JP2001504684A - 髄膜炎菌種の細菌に特異的なｄｎａおよび蛋白質またはペプチド、それらの取得方法およびそれらの生物学的応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明のＤＮＡは、髄膜炎菌に存在するが淋菌にもナイセリア・ラクタミカにも存在しないところの、読み取り相をもつ遺伝子（ただし、多糖性莢膜、ｆｒｐＡ、ｆｒｐＣ、ｏｐｃ、ｐｏｒＡ、ロータマーゼ、配列ＩＳ１１０６、ＩｇＡプロテアーゼ、ピリン、ＰｉｌＣ、トランスフェリンに結合する蛋白質、および混濁蛋白質の生合成に関わる遺伝子を除く）の全部または一部であることを特徴とする。本発明はこれらＤＮＡに対応するポリペプチド、およびこれらポリペプチドに対する抗体にも関する。本発明は、髄膜炎菌によって誘発された感染症および髄膜炎の予防および検出に応用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 髄膜炎菌種の細菌に特異的なＤＮＡおよび蛋白質またはペプチド、それらの取得 方法およびそれらの生物学的応用 本発明は、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（以下Ｎｍと略す）種の細菌 に特異的なＤＮＡおよび蛋白質またはペプチド、それらの取得法およびそれらの 生物学的応用、とくに髄膜炎菌感染および髄膜炎の予防および検出のための応用 に関するものである。 Ｎｍが髄膜炎の主たる病因であることは既知である。 合衆国で進められた研究は、人口の５〜１０％が種々のＮｍ株の無症状保菌者 であることを示している。Ｎｍの伝達因子はあまり知られていない。感染者の一 部では、Ｎｍが血流中に入り込み、そこで髄膜炎菌血を惹起する可能性および／ または髄液流中へ進み、髄膜炎を惹起する可能性がある。迅速な抗生物質療法が なければ、その感染症は速やかに進展して、致命的となる可能性がある。 他の病原体と比較して、Ｎｍは、血液脳関門を通過することができて、髄膜に すみつくという特性を示す。それゆえ、Ｎｍの病原性の研究は、髄膜炎という範 囲内においてのみならず、脳に関するすべての疾患という範囲においても、重要 である。 それゆえ、この細菌種に特異的なツールを上記意図の用途に利用することに興 味がもたれる。 Ｎｍは、遺伝学上、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）（以下Ｎｇと略す）種お よびナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica）（以下Ｎｌと略す）種に きわめて近い。しかし、それらの病原性はきわめて異なっている。 Ｎｍは、鼻咽腔にすみつき、つぎに咽頭上皮を通り抜けて粘膜下隙に侵入し、 そこで敗血症および髄膜炎の原因となる。 Ｎｇは、とりわけ泌尿生殖器の局所感染の原因となる。それは、性器粘膜にす みつき、つぎに上皮を通る抜け、その後に上皮下に侵入し、そこで増殖し、強度 の炎症反応の原因となる。播種性淋菌感染が起こりうるが、稀であり、若干の株 の場合であるにすぎない。Ｎｌに関しては、それは非病原性で あり、限局性侵襲の原因にも全身性侵襲の原因にもならないと言われている。 このように、まず考えられるのは、ＮｍおよびＮｇが、きわめて近似した細菌 であるのに、異なる病原性を示すことを考慮に入れることである。 これらの細菌のゲノムは強度に相同性であるから、ＮｍとＮｇのゲノムの限ら れた部分のみが、それらの病原性の原因となる特異的毒力因子をコードしている にちがいない。 Ｎｍが、（Ｎｇと比較して）それに特異的で、その特異的病原性の発現レベル に影響するにちがいないＤＮＡ配列を示すことは明らかである。 Ｎｍ種は、莢膜（きょうまく）多糖類の特徴に基づく血清グループによって副 分類される。 少なくとも１３の血清グループが明らかにされており、それらのうちでも、血 清グループＡ、ＢおよびＣが髄膜炎症例の約９０％の原因である。グループＡお よびＣは流行性の形態の疾患で観察される。グループＢは、欧州および合衆国で もっとも普通に単離される血清グループである。 Ｎｍでは存在し、Ｎｇでは存在しない莢膜が、髄膜炎菌由来抗髄膜炎ワクチン 作成のための基礎となった。 Ｎｍの莢膜多糖類が、血清グループＡ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの髄膜炎菌によ り惹起される成人での髄膜炎を予防するのに有効なことが示されたワクチンの作 成に利用された。 しかし、グループＢのＮｍの多糖類はヒトで非免疫原性であり、ヒト神経細胞 中に存在する接着糖蛋白質とエピトープを共にするが、グループＣのＮｍの多糖 類は、１０歳未満の小児において軽度に免疫原性であることが明らかにされてい る。 それゆえ、全血清グループの髄膜炎菌により惹起される感染を予防でき、一般 の細菌性病原体、とくにＮｍに固有の抗原性の可変性に対応できる万能ワクチン は存在しない。 ＮｍのグループＢ多糖類のヒト抗原との交差反応性、血清グループの多様性お よびＮｍの抗原としての多様性のために、今日までに提案された戦略は 、すべての場面で有効なワクチンに導くことができていない。 それゆえ、研究は、髄膜炎菌病原の特異性の原因をなす特徴的要素の検討に集 中された。 両細菌ＮｍおよびＮｇのいずれかで検討された遺伝子の多くは、もう一方の細 菌中にそれらの相同配列をもっている。 同様に、現在までにＮｍ中で同定された病毒因子の多くが、Ｎｇ中に対応物、 すわわちピリン、ＰｉｌＣ蛋白質、混濁蛋白質ならびにラクトフェリンおよびト ランスフェリンの受容体をもっている。 先行技術において特性描写されている髄膜炎菌の特異的属性は、莢膜、ＲＴＸ 毒素に類似の蛋白質Ｆｒｐ、外部構成因子蛋白質Ｏｐｃ、グルタチオンペルオキ シダーゼ、ポーリンＰｏｒＡおよびロータマーゼ遺伝子である。 これらのうち、莢膜は、常に、Ｎｍの病毒株中に存在する。一方、多くの細胞 外病原体が莢膜をもつが、血液脳関門を通過するわけではない。 それゆえ、いまだ同定されていない属性が、髄膜炎菌病原の特異性の原因とな っているにちがいない。これらの属性は、おそらく、髄膜炎菌の間では存在する が、淋菌では存在しないＤＮＡによってコードされているであろう。 本発明者らは、Ｎｍに特異的な遺伝子の差引き（サブトラクション）単離に基 づく新しいアプローチ法を開発した。これらの遺伝子はＮｍ特異性病原に、より 詳しくは血液脳関門の通過に、関連しているにちがいない。 先行技術で開発された差引き法は、Ｎｍのいくつかの単離株について疫学的マ ーカーの産生に成功している。これらのマーカーは有用性が限られている：それ らはＮｍ種の血清グループの全体をカバーしない。 これらの研究に対して、本発明者らの研究は、Ｎｍをランダム（無作為的）に 切断したＮｇの染色体の全体と比較・照合することによりＮｍには存在するがＮ ｇには存在しないＤＮＡの全体をクローンする手段の開発に導き、かくして、Ｎ ｍに対して高度の特異性をもつツールを提供し、かくしてこの菌種の遺伝的可変 性に初めで対応することを可能にした。 本明細書および特許請求の範囲においてある株のＤＮＡまたはそれらの発 現産物に関連して使用した「存在する」および「存在しない」なる語は、同じプ ローブ、同じプローブ標識強度、同じ染色体ＤＮＡ量および同じ比較要素（相同 株の染色体ＤＮＡ）を用いることによる同一のハイブリデーション条件（０．５ Ｍ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．２；０．００１Ｍ ＥＤＴＡ−Ｎａ、１％、１％ウシ 血清アルブミンおよび７％ドデシル硫酸ナトリウムを用い、６５℃で１６時間） に関連して把握されるものである。たとえば、プローブによって得られたシグナ ルが参考株を用いて得られたものと実質的に同じであれば、当該ＤＮＡが存在す ると考える。 一方、そのシグナルがきわめて弱いときには、当該ＤＮＡは存在しないと考え る。 ＮｍおよびＮｇの病原性に関して第二に考えられるのは、それらが粘膜にすみ つき、これを透過し、つぎにそれの上皮下隙を占拠することのできる能力を考慮 に入れることである。このプロセスが両病原体に共通の病毒因子に関わっている ことはきわめてありうることである。これに関して、ＮｍおよびＮｇにおいて、 ｐｉｌｉ、ＰｉｌＣ蛋白質、混濁蛋白質、、ＩｇＡプロテアーゼ、トランスフェ リンおよびラクトフェリンに結合する蛋白質、およびリポオリゴ糖などのいくつ かの病毒因子がすでに同定されていることは既知である。 それゆえ、本発明者らのアプローチは、ＮｍおよびＮｇに特異性であるが非病 原性菌種Ｎｌには存在しないＮｍの領域の探索、ならびに、本発明に従って開発 された手段による与えられた菌種に特異的な染色体ＤＮＡ領域およびそれらの発 現産物の一般的研究方法の探索へと拡がった。 従って、本発明は、その病原性により特異的なＮｍのＤＮＡおよびそれらを取 得する手段を、とりわけそれらＮｍ特異性ＤＮＡからもっぱらなるバンク（ライ ブラリー）を構築することによって、提供することを目的とする。 本発明はまた、これらのＤＮＡ配列により導かれた産物をも対象とする。 本発明はまた、とりわけ診断、治療および予防に利用できるツールを作り上げ るためにこれらバンクの特異的で網羅的な特徴を利用することを対象とする。 本発明のＤＮＡは、髄膜炎菌に存在するが淋菌にもナイセリア・ラクタミカに も存在しないところの、読み取り相をもつ遺伝子（ただし、多糖性莢膜、ｆｒｐ Ａ、ｆｒｐＣ、ｏｐｃ、ｐｏｒＡ、ロータマーゼ、配列ＩＳ１１０６、ＩｇＡプ ロテアーゼ、ビリン、ＰｉｌＣ、トランスフェリンに結合する蛋白質、および混 濁蛋白質の生合成に関わる遺伝子を除く）の全部または一部であることを特徴と する。 先に明確に説明した通り、「存在する」および「存在しない」なる語は、実施 例中で記載したサザンブロットにおいて用いた、および先にも触れたハイブリデ ーション条件に関連して把握されるものである。 これらのＤＮＡが、菌種Ｎｍに固有の機能、より詳しくは、もっぱらＮｍで見 出される表現型またはもっぱらＮｇと共通の表現型を示す限りの変異体を包含す ることを了解されたい。 主要な一面に従えば、これらのＤＮＡは髄膜炎菌の病原性のゆえに特異的であ り、しかもこの菌種の遺伝的可変性に拘らずそうである。 本発明の一実施態様に従えば、該ＤＮＡはＮｇよりもＮｍに特異的である。 より詳しくは、Ｎｍに特異的なＤＮＡはナイセリア・ラクタミカおよびナイセ リア・シネレア（Neisseria cinerea）には存在しない。 驚くべきことに、髄膜炎菌株とこれら淋菌株との間の遺伝的相違の大部分は、 大腸菌およびペスト菌について以前に述べられているように病原性区画に対応し たはっきり異なる領域に結集されているように思われる。 かくして、本発明の好ましい一態様においては、これらのＤＮＡは、髄膜炎菌 Ｚ２４９１の染色体のｔｕｆＡとｐｉｌＴとの間、すなわち該染色体の領域１に 存在している１つまたは複数の配列および／または髄膜炎菌特異性であるという 条件付きで、上記配列とハイブリダイズしうる１つまたは複数の配列を包含する ことによっても特徴付けられる。 本明細書および特許請求の範囲において、「特異的」とは、実施例で示し、か つ前記したハイブリデーション条件下でＮｍのそれらとしかハイブリダイズしな いヌクレオチド配列を意味する。 その点に関して、一般的に、明細書および特許請求の範囲において配列の「全 部または一部」というとき、この表現は上で定義した特異性に関連して把握され るべきものである。 同様に、ペプチド、ペプチド断片および抗体の全部または一部とは、天然のペ プチドまたはこのペプチドに対して生成される抗体のそれぞれの生物学的性質を 呈する産物を意味する。 領域１には、髄膜炎菌の莢膜の遺伝子が結集されている。 このタイプのＤＮＡは、配列番号９、１３、２２または３０および／またはあ るＮｍ株の染色体上のこれら配列番号から前後２０ｋｂ以内に位置するあらゆる 配列に全部または一部が相応する配列を示し、および／またはこれらの配列のい ずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうる配列を示す。 本発明の他の好ましい一態様においては、これらのＤＮＡは、髄膜炎菌Ｚ２４ ９１の染色体のｐｉｌＱｉとλ７４０との間、すなわち該染色体の領域２に存在 している１つまたは複数の配列および／または髄膜炎菌特異性であるという条件 付きで、上記配列とハイブリダイズしうる１つまたは複数の配列を包含すること によっても特徴付けられる。 この態様に従ったＤＮＡは、配列番号１、２、４、６、７、１０、１５、３１ または３４および／またはあるＮｍ株の染色体上のこれら配列番号から前後２０ ｋｂ以内に位置するあらゆる配列に全部または一部が相応する配列を示し、およ び／または、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズ しうる配列を示す。 本発明は、とくに、配列番号３６の１５６２０ｂｐのＤＮＡならびに配列番号 ３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４ ２、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５の読み取り枠（オープンリ ーディングフレーム）に相応する配列を対象とする。 本発明のさらに別の一態様においては、これらのＤＮＡは、髄膜炎菌Ｚ２４９ １の染色体のａｒｇＦとｏｐａＢとの間、すなわち該染色体の領域３に存在して いる１つまたは複数の配列および／または髄膜炎菌特異性であると いう条件付きで、上記配列とハイブリダイズしうる１つまたは複数の配列を包含 することによっても特徴付けられる。 この態様に従ったＤＮＡは、配列番号８、２１、２３、２５、２６、２８、２ ９、３２または３５および／またはあるＮｍ株の染色体上のこれら配列番号から 前後２０ｋｂ以内に位置するあらゆる配列に全部または一部が相応する配列を示 し、および／または、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブ リダイズしうる配列を示す。 上記の領域１、２、３は、髄膜炎菌特異配列の大きい割合を示し、やはり本発 明の枠内に含まれる。 髄膜炎菌に対する特異性を代表する他のＤＮＡは、髄膜炎菌Ｚ２４９１の染色 体上に存在する１つまたは複数の配列を示すが、上に定義した領域１、２、３の 一部を構成しない。 かかるＤＮＡは、配列番号３、５、１１、１２、１４、１６、１８、１９、２ ０、２４、２７または３３および／またはあるＮｍ株の染色体上のこれら配列番 号から前後２０ｋｂ以内に位置するあらゆる配列に全部または一部が相応する配 列を包含し、および／または、かかる配列とハイブリダイズしうる配列を示す。 とくに対象とする用途を考慮するとき、本発明は、より特別には、当該細菌の 病原に関わる上記ＤＮＡに関するものである。 本発明は、とくに、上に示した特性の少なくとも１つに対応し、細胞膜を越え て運び出される蛋白質をコードするＤＮＡおよび／またはその配列の全部または 一部が該ＤＮＡの保存された領域に相応するＤＮＡを対象とする。 かくして、本発明の別の一実施態様に従えば、それらＤＮＡは、Ｎｇのそれら と共通であるが、Ｎｌには存在しない。 より特別には、それらは、Ｎｍ Ｚ２４９１の染色体上の領域４（ａｒｇＪか らｒｅｇＦまで）または領域５（ラムダ３７５マーカーからｐｅｎＡまで）に存 在するＤＮＡおよび／またはＮｌよりもＮｍおよびＮｇに特異的であるという条 件付きで、該存在するＤＮＡとハイブリダイズしうるＤＮＡである。 「ＮｌよりもＮｍおよびＮｇに特異的」とは、実施例（とくに実施例４参照） のハイブリダイゼーション条件下でＮｍおよびＮｇのＤＮＡとハイブリダイズす るＤＮＡを意味する。 領域４および５のＤＮＡならびにこれらのＤＮＡとハイブリダイズしうるＤＮ Ａは、Ｎｍに固有の機能を発現するという条件付きであるが、すみつきおよび初 期侵入の段階および敗血症の拡散に関与することによって、主としてＮｍの病毒 性に干渉するという長所を示す。 他の態様に従えば、本発明は、少なくとも１つの上に定義した通りのＤＮＡを 含むプラスミド、コスミド、ファージなどの伝達ベクターおよび発現ベクターを 対象とする。 本発明はまた、少なくとも一つの上に定義した通りのＤＮＡにより形質転換さ れた宿主細胞を対象とする。 本発明の他の宿主細胞は、Ｎｍに特異的な遺伝子または遺伝子断片を含み、そ れらの染色体が本発明の少なくとも１つのＤＮＡ、とくに病原性の原因となって いるＤＮＡを欠失していることにより特徴付けられる。とくに、細菌細胞、とり わけＮｍの細胞が重要である。 本発明は、その配列の全部または一部が上に定義した通りのＤＮＡ配列または その配列の断片の転写産物に相応するＲＮＡをも対象とする。 上に定義した通りのＤＮＡまたはこれらのＤＮＡの断片のアンチセンス核酸配 列も、本発明の一部をなす。 これらのアンチセンス核酸は、場合により、メチル基またはグリコシル基など の少なくとも１つの置換基を有する。 本発明の範囲に含まれる他の産物は、ポリペプチドによって構成される。 これらのポリペプチドは、先に定義した核酸によりコードされているかまたは それら核酸の配列から推定される配列の全部または一部に相応するアミノ酸連鎖 を示すことによって特徴付けられる。 それらは、細胞膜を越えて運び出されるポリペプチドの全部または一部に相応 するポリペプチド、より特別には保存された領域によりコードされているものに 相応するポリペプチドであるのが有利である。 変形として、本発明のポリペプチドは、核酸配列に相応するものに比して、し かも所与の用途、とくにワクチンとしての適用にとくに適するように、修飾され ていてもよい。 修飾とは、対応する天然ポリペプチド、とくにペリプラズムおよび外膜を通し て運び出される機能性蛋白質の生化学的性質に影響しない限りのあらゆる変化、 欠失、化学的置換を意味する。 本発明に従った他の生成物は、上記ポリペプチドに対する抗体からなる。 すなわち、本発明は、上に言及したポリペプチドの少なくとも１つのエピトー プを認識することを特徴とするポリクローナル抗体ならびにモノクローナル抗体 を対象とする。 本発明は、これら抗体の断片、より詳細にはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２断片を も対象とする。 上に定義した抗体またはそれらの断片を抗原−抗体型反応に従って認識しうる 抗抗体も本発明の一部をなす。 本発明に従えば、上で考慮した種々の製品は、合成および／または生物学的方 法により、オーソドックスな技法に従って操作することによって得られる。 核酸は、差引き手法に従って構築されたＮｍ特異性ＤＮＡからなるバンクから 出発して得ることもできる。この手法は、 − ２つのＤＮＡ集団の混合、 − 差引きハイブリダイゼーション−増幅の反復の少なくとも一回の実施および − 所望のＤＮＡ（単数または複数）の回収、場合によってのそれに続く余分な 配列の除去を含めての精製 を包含する。 本発明に従えば、該２つのＤＮＡ集団はそれぞれ、それのために特定のバンク を構成すべき１つの髄膜炎菌株（いわゆる基準株）ならびに該髄膜炎菌株と約７ ０％を越える相同性を示すいわゆる差引き（サブトラクション）株である１つの ナイセリア株に由来し、差引き株および基準株のＤＮＡ配列は 、それぞれ、ランダム切断およびサイズが約１ｋｂ未満の断片を生じうる制限酵 素による切断によって得られる。 本発明は、とくに： − いわゆる差引き株である１つの淋菌株の染色体ＤＮＡの、とりわけ注射器の 反復通過によるランダム切断、 − いわゆる基準株である髄膜炎菌の染色体ＤＮＡの、好ましくは約１ｋｂ未満 のサイズの断片を生じうる制限酵素による切断、 − 制限酵素で切断した基準株のＤＮＡ断片と適当なオリゴヌクレオチドプライ マーとの連結、 − ・ 相同性配列のハイブリダイゼーションための適当な条件下での２つのＤ ＮＡ集団の混合、 ・ その後の、自己再アニーリングした(auto-reanneles)断片の増幅および これら断片の回収、 ・ これら断片の制限酵素による消化および該オリゴヌクレオチドへの再連 結による差引きハイブリダイゼーション−増幅の反復の１回実施、続いての − 連結ＤＮＡの精製および場合によっての引き続いての上に示したごとく切断 した髄膜炎菌ＤＮＡ断片と先の反復で生じた髄膜炎菌ＤＮＡ断片との混合からな る差引きハイブリダイゼーションの新たな反復、所望による続いてのバンクＤＮ Ａのクローニング の各工程を包含する髄膜炎菌特異性ＤＮＡバンクの取得方法を対象とする。 使用するプライマーは、クローニング部位、たとえばプラスミドｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩ部位、への挿入を可能ならしめる使用制限酵素に適合し たオリゴデオキシヌクレオチドプライマーである。かかるプライマーは、配列表 の配列番号３６〜４５のもとに表されているオリゴデオキシヌクレオチドのうち から選ぶのが有利である。 こうして得られたバンクは、髄膜炎菌に特異的で、淋菌には存在しないＤＮＡ から構成されている。 それらＤＮＡの特異性は、実施例で示したように、各反復ごとに、差引き 株と基準株とに共通の遺伝子またはＣｌａＩなどの制限酵素により消化した各々 の株の全ＤＮＡを用いて、サザンブロットにより確認されている。 各反復ごとに、ＤＮＡバンクの網羅性も、基準株に特異的であることが既知の プローブ、すなわち髄膜炎菌の場合は、とりわけｆｒｐ、ｏｐｃ、ロータマーゼ の各遺伝子を用いて、確認されている。 実施した実験の結果、本発明の方法に従って得られたバンクは、髄膜炎菌以外 のナイセリア種と有意の相同性を示す遺伝子、たとえばｐｐｋまたはｐｉｌＣ１ 遺伝子を欠いている。それも、通常は２〜３回の反復操作でそうなる。 必要ならば、互いに排他的ではない２つの方法を利用することができる。 基準株のＤＮＡ集団としで反復回数ｎのＤＮＡを用いて（ｎ＋１）回目の反復 を実施することができる。 変形としては、第一のバンクで用いたものと特異性の異なる制限酵素、たとえ ばＭｂｏＩを用いて、第一のバンクから独立した第二のバンクを製出する。 いずれの場合にも、実施した反復の各々から生じた産物の各々を保存しておく ことが好ましい。 本発明は、ＮｇとＮｍとに共通の、しかしＮｌと比較すれば特異的なＤＮＡバ ンクを取得するための上記差引き手法をも対象とする。 ３つの異なるバンクを、２つはＮｍ染色体ＤＮＡのＭｂｏＩおよびＴｓｐ５０ ９１での消化により、一つはＮｍ染色体ＤＮＡのＭｓｐＩでの消化により、構築 することが有利である。２系列の差引きにより、実施例で記載したように、求め る特異性を示ずＤＮＡを回収することが可能になる。 これらバンクの取得方法およびそれらのバンク自体も、本発明の一部をなす。 一般に、本発明の方法は、遺伝的に近く、異なる病原性を示す他の種または他 の変異体が存在するときに、所与の細胞種または同じ種の所与の変異細胞種に特 異的なＤＮＡバンクを得るのに適用できることが指摘される。 本発明の方法を適用することにより、クリプトコックス、ヘモフィルス、 肺炎双球菌、さらには大腸菌の所与の種に、より一般的には、同じ種に属し、異 なる病原性(pathovars)を有するすべての細菌性病原体に特異的なＤＮＡバンク が有利に構築される。 同様に、本発明は、これらのバンクから出発して、所与のある種または変異体 に特異的な病毒因子を自由に処分する手段を提供する。 それゆえ、かかるバンクは、ある病原体の特異性の原因となっている属性を自 由に処分する上で興味深いツールを構成し、この応用は、とくに、本発明に従っ て、髄膜炎菌の病原の特異性の原因である属性を含むバンクを取得することによ って例証される。 本発明の産物、核酸、ポリペプチドおよび抗体の研究により、髄膜炎菌株また はその変異体のいずれであれ、髄膜炎菌に関する絶対的特異性がはっきりとなっ た。 それゆえ、これらの産物は、成人におけるものであれ、小児におけるものであ れ、また問題の株の血清グループにかかわりなく、髄膜炎菌により惹起される感 染および髄膜炎の診断および予防にとくに適している。 分析すべき試料中の髄膜炎菌の存在を証明することによる髄膜炎菌感染、とく に髄膜炎菌性髄膜炎の本発明に従った診断方法は、 − 分析すべき試料、すなわち生体試料または細胞培養を、少なくとも１種の上 に定義した通りの核酸から、場合によりヌクレオチドプローブまたはプライマー の形で、作成した試薬、または、変形として、上に定義した通りの少なくとも１ 種の抗体または抗体断片から作成した試薬と、それぞれにハイブリダイゼーショ ンまたは抗原−抗体型反応を可能ならしめる条件下で接触させ、 − 場合によって形成された反応生成物を確認する 工程により特徴付けられる。 該試薬を核酸から作成するとき、それはヌクレオチドプローブの形であっても よく、その形態においで該核酸またはその断片をその確認を可能ならしめるため に標識する。適当な標識としては、放射性、蛍光性、酵素性または発光性の標識 が挙げられる。 変形としては、該核酸が試薬として使用される宿主細胞中に包含される。 これらの様々な形態のもとに、該核酸は、そのまままたは不活性担体との組成 物の形で使用される。 該試薬を抗体または抗体断片から作成するときには、確認のためにそれを標識 することができる。もっとも普通には、蛍光性、酵素性、放射性または発光性の 標識を利用する。 使用する抗体または抗体断片は、場合により標識されていてもよいが、それを そのまままたは不活性担体との組成物の形で使用できる。 接触段階で使用する試料は、脳脊髄液、尿、血液、唾液などの哺乳動物由来の 生体試料である。 確認段階は、それが生成された場合の反応生成物を明らかにしうる条件下で実 施する。オーソドックスな手段では、蛍光反応、発光反応、呈色反応、放射能、 さらにはオートラジオグラフィー手法を利用する。生成物を定量することも可能 である。 それら標識産物、核酸および抗体も、新規産物として本発明の一部をなす。 上に定義した方法は、髄膜炎菌感染に特異的な免疫反応による診断にも適用で きる。 その時には、試薬として、天然産物に相応して前記の核酸配列によりコードさ れている本発明のポリペプチドまたは対応する天然ポリペプチドの生物学的活性 および免疫活性を有する修飾ポリペプチドを利用する。 それは、細胞膜を通して運び出される髄膜炎菌のポリペプチド、とくに保存Ｄ ＮＡ領域に対応するかかるポリペプチドの部分であるのが有利である。 本発明はまた、上に定義した方法を実施するためのキットをも対象とする。こ れらのキットは、 − 少なくとも１種の上に定義した試薬、すなわち核酸、抗体またはポリペプチ ドタイプの試薬、 − 対象とするヌクレオチドハイブリダイゼーション反応または免疫反応の実施 を可能ならしめる製品、とりわけマーカーまたは緩衝液ならびに使用説 明書 を包含することを特徴とする。 本発明の産物の特異性と、病原性区画であると解釈しうる領域に結集されてい ても、染色体上で隔離されていても、それらが髄膜炎菌Ｚ２４９１染色体上に局 在していることとが、普遍的対象に対する、すなわち菌株およびそれが示す可変 性を問わない、ワクチン組成物の実現のための特別な重要性をそれらに与える。 これらの組成物は、それらのスペクトル中にとりわけ予防を包含でき、たとえば 小児用ワクチンに組み込むことができる。 それゆえ、本発明は、抗髄膜炎菌を目的とした予防をそのスペクトル中に包含 し、髄膜炎菌により惹起される可能性のあるあらゆる感染を予防するのに当てら れるワクチン組成物を対象とし、これらの組成物は、上に定義したポリペプチド または抗抗体またはそれらの断片の有効量を生理学的に許容しうる一種または複 数の担体と組み合わせて含有することを特徴とする。なお、これらの産物は、そ れらの免疫原性を増強するために、組み合わせてもよい。 利用可能な免疫原分子としては、ポリオウイルス蛋白質、破傷風毒素（テタヌ ストキシン）、さらにはピリンの超可変部に由来する蛋白質が挙げられる。 変形として、本発明のワクチン組成物は、有効量の − 上に定義した通りの核酸、 − 上で定義した通りの形質転換宿主または − 細菌の病原性に関与する少なくとも１つの本発明のＤＮＡ配列が染色体から 欠失しているＮｍ細胞 を、生理学的に許容しうる１種または複数の担体とともに包含することを特徴と する。使用するヌクレオチド材料は、生体内でのそれの発現および対応する蛋白 質の合成を助長するプロモーターの調節下に置くことが有利である。免疫原性を 増強するために、この核酸材料を、ポリオウイルス蛋白質、破傷風毒素、ピリン の超可変部に由来する蛋白質などの担体蛋白質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ と組み合わせることもできる。 本発明のワクチン組成物は、非経口経路で、または皮下に、筋肉内に、さらに はスプレーの形態で、投与する。 本発明の他の特徴および利点は、本発明を例証する下記実施例に示すが、それ らは本発明の範囲を限定するものではない。 これらの実施例においては、図１〜１１を参照するが、それらはそれぞれ下記 を示す： − 図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆおよび１Ｇは、差引きバンクＴｓｐ ５０９１の分析結果を示す。 − 図２は、Ｎｇと比較しでのＺ２４９１株の染色体上のＮｍ特異的配列の分布 （左部分）およびＮｌと比較してのＮｍ特異的配列の分布（右部分）を示す。 − 図３Ａ〜３Ｃは、本発明に従った染色体の３領域のクローンのナイセリア属 株標本パネルに対する反応性を示す。 − 図４は、プローブとして用いたオリゴヌクレオチドのＮｍの染色体の領域２ における位置を示す。 − 図５、６および７は、Ｎｍの領域２の部分をプローブとして用いたときの、 ナイセリア属標本パネルのサザンブロットを示す。 − 図８Ａ〜８Ｃは、１２株からなるナイセリア標本パネルについての、３つの 差引きバンクを用いたザザンブロットを示す。 − 図９、１０および１１は、Ｎｍ、ＮｌおよびＮｇに対する３つの差引きバン クのクローンの反応性を示す。 以下の実施例において、以下の材料および方法を用いた： 細菌株 − 差引きバンク構築のためには、ＮｍのＺ２４９１株（Ａｃｈｔｍａ ｎら、１９９１年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６４，３７５−３８２）、Ｍ Ｓ１１株（Ｓｗａｎｓｏｎら、１９７４年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１０， ６３３−６４４）およびＮｌの８０６４株および９７６４株を用いたが、検討し た種の他のいかなる株も使用可能なことはもちろんである。 これらバンクの特異性を確認するために、６株のＮｍ、４株のＮｇ、１株 のＮｌ（ナイセリア・ラクタミカ）および１株のＮｃ（ナイセリア・シネレア） を用いた。 ６株のＮｍは次のものである：、血清グループＡのＮｍ Ｚ２４９１、血清グ ループＣのＮｍ ８０１３（ＸＮコレクション）、血清グループに分類できない Ｎｍ １１２１（ＸＮコレクション）、血清グループＡのＮｍ １９１２（ＸＮ コレクション）、血清グループＡのＮｍ ７９７２（ＸＮコレクション）および 血清グループＢのＮｍ ８２１６（ＸＮコレクション）。 ４株のＮｇは次のものである：Ｎｇ ＭＳ１１（パスツール研究所、パリ）、 Ｎｇ４０３（パスツール研究所、パリ）、Ｎｇ ６９３４（パスツール研究所、 パリ）、Ｎｇ ＷＩ（播種性淋菌感染例から単離）、Ｎｇ ４Ｃ１、Ｎｇ ６４ ９３およびＮｇ ＦＡ１０９０。 Ｎｌ株はＮｌ ８０６４およびＮｌ ９７６４（ＸＮコレクション）であり、 Ｎｃ株はＮｃ ３２１６５（ＸＮコレクション）である。 分子遺伝学的手法 とくに断らない限り、使用した手法および試薬は、サンブルックら（Ｓａｍｂ ｒｏｏｋら、１９８９年、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マ ニュアル。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）により推 奨されているものに相応する。この検討において使用したオリゴデオキシヌクレ オチドは次のものである： 膜への転移（サザンブロット） 膜への転移は、正荷電ナイロン膜（ベーリンガー・マンハイム）へのキャピラ リー転移により実施した。ハイブリダイゼーションは、０．５Ｍ ＮａＰｉ、ｐ Ｈ７．２／１ｍＭ ＥＤＴＡ／７％ＳＤＳ／１％ＢＳＡを含有する溶液中、６５ ℃で実施した。膜の洗浄は、４０ｍＭ ＮａＰｉ、ｐＨ７．２／１ｍＭ ＥＤＴ Ａ／１％ＳＤＳを含有する溶液中で実施した。最終洗浄は、６５℃で５分間実施 した。 ｆｒｐＡの配列に基づいたオリゴヌクレオチドを用いて得られたプローブｆｒ ｐは、Ｚ２４９１株遺伝子５’末端の２．４ｋｂに相応するものである。完全遺 伝子に相応するプローブｏｐｃおよびロータマーゼは、発表されている配列に基 づいて作成したオリゴヌクレオチドを用いてＺ２４９１株から作成した。プロー ブｐｉｌＣ１およびｐｐｋ（ポリ燐酸キナーゼ）は、それぞれプラスミドｐＪＬ １およびｐＢｌｕｅＰＰＫ６００１の挿入片に相応したものである。実施例１：Ｎｍに存在するがＮｇには存在しないＤＮＡバンクの構築 ａ．「ＭｂｏＩ」バンク 構築 − Ｎｍ Ｚ２４９１のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＭｂｏＩにより切 断し、以下ＣＤＡ（包括的差分析、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）と呼ぶ方法に付し、これを２回反復した。この方 法は、Ｎｇ ＭＳＩ１１のＤＮＡを切断したものの過剰の存在下での差引きハイ ブリダイゼーションならびにＮｇ ＭＳ１１のＤＮＡとは有意の相同性を欠いて いるかまたはそれを示さないために再アニーリング(re-anneler)しうる髄膜炎菌 配列をもつもののＰＣＲによる増幅を包含する。 Ｎｇ ＭＳ１１株の染色体ＤＮＡを、皮下注射器を反復通過させてランダムに 切断し、サイズが３〜１０ｋｂの範囲内になるようにする。これらのＤＮＡ断片 をフェノール抽出により精製する。 Ｎｍ Ｚ２４９１の染色体ＤＮＡは、制限酵素ＭｂｏＩにより切断する。これ らのＤＮＡ断片（２０μｇ）を、１０ナノモルのアニーリングさせたオリゴヌク レオチドＲＢａｍ１２およびＲＢａｍ２４に連結する。過剰のプラ イマーを２％低融点アガロースゲル電気泳動により除去する。サイズが２００ｂ ｐを越える増幅断片を含有するゲル部分を切り出し、β−アガラーゼで消化する 。これらの断片をフェノール抽出により精製する。 差引きハイブリダイゼーション（第一回）の実施のために、オリゴヌクレオチ ドＲＢａｍに連結したＮｍ ＤＮＡの０．２μｇを、全量８ｍｌのＥＥ３Ｘ緩衝 液（ＥＥ１Ｘ緩衝液は、１０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン− Ｎ’−（プロパン−３−スルホン酸）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる。そのｐ Ｈは８．０である。）中で４０μｇのＮｇ ＤＮＡと混合する。この溶液を鉱油 で覆い、１００℃で２分間加熱してＤＮＡを変性させる。２μｌの５Ｍ ＮａＣ ｌを加え、混合物を５５℃で４８時間ハイブリダイズさせる。反応混合物を、Ｎ ａＣｌおよびＥＥ緩衝液からなる前もって加温した溶液で１／１０に希釈し、直 ちに氷上に置く。 この希釈液の１０μｌを、ＰＣＲ用反応混合物（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐ Ｈ９．０；５０ｍＭ ＫＣｌ；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．１％トライトンＸ １００；各々０．２５ｍＭの４種のデオキシヌクレオチド三燐酸；５０単位／ｍ ｌのＴａｑポリメラーゼ）４００μｌに加える。混合物を７０℃で３分間インキ ュベートし，て、髄膜炎菌ＤＮＡの再アニーリングした断片の末端を補って完全 化する。 ９４℃で５分間の変性およ、び１００μｌ当たり０．１ナノモルの割合でのオ リゴヌクレオチドＲＢａｍ２４の添加ののち、ハイブリダイゼーション産物をＰ ＣＲ（９４℃で１分間、７０℃で１分間および７２℃で３分間を３０サイクル、 続いて９４℃で１分間および７２℃で１０分間；パーキン・エルマ−ＧｅｎｅＡ ｍｐ ９６００）により増幅する。 増幅された髄膜炎菌断片を、プライマーおよび高分子量淋菌ＤＮＡのゲルで分 離する。それらをＭｂｏＩにより消化し、再度オリゴヌクレオチドＪＢａｍ１２ およびＪＢａｍ２４に連結する。これらの連結されたＤＮＡを再度ゲルおよびフ ェノール抽出により精製する。 ランダムに切断したＮｇ ＤＮＡ ４０μｇおよび第一回の差引きハイブリダ イゼーションから得られたＪＢａｍオリゴヌクレオチド連結ＤＮＡ ２ ５ｎｇについて二回目の差引きハイブリダイゼーションを実施する。この第二回 反復の時には、自己アニーリングしたＮｍ ＤＮＡの増幅を、オリゴヌクレオチ ドＪｂａｍ２４を用いて実施する。 特異性 − それらのＮｍ特異性を確認するために、第二回ＣＤＡ法反復後の 増幅された配列を標識し、６株の髄膜炎菌、４株の淋菌、１株のナイセリア・ラ クタミカおよび１株のナイセリア・シネレアからなるパネルに由来するＣｌａＩ 消化ＤＮＡに対するプローブとして用いる。 実施したサザンブロットにより、第二回ＣＤＡ法反復後の増幅された配列が髄 膜炎菌に相応する多くのバンドと強い反応性を示すが、Ｎｇ、Ｎｌ、Ｎｃの諸株 に相応するバンドとの反応性は示さないことが証明される。 それゆえ、「ＭｂｏＩ」バンクはＮｍ特異的であると思われる。 網羅性 − バンクの網羅性を検定するために、第一回および第二回のＣＤＡ 法の反復で生じた生成物の全体ならびにＮｍ Ｚ２４８１およびＮｇＭＳ１１の 初期染色体材料をアガロースゲル電気泳動に付し、膜に移し、髄膜炎菌特異的で あることが既知の遺伝子、すなわちｆｒｐ、ｏｐｃ、ロータマーゼを含むプロー ブと接触させる（サザンブロット）。 これらのハイブリダイゼーションから、Ｎｍ特異的遺伝子ｆｒｐがＭｂｏＩバ ンクにおいて６００ｂｐの断片により表されるが、ロータマーゼおよびｏｐｃ遺 伝子についてはいかなる活性も認められないという結果が得られる。それゆえ、 ＭｂｏＩバンクは、Ｎｍ特異的であるにも拘らず、網羅的であると考えることは できない。 しかしながら、高い特異性が得られたので、ＭｂｏＩバンクのためのＣＤＡ法 の第二回反復で生じた断片を、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ 部位にクローニングすることができる。 Ｎｍ特異的遺伝子のいずれかに対応する配列は、それが適当なサイズの制限断 片により担持されている場合にのみ、当該差引きバンク中に含まれうる。この条 件は、２つの因子によって左右される。第一に、より大きい断片が完全にＮｍ特 異的である確率は低い。第二に、そのような断片が存在していたとしても、断片 のサイズの増大とともに増幅効率が低下するというＰＣＲ 手法の限界のために、それら断片がバンク中に不十分にしか出現しない。約６０ ０ｂｐを越えるサイズの断片はバンク中に含まれない。Ｎｍ Ｚ２４９１の染色 体中に適当なサイズのＭｂｏ断片が存在しないために、ロータマーゼおよびｏｐ ｃ遺伝子はバンク中に含まれえない。いかなる酵素も、それ単独では、何らかの Ｎｍ特異的遺伝子に対応する小さい断片を製出することができない。それゆえ、 特異性の異なる別の制限酵素Ｔｓｐ５０９を用いて、第二のバンクを構築した。 ｂ．「Ｔｓｐ５０９１」バンク 構築 − 酵素Ｔｓｐ５０９１には、酵素ＭｂｏＩよりも小さいサイズ（約１ ｋｂ未満）の断片を製出することができるという利点がある。 Ｔｓｐ５０９Ｉは配列ＡＡＴＴを認識し、ＥｃｏＲＩに適合する４塩基配列を ５’突出端に残す。使用するオリゴヌクレオチドはＲｅｃｏ、ＪｅｃｏおよびＮ Ｅｃｏである。 従った方法は、上記「ＭｂｏＩ」バンクの構築のために従った方法と一致して いる。ただし、Ｔｓｐ５０９Ｉにより製出されたより低分子量断片の数がより多 いのを相殺するために、差引きハイブリダイゼーションの第一反復のために、よ り多量の髄膜炎菌ＤＮＡを用いた。第一反復のためには、４００ｎｇのＮｍ Ｄ ＮＡ断片を、第二反復のためには、２５ｎｇのＮｍ断片を、４０μｇのランダム 切断Ｎｇ ＤＮＡ断片とともに、差引きハイブリダイゼーションに付す。 この「Ｔｓｐ５０９Ｉ」バンクの構築のため、切断Ｎｇ ＤＮＡ ４０μｇお よびＴｓｐ５０９Ｉ消化と第二反復から得られた断片のアダプターＮＥｃｏへの 再連結とによって得られたＮｍ断片０．２ｎｇを用いて、対照として、差引きハ イブリダイゼーションの第三反復を実施する。 特異性 − 先のバンクについて記載した通りにして、ＣＤＡ法の第二反復で 生じた生成物を標識し、ナイセリア諸株からなるパネルに対するプローブとして 利用する。 図１Ａは、ＣＤＡ法の第二反復の生成物の、つぎのもののＣｌａＩ消化ＤＮＡ とのサザンブロットハイブリダイゼーションを示している：Ｎｍ（レー ンａ）、Ｎｇ ＭＳ１１（レーンｂ）、Ｎｍ ８０１３（レーンｃ）、Ｎｇ ４ ０３（レーンｄ）、Ｎｍ １１２１（レーンｅ）、Ｎｇ ６９３４（レーンｆ） 、Ｎｍ １９１２（レーンｇ）、Ｎｇ ＷＩ（ＤＧＩ株）（レーンｈ）、Ｎｍ ７９７２ （レーンｉ）、Ｎｌ ８０６４（レーンｊ）、Ｎｃ ３２１６５（レーンｋ）、 Ｎｍ ８２１６（レーンｌ）。 すべてのＮｍ株について観察された強い反応性とは反対に、Ｎｇ、Ｎｌおよび Ｎｃの諸株については弱い反応性が認められるかまたはいかなる反応性も認めら れない。 該バンクの特異性を、まず、ＣＤＡ法の３回の反復の各々から生じた生成物の 膜への転移（サザンブロット）をｐｉｌＣ１およびｐｐｋに相応するプローブと 反応させて調べた。これら２つの遺伝子はＮｍとＮｇとに共通している。 図１Ｂは、Ｔｓｐ５０９で消化したＮｍ Ｚ２４９１およびＮｇ ＭＳ１１の 染色体ならびにＣＤＡ法の反復の各々から生じた生成物の電気泳動後のアガロー スゲルを示している。 レーンａには、Ｎｍの染色体１μｇを、レーンｂにはＮｇの染色体１μｇを、 レーンｃにはＣＤＡの第一反復で生じた生成物０．１５μｇを、レーンｄには第 二反復で生じた生成物０．１μｇを、レーンｅには第三反復で生じた生成物０． ０５μｇを、それぞれ置いた。ＭＷは分子サイズマーカーを表している。 図１Ｃおよび１Ｄは、膜への転移（サザンブロット）およびｐｉｌＣ１（図１ Ｃ）およびｐｐｋ（図１Ｄ）とのハイブリダイゼーションののちの図１Ｂについ て記載したのと同様にして得られたゲルを表している。 ＣＤＡ法の第二反復ののち、遺伝子ｐｉｌＣ１およびｐｐｋに相応する配列は バンクから完全に排除されている。 網羅性 − 該バンクの網羅性を、差引きハイブリダイゼーションで生じた生 成物をＮｍ特異性の３遺伝子（ｆｒｐ、ロータマーゼおよびｏｐｃ）に相応する プローブと反応させることにより調べた。 これらのＮｍ特異性プローブは、差引きハイブリダイゼーションの第一および 第二反復で生じた増幅産物と反応する。 図１Ｅ、１Ｆおよび１Ｇは、膜への転移（サザンブロット）およびｆｒｐＡ（ 図１Ｅ）、ロータマーゼ（図１Ｆ）およびｏｐｃ（図１Ｇ）とのハイブリダイゼ ーションののちの図１Ｂについて記載したのと同様にして得られたゲルを表して いる。 しかし、差引きハイブリダイゼーションの第三反復は、Ｎｍ特異性配列の喪失 をもたらす。なぜなら、ロータマーゼ遺伝子およびｏｐｃ遺伝子と反応する断片 がこの第三反復には欠けるからである。 これらのデータの全体を考慮するとき、ＣＤＡ法の第二反復で生じた産物はＮ ｍ特異性であり、Ｎｍ特異性配列の網羅的バンクを構成してもいるということに なる。 この第二反復で生じた産物を、改めて、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの ＥｃｏＲＩ部位にクローニングする。 Ｔｓｐ５０９Ｉにより製出されたバンクは、酵素によるより小さい制限断片の 産生に基づく理論的考察から推測されるように、ＭｂｏＩにより産生されたバン クよりも網羅的である。 この見地からは、Ｔｓｐ５０９ＩバンクはＭｂｏＩバンクよりも冗長さがより 少ないこと、すなわちそれが包含するクローンの重複がより少ないことにも注目 すべきである。Ｔｓｐ５０９Ｉバンクの８６％が異なる配列に相応するが、Ｍｂ ｏＩバンクではクローンの４３％が異なる配列に対応するだけである（データは 示さない）。 それゆえ、Ｔｓｐ５０９１により製出されたバンクは、Ｎｍ特異的クローンの 源を構成する。実施例２：差引きバンクのクローンの分析 Ｎｍ特異的ＤＮＡのクローニングおよび配列決定 差引きバンクのＤＮＡを、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ（ ＭｂｏＩバンク）またはＥｃｏＲＩ（Ｔｓｐ５０９Ｉバンク）のレベルでクロー ニングしたのち、大腸菌ＤＨ５αを形質転換する。挿入片を、プラ イマーＭ１３−５０およびＭ１３−４０を用いて形質転換コロニーについてＰＣ Ｒを実施して増幅する。後者のプライマーはその５’末端がビオチニル化されて いる。 配列決定は、各ＰＣＲ産物につき、ビオチニル化された鎖とビオチニル化され ていない鎖を分離後、ストレプトアビジンを用いるダイナビーズＭ−２８０シス テム（ダイナール社、オスロ）を用いて実施した。それらの配列を、コンピュー タープログラムＢｌａｓｔｎおよびＢｌａｓｔｘ（ＮＣＢＩ、ＵＳＡおよびファ スタ）を用い、先に発表されている配列とのそれらの相同性に従って選別する。 上記の通りプライマーＭ１３−４０およびＭ１３−５０を使用した後の形質転換 細菌コロニーからのＰＣＲ産物を、ランダムプライミングによるα−³²Ｐ−ｄＣ ＴＰの組み込みにより標識し、上記の通りに、Ｎｍ Ｚ２４９１およびＮｇ Ｍ Ｓ１１株のＣｌａＩにより消化した染色体ＤＮＡの膜への転移のためのプローブ として使用して、それらの特異性を確認しようとした。 Ｎｍ Ｚ２４９１株染色体上のクローンの地図の作成 「ＭｂｏＩ」バンク（文字Ｂで表わす）の１７クローンおよび「Ｔｓｐ５０９ １」バンク（文字Ｅで表わす）の１６クローンを用いて実施した検討の結果を報 告する。これらのクローンの各々は、非反復配列を有しており、Ｎｇには対応す るものがない。 Ｎｍ特異性クローン産物に対応するＤＮＡの配列の位置を、パルスフィールド 電気泳動（ＰＦＧＥ）に付したアガロースゲルの膜への転移（サザンブロット） を用い、発表されでいるＮｍ Ｚ２４９１の染色体地図（Ｄｅｍｐｓｅｙら、１ ９９５年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，６３９０−６４００）と比較し、 決定した。 それらＮｍ特異的クローンを、稀な切断部位を示す酵素、すなわちＰａｃＩ、 ＰｍｅＩ、ＳｇｆＩ、ＢｇＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩおよびＳｇｆＩで消化し たＮｍ Ｚ２４９１のＤＮＡの膜上でのハイブリダイゼーション（サザンブロッ ト）のためのプローブとして利用する。 ゲル（２０×２０ｃｍ）は、ＴＢＥ ０．５Ｘ緩衝液中の１％アガロース ゲルで、５秒と３５秒との間で直線状に変動するパルスタイムに従い、６Ｖ／ｃ ｍで３６時間電気泳動に付した。 膜上でのハイブリダイゼーション（サザンブロット）は、先に記載した通りに 実施した。 得られた結果を図２に示す：発表されている地図上の対応するサイズの断片の 位置と比較して、反応性が局在化されていた。Ｄｅｍｐｓｅｙら（先に引用）に より地図に記入された遺伝標識形質（マーカー）の全体の位置は、線状染色体地 図上に点によって表示してある。先行開示されているＮｍに特異的な遺伝子は星 印によって示されている。「ｆｒｐ」と呼ばれる２つの座は、ｆｒｐＡおよびｆ ｒｐＣ遺伝子に相応する。「ｐｉｌＣ」座（複数）はｐｉｌＣ１およびｐｉｌＣ ２遺伝子に相応し、これら遺伝子は相同性遺伝子対であるが、地図上では区別さ れていない。本発明のＮｍに特異的なクローンの位置の正確さは、反応性制限断 片の一部が重なり合うことによる。平均して、その位置は＋／−２０ｋｂである 。 この地図作成は、Ｎｍに特異的な配列のランダムではない分布を明らかにして いる。Ｎｍに特異的な配列の大部分は、異なる３群に属している。これらの群の １つ（領域１）は、先に記述した莢膜に関係する遺伝子の位置に相応している。 下記が識別される： − Ｅ１０９、Ｅ１３８、Ｂ２３０およびＢ３２３を領域１であるとして、 − Ｂ３２２、Ｂ２２０、Ｂ１０８、Ｂ１３２、Ｂ２３３、Ｂ３２８、Ｅ１３９ 、Ｅ１４５およびＢ１０１を領域２であるとして、そして、 − Ｂ３０６、Ｅ１１４、Ｅ１１５、Ｅ１２４、Ｅ１４６、Ｅ１２０、Ｅ１０７ 、Ｅ１３７およびＥ１４２を領域３であるとして。 髄膜炎菌に特異的であると確認された配列の６３％が、これら３つの異なる領域 の内部に局在している。 この結集は、先行開示されているＮｍに特異的な遺伝子（ｆｒｐＡ）ｆｒｐｃ 、ｐｏｒＡ、ｏｐｃおよび莢膜に関係する領域）の分布と対照をなしている。 この先行技術は、実際、Ｎｍに特異的な遺伝子が、機能的に莢膜に関係す る遺伝子を除いて、染色体に沿って分散していることを示唆していた。 染色体上のＮｍに特異的な配列の地図作成は、先行技術と比較して予想できな い結果へと導いている。 検討した髄膜炎菌株と淋菌株との間の遺伝的差の大部分は、異なる３つの群に 結集されている。 領域１は、髄膜炎菌の莢膜に関連する遺伝子を結集している。 他の領域の遺伝子の機能は未知であるが、発表されている配列との相同性（表 １）は、領域３のいくつかの遺伝子とバクテリオファージのトランスポザーゼ蛋 白質および調節蛋白質との間の類似性を示唆している。いかなる髄膜炎菌ウイル スも確認されておらず、これらの配列がファージ起源のものであろうと想像する のは魅力的なことである。興味あることに、インフルエンザ菌のゲノムも、ファ ージＭｕの調節蛋白質Ｎｅｒの配列と相同性の配列を含んでいるが、機能的遺伝 子であるかどうかは未知である。 クローンＢ２０８は、ＴｏｎＢ依存性のフェリックシデロフォアに結合する蛋 白質のクラス中に保存されている領域のクローン（ドメインＩＩＩ）と高い相同 性（３３アミノ酸について４８％同一、９１％相同）を示す。 このクローンがＮｍに特異的な遺伝子ｐｏｒＡならびにｆｅｒ ｆｒｐ（鉄） により調節される遺伝子に近接していること、およびとくにそれが外膜表面に露 出したＮｍに特異的な受容体蛋白質である可能性は、それをさらに詳しく研究す るためのよき候補ならしめる。 クローンＢ３３９は、Ｎｍに特異的な挿入配列ＩＳ１１０６に相応する。 クローンＢ１３４とアエロモナス(Aeromonas)の挿入配列との間のわずかな相 同性ならびにＮｍの種々の株の間でのクローンＢ１３４の重複コピーの存在は、 それが新しいタイブのＮｍ特異性挿入配列を表わしている可能性を示唆する。 Ｎｍに特異的なクローンを含む領域が大腸菌およびペスト菌について先に記述 した通りの病原性区画に相応する可能性は、とくに興味あるものである。 この発明において単離されたクローンは、より大きい染色体断片のクロー ニングおよび配列決定を可能ならしめることにより、そして直接的に、遺伝子座 変異のためのそれらの利用により、Ｎｍ特異的領域の直接関連性をよりよく理解 することを可能ならしめる。 最後に、微生物の病原性に関与している可能性のある髄膜炎菌特異性遺伝子を 検出することにより、抗髄膜炎菌ワクチンの利用できる適切な抗原に照準を当て ることが可能になる。 本発明方法の有効性および迅速性のため、似通った２つの病原体に固有の表現 型の原因となっている遺伝的差を探究する多くの場面で該方法を使用することが 可能となる。 ナイセリア諸株からなるバネルに対する領域１、２および３のクローンの反応 性の検討 クローンの各々の挿入断片に対応するＰＣＲ産物を集め、Ｎｍ、Ｎｇ、Ｎｌお よびＮｃの諸株からなるパネルに対する膜上ハイブリダイゼーション（サザンブ ロット）のプローブとして使用した。 領域１および２は、髄膜炎菌の各々について限られた数のバンドを生じさせる 。このことは、これらの領域が、Ｎｍに特異的であると同時に、髄膜炎菌のすべ てに共通していることを示唆している。 図３は、ナイセリア諸株からなるパネルに対する領域１、２および３のクロー ンの反応性を示している。領域１（図３Ａ）、領域２（図３Ｂ）および領域３（ 図３Ｃ）のクローンを同時に、髄膜炎菌、淋菌からなるパネルならびにＮｌおよ びＮｃの各１株に対するプローブとして用いた。 レーンはつぎの通りである：レーンａがＮｍ Ｚ２４９１の、レーンｂがＮｇ ＭＳ１１の、レーンｃがＮｍ ８０１３の、レーンｄがＮｇ ４０３の、レーン ｅがＮｍ １１２１の、レーンｆがＮｇ ６９３４の、レーンｇがＮｍ １９１ ２の、レーンｈ［がＮｇ ＷＩ （ＤＧＩ株）の、レーンｉがＮｍ ７９７２の 、レーンｊがＮｌ ８０６４の、レーンｋがＮｃ ３２１６５の、レーンｌがＮ ｍ ８２１６の各ＤＮＡ。 見事なことに、領域３は血清グループＡの髄膜炎菌のみと反応性を示す。 この領域３は、それゆえ、Ｎｍのサブグループに特異的である。 クローン化された領域の可能性ある機能を評価するために、データバンクで既 知の配列との比較を実施した。 つぎの表１は、染色体地図上の特異的クローンの位置および既知配列との相同 性を示している。 括弧内は、プログラムＢｌａｓｔｘにより与えられたままの見出された相同性の 有意性である。 ＊）指数「１」、「２」または「３」の付されたクローンはそれぞれ髄膜炎菌Ｚ ２４９１の染色体の領域「１」、「２」または「３」のものである。＋）Ｅ１０ ９とＥ１３８とは隣接クローンである。§）Ｂ３０６とＥ１１５とは一部が重な り合っている。＃）Ｂ２３６はａｒｇＦ領域で弱い反応性を示しもする。ｑ）ク ローンＥ１０３はＴｓｐ５０９Ｉ部位を含み、従って、２つの挿入断片を含みう るが、それは髄膜炎菌Ｚ２４９１の染色体のＣｌａＩ（Ｏｋｓ）断片としか反応 せず、地図上で１つの位置しか占めないので、ここにはこのクローンが含められ ている。 まず最初に、領域１のクローンがすべて莢膜の生合成に関与する遺伝子に相応 していることがわかる。これらの遺伝子は、先に、血清グループＢのＮｍのあい だで研究されている（Ｆｒｏｓｃｈら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１６６９−１６７３およびＦｒｏｓｃｈら、１９ ９３年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８，４８３−４９３）。 セラチア．マルセセンス（Serratia marcescens）の溶血素活性化物質との弱 い相同性を除けば、領域２のクローンは、ＤＮＡレベルでも蛋白質レベルでも、 発表されている配列とはいかなる有意の相同性も示さない。 領域３のクローンの２つは、ＤＮＡに結合する蛋白質、とくにバクテリオファ ージの調節蛋白質およびトランスポザーゼ蛋白質との興味ある相同性を示す。 クローンＢ２０８は、あるクラスの受容体（ＴｏｎＢ依存性フェリックシデロ フオア）中に保存された領域の１つと強い相同性を示す。 クローンＢ１３４およびＢ３３９は、染色体の多く（それぞれ少なくとも５つ および少なくとも８つ）の領域とハイブリダイズする。 配列に関するデータは、クローンＢ３３９がＮｍに特異的な挿入配列Ｓ１１０ ６に相応することを示している。 クローンＢ１４３の翻訳産物は、アエロモナス(Aeromonas)の１つの挿入配列 （ＳＡＳ２）のトランスポザーゼ（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎら、１９９４年、Ｊ．Ｍ ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３７，４５２−４６３）と限られた相同性を示す。我々は、 膜への転移（サザンブロット）により、このクローンが、試験したパネルの各髄 膜炎菌の染色体中の重複コピーとして存在するＮｍに特異的な存在であることを 証明できた。 他のクローンは、発表されているナイセリアの配列と有意の相同性を示さず、 しかも、発表されているいかなる配列とも相同性を示さない。それゆえ、これら のクローンは、単離された他のクローンの大部分とともに、全く新規なＮｍ特異 的遺伝子座のバンクを構成する。実施例３ ：Ｎｍ染色体の領域２の研究 領域２の配列決定および特性描写 血清グループＡ、サブグループＩＶ−１のＺ２４９１株の染色体ＤＮＡを用い てのＰＣＲによる増幅を、領域２のクローンの配列の各々から作成したオリゴヌ クレオチドプローブを用い、多くの異なる組合せに従って、実施する。チェイン ターミネーター手法ならびに自動配列決定（ＡＢＩ３７３または３７７）を利用 し、２本鎖から出発して、重なり合うＰＣＲ産物の配列を決定する。 すぐに使用できるクローンの限界を越えて配列を延長するために、Ｚ２４９１ 株の１５ｋｂのＳａｕＩＩＩＡ部分断片をラムダＤＡＳＨ−ＩＩ（ストラタジー ン）中にクローン化する。 領域２に重なる挿入断片を含むファージを、この領域のクローンをプローブと したハイブリダイゼーションにより確認する。挿入ＤＮＡを、挿入断片の両末端 から配列決定し、これらの配列を、ファージＤＮＡを増幅しないで直接染色体Ｄ ＮＡを増幅するのに役立つ新規なプライマーを作成するのに利用する。 これら新規プライマーおよび以前から利用可能な配列のプライマーを用いるこ とにより、染色体ＤＮＡの増幅が達成される。 これらのＰＣＲ産物も、２本鎖から出発して配列を決定する。これにより 、１５６２０ｂｐの完全配列に至る（配列番号３６）。この配列の、ＡＴＧまた はＧＴＧで始まり、高いコドン使用率により特徴付けられる読み取り枠を分析す る。この分析により、１５６２０ｂｐの配列の大部分を満たす７つのＯＲＦ（op en reading frame）が明らかになる。これらのＯＲＦはつぎのものである： ORF-1:1330から2970(配列番号37):ORF-2:3083から9025(配列番号38);ORF-3: 9044から9472(配列番号39):ORF-4:9620から12118(配列番号40);ORF-5:12118から 12603(配列番号42);ORF-6:12794から13063(配列番号43);ORF-7:13297から14235( 配列番号44);およびORF-8:14241から15173(配列番号45)． ＯＲＦ−４は、コドンＧＴＧで始まり、同じ読み枠（１０１２７−１２１１８ 、フレーム２）中のそれよりもわずかに小さくてコドンＡＴＧに始まるＯＲＦ（ 配列番号４１）に重なる。 ＯＲＦ−４は、細菌毒素（ピオシン、コリシン）または細菌の真核細胞蛋白質 への接着に関与する表面蛋白質であるピオシン（緑膿菌）、コリシンおよびイン チミン（大腸菌）を包含するポリペプチドファミリーと構造上の相同性を示す蛋 白質をコードする。ＯＲＦ−７は、配列中に潜在的膜貫通領域を含み、細菌のペ リプラズム蛋白質または外膜中にはさみ込まれる蛋白質と構造上の相同性を示す 蛋白質をコードする。ＯＲＦ−４およびＯＲＦ−７の構造上の相同性は、プログ ラムＰｒｏｐＳｅａｒｃｈを用いて確認した。 プログラムＢＬＡＳＴを用いてのＧｅｎＢａｎｋ中の他のＯＲＦと相同性の配 列の検索により、ＯＲＦ−２のＮ末端領域と百日咳菌の繊維状ヘマグルチニンＢ との間の相同性（３５２アミノ酸について類似４３％、同行３６％）およびＯＲ Ｆ−１と百日咳菌のｆｈａＣｄｅ蛋白質との間の相同性（４０１アミノ酸につい て類似３５％、同−２７％）が明らかにされた。ＯＲＦ−１とＯＲＦ−２とは、 Ｚ２４９１株中での隣接遺伝子であり、百日咳菌の繊維状ヘマグルチニンＢとｆ ｈａＣとは百日咳菌中での隣接遺伝子であり、こ のことは、これらの相同性が機能上の相同性を反映している可能性を強めるもの である。 Ｎｍに対する領域２の特異性の確認 領域２の諸クローンの配列から出発して作成したオリゴヌクレオチドプライマ ーを用いて領域２のいろいろな部分のＰＣＲによる増幅によって得られたＤＮＡ プローブを用いて、サザンブロットを実施した。 図４に、これらオリゴヌクレオチドのおおよその位置を示した。 ＯＲＦ−１の半分には、Ｒ２００１（配列番号４６）およびＲ２００２（配列 番号４７）と呼ぶオリゴヌクレオチドが、ＯＲＦ−１の半分＋ＯＲＦ−２の大部 分には、オリゴヌクレオチドＢ３３２ａ（配列番号４８）、ｅ１３９ａ（配列番 号４９）、ｂ１３２ａ（配列番号５０）およびｂ２３３ｂ（配列番号５１）が、 ＯＲＦ−４の１／３＋ＯＲＦ−５〜７には、オリゴヌクレオチドｅ１４５ａ（配 列番号５２）およびｂ１０１ａ（配列番号５３）がある。 つぎのハイブリダイゼージョン条件のもとで３回のサザンブロットを実施する ： ６５℃で１６時間、 ＮａＰＯ₄ ０．５Ｍ、ｐＨ７．２ ＥＤＴＡ−Ｎａ ０．００１Ｍ ドデシル硫酸ナトリウム１％。 洗浄のためには、６５℃で１０分間加熱し、０．５Ｍ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７． ２；０．００１Ｍ ＥＤＴＡ−Ｎａ、１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いる。 図５、６および７は、それぞれ、上に述べたＯＲＦ部分の各々を用いて得られ たサザンブロットを示している。 サザンブロットの各々において、１４のレーンはそれぞれ下記に対応している ： １：ＭＳ１１（Ｎｇ） ２：４０３（Ｎｇ） ３：ＦＡ１０９０（Ｎｇ） ４：Ｗ１（Ｎｇ） ５：６４９３（Ｎｇ） ６：マーカー（ラムダＨｉｎｄＩＩＩ） ７：Ｚ２４９１（Ｎｍ，グループＡ） ８：７９７２（Ｎｍ グループＡ） ９：８０１３（Ｎｍ，グループＣ） １０：１１２１（グループ分けできないＮｍ） １１：１９１２（Ｎｍ，グループＢ） １３：３２１６５（Ｎｃ） １４：８０６４（Ｎｌ） これらの実験ではナイセリア諸株からなるパネルを用い、各々のウエルには類 似した量の消化ＤＮＡを加えているから、これら３回のサザンブロットは、領域 ２に相応する配列が試験した髄膜炎菌のすべてにあること、および試験した諸株 のＮｇのゲノム中には有意の相同性配列がないことをはっきりと示している。実施例４ ：Ｎｍのゲノムの、Ｎｌにはなく、Ｎｇとは共通の領域の同定 実施例１に記載した手法に従い、ただし１株のＮｍ（Ｚ２４９１）および２株 のＮｌ（ＸＮコレクション）用い、同量のＤＮＡを混合して、操作する。 ＲおよびＪのプライマー系列を用いて２回の差引きを実施する。このようにし て、３つの異なるバンクを構築する。 ＢａｍおよびＥｃｏと呼ぶ２つのバンクは、それぞれ、Ｎｍ Ｚ２４９１の染 色体ＤＮＡをＭｂｏＩおよびＴｓｐ５０９１により消化することによって得る； Ｎｍの染色体ＤＮＡのＭｓｐＩ消化に由来するＣｌａと呼ぶ第三のバンクは、プ ライマーＲＭｓｐ１０、ＲＭｓｐ２４、ＪＭｓｐ１０およびＪＭｓｐ２４のセッ トを用いて得る。使用プライマーの集合を、つぎの表２に示す。 ２回の差引きののち、各増幅産物全体を標識し、プローブとして利用する。 それらの差引きバンクのチェックを、１２株のナイセリア（ＣｌａＩ切断染色 体ＤＮＡ）からなるパネルについてサザンブロットにより実施する。ハ イブリダイゼーション条件は、実施例１で示したものと同一である。 これらのサザンブロットを図８Ａ〜８Ｃに示す。それらの図はそれぞれ、Ｍｂ ｏＩ／ＢａｍＨＩバンク、ＭｓｐＩ／ＣｌａＩバンクおよびＴｓｐ５０９１／Ｅ ｃｏＲＩバンクに対応している。 １２のレーンはそれぞれ下記に対応している： 1:Nm z2491（グループA） 2:N1 8064 3:Nm 8216（グループB） 4:N1 9764 5:Nm 8013（グループC） 6:Ng MS11 7:Nm 1912（グループA） 8:Ng 4C1 9:Nm 1121（グループ分けできない） 10:Ng FA1090 11:Nc 32165 12:Nm 7972（グループA）． サザンブロット試験は、各バンクに含まれている配列がＮｍに特異的であり、 Ｎｌにはないことを示している。さらに、Ｎｇの諸株を用いて観察された反応性 は、これら配列のいくつかがＮｇに存在することを示唆している。 これらのバンクの各々をつぎに、Ｂａｍの場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの ＢａｍＨＩ部位に、Ｅｃｏの場合にはＥｃｏＲＩ部位に、Ｃｌａの場合にはＣｌ ａＩ部位にクローン化した。それらクローンのＮｍゲノムに対する特異性を確認 するために、個々のクローンの制限およびそれらの放射性標識を実施した。Ｎｍ およびＮｇに対して同時に反応性を示すクローンを、のちの研究のために保存し た。これらのクローンを図９、１０および１１に示す。それらの図は、Ｎｍ、Ｎ ｌおよびＮｇに対するＢａｍバンクの５クローン（図９）、Ｅｃｏバンクの１６ クローン（図１０）およびＣｌａバンクの１３クローン（図１１）のプロフィー ルを示している。 普遍プライマーおよび逆方向プライマーを用いて、これらのクローンの配列を 決定した。以下の通りである： − Ｂａｍクローン １４０ｂｐの不完全Ｂ１１（配列番号６６）、４２５ｂｐと推定される不完全Ｂ １３（配列番号６７）、１８１ｂｐのＢ２６（配列番号６８）、３０７ｂｐのＢ ３３（配列番号６９）、２４３ｂｐのＢ４０（配列番号７０）、 − Ｃｌａクローン ２８０ｂｐのＣ１６（配列番号７２）、３６５ｂｐと推定される不完全Ｃ２０（ 配列番号７３）、６４５ｂｐと推定される不完全Ｃ２４（配列番号７４）、２４ ５ｂｐと推定される不完全Ｃ２９（配列番号７５）、３８１ｂｐのＣ３４（配列 番号７６）、２６９ｂｐのＣ４０（配列番号７７）、２０３ｂｐのＣ４２（配列 番号７８）、２２９ｂｐのｐ Ｃ４３（配列番号７９）、２０６ｂｐのＣ４５（ 配列番号８０）、２２４ｂｐのＣ４７（配列番号８１）、２１２ｂｐのＣ６２（ 配列番号８２）および９００ｂｐと推定されるＣ１３０（５’．．．）（配列番 号８３）ならびに − Ｅｃｏクローン ３０８ｂｐのＥ２（配列番号８４）、１７０ｂｐと推定される不完全Ｅ５（配列 番号８５）、３００ｂｐと推定される不完全Ｅ２２（配列番号８６）、２７３ｂ ｐのＥ２３（配列番号８７）、２７１ｂｐのＥ２４（配列番号８８）、２６８ｂ ｐのＥ２９（配列番号８９）、２７５ｂｐと推定される不完全Ｅ３３（配列番号 ９０）、３６５ｂｐと推定される不完全Ｅ３４（配列番号９１）、２６０ｂｐの Ｅ４５（配列番号９２）、３８０ｂｐを越えると推定されるＥ５９（配列番号９ ３）、３０８ｂｐのＥ７８（配列番号９４）、２８６ｂｐのＥ８５（配列番号９ ５）、２３８ｂｐのＥ８７（配列番号９６）、３２０ｂｐを越える不完全Ｅ９４ （配列番号９７）、３２０ｂｐを越える不完全Ｅ１０３（配列番号９８）および ２１７ｂｐのＥ１１０（配列番号９９）。 各々のクローンの地図作成を、Ｎｍ Ｚ２４９１の染色体上で、実施例２で記 載した通りにして実施した。得られた結果を、図２の右側部分に示す。 これらのクローンが４および５と呼ぶ領域に対応することが確認される。それゆ え、これらの領域は、ＮｍおよびＮｇに同時に存在するがＮｌにはない配列から 構成されれいる。従って、それらは、初期のすみつきと粘膜貫通の原因となる病 毒因子をコードする配列であると考えられる。領域４は、Ｎｍ ２４９１の染色 体上のａｒｇＦとｒｅｇＦとの間に、領域５はラムダマーカー３７５とｐｅｎＡ との間に位置している。この領域は、おそらく、変異体Ｏｐａおよびトランスフ ェリン結合蛋白質をコードする配列を含んでいると思われる。 データバンクの既知の配列との比較から、５０％の確率で、領域４中ではクロ ーンＣ１３０のみが相同性を、すなわちＭｓｐＩメチラーゼと相同性を示す。領 域５では、クローンＣ８、Ｅ２、Ｂ４０、Ｃ４５、Ｅ２３およびＥ１０３につい て、いかなる既知配列との相同性も見出されなかった。他のクローンについての 相同性はつぎの通りである： Ｂ１１ アルギニンデカルボキシラーゼＳｐｅＡ；Ｃ２９ アルギニンデカル ボキシラーゼＳｐｅＡ；Ｃ６２ オキソグルタル酸／リンゴ酸トランスポーター ；反復ＤＮＡエレメント；Ｅ３４ ＤＮＡの反復エレメント；Ｅ９４ マウスエ ンドペプチダーゼＭｅｐＡ；Ｃ４７ クエン酸シンターゼＰｒｐＣ；Ｅ７８ ク エン酸シンターゼＰｒｐＣ実施例５：生体試料中に１つ以上の髄膜炎菌株が存在することの証明 脳脊髄液、尿、血液、唾液タイプの生体試料を採取する。 濾過および抽出ののち、この試料中に存在するＤＮＡをゲル電気泳動に付し、 サザンブロッティングにより膜へ移行させる。 配列番号５の³²Ｐ標識により構成されたヌクレオチドプローブをこの転移膜と ともにインキュベートする。 オートラジオグラフィーののち、反応性バンド（単数または複数）の存在によ り、試料中の髄膜炎菌の存在を診断できる。実施例６：抗髄膜炎菌を目的とした予防をそのスペクトル中に含み、あらゆる形 態の髄膜炎菌感染を防止するためのワクチン組成物 配列番号１０を含む配列によりコードされたペプチドは毒素に結合される 。 そこで、この結合ペプチドを、抗ヘモフィルスおよび抗肺炎双球菌ワクチンま たは他の任意の小児用ワクチンを含有する組成物に加える。 生じた組成物は、滅菌後、非経口的に、皮下にまたは筋肉内に注射できる。 この同じ組成物を、噴霧によって粘膜に適用することもできる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ０７Ｋ 14/22 Ｃ０７Ｋ 14/22 16/22 16/22 16/42 16/42 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 スミスクライン ビーチャム イギリス国 ミドルセックス ティー ダ ブリュー ８ ９ イー ピー ブレント フォート ニュー ホライズンズ コート （番地なし) (72)発明者 ナシフ ザビエル フランス国 パリー 75015 リュ ラブ ルースト 30 (72)発明者 タンスレー コラン フランス国 パリー 75015 リュ ドゥ ボジラール 156 (72)発明者 アハトマン マルク ドイツ連邦共和国 ベルリン 10969 ノ イエンブルガーシュトラーセ 16 (72)発明者 リュエル ジャン ルイ ベルギー国 リマル 1300 レジダーンス ドゥ ラ リル 18 (72)発明者 ヴィナル カーラ ベルギー国 リエージュ 4000 リュ デ ザカシア 30 (72)発明者 メルカー ペトラ ドイツ連邦共和国 ベルリン 10997 キ ュヴリーシュトラーセ 38

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．髄膜炎菌（以下Ｎｍと表示）に存在するが淋菌（以下Ｎｇと表示）にもナ イセリア・ラクタミカ（以下Ｎｌと表示）にも存在しないところの、読み取り相 をもつ遺伝子（ただし、多糖性莢膜、ｆｒｐＡ、ｆｒｐＣ、ｏｐｃ、ｐｏｒＡ、 ロータマーゼ、配列ＩＳ１１０６、ＩｇＡプロテアーゼ、ピリン、ＰｉｌＣ、ト ランスフェリンに結合する蛋白質、および混濁蛋白質の生合成に関わる遺伝子を 除く）の全部または一部であることを特徴とするＤＮＡ。 ２．Ｎｍには存在するが、Ｎｇには存在しないことを特徴とする請求項１記載 のＤＮＡ。 ３．Ｎｍ Ｚ２４９１の染色体上のｔｕｆＡとｐｉｌＴとの間、すなわち該染 色体の領域１に存在する１つ以上の配列および／または該配列とハイブリダイズ しうる１つ以上のヌクレオチド配列を含有することを特徴とする請求項２記載の ＤＮＡ。 ４．Ｎｍ Ｚ２４９１の染色体上のｐｉｌＱとλ７４０との間、すなわち該染 色体の領域２に存在する１つ以上の配列および／または該配列とハイブリダイズ しうるヌクレオチド配列を含有することを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ。 ５．Ｎｍ Ｚ２４９１の染色体上のａｒｇＦとｏｐａＢとの間、すなわち該染 色体の領域３に存在する１つ以上の配列および／または該配列とハイブリダイズ しうるヌクレオチド配列を含有することを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ。 ６．それの配列の全部または一部が、配列番号９、１３、２２または３０に相 当し、および／または、配列全体として、あるＮｍ株の染色体上のこの配列番号 の前後２０ｋｂ以内に位置し、および／または、これらの配列のいずれかの少な くとも１つの断片とハイブリダイズしうることを特徴とする請求項３記載のＤＮ Ａ。 ７．それの配列の全部または一部が、配列番号１、２、４、６、７、１０、１ ５、３１または３４に相当し、および／または、配列全体として、ある Ｎｍ株の染色体上のこれら配列番号の前後２０ｋｂ以内に位置し、および／また は、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうるこ とを特徴とする請求項４記載のＤＮＡ。 ８．配列番号３６のＤＮＡ配列の全部または一部あるいは配列番号３７、配列 番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番 号４３、配列番号４４、配列番号４５の読み取り枠（オープンリーディングフレ ーム）に相当する、および／または配列全体として、あるＮｍ株の染色体上のこ れら配列番号の前後２０ｋｂ以内に位置する、および／または、これらの配列の いずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうる配列の全部または一部 であることを特徴とする請求項４記載のＤＮＡ。 ９．それの配列の全部または一部が、配列番号８、２１、２３、２５、２６、 ２８、２９、３２または３５に相当し、および／または、配列全体として、ある Ｎｍ株の染色体上のこれら配列番号の前後２０ｋｂ以内に位置し、および／また は、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブリダイズしうるこ とを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ。 １０．それの配列の全部または一部が、配列番号３、５、１１、１２、１４、 １６、１８、１９、２０、２４、２７または３３に相当し、および／または、配 列全体として、あるＮｍ株の染色体上のこの配列番号の前後２０ｋｂ以内に位置 し、および／または、これらの配列のいずれかの少なくとも１つの断片とハイブ リダイズしうることを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ。 １１．Ｎｇのそれらとは共通であるが、Ｎｌには存在しないことを特徴とする 請求項１記載のＤＮＡ。 １２．Ｎｍ Ｚ２４９１の染色体上のａｒｇＪとｒｅｇＦとの間、すなわち該 染色体の領域４に存在ずる１つ以上の配列および／または該配列とハイブリダイ ズしうるフクレオヂド配列を含有することを特徴とする請求項１１記載のＤＮＡ 。 １３．Ｎｍ Ｚ２４９１の染色体上のラムダ３７５とｐｅｎＡとの間、す なわち該染色体の領域５に存在する１つ以上の配列および／または該配列とハイ ブリダイズしうるフクレオチド配列を含有することを特徴とする請求項１１記載 のＤＮＡ。 １４．細胞膜を越えて運び出される蛋白質をコードしていることを特徴とする 上記請求項のいずれか記載のＤＮＡ。 １５．それの配列の全部または一部がＮｍ種中に保存されている領域に相当す ることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか記載のＤＮＡ。 １６．コスミド、プラスミド、バクテリオファージなどの伝達ベクターまたは 発現ベクター中に挿入されていることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記 載のＤＮＡ。 １７．請求項１〜１５のいずれか記載の少なくとも１つのＤＮＡの挿入によっ て形質転換されている宿主細胞、とくに細菌細胞またはＮｍ細胞。 １８．染色体から請求項１〜１５のいずれか記載の少なくとも１つのＤＮＡ、 とくに病原性の原因であるＤＮＡが欠失しているところのＮｍに特異的な遺伝子 またはそれらの断片を含む細胞、とくに細菌細胞またはＮｍ細胞。 １９．それの配列の全部または一部が請求項１〜１５のいずれか記載の少なく とも１つのＤＮＡ配列またはその断片の転写物に相当することを特徴とするＲＮ Ａ。 ２０．それの配列が、請求項１〜１５または１９のいずれか記載の少なくとも １つのヌクレオチド配列またはかかる配列の断片のアンチセンスに相当し、それ らが場合によりメチル基および／またはグリコシル基などの少なくとも１つの化 学的置換基を有することを特徴とするアンチセンス核酸。 ２１．請求項１〜１５または１９のいずれかに定義した核酸によりコードされ ているかまたはそれら核酸の配列から演鐸しうる配列の全部または一部に相当す るアミノ酸鎖を示[.、場合により、天然ポリペプチドで認められる生化学的性質 を変えない限りにおいて、コードされているまたは演鐸される配列に比して修飾 されていでもよいポリペプチド。 ２２．細胞膜を越えて運び出されるペプチド、とくに請求項１４記載のＤ ＮＡによりコードされているものに全部または一部が相当するペプチドであるこ とを特徴とする請求項２１記載のペプチド。 ２３．請求項２０または２１記載のペプチドの少なくとも１つのエピトープに 対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体もしくはこれらの抗体の断片、 とくにＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２断片、あるいは抗原−抗体型反応に従って該抗 体またはそれらの断片を認識しうる抗抗体であることを特徴とする抗体。 ２４．− ２つのＤＮＡ集団の混合、 − 差引き（サブトラクティヴ）ハイブリダイゼーション−増幅の少なくとも１ 回の反復および − 所望のＤＮＡ（単数または複数）の回収およびそれに続く場合によってのそ れらの精製および余分な配列の除去 を包含する髄膜炎菌に特異的なＤＮＡバンク（ライブラリー）の取得方法。 ２５．Ｎｇに比してＮｍに特異的なバンクを得るために、 − それのために特異的バンクを構築すべき１つの髄膜炎菌株、すなわち基準株 および１つの淋菌株、すなわち差引き株にそれぞれ由来する２つのＤＮＡ集団を 混合すること、それらの株のＤＮＡ配列は、 ・該差引き株の染色体ＤＮＡの、とりわけ注射器を反復通過させることによる、 ランダム切断および ・基準株の染色体ＤＮＡの、好ましくは約１ｋｂ未満の大きさの断片を生じる制 限酵素による、切断により得られたものであること、およびＮｍとＮｇとには共 通であるが、Ｎ１に比しては特異的なＤＮＡバンクを得るために、３つの異なる バンクを、２つはＮｍの染色体ＤＮＡのＭｂｏＩおよびＴｓｐ５０９１による消 化によって、第三のものはＮｍの染色体ＤＮＡのＭｓｐＩによる消化によって、 構築し、２系列の差引きを実施し、求める特異性を示すＤＮＡを回収すること を特徴とする請求項２４記載の方法。 ２６．請求項２４または２５記載の方法を実施して得られたＤＮＡクローンバ ンク。 ２７．遺伝的に近い他の種または他の変異体が存在し、異なる病原性を発現す るときに、所与の細胞または同種細胞の所与の変異体の特異的なＤＮＡバンク、 とくにクリプトコックス、ヘモフィルス、肺炎双球菌または大腸菌に特異的なＤ ＮＡバンクを取得するために、請求項２４記載の方法を適用すること。 ２８．生体試料中の髄膜炎菌の存在を証明することによって髄膜炎菌感染、と くに髄膜炎菌性髄膜炎を診断する方法であって、 − 請求項１〜１５または１９に定義した少なくとも１種の核酸から出発して作 成した、場合によりヌクレオチドプローブまたはプライマーの形の、試薬、もし くは変形として、請求項２３に定義した抗体または抗体断片から出発して作成し た試薬に、分析すべき生体試料を、それぞれハイブリダイゼーションまたは抗原 一抗体型反応を可能ならしめる条件下で、接触させる段階および − 場合により形成された反応生成物を確認する段階 を包含することを特徴とする該診断方法。 ２９．− 分析すべき生体試料を、場合により標識されていてもよい請求項２ １または２２のいずれか記載の少なくとも１つのポリペプチドまたは請求項２３ 記載の抗体もしくはこれらの断片と、抗原−抗体型反応を可能ならしめる条件下 で接触させる段階および − 場合により形成された反応生成物を確認する段階 を包含することを特徴とする髄膜炎菌感染に特異的な免疫反応を診断する方法。 ３０．− 請求項２８または２９に定義した、すなわち核酸、抗体またはペプ チドタイプの少なくとも１種の試薬、 − 目的とするヌクレオチドのハイブリダイゼーションまたは免疫反応の実施を 可能ならしめる製品、とりわけマーカーまたは緩衝液ならびに使用説明書 を包含することを特徴とする請求項２８または２９のいずれか記載の方法を実施 するためのキット。 ３１．生理学的に許容しうる担体（単数または複数）と組合せて、有効量の − 請求項２１または２２記載のペプチドまたは − 請求項２３記載の抗体、または抗抗体断片 を含有し、場合により、その免疫原性増強のために、ポリオウイルス蛋白質、テ タヌストキシン、ピリンの超可変領域由来の蛋白質などの担体分子と組合せられ ていてもよいことを特徴とする、そのスペクトル中に、とくに小児用の少なくと も１種のワクチンとの組合せにおいて、抗髄膜炎菌目的の予防を含み、あらゆる 形の髄膜炎菌感染を防止するためのワクチン組成物。 ３２．生理学的に許容しうる担体（単数または複数）と組合せて、有効量の − 請求項１〜１５または１９記載の核酸または − 請求項１７または１８記載の細胞 を含有することを特徴とする、そのスペクトル中に、とくに小児用の少なくとも １種のワクチンとの組合せにおいて、抗髄膜炎菌目的の予防を含み、あらゆる形 の髄膜炎菌感染を防止するためのワクチン組成物。