」Nuc. Acid Res. 14:217-231 ;Staden, R. 1982 「核酸およびアミノ酸の配列を比較およびアラインメントするための相互作用的なグラフプログラム」Nuc. Acid Res. 10:2951-2961]を使用して、プロセスおよび分析した。図4は、E.coli O157O抗原遺伝子クラスターの構造を示す。12個のオープンリーディングフレームが、配列データから予測され、次いで、全てのこれらの遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を、これらの遺伝子の潜在的な機能および特異性の同定のために、GenBank データベースをサーチするために使用した。各遺伝子の位置を、表6に列挙する。ヌクレオチド配列を、配列番号2および図8に示す。
材料および方法−第4部
トランスフェラーゼのO抗原遺伝子、およびwzx 、wzy 遺伝子が、診断的なPCR について、経路遺伝子よりも特異的であるという、本発明者らの仮説を試験するために、本発明者らは先ず、全てのE.coli O16O抗原遺伝子についてのプライマーを使用して、PCR を行った(表4)。次いで、PCR を、E.coli O111 トランスフェラーゼ、wzx 、およびwzy の遺伝子のPCR プライマーを使用して行った(表5、5A)。PCR をまた、E.coli O157 トランスフェラーゼ、wzx 、およびwzyの遺伝子のPCR プライマーも使用して行った(表6、6A)。
A. E.coli O16O抗原遺伝子クラスター配列に基づくプライマー
E.coli O16のO抗原遺伝子クラスターは、O111の配列決定の前に十分に配列決定されていた、唯一の典型的なE.coliO抗原遺伝子クラスターであり、本発明者らはそれを仮説の試験のために選んだ。各遺伝子についての1対のプライマーを、E.coli染色体DNA のプール2〜20、30、および43に対して試験した。各遺伝子についてのプライマー、アニーリング温度、および機能的な情報を、表4に列挙する。
B.E.coli O111 O抗原遺伝子クラスター配列に基づくプライマー
O111のトランスフェラーゼ、wzx およびwzy 遺伝子のそれぞれの、1〜4個のプライマー対をE.coli染色体DNA のプール1〜21に対して試験した(表5)。wbdHについて、この遺伝子の様々な領域に結合する4個のプライマーの対を試験したところ、試験したE.coli染色体DNA の任意のそれらの21個のプールにおいて、正確な大きさの増幅DNA は存在しなかったので、O111に特異的であることが見出された。wbdMについて3対のプライマーを試験し、それらはすべて、特異的であるが、プライマー番号985/番号986 は、1つのプールから間違った大きさのバンドを生成した。wzx についての3つのプライマーの対を試験したところ、それらはすべて特異的であった。wzy について2つのプライマーの対を試験し、両方とも特異的であるが、番号980/番号983 は、全てのプールにおいて間違った大きさのバンドを与えた。wbdLについて1つのプライマーの対を試験し、そして非特異的であることが見出され、それゆえさらなる試験を行わなかった。従って、wzx、wzy 、および3つのトランスフェラーゼのうちの2つの遺伝子は、O111に非常に特異的である。増幅されたDNA において見出された間違った大きさのバンドは、E.coliにおいて広範に存在する遺伝子の偶然のハイブリダイゼーションに起因すると推定される。各遺伝子についてのプライマー、アニーリング温度、および位置は、(表5)にある。
C. E.coli O157 O抗原遺伝子クラスター配列に基づくプライマー
O157のトランスフェラーゼ、wzx およびwzy 各遺伝子の2または3つのプライマー対を、プール1〜19、29、および30のE.coli染色体DNA に対して試験した(表6)。wbdNについて、この遺伝子の種々の領域に結合する3つのプライマーの対を試験し、そして試験したE.coli染色体のこれらの21個のプールのいずれにおいてもDNA は増幅されなかったので、O157について特異的であることが見出された。wbdOについての3つのプライマー対を試験し、そしてこれらは全て特異的であったが、番号1211/ 番号1212は、全てのプールから間違った大きさの2つまたは3つのバンドを生成した。3つのプライマーの対を、wbdPについて試験し、これらは全て特異的であった。2つのプライマーの対をwbdRについて試験し、そしてこれらは全て特異的であった。wzy について、3つのプライマーの対を試験し、そして全て特異的であったが、プライマー対番号1203/ 番号1204は、各プールにおいて間違った大きさの1つまたは3つのバンドを生成した。wzx について、2つのプライマーの対を試験し、両方とも特異的であったが、プライマー対番号1217/ 番号1218は、2つのプールにおいて間違った大きさの2つのバンド、および7つのプールにおいて間違った大きさの1つのバンドをを生成した。増幅されたDNA において見出される間違った大きさのバンドは、E.coliに広範に存在する遺伝子の偶然のハイブリダイゼーションに起因すると推定される。各遺伝子についてのプライマー、アニーリング温度、および機能情報は、表6にある。
D.Salmonella enterica 血清型C2およびB O抗原遺伝子クラスター配列に基づくプライマー
本発明者らはまた、S.enterica C2 およびB 血清群のトランスフェラーゼ、wzx 、およびwzy の遺伝子についてのプライマーを使用してPCR を行った(表7〜9)。C2およびB O抗原遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を、配列番号3(図9)および配列番号4(図10)として、それぞれ列挙する。Salmonella enterica の全ての46個の血清型由来の染色体DNA (表9)を、Promega 遺伝子単離キットを使用して単離し、プール当たり4〜8サンプルの7プールを作製した。Salmonella enterica 血清型B またはC2 DNAは、46個のそれぞれの血清型のプライマーを試験するためのプールから省略したが、ポジティブコントロールとしての使用のために6つの他のサンプルを含有するプールに添加し、プール番号8を与えた。
Claims (12)
- 細菌性の血清型がO157である大腸菌が、試料中に存在するかを試験するための方法。
ここで、当該血清型の大腸菌は多糖O抗原を発現しており、
当該方法は以下の工程を含む:
(a) 試験すべき試料を提供する工程、
(b) 少なくとも一つのオリゴヌクレオチド分子を提供する工程、
ここで、当該オリゴヌクレオチド分子は、特異的な条件を用いた場合に、以下からなる群から選択される核酸配列の少なくとも一つとハイブリッド形成する:
wbdN (ヌクレオチド位置 79から861; 配列番号2)、
wbdO (ヌクレオチド位置 2011から2757; 配列番号2)、
wbdP (ヌクレオチド位置 5257から6471; 配列番号2)、
wbdR (ヌクレオチド位置 13156から13821; 配列番号2)、及び
wzy (ヌクレオチド位置 858から2042; 配列番号2)、
若しくは、以下からなる群から選択される核酸配列に相補的な核酸配列の少なくとも一つとハイブリッド形成する:
wbdN (ヌクレオチド位置 79から861; 配列番号2)、
wbdO (ヌクレオチド位置 2011から2757; 配列番号2)、
wbdP (ヌクレオチド位置 5257から6471; 配列番号2)、
wbdR (ヌクレオチド位置 13156から13821; 配列番号2)、及び
wzy (ヌクレオチド位置 858から2042; 配列番号2)、
(c) 前記少なくとも一つのオリゴヌクレオチド分子と前記試料中に存在する前記核酸配列とが、前記の特異的な条件の下でハイブリッド形成できるように、当該試料を当該オリゴヌクレオチド分子と接触させる工程、及び、
(d) ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド分子を検出する工程:
ここで、当該ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド分子の検出は前記試料中の前記大腸菌の存在を示す。 - 前記工程(b)において一対のオリゴヌクレオチド分子を提供し、当該一対のオリゴヌクレオチド分子のうち少なくとも一つが前記核酸配列の少なくとも一つとハイブリッド形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記一対のオリゴヌクレオチド分子が、ポリメラーゼ連鎖反応の一対のプライマーである、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも一つのオリゴヌクレオチド分子が、以下からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
位置 79から96; 配列番号2、
位置 184から201; 配列番号2、
位置 310から327; 配列番号2、
位置 858から875; 配列番号2、
位置 1053から1070; 配列番号2、
位置 1278から1295; 配列番号2、
位置 2011から2028; 配列番号2、
位置 2110から2127; 配列番号2、
位置 2305から2322; 配列番号2、
位置 5257から5274; 配列番号2、
位置 5440から5457; 配列番号2、
位置 5707から5724; 配列番号2、
位置 13261から13278; 配列番号2、
位置 13384から13401; 配列番号2、
位置 861から844; 配列番号2、
位置 531から514; 配列番号2、
位置 768から751; 配列番号2、
位置 2042から2025; 配列番号2、
位置 1619から1602; 配列番号2、
位置 1913から1896; 配列番号2、
位置 2757から2740; 配列番号2、
位置 2493から2476; 配列番号2、
位置 2682から2665; 配列番号2、
位置 6471から6454; 配列番号2、
位置 5973から5956; 配列番号2、
位置 6231から6214; 配列番号2、
位置 13629から13612; 配列番号2、及び
位置 13731から13714; 配列番号2。 - 以下の2つの工程の両方をさらに含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
(e) 前記試料をさらに少なくとも一つ又は一対のオリゴヌクレオチド分子に接触させる工程、及び
(f) 特異的にハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド分子を検出する工程:
ここで、上記(e)のオリゴヌクレオチド分子は、特異的な条件の下で少なくとも一つの糖経路遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリッド形成することができるものであり、当該糖経路遺伝子は、細菌性の血清型がO157であり多糖O抗原を発現する大腸菌のものである。 - 前記ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド分子が、サザンブロット解析により検出される、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項3に記載の方法。
- 前記試料が食物由来の試料である、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が糞便由来の試料である、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 前記試料が患者由来の試料である、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 細菌性の血清型がO157であり多糖O抗原を発現する大腸菌が、試料中に存在するかを試験するためのキット。
ここで、当該キットは以下のものを含む;
(a) 少なくとも一つのオリゴヌクレオチド分子:
ここで、当該オリゴヌクレオチド分子は、特異的な条件を用いた場合に、以下からなる群から選択される核酸配列の少なくとも一つとハイブリッド形成する:
wbdN (ヌクレオチド位置 79から861; 配列番号2)、
wbdO (ヌクレオチド位置 2011から2757; 配列番号2)、
wbdP (ヌクレオチド位置 5257から6471; 配列番号2)、
wbdR (ヌクレオチド位置 13156から13821; 配列番号2)、及び
wzy (ヌクレオチド位置 858から2042; 配列番号2)、
若しくは、以下からなる群から選択される核酸配列に相補的な核酸配列の少なくとも一つとハイブリッド形成する:
wbdN (ヌクレオチド位置 79から861; 配列番号2)、
wbdO (ヌクレオチド位置 2011から2757; 配列番号2)、
wbdP (ヌクレオチド位置 5257から6471; 配列番号2)、
wbdR (ヌクレオチド位置 13156から13821; 配列番号2)、及び
wzy (ヌクレオチド位置 858から2042; 配列番号2)、
(b) 当該オリゴヌクレオチドが上記核酸配列とハイブリッド形成するために必要な試薬、及び
(c) 当該キットの使用説明書。 - さらに第二のオリゴヌクレオチド分子を含む、請求項11に記載のキット。
ここで、当該オリゴヌクレオチド分子は特異的な条件の下で少なくとも一つの糖経路遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリッド形成することができるものであり、当該糖経路遺伝子は、細菌性の血清型がO157であり多糖O抗原を発現する大腸菌のものである。
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