JP3229880B2 - カンジダアルビカンスの検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カンジダアルビカンス
（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）をＤＮＡレベル
で特異的に検出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】カンジダアルビカンスは、免疫不全の患
者にとって重要な病原菌である。このカンジダ症の診断
には、抗原又は抗体を検出する血清学的な方法が従来か
ら使われていた。しかし、抗体検出法では、免疫機能の
低下した患者に抗体産生能の低下が観察されることや、
逆に健康人にも高い抗体価を示す場合があるので、診断
法として問題があった。一方、抗原検出法では、検体内
に病原菌が少なくとも１０⁵ 個存在しないと検出できな
いという感度上の問題があるので、菌の培養操作等を必
要とした。以上のように、従来、カンジダ症の良好な診
断法は存在しなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、迅速か
つ確実にカンジダアルビカンスを検出するために、カン
ジダアルビカンスのＤＮＡを制限酵素を用いて分解し、
得られたカンジダアルビカンスのＤＮＡ断片をクローニ
ングし、それらの各種クローニングＤＮＡ断片について
プローブとしての評価を行ったところ、カンジダアルビ
カンスのＤＮＡと特異的にハイブリダイズするプローブ
として用いることのできるＤＮＡ断片を見い出した。次
に、このプローブの部分塩基配列を決定し、その部分塩
基配列に相補的なＤＮＡを合成したところ、ＰＣＲ法の
プライマーとして良好に用いることができることを見い
出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、カン
ジダアルビカンスＡ血清型Ｍ１０１２株の全ＤＮＡを制
限酵素ＥｃｏＯ１０９Ｉで分解して得られ、一端より約
０．１ｋｂの位置に制限酵素ＨｉｎｃII認識部位を有す
る約０．９kbのＤＮＡ断片を標識し、イン・ザイチュー
でプローブとして被検試料と接触させ、前記標識からの
信号を検出することを特徴とする、カンジダアルビカン
スのＡ血清型及びＢ血清型の検出方法に関する。本明細
書の塩基配列において、Ａはアデニン残基、Ｃはシトシ
ン残基、Ｇはグアニン残基そしてＴはチミン残基の意味
である。また、本発明者が見出した別の方法は、配列表
における配列番号１の配列で表される塩基配列の少なく
とも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第１
のＤＮＡプライマーと配列表における配列番号２の配列
で表される塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌク
レオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーの組み
合わせと、ＤＮＡポリメラーゼと、水性液体被検試料と
を含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られ
た反応液をＤＮＡ検査工程にかけることを特徴とする、
カンジダアルビカンスの検出方法である。

【０００５】本発明方法で用いる液体被検試料とは、カ
ンジダアルビカンスを含有している疑いのある試料であ
れば特に制限されない。例えば、血液、唾液、咽頭拭い
液、組織切片等を用いることができる。

【０００６】前記の別のカンジダアルビカンス検出方法
は、主に、（１）ＤＮＡ増幅工程と、（２）ＤＮＡ検査
工程とからなる。このＤＮＡ増幅工程（１）では、ＰＣ
Ｒ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ）法を用いることができる。ＰＣＲ法を利用する
と、微量のＤＮＡから目的とするＤＮＡ領域のみを自動
的に約百万倍にまで増幅することができる（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２３９：４８７−４９１）。ＰＣＲ法では、増幅
させるＤＮＡ領域を挟んで＋鎖に対するプライマー（以
下、第１プライマーと称する）及び−鎖に対するプライ
マー（以下、第２プライマーと称する）の二種類のＤＮ
Ａプライマーを用いる。

【０００７】前記別法のＤＮＡ増幅工程（１）では、第
１プライマーと第２プライマーの組み合わせを用いるこ
とにより、カンジダアルビカンスのミトコンドリアＤＮ
ＡをＥｃｏＯ１０９Ｉ処理して得られるＤＮＡ断片の１
つであるＥＯ３に由来する約１．８kbの領域のみを特異
的に増幅することができる。

【０００８】前記の第１プライマー及び第２プライマー
はそれぞれ１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることができる
が、一般的には２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであることが好
ましい。第１プライマー及び第２プライマーは、それぞ
れ配列表における配列番号１及び配列番号２の配列で表
される２５塩基の配列のうちの少なくとも１５塩基のオ
リゴヌクレオチドを含有していればよい。第１プライマ
ー及び第２プライマーが１５ｍｅｒ未満であるとアニー
リングの際の特異性が減少し、非特異的結合が増加す
る。また３０ｍｅｒを越えるとプライマー分子間あるい
は分子内での二重鎖を取り易くなるので好ましくない。
本発明方法で用いる第１プライマー及び第２プライマー
のそれぞれを構成する各塩基は、公知の任意の態様で修
飾（例えばビオチン又は発光物質によるラベル化）され
ていてもよい。

【０００９】前記別法で用いる前記のそれぞれの第１プ
ライマー及び第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成
機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、
公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイト法）によ
って調製することができる。

【００１０】前記別法ののＤＮＡ増幅工程（１）では、
第１プライマー及び第２プライマーと共に、ＤＮＡポリ
メラーゼ、例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増
幅サイクルを繰り返す。耐熱性ポリメラーゼとしては、
特に９５℃までの温度で活性を維持することのできるＤ
ＮＡポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼ
を用いることができる。

【００１１】前記別法のＤＮＡ増幅工程では前記の第１
プライマーと第２プライマーとの特定の組み合わせ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ及び液体被検試料を含む混合液を用い
る。第１プライマー、第２プライマー及びＤＮＡポリメ
ラーゼの使用量は、液体被検試料の種類によって変化す
るが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実行することが
できる範囲で容易に決定することができる。この混合液
は場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）、
安定剤（例えば、ゼラチン）、又は塩類（例えば、塩化
ナトリウム）を含有することができる。

【００１２】前記別法では、前記の混合液を用いてＰＣ
Ｒ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、 （ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９５℃で、約１０
秒〜約２分間） （ii）１本鎖ＤＮＡの第１プライマー及び第２プライマ
ーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃で、約３０
秒〜約３分間）、及び （iii ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約
６５℃〜８０℃で、約３０秒〜約５分間）とからなる。
１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅され、ｎサイクル
後には２ⁿ 倍に増幅される。本発明においては、前記の
増幅サイクルを１０〜６０回、好ましくは２０〜４０回
繰り返す。最後のサイクルにおいては、工程（iii)での
加熱時間を約５〜１０分間に延長してＤＮＡ合成が完全
に行われるようにするのが好ましい。

【００１３】被検試料中にカンジダアルビカンスが存在
する場合には、前記の増幅サイクル終了後に、約１．８
kbのＤＮＡ断片ＥＯ３が大量に合成される。このＤＮＡ
断片ＥＯ３の一部である約１．８kbのＤＮＡ断片を次の
ＤＮＡ検査工程によって検出する。

【００１４】ＤＮＡ検査工程としては、ゲル電気泳動法
及びエチジウムブロマイド染色を利用する方法、サザン
ブロットハイブリッド法、又はジデオキシ法による塩基
配列決定法などを用いることができる。ゲル電気泳動法
を行う場合には、例えば、アガロースゲルを担体とした
サブマリーン型電気泳動、又はアクリルアミドを用いた
スラブ型電気泳動を使用することができる。

【００１５】サザンブロットハイブリッド法、又はｉｎ
ｓｉｔｕハイブリッド法を行う場合には、非放射性プ
ローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオチン化プロー
ブ、ジゴキシゲニン化プローブ又は化学発光物質、蛍光
物質でラベルしたプローブ）を用いることができる。更
に、ジデオキシ法による塩基配列決定法を利用する場合
には、蛍光ラベルを使用したＤＮＡオートシークエンサ
ー（アプライドバイオシステムズ社）等を用いることが
できる。

【００１６】本発明は更に、カンジダアルビカンス−Ｄ
ＮＡの特異的な検出に用いることのできるＤＮＡプロー
ブを提供するものでもある。即ち、カンジダアルビカン
スのミトコンドリアＤＮＡをＥｃｏＯ１０９Ｉで分解し
て得られる約２kbのＤＮＡ断片であるＥＯ３を標識して
プローブとして用いることにより、カンジダアルビカン
スのＡ血清型及びＢ血清型を特異的に検出することがで
きる。このＤＮＡ断片ＥＯ３は１．３kb離れて存在する
２つのＰｖｕII認識部位を保有している。また、カンジ
ダアルビカンスの全ＤＮＡをＥｃｏＯ１０９Ｉで分解し
て得られる一端より約０．１ｋｂの位置にＨｉｎｃII認
識部位を有する約０．９kbのＤＮＡ断片であるＥＯ１を
標識してプローブとして用いることもできる。これらの
ＤＮＡプローブＥＯ３及びＥＯ１は、被検試料がＰＣＲ
法によるＤＮＡ増幅工程を経たものであっても、あるい
はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法であっても、カンジダ
アルビカンスＤＮＡを特異的に認識することができる。
プローブＥＯ３及びＥＯ１の標識物質としては、従来公
知の任意の物質、例えば³²Ｐなどの放射性物質、好まし
くは非放射性物質（酵素、蛍光色素、発光物質、ビオチ
ン等）を用いることができる。この標識物質から信号を
発生させ、更にその信号を測定する方法も、従来公知の
任意の方法を用いる。

【００１７】前記別法においては、被検試料中にカンジ
ダアルビカンスが存在する場合にのみ、前記の第１プラ
イマーと第２プライマーとの組み合わせによりそれぞれ
約１．８kbのＤＮＡ断片ＥＯ３が短時間のうちに特異的
に大量に増幅合成される。従って、被検試料中における
カンジダアルビカンスの存在を極めて特異的に検出する
ことができる。更に、被検試料中のカンジダアルビカン
ス量が微量であってもＤＮＡ断片ＥＯ３が増幅合成され
るので高感度である。また、本発明方法においては、
（場合により増幅した）カンジダアルビカンス−ＤＮＡ
に特異的な標識ＤＮＡプローブＥＯ３又はＥＯ１を用い
るので、極めて正確にカンジダアルビカンスを検出する
ことができる。更に前記の第１及び第２プライマーを用
いる増幅工程と前記のプローブＥＯ３を用いる検査工程
とを併用すると、検査の所要時間はエチジウム染色の場
合は４〜５時間程度であり、サザンブロットハイブリッ
ド法まで行う場合でも４８〜５０時間程度であり、迅速
に結果を得ることができる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。以下の実施例において使用した標準菌株は、以下の
とおりである。カンジダアルビカンスＭ１０１２Ａ血清
型、カンジダアルビカンスＭ１４４５Ｂ血清型、カンジ
ダトロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）Ｍ１０１
７、カンジダギラモンディー（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍ
ｏｎｄｉｉ）Ｍ１０２３、カンジダクルセイ（Ｃ．ｋｒ
ｕｓｅｉ）Ｍ１００５、カンジダパラプシロシス（Ｃ．
ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）Ｍ１０１５、カンジダシュ
ードトロピカリス（Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌ
ｉｓ）Ｍ１００４、カンジダグラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂ
ｒａｔａ）Ｍ４００２、サッカロミセスセレビシアエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）ＬＬ２０〔文献１〕、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２
３、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ
１０９、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２７８５３、クリプトコッカスネ
オフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆ
ｏｒｍａｎｓ）ＮＩＨ−６８〔文献２〕、ヒト口腔偏平
上皮癌ＨＳＣ−２細胞株〔ＪＣＲＢ細胞バンク〕〔文献
３〕。

【００１９】また、以下の実施例において用いた各種の
供試カンジダ菌株は、明治薬科大学、（株）ヤトロン及
び理化学研究所（ＪＣＭ：Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の保存
株である〔文献４及び５〕。カンジダ菌株の同定は、通
常の生物学的方法〔文献６〕及びポリクローナル因子血
清〔カンジダチェック：（株）ヤトロン〕を用いる血清
学的方法〔文献５〕によって行った。酵母の培養はサブ
ロー培地〔Ｄｉｆｃｏ社〕中で２７℃にて行い〔文献
４〕、細菌の培養は普通栄養液体培地〔栄研（株）〕中
で３７℃にて行った。

【００２０】《実施例１：ＤＮＡの調製》カンジダアル
ビカンスＡ血清型（Ａ型）Ｍ１０１２株〔明治薬科大学
から入手〕をザイモリエース（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）に
よりスフェロプラストとした後〔文献７〕、Ｃｒｙｅｒ
らの方法〔文献８〕に従い、全ＤＮＡを調製した。即
ち、プロテイナーゼＫ（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ）の存在
下でスフェロプラストを１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで溶解
し、その溶解物をクロロホルム−イソアミルアルコール
（２４：１）で処理してタンパク質を除去した後、膵Ｒ
Ｎａｓｅ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏ：５０μｇ／ml）
処理、ＲＮａｓｅＴＩ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎ
ｈｅｉｍ：１００Ｕ／ml）処理及びα−アミラーゼ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ：０．０３Ｕ／
ml）処理を行った。クロロホルム−イソアミルアルコー
ル抽出とＲＮａｓｅ処理を３回繰り返し、エタノールで
沈澱させ、得られた精製ＤＮＡをエタノール沈澱によっ
て集め、ＴＥ−バッファー（１０mMトリスＨＣｌ−１mM
−Ｎａ₂ ＥＤＴＡ，pH８．０）に溶解し、遺伝子ライブ
ラリーの作成に用いた。他のカンジダ菌株については、
前記と同様のスフェロプラスト溶解物をクロロホルム−
フェノール（１：１）で抽出処理してタンパク質を除い
た後、膵ＲＮａｓｅで処理し、エタノール沈澱により粗
ＤＮＡを調製し、これらを後述のハイブリダイゼーショ
ン及びＰＣＲ法に用いた。クリプトコッカスネオフォル
マンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒト由来細胞株
及び各種細菌の粗ＤＮＡは、Ｒｅｓｔｒｅｐｏらの方法
〔文献９〕及びＭａｎｉａｔｉｓらの方法〔文献１０〕
により調製した。

【００２１】《実施例２：多コピーＤＮＡ断片のクロー
ン化》前記実施例１で得られたカンジダアルビカンスＭ
１０１２の全ＤＮＡをＥｃｏＯ１０９Ｉで分解し、１％
アガロースゲルで電気泳動した。アガロース上に生じた
不連続なＤＮＡ断片バンドのうち、約０．９kb及び約２
kbの長さのＤＮＡ断片バンド（各々図１にＥＯ１とＥＯ
３で示す）からＤＮＡを抽出し、各々の接着末端をクレ
ノー断片により平滑末端化した。各ＤＮＡ断片をｐＵＣ
１１８のＳｍａＩ部位に連結した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）ＪＭ１０９に移入し、約０．９kb断片及び約２kb
断片を有するプラスミドのライブラリーを作製した。約
０．９kb挿入断片のライブラリーからは各種制限酵素の
切断で同一の切断パターンを示す４つのプラスミドが得
られたことからこれらを同一クローンとみなし、代表的
な１つのプラスミドを選びその挿入断片をＥＯ１と命名
した。同様の方法で、約２．０kb挿入断片のライブラリ
ーから同一のプラスミド３つを得、そのうちの１つの挿
入断片をＥＯ３と命名した（図１参照）。

【００２２】《実施例３：ＤＮＡプローブの標識》カン
ジダアルビカンス由来のＥＯ１（０．９kbＤＮＡ断片）
とＥＯ３（２kbＤＮＡ断片）をランダムプライマーＤＮ
Ａラベリングキット〔宝酒造（株）〕を用いて〔α−³²
Ｐ〕ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌｐｌｃ：３，０００ Ci／ミリモル）で標識
し、ニックカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）で精
製した。

【００２３】《参考例１：ＥＯ３の特異性》各種菌株よ
り得たＤＮＡにつきドットブロットハイブリダイゼーシ
ョンを行い、ＤＮＡ断片ＥＯ３の種特異性を調べた。即
ち、前記実施例１で調製した粗ＤＮＡの熱変性物各５μ
ｌ（０．１μｇ及び１．０μｇ）を、予めアルカリ処理
したナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ：Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）上にスポットした後、８０℃で２０分間乾燥して固
定した（ドットブロッテイング）。続いて、この膜に対
し、前記実施例３で標識したプローブＥＯ３で６８℃に
て２０分間、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法〔文献１０〕に
より、ハイブリダイゼーションを行った。プローブの比
活性は１ｘ１０⁹ ｃｐｍ／μｇＤＮＡであった。ハイブ
リダイゼーション後に膜を洗浄し、Ｘ線フィルム〔フジ
ＲＸ：富士写真フィルム（株）〕に対し−８０℃で密着
させた。結果を図２及び表１に示す。プローブＥＯ３は
カンジダアルビカンスＡ血清型及びＢ血清型の標準株Ｄ
ＮＡに特異的に結合した（図２；Ａのａ−１，ａ−
２）。しかし、他の医学的に重要なカンジダ属に属する
６種の菌株（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓなど、ａ−３〜
ｂ−４）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｃ−１）、Ｓ
ｔ．ａｕｒｅｕｓ（ｃ−２）、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｃ−
３）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ｃ−４）、Ｃｒ．ｎ
ｅｏｆｏｒｍａｎｓ（ｆ−３）及びヒト由来細胞株（ｆ
−４）の各標準株ＤＮＡのいずれに対しても結合しなか
った。またプローブＥＯ３はカンジダアルビカンスＡ血
清型（ｄ−１〜ｅ−１）及びＢ血清型（ｅ−２〜ｆ−
２）の保存株１０株のすべてのＤＮＡに結合した。プロ
ーブＥＯ３によるドットブロット分析の比較実験の結果
を表１に示す。この結果はプローブＥＯ３がカンジダア
ルビカンス（両血清型を含む）に特異的であることを示
している。

【００２４】同様の結果はＥＯ１をプローブとした場合
にも示された（図２；Ｂ）。プローブＥＯ１もカンジダ
アルビカンスに特異的ではあるが、カンジダアルビカン
スＤＮＡ１．０μｇ（各対の下側のスポット）に対する
プローブＥＯ１の結合度は、同種のＤＮＡ０．１μｇ
（各対の上側のスポット）に対するプローブＥＯ３の結
合度よりも弱かった。プローブＥＯ１とプローブＥＯ３
の標識比活性は等しいので、ＤＮＡ断片ＥＯ３はＤＮＡ
断片ＥＯ１よりもゲノム内のコピー数がはるかに多いも
のと考えられる。

【００２５】《参考例２：ＥＯ３の由来》ＤＮＡ断片Ｅ
Ｏ３が核ＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡ（mtＤＮＡ）
のどちらに由来するかを調べるために、カンジダアルビ
カンスＡ血清型及びＢ血清型数株の全ＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉで切断し、プローブＥＯ３を用いてサザンブロットハ
イブリダイゼーション分析を行った。ＥｃｏＲＩ切断産
物を電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った結
果、Ｗｉｌｌｓらの報告した〔文献１１及び１２〕カン
ジダアルビカンスmtＤＮＡの５つのＥｃｏＲＩ切断々片
（Ｅ１〜Ｅ５）の大きさに対応する大きさを有する５本
の不連続なバンドが検出された（図３；Ａのレーン３及
びレーン４）。サザンブロット分析を行ったところ、プ
ローブＥＯ３は、カンジダアルビカンスＡ血清型及びＢ
血清型株ともに、これら５本のうちの２本のバンド、す
なわちＥ２（１０．０kb）とＥ３（８．１kb）の位置に
結合することが示された（図３；Ｂ）。更に、ＤＮＡ断
片ＥＯ３の制限酵素切断地図を作成した結果、ＤＮＡ断
片ＥＯ３は相互に約１．３kb離れた２つのＰｖｕII部位
〔文献１２の図７と同様〕を保有していた（図４；
Ａ）。これらの結果からＤＮＡ断片ＥＯ３はカンジダア
ルビカンスmtＤＮＡに由来しているものと推定される。

【００２６】《参考例３：プライマーの合成》ＤＮＡ断
片ＥＯ３の両端領域の部分塩基配列をダイデオキシ法
〔文献１３〕により決定した（図４；Ａ）。この配列に
基づき、ＰＣＲ法で用いる一対のプライマー（２０ｍｅ
ｒ）２種をＤＮＡ合成装置で作製した。即ち、３８１Ａ
型自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）に、アデニンＣＰＧカラムを装着
してプライマー（１ａ）〔TAGGTGAGAC ATATCACAGA 〕及
びプライマー（２ａ）〔GTTATATCGC TAGTATATGA 〕を合
成した。

【００２７】アンモニア水（約３０％）２．５mlを入れ
たディスポシリンジ（２．５ml）を、合成工程が完了し
たＣＰＧカラムに接続し、アンモニア水をカラム内に押
し出して、合成したＤＮＡフラグメントを溶出した。回
収したＤＮＡアンモニア溶液の入ったバイアル瓶を密栓
し、５５℃で６時間加温した後、室温まで冷やしてから
濃縮した。濃縮物を凍結乾燥し、１０mMトリエチルアン
モニウムアセテート（以下、ＴＥＡ−Ａと称す）（pH
７．４）に溶解し、沈澱を除いてから、Ｌ−６２００型
高速液体クロマトグラフィー装置（日立製作所）（以
下、ＨＰＬＣと称す）に分離用カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃ
ｋ ＯＤＳ−ＡＭ３１３：ＹＭＣ社）を装着し、５％ア
セトニトリルを含んだ９５mM−ＴＥＡ−Ａとアセトニト
リルとによる濃度勾配を用いて精製し、メインピークを
集めた。得られた沈渣に８０％酢酸（アセトニトリルで
調整）を加えて懸濁させ、室温で３０分間保持してから
減圧乾燥した。乾燥物を１０mM−ＴＥＡ−Ａに溶解し、
ジエチルエーテルで抽出してから減圧乾燥した。乾燥し
たＤＮＡ試料をＴＥＡ−Ａに溶解し、沈澱を除いてか
ら、２回目のＨＰＬＣによる精製を行い、メインピーク
を集めた。こうして得られた精製ＤＮＡプライマーを減
圧乾燥して保存し、後記の実施例で用いた。

【００２８】《参考例４：ＥＯ３のＰＣＲ法への応用》
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（耐熱性：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ）０．６２５Ｕを反応液２５μｌ〔５０mM−Ｋ
Ｃｌ、１．５mMＭｇＣｌ₂ 、１０mMトリスＨＣｌ（pH
８．３）、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、各々０．
２mMのｄＧＰＴ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ（Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、標的ＤＮＡ２５０pg及び各
プライマー1 μM を含む〕に加えた。ＤＮＡをＰＣＲプ
ロセッサー（Ｂｉｏ Ｏｖｅｎ：Ｂｉｏ Ｔｈｅｒｍ）
中で、 熱変性：９２℃で４５秒間、 アニーリング（二重鎖形成反応）：５０℃で３０秒
間、及び プライマー伸張反応：７２℃で９０秒間のサイクルを
３５回繰り返し行って増幅させた。最終サイクルでは、
ＰＣＲの残存産物を完全な二重鎖とするため更に７２℃
で７分間反応させた。

【００２９】前記実施例１で得た粗ＤＮＡ（表１に示し
たものと同じ）を用い、３５サイクルのＰＣＲ処理の
後、そのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分
析した。結果を図５及び表２に示す。図５から明らかな
通り、カンジダ属の７菌種を始めとする１２標準株のう
ちカンジダアルビカンスＡ血清型及びＢ血清型のＤＮＡ
にのみ１．８kb断片が検出され、その他の株では増幅さ
れたバンドは認められなかった。表２には、標準株以外
に多数の株についてＰＣＲ処理を行い、そのＰＣＲ産物
をアガロースゲルで分析した結果を示す。カンジダアル
ビカンスＡ血清型及びＢ血清型の３１株全てにおいて
１．８kb断片の増幅が観察された。一方、カンジダアル
ビカンスに属していない菌株及びヒト細胞株において
は、増幅されたＤＮＡ断片は全く検出されなかった。

【００３０】《参考例５：３種のＰＣＲ産物の同定》前
記参考例４で用いたカンジダアルビカンスＡ血清型及び
Ｂ血清型の菌株には、ＰＣＲ産物にわずかな大きさの相
違が見出された。図５のＡの右端に示したようにこれら
のＰＣＲ産物を、その大きさの違いにより３種（Ｌ型、
Ｍ型及びＳ型）に大別した。図５から明らかなとおり、
前記実施例１においてＤＮＡ断片ＥＯ３のクローン化に
用いたカンジダアルビカンスＭ１０１２菌株のＰＣＲ処
理からはＭ型のＰＣＲ産物が得られた。次に、Ｌ型、Ｍ
型及びＳ型の各ＰＣＲ産物をＨｉｎｃII、ＰｖｕII及び
ＢｇｌII−ＰｖｕIIにより切断して解析した（図６）。
その結果を示す制限酵素地図（図４；Ｂ）から明らかな
通り、１つのＨｉｎｃII部位を含む短い断片（図４Ｂの
斜線領域ａで示す）がＳ型産物で欠け、またもう１つの
短い断片（同図の斜線領域ｂで示すＢｇｌII−Ｈｉｎｃ
II断片内の一部）がＭ型産物及びＳ型産物の両方に欠け
ていることが分かる。ＰＣＲ法で陽性となった２８株の
ＰＣＲ産物について同様の解析を行った結果、すべての
ＰＣＲ産物が図６に示す３型のいずれか１つに一致し
た。これらの結果は、このような大きさの多様化に関わ
る領域はＤＮＡ断片ＥＯ３の制限酵素地図上のある限ら
れた領域、ＢｇｌII−ＨｉｎｃII断片内の一部及び（又
は）ＨｉｎｃII部位を含む一部に存在していることを示
している。

【００３１】次にこれらの増幅された断片がＥＯ３領域
に由来していることを示すために、ＰＣＲ陽性３１株す
べてのＰＣＲ産物について、ＥＯ３をプローブとしたサ
ザンブロットハイブリダイゼーションを行った。表２と
図５のＢに示すように、プローブＥＯ３は増幅された
１．８kb断片のすべてと結合した。しかし結合した断片
の大きさは図５のＡに示したエチジウムブロマイド染色
断片に対応したサイズ多様性を示した。従って、これら
の結果から、増幅された１．８kb断片はＤＮＡ断片ＥＯ
３内の同一の領域に由来していること、またその断片に
は、その大きさにわずかな多様性があるものの、カンジ
ダアルビカンスのすべての株に特異的に含まれているこ
とが明らかにされた。

【００３２】《参考例６：ＰＣＲの感度》カンジダアル
ビカンスＤＮＡを検出するＰＣＲの感度を調べるため
に、カンジダアルビカンス精製ＤＮＡの１０倍希釈系列
（１０⁵ 〜１０¹ fg／μｌ）を作り、各々の２．５μｌ
をＰＣＲ法反応液２５μｌに加え、各増幅産物をアガロ
ース電気泳動及びＥＯ３をプローブとするサザンブロッ
トハイブリダイゼーションで解析した（図７）。エチジ
ウムブロマイド染色による検出限界は２．５pg〔ＤＮＡ
（１pg／μｌ）含有液２．５μｌを反応液に添加する場
合に相当〕であるのに対し、サザンハイブリダイゼーシ
ョンでは理論的に酵母の１細胞に相当するＤＮＡ量と推
測される２５fg（２５×１０^-15 ｇ）であった。

【００３３】

【表１】

【００３４】

【表２】

【００３５】

【発明の効果】前記別法では、プライマー（１ａ）とプ
ライマー（２ａ）との組合せを用いるＰＣＲ法により、
カンジダアルビカンスmtＤＮＡ由来の約２kbのＤＮＡ領
域（ＥＯ３）内の約１．８kbの領域を特異的に増幅する
ことができる。このＤＮＡ領域（ＥＯ３）はカンジダア
ルビカンスＡ血清型及びＢ血清型のいずれにおいても特
異的に存在するのに対し、他のカンジダ属に属する菌に
は存在しない。従って、本発明のプライマーによって該
領域を増幅し、ＤＮＡ検査工程として好ましくは本発明
プローブを使用すると、試料中に少量のＤＮＡしか存在
しなくても、カンジダアルビカンスを特異的に検出する
ことができる。

【００３６】本発明によると、カンジダアルビカンスmt
ＤＮＡ由来の約２kbのＤＮＡ断片ＥＯ３、及びカンジダ
アルビカンス全ＤＮＡ由来の約０．９kbのＤＮＡ断片Ｅ
Ｏ１は、それぞれカンジダアルビカンスＡ血清型及びＢ
血清型のいずれのＤＮＡに対しても特異的であるので、
ＤＮＡ断片ＥＯ３又はＥＯ１をプローブとすることによ
り、カンジダアルビカンスを特異的に検出することがで
きる。

【００３７】更に、前記ＰＣＲ法と前記プローブＥＯ３
とを組み合わせると、精製ＤＮＡの検出限界はわずか２
５fg（１細胞相当のＤＮＡ）であり、極めて高感度でカ
ンジダアルビカンスの検出を行うことができる。なお、
ＤＮＡ断片ＥＯ３内の１．８kb断片は、ヒト由来の細胞
には存在しない。従って、カンジダアルビカンスを臨床
材料からＰＣＲ法で特異的に検出する際に、混同を生じ
る恐れがない。以上のように、本発明は特異性と感度の
優れた新しいカンジダアルビカンスの迅速検出及びカン
ジダ症の迅速診断手段を提供することができる。

【００３８】前記の参考文献は以下のとおりである。 文献１：Szostak,J.W.,et al, 1979, Insertion of a g
enetic marker into theribosomal DNA of yeast. Plas
mid 2:536-554 文献２：Kagaya,K.,et al, 1985, Characterization of
pathogenic constituents of Cryptococcus neoforman
s strains. Microbiol. Immunol. 29:517-532 文献３：Miyakawa,Y.,et al, 1986, Production and ch
aracterization of agglutinating monoclonal antibod
ies against predominant antigenic factors for Cand
ida albicans. J.Clin. Microbiol. 23:881-886 文献４：Kagaya,K.,et al, 1989, Immunologic signifi
cance of diverse specificity of monoclonal antibod
ies against mannans of Candida albicans. J.Immuno
l. 143:3353-3358 文献５：Meyer,S.,et al, 1984, Genus 4 Candida Berk
hout, p. 585-844. In N.J.W.Kreger-van Rij(ed.), Th
e yeasts: a taxonomic study, 3rd ed. Elsevier Scie
nce Publishers B.V., Amsterdam 文献６：Kaufman,L.,et al, 1986, Serodiagnosis of f
ungal diseases, p. 446-466, In N.R.Rose, et al (e
d.), Manual of clinical laboratory immunology, 3rd
ed. American Society for Microbiology, Washingto
n, D.C. 文献７：Torres-Bauza,L.J.,et al, 1980, Protoplasts
from yeast and mycelial forms of Candida albican
s. J. Gen. Microbiol. 119:341-349 文献８：Cryer,D.R.,et al, 1975, Isolation of yeast
DNA, In D. M. Prescott(ed.), Methods in cell biol
ogy, Vol. 12, Academic Press, New York 文献９：Restrepo,B.I.,et al, 1989, Cloning of 18S
rDNAs from the pathogenic fungus Cryptococcus neof
ormans. J. Bacteriol. 171:5596-5600 文献１０：Maniatis,T.,et al, 1982, Molecular cloni
ng: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Labora
tory, Cold Spring Harbor, N.Y. 文献１１：Wills,J.W.,et al, 1984, Repetitive DNA o
f Candida albicans: nuclear and mitochondrial comp
onents, J. Bacteriol. 157:918-924 文献１２：Wills,J.W.,et al, 1985, Circular mitocho
ndrial genome of Candida albicans contains a large
inverted duplication, J. Bacteriol. 164:7-13 文献１３：Sanger,F.,et al, 1977,DNA sequencing wit
h chain terminating inhibitors, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74:5463-5467

【００３９】

【配列表】

<110> IATRON LABORATORIES, INC. <120> Method for detecting Candida albicans <130> IAT9112D1 <160> 2 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 1 ATAGGTGAGA CATATCACAG ATTAT <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Candida albicans <400> 2 CATGGTTATA TCGCTAGTAT ATGAC

【図面の簡単な説明】

【図１】カンジダアルビカンスＤＮＡ由来の多コピーを
有するクローン化ＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動
の結果を示す図面に代わる写真である。レーン１及びレ
ーン２は各々ＤＮＡサイズスタンダードであり、レーン
１がＨｉｎｄIII 分解λＤＮＡで、レーン２がＥｃｏＴ
１４Ｉ分解λＤＮＡである。レーン３はカンジダアルビ
カンスＭ１０１２株の全ＤＮＡのＥｃｏＯ１０９Ｉ分解
物である。レーン４及びレーン５は、挿入断片ＥＯ１及
び挿入断片ＥＯ３を有するプラスミドのＥｃｏＲＩ−Ｐ
ｓｔＩ分解物及びＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 分解物であ
る。

【図２】プローブの種特異性をドットブロットハイブリ
ダイゼーションによって分析した結果を示す図面に代わ
る写真であり、（Ａ）はプローブＥＯ３、（Ｂ）はプロ
ーブＥＯ１の結果をそれぞれ示す。各プローブに関する
比放射能は１×１０⁹ ｃｐｍ／μｇＤＮＡであった。各
種菌株からのＤＮＡを０．１μｇ（各対の上部）及び
１．０μｇ（各対の下部）の量で膜上にドットブロッテ
ィングした。ブロッティングしたＤＮＡは以下のとおり
である。 ａ−１：カンジダアルビカンスＭ１０１２Ａ血清型、 ａ−２：カンジダアルビカンスＭ１４４５Ｂ血清型、 ａ−３：カンジダトロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌ
ｉｓ）Ｍ１０１７、 ａ−４：カンジダギラモンディー（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅ
ｒｍｏｎｄｉｉ）Ｍ１０２３、 ｂ−１：カンジダクルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）Ｍ１０
０５、 ｂ−２：カンジダパラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉ
ｌｏｓｉｓ）Ｍ１０１５、 ｂ−３：カンジダシュードトロピカリス（Ｃ．ｐｓｅｕ
ｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）Ｍ１００４、 ｂ−４：カンジダグラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）
Ｍ４００２、 ｃ−１：サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＬ２０、 ｃ−２：黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３、 ｃ−３：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
ＪＭ１０９、 ｃ−４：緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２７８５３、 ｄ−１からｆ−２のＤＮＡはカンジダアルビカンスＡ血
清型の菌株５種（ｄ−１からｅ−１）とカンジダアルビ
カンスＢ血清型の菌株５種（ｅ−２からｆ−２）由来の
ものである。ｆ−３はクリプトコッカスネオフォルマン
ス、ｆ−４はヒト細胞株ＨＳＣ−２のＤＮＡである。

【図３】カンジダアルビカンスＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解
物とＥＯ３とのハイブリダイゼーションの結果を示す図
面に代わる写真である。（Ａ）はカンジダアルビカンス
全ＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解物を電気泳動した結果を示
し、（Ｂ）はプローブＥＯ３を用いたサザンブロットハ
イブリダイゼーションの結果を示す。レーン１及びレー
ン２はそれぞれサイズスタンダードとしてのλＤＮＡＨ
ｉｎｄIII 分解物及びＥｃｏＴ１４Ｉ分解物であり、レ
ーン３及びレーン４はそれぞれカンジダアルビカンスＡ
血清型およびＢ血清型である。mtＤＮＡ由来であること
が示されている個々の断片Ｅ１〜Ｅ５の位置を、Ｗｉｌ
ｌらが報告したサイズに従って示した。

【図４】（Ａ）はカンジダアルビカンスのＥＯ３断片の
制限酵素認識部位及びその部分的なヌクレオチド配列を
示す説明図である。左端及び右端の黒い太線部分はｐＵ
Ｃ１１８であり、中央の白抜き部分はクローン化断片Ｅ
Ｏ３であり、白抜き部分の両端近傍の各黒丸はＰＣＲ用
プライマーの位置である。矢印を伴ったヌクレオチド配
列（２０ｍｅｒ）はＰＣＲプライマーの配列である。
（Ｂ）は図６に示すＰＣＲ産物の制限酵素分析に基づい
て、３種のＰＣＲ産物における変異を比較したものであ
る。斜線部ａはＳ型ＰＣＲ産物に欠失する領域であり、
斜線部ｂはＳ型及びＭ型のＰＣＲ産物に欠失する領域で
ある。

【図５】カンジダアルビカンスの粗ＤＮＡからＰＣＲ法
によって特異的に増幅した１．８kb断片を示す図面に代
わる写真である。（Ａ）はＰＣＲ法によって生産したＤ
ＮＡ断片のエチジウムブロマイド染色の結果を示し、
（Ｂ）はＰＣＲ産物とプローブＥＯ３とのサザンブロッ
ト分析の結果を示す。λＢｓｔＰＩは、ＤＮＡサイズス
タンダードであり、λＤＮＡのＢｓｔＰＩ分解物であ
る。ＤＮＡサイズスタンダードλＢｓｔＰＩの左側は以
下の参照菌株である。 Ｃ．ａｌｂ（Ａ）：カンジダアルビカンスＡ血清型、 Ｃ．ａｌｂ（Ｂ）：カンジダアルビカンスＢ血清型、 Ｃ．ｔｒｐ：カンジダトロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃ
ａｌｉｓ）、 Ｃ．ｇｌｍ：カンジダギラモンディー（Ｃ．ｇｕｉｌｌ
ｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、 Ｃ．ｋｒ：カンジダクルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、 Ｃ．ｐｐ：カンジダパラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓ
ｉｌｏｓｉｓ）、 Ｃ．ｐｔ：カンジダシュードトロピカリス（Ｃ．ｐｓｅ
ｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、 Ｃ．ｇｌｂ：カンジダグラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔ
ａ）、 Ｓ．ｃｅｒ：サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、 Ｓ．ａｕｒ：黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、 Ｅ．ｃｏｌｉ：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）、 Ｐｓ．ａｅｒ：緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ）、 ＤＮＡサイズスタンダードλＢｓｔＰＩの右側はカンジ
ダアルビカンスＡ血清型及びＢ血清型のそれぞれ５種の
保存菌株を示す。Ｌ，Ｍ及びＳは、ＤＮＡのサイズによ
って分類したＰＣＲ産物の位置を示す。

【図６】３種のＰＣＲ産物の制限酵素分析の結果を示す
図面に代わる写真である。カンジダアルビカンスＡ２０
７菌株（レーン３、６及び９）からのＬ型、カンジダア
ルビカンスＭ１０１２菌株（レーン４、７及び１０）か
らのＭ型、そしてカンジダアルビカンス８６２４菌株
（レーン５、８及び１１）からのＳ型の各増幅産物をＨ
ｉｎｄIII （レーン３〜レーン５）、ＰｖｕII（レーン
６〜レーン８）及びＢｇｌII−ＰｖｕII（レーン９〜レ
ーン１１）で分解し、アガロースゲル上で電気泳動にか
けた。レーン１及びレーン２はＤＮＡサイズスタンダー
ドであり、レーン１はλＤＮＡのＨｉｎｄIII 分解物、
レーン２はλＤＮＡのＢｓｔＰＩ分解物である。

【図７】カンジダアルビカンスＤＮＡをＰＣＲ法で増幅
した後に、エチジウムブロマイド染色（Ａ）及びプロー
ブＥＯ３とのサザンブロットハイブリダイゼーションに
よって、ＰＣＲ法でのＤＮＡ検出感度を試験した結果を
示す図面に代わる写真である。精製ＤＮＡの１０倍連続
希釈シリーズ（１０⁵ 〜１０¹ ｆｇ／μｌ）２．５μｌ
及びＴＥ緩衝液を反応混合物２５μｌに加えてからＰＣ
Ｒ法によって増幅した。ＰＣＲ産物の各５μｌをアガロ
ースゲル上で電気泳動にかけた。λＢｓｔはＤＮＡサイ
ズスタンダードであり、λＤＮＡのＢｓｔＰＩ分解物で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔ ｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，（1989）, Ｖｏｌ．159，Ｎｏ．３，ｐ．488−494 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ, （1990），Ｖｏｌ．28，Ｎｏ．６，ｐ. 1204−1213 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ，（1985），Ｖｏｌ．164, Ｎｏ．１，ｐ．７−13 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 - 15/90 C12Q 1/04 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カンジダアルビカンスＡ血清型Ｍ１０１
   ２株の全ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＯ１０９Ｉで分解して
   得られ、一端より約０．１ｋｂの位置に制限酵素Ｈｉｎ
   ｃII認識部位を有する約０．９kbのＤＮＡ断片を標識
   し、イン・ザイチューでプローブとして被検試料と接触
   させ、前記標識からの信号を検出することを特徴とす
   る、カンジダアルビカンスのＡ血清型及びＢ血清型の検
   出方法。