JPH0889254A - 真菌の検出および真菌の菌種同定用オリゴヌクレオチド - Google Patents
真菌の検出および真菌の菌種同定用オリゴヌクレオチドInfo
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- JPH0889254A JPH0889254A JP6235339A JP23533994A JPH0889254A JP H0889254 A JPH0889254 A JP H0889254A JP 6235339 A JP6235339 A JP 6235339A JP 23533994 A JP23533994 A JP 23533994A JP H0889254 A JPH0889254 A JP H0889254A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 直接的で簡便、迅速かつ確実な真菌の検出お
よび真菌の菌種の同定の方法およびそれに用いる新規の
オリゴヌクレオチドを提供する。 【構成】 配列番号１から配列番号１２に記載の真菌の
１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列の一部または全部、あ
るいはその相補配列の一部または全部を含有する、真菌
の検出および真菌の菌種同定用オリゴヌクレオチド、そ
のオリゴヌクレオチドを標識した標識オリゴヌクレオチ
ド、およびそのオリゴヌクレオチドまたはその標識オリ
ゴヌクレオチドを使用する、真菌の検出および真菌の菌
種の同定の方法ならびに試薬キット。
よび真菌の菌種の同定の方法およびそれに用いる新規の
オリゴヌクレオチドを提供する。 【構成】 配列番号１から配列番号１２に記載の真菌の
１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列の一部または全部、あ
るいはその相補配列の一部または全部を含有する、真菌
の検出および真菌の菌種同定用オリゴヌクレオチド、そ
のオリゴヌクレオチドを標識した標識オリゴヌクレオチ
ド、およびそのオリゴヌクレオチドまたはその標識オリ
ゴヌクレオチドを使用する、真菌の検出および真菌の菌
種の同定の方法ならびに試薬キット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は真菌症の検出・診断に有
効なオリゴヌクレオチドに関する。更に詳しくは、臨床
診断上、カンジダ症、アスペルギルス症等の病原真菌を
迅速、確実かつ簡便に検出するための、および病原真菌
を同定するためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオ
チドを用いて病原真菌を検出する方法、ならびに病原真
菌の検出・同定のための試薬に関する。
効なオリゴヌクレオチドに関する。更に詳しくは、臨床
診断上、カンジダ症、アスペルギルス症等の病原真菌を
迅速、確実かつ簡便に検出するための、および病原真菌
を同定するためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオ
チドを用いて病原真菌を検出する方法、ならびに病原真
菌の検出・同定のための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】高度医療の普及に伴い、易感染患者は増
加の一途をたどっている。カンジダ症およびアスペルギ
ルス症をはじめとする深在性（全身性）真菌症は、易感
染患者が高率に罹患する重要な感染症として医療上の問
題となっている。真菌症の治療には、様々な抗真菌剤が
開発されている。しかし、真菌剤は開発されていても、
真菌症であると診断するための迅速かつ確実な方法は未
だ開発されていないのが現状である。現在使用されてい
る深在性真菌症の診断法としては、病原真菌の検出、病
原真菌の抗原またはこれに対する抗体を免疫学的に検出
する方法、病原真菌の菌体成分または代謝産物を生化学
的に検出する方法などがある。例えば、カンジダ症の診
断には、カンジダ抗原またはこれに対する抗体を検出す
る方法がある。しかし、病理学的に真菌感染が認められ
ない患者（健康人を含む）をも検出するという擬陽性の
問題があり、また感度の点でも臨床的な要請に十分答え
ていない。
加の一途をたどっている。カンジダ症およびアスペルギ
ルス症をはじめとする深在性（全身性）真菌症は、易感
染患者が高率に罹患する重要な感染症として医療上の問
題となっている。真菌症の治療には、様々な抗真菌剤が
開発されている。しかし、真菌剤は開発されていても、
真菌症であると診断するための迅速かつ確実な方法は未
だ開発されていないのが現状である。現在使用されてい
る深在性真菌症の診断法としては、病原真菌の検出、病
原真菌の抗原またはこれに対する抗体を免疫学的に検出
する方法、病原真菌の菌体成分または代謝産物を生化学
的に検出する方法などがある。例えば、カンジダ症の診
断には、カンジダ抗原またはこれに対する抗体を検出す
る方法がある。しかし、病理学的に真菌感染が認められ
ない患者（健康人を含む）をも検出するという擬陽性の
問題があり、また感度の点でも臨床的な要請に十分答え
ていない。
【０００３】アスペルギルス症の診断は、臨床検体から
得られた培養、同定によって行われるが、たとえ病理学
的にアスペルギルスの感染が明かな症例であったとして
も、患者の検体からアスペルギルスが培養される割合
（陽性率）は低く、さらに培養が出来たとしてもアスペ
ルギルス属の同定の根拠となる分生子頭が形成されるま
でに２週間以上かかるのが普通であり、このことがアス
ペルギルス症の発症前診断を困難にしている。現在のと
ころ、アスペルギルス症の診断キットとして現在までに
認可されているものはなく、実験室的な診断法としてア
スペルギルス抗原またはこれに対する抗体を免疫学的に
検出する方法、アスペルギルスの菌体成分または代謝産
物を生化学的に検出する方法があるが、いずれの方法
も、病理学的に真菌感染が認められない患者（健康人を
含む）をも検出してしまう欠点がある。
得られた培養、同定によって行われるが、たとえ病理学
的にアスペルギルスの感染が明かな症例であったとして
も、患者の検体からアスペルギルスが培養される割合
（陽性率）は低く、さらに培養が出来たとしてもアスペ
ルギルス属の同定の根拠となる分生子頭が形成されるま
でに２週間以上かかるのが普通であり、このことがアス
ペルギルス症の発症前診断を困難にしている。現在のと
ころ、アスペルギルス症の診断キットとして現在までに
認可されているものはなく、実験室的な診断法としてア
スペルギルス抗原またはこれに対する抗体を免疫学的に
検出する方法、アスペルギルスの菌体成分または代謝産
物を生化学的に検出する方法があるが、いずれの方法
も、病理学的に真菌感染が認められない患者（健康人を
含む）をも検出してしまう欠点がある。
【０００４】カンジダ症およびアスペルギルス症のほか
にも、クリプトコッカス症およびカリニ原虫による感染
症はＡＩＤＳおよび移植患者などの易感染性宿主におけ
る重要な病原微生物による疾患である。クリプトコッカ
ス症の診断には、免疫凝集反応を用いる方法があるが、
この方法はトリコスポロン・クタネウム（Trichosporon
cutaneum）が病原と考えられる夏型過敏性肺臓炎の患
者をも検出して擬陽性反応を示すことがあり、更に鑑別
が必要となっている。また、カリニ原虫の培養は一般的
には不可能であり、グロコット染色により虫体を顕微鏡
で検出する方法に頼っている。さらに虫体総数の大部分
を占めるトロフォゾイトを染めることは難しく、確実な
診断のためには多量の虫体を必要としているのが現状で
ある。
にも、クリプトコッカス症およびカリニ原虫による感染
症はＡＩＤＳおよび移植患者などの易感染性宿主におけ
る重要な病原微生物による疾患である。クリプトコッカ
ス症の診断には、免疫凝集反応を用いる方法があるが、
この方法はトリコスポロン・クタネウム（Trichosporon
cutaneum）が病原と考えられる夏型過敏性肺臓炎の患
者をも検出して擬陽性反応を示すことがあり、更に鑑別
が必要となっている。また、カリニ原虫の培養は一般的
には不可能であり、グロコット染色により虫体を顕微鏡
で検出する方法に頼っている。さらに虫体総数の大部分
を占めるトロフォゾイトを染めることは難しく、確実な
診断のためには多量の虫体を必要としているのが現状で
ある。
【０００５】さらに、広範囲の深在性病原性真菌を迅
速、確実に検出する事の重要性は深在性真菌症に対する
薬剤の開発とも密接に関係する。病原真菌の菌種によっ
て抗菌剤を選択する必要があるからである。そのため
に、病原真菌の同定が必要とされる場合が少なくない。
従って、直接的で簡便、迅速かつ確実な真菌の検出およ
び真菌の菌種の同定の方法が望まれていた。
速、確実に検出する事の重要性は深在性真菌症に対する
薬剤の開発とも密接に関係する。病原真菌の菌種によっ
て抗菌剤を選択する必要があるからである。そのため
に、病原真菌の同定が必要とされる場合が少なくない。
従って、直接的で簡便、迅速かつ確実な真菌の検出およ
び真菌の菌種の同定の方法が望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、直接
的で簡便、迅速かつ確実な真菌の検出および真菌の菌種
の同定の方法と、それに用いる新規のオリゴヌクレオチ
ド、ならびにその検出用試薬を提供することである。
的で簡便、迅速かつ確実な真菌の検出および真菌の菌種
の同定の方法と、それに用いる新規のオリゴヌクレオチ
ド、ならびにその検出用試薬を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
解決のため真菌およびその他の生物の１８Ｓリボゾーム
ＲＮＡ（以下１８ＳｒＲＮＡという）遺伝子に関して種
々の検討を重ねた結果、真菌の検出および真菌の菌種の
同定に適当な核酸配列を得、それを用いた検出方法を確
立して本発明を完成させるに至った。
解決のため真菌およびその他の生物の１８Ｓリボゾーム
ＲＮＡ（以下１８ＳｒＲＮＡという）遺伝子に関して種
々の検討を重ねた結果、真菌の検出および真菌の菌種の
同定に適当な核酸配列を得、それを用いた検出方法を確
立して本発明を完成させるに至った。
【０００８】本発明は、真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の
核酸配列とハイブリダイズする、真菌の検出および真菌
の菌種同定用オリゴヌクレオチドである。
核酸配列とハイブリダイズする、真菌の検出および真菌
の菌種同定用オリゴヌクレオチドである。
【０００９】本発明における真菌とは、カンジダ属、ハ
ンセヌラ属、サッカロマイセス属、トリコスポロン属、
クリプトコッカス属、アスペルギルス属、ペニシリウム
属、ブラストマイセス属、コクシジオイデス属、ニュウ
モシスチス属、マラセジア属およびデバリオマイセス属
を含む。上記オリゴヌレオチドは、好ましくは、配列番
号１に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはその
相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有
する（以下、核酸配列を示す場合に、Ａはアデニン、Ｃ
はシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、
いずれの位置のＴがウラシル（Ｕ）と置換されていても
よい）。以下、核酸配列の一部は、少なくとも５塩基以
上、好ましくは10塩基以上、さらに好ましくは20塩基以
上の長さを有する。
ンセヌラ属、サッカロマイセス属、トリコスポロン属、
クリプトコッカス属、アスペルギルス属、ペニシリウム
属、ブラストマイセス属、コクシジオイデス属、ニュウ
モシスチス属、マラセジア属およびデバリオマイセス属
を含む。上記オリゴヌレオチドは、好ましくは、配列番
号１に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはその
相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有
する（以下、核酸配列を示す場合に、Ａはアデニン、Ｃ
はシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、
いずれの位置のＴがウラシル（Ｕ）と置換されていても
よい）。以下、核酸配列の一部は、少なくとも５塩基以
上、好ましくは10塩基以上、さらに好ましくは20塩基以
上の長さを有する。
【００１０】好ましい実施態様においては、オリゴヌク
レオチドは、配列番号１に記載の核酸配列の一部または
全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選
択される配列を含有する。
レオチドは、配列番号１に記載の核酸配列の一部または
全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選
択される配列を含有する。
【００１１】さらに好ましい実施態様においては、オリ
ゴヌクレオチドは配列番号２、配列番号３、配列番号４
または配列番号５に記載の核酸配列の一部または全部、
あるいはそれらの相補配列の一部または全部、から選択
される配列を含有する。
ゴヌクレオチドは配列番号２、配列番号３、配列番号４
または配列番号５に記載の核酸配列の一部または全部、
あるいはそれらの相補配列の一部または全部、から選択
される配列を含有する。
【００１２】また本発明は、カンジダ・アルビカンス
（Candida albicans）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配
列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド
である。
（Candida albicans）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配
列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド
である。
【００１３】好ましい実施態様においては、そのオリゴ
ヌクレオチドが配列番号６に記載の核酸配列の一部また
は全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から
選択される配列を含有する。
ヌクレオチドが配列番号６に記載の核酸配列の一部また
は全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から
選択される配列を含有する。
【００１４】また本発明は、カンジダ・ルシタニエ（Ca
ndida lusitaniae）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列
と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドで
ある。 好ましい実施態様においては、そのオリゴヌク
レオチドは配列番号７に記載の核酸配列の一部または全
部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選択
される配列を含有する。
ndida lusitaniae）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列
と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドで
ある。 好ましい実施態様においては、そのオリゴヌク
レオチドは配列番号７に記載の核酸配列の一部または全
部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選択
される配列を含有する。
【００１５】また本発明は、カンジダ・クルゼイ（Cand
ida krusei）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列と特異
的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドである。
好ましい実施態様においては、そのオリゴヌクレオチド
は配列番号８に記載の核酸配列の一部または全部、ある
いはその相補配列の一部または全部、から選択される配
列を含有する。
ida krusei）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列と特異
的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドである。
好ましい実施態様においては、そのオリゴヌクレオチド
は配列番号８に記載の核酸配列の一部または全部、ある
いはその相補配列の一部または全部、から選択される配
列を含有する。
【００１６】また本発明は、カンジダ・グラブラータ
（Candida glabrata）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配
列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド
である。 好ましい実施態様においては、そのオリゴヌ
クレオチドは配列番号９に記載の核酸配列の一部または
全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選
択される配列を含有する。
（Candida glabrata）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配
列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド
である。 好ましい実施態様においては、そのオリゴヌ
クレオチドは配列番号９に記載の核酸配列の一部または
全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選
択される配列を含有する。
【００１７】また本発明は、クリプトコッカス・ネオフ
ォルマンス（Cryptococcus neoformans）の１８ＳｒＲ
ＮＡ遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、
オリゴヌクレオチドである。好ましい実施態様において
は、そのオリゴヌクレオチドは配列番号１０に記載の核
酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列の一部
または全部、から選択される配列を含有する。
ォルマンス（Cryptococcus neoformans）の１８ＳｒＲ
ＮＡ遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、
オリゴヌクレオチドである。好ましい実施態様において
は、そのオリゴヌクレオチドは配列番号１０に記載の核
酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列の一部
または全部、から選択される配列を含有する。
【００１８】また本発明は、アスペルギルス・フミガタ
ス（Aspergillus fumigatus）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子
の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌク
レオチドである。好ましい実施態様においては、そのオ
リゴヌクレオチドは配列番号５または配列番号１１に記
載の核酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列
の一部または全部、から選択される配列を含有する。
ス（Aspergillus fumigatus）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子
の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌク
レオチドである。好ましい実施態様においては、そのオ
リゴヌクレオチドは配列番号５または配列番号１１に記
載の核酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列
の一部または全部、から選択される配列を含有する。
【００１９】また本発明は、ニュウモシスチス・カリニ
（Pneumocistis carinii）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核
酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオ
チドである。好ましい実施態様においては、そのオリゴ
ヌクレオチドは配列番号１２に記載の核酸配列の一部ま
たは全部、あるいはその相補配列の一部または全部、か
ら選択される配列を含有する。
（Pneumocistis carinii）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核
酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオ
チドである。好ましい実施態様においては、そのオリゴ
ヌクレオチドは配列番号１２に記載の核酸配列の一部ま
たは全部、あるいはその相補配列の一部または全部、か
ら選択される配列を含有する。
【００２０】また本発明は、真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝
子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌ
クレオチドであり、好ましい実施態様においては、その
オリゴヌクレオチドが配列番号１に記載の核酸配列の一
部、あるいはその相補配列の一部を、真菌の菌種に応じ
て改変した配列を含有する。
子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌ
クレオチドであり、好ましい実施態様においては、その
オリゴヌクレオチドが配列番号１に記載の核酸配列の一
部、あるいはその相補配列の一部を、真菌の菌種に応じ
て改変した配列を含有する。
【００２１】また本発明は、上記オリゴヌクレオチドを
プローブまたはプライマーとして使用する真菌の検出お
よび真菌の菌種同定方法である。さらに本発明は、上記
オリゴヌクレオチドを含有する標識プローブである。さ
らに本発明は、上記オリゴヌクレオチドを含有する核酸
プライマーである。本発明は、上記標識プローブを含
む、真菌の検出および真菌の菌種同定用試薬キットであ
る。さらに本発明は、上記核酸プライマーを含む、真菌
の検出および真菌の菌種同定用試薬キットである。
プローブまたはプライマーとして使用する真菌の検出お
よび真菌の菌種同定方法である。さらに本発明は、上記
オリゴヌクレオチドを含有する標識プローブである。さ
らに本発明は、上記オリゴヌクレオチドを含有する核酸
プライマーである。本発明は、上記標識プローブを含
む、真菌の検出および真菌の菌種同定用試薬キットであ
る。さらに本発明は、上記核酸プライマーを含む、真菌
の検出および真菌の菌種同定用試薬キットである。
【００２２】以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】本発明者らは、現在までに決定された真菌
およびその他の生物の遺伝子配列データバンク（GenBan
k）に登録されている１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を参考
にして各属および種間の遺伝子配列の相同性の理論的検
証と実験的検証を重ねた結果、配列番号１に記載の１位
から６８７位までの６８７塩基対の核酸配列に相当する
部分が、真菌の検出および真菌の菌種の同定に関して適
当な核酸配列であることを見い出した。この６８７塩基
対の領域に相当する部分（カンジダ・アルビカンスでは
６７３塩基対であるが、他の属では長さが異なる場合が
ある）は、真菌種間で保存されている相同性の高い部分
（以下、真菌共通領域という）と、真菌科内でも属また
は種によって配列が大きく異なる部分（以下、属または
種特異的領域という）とからなり、本発明者らはこれら
の領域の配列を検出することで真菌の検出および真菌の
菌種の同定を可能にした。
およびその他の生物の遺伝子配列データバンク（GenBan
k）に登録されている１８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を参考
にして各属および種間の遺伝子配列の相同性の理論的検
証と実験的検証を重ねた結果、配列番号１に記載の１位
から６８７位までの６８７塩基対の核酸配列に相当する
部分が、真菌の検出および真菌の菌種の同定に関して適
当な核酸配列であることを見い出した。この６８７塩基
対の領域に相当する部分（カンジダ・アルビカンスでは
６７３塩基対であるが、他の属では長さが異なる場合が
ある）は、真菌種間で保存されている相同性の高い部分
（以下、真菌共通領域という）と、真菌科内でも属また
は種によって配列が大きく異なる部分（以下、属または
種特異的領域という）とからなり、本発明者らはこれら
の領域の配列を検出することで真菌の検出および真菌の
菌種の同定を可能にした。
【００２４】上記の真菌共通領域は、真菌種内ではよく
保存されているが他の生物とは配列に相違があり、本発
明者らはこの領域の真菌に共通する配列を検出して真菌
の存在を検出し得ることを実験的に確認した。具体的に
は、例えば、この真菌共通領域内の核酸配列またはその
相補配列である、配列番号２、配列番号３、配列番号４
または配列番号５に記載の核酸配列の一部または全部を
含有するオリゴヌクレオチドを核酸プライマーまたは標
識プローブとして使用して真菌を検出する。これによ
り、１回の測定で全ての真菌を検出し得る。しかし、こ
の測定のみでは真菌属および真菌の菌種を同定し得な
い。
保存されているが他の生物とは配列に相違があり、本発
明者らはこの領域の真菌に共通する配列を検出して真菌
の存在を検出し得ることを実験的に確認した。具体的に
は、例えば、この真菌共通領域内の核酸配列またはその
相補配列である、配列番号２、配列番号３、配列番号４
または配列番号５に記載の核酸配列の一部または全部を
含有するオリゴヌクレオチドを核酸プライマーまたは標
識プローブとして使用して真菌を検出する。これによ
り、１回の測定で全ての真菌を検出し得る。しかし、こ
の測定のみでは真菌属および真菌の菌種を同定し得な
い。
【００２５】上記の種特異的領域は、真菌属間でも、そ
して属内の真菌の菌種間でも配列の相違があり、本発明
者らはこの領域の特定の真菌種に特有の配列を検出する
ことで、その真菌の存在を検出し得ることを実験的に確
認した。具体的には、例えば、カンジダ・アルビカンス
の種特異的領域内の核酸配列またはその相補配列であ
る、配列番号６に記載の核酸配列の一部または全部を含
有するオリゴヌクレオチドを核酸プライマーおよび標識
プローブとして使用して、カンジダ・アルビカンスを検
出する。
して属内の真菌の菌種間でも配列の相違があり、本発明
者らはこの領域の特定の真菌種に特有の配列を検出する
ことで、その真菌の存在を検出し得ることを実験的に確
認した。具体的には、例えば、カンジダ・アルビカンス
の種特異的領域内の核酸配列またはその相補配列であ
る、配列番号６に記載の核酸配列の一部または全部を含
有するオリゴヌクレオチドを核酸プライマーおよび標識
プローブとして使用して、カンジダ・アルビカンスを検
出する。
【００２６】真菌の他の菌種についても、それぞれの菌
種に特有の配列を検出してカンジダ・アルビカンスと同
様に検出し得る。例えば、カンジダ・アルビカンスの場
合配列番号６に記載の核酸配列の領域に相当する配列
は、カンジダ・ルシタニエ（Candida lusitaniae）では
配列番号７に記載の核酸配列であり、カンジダ・クルゼ
イ（Candida krusei）では配列番号８に記載の核酸配列
であり、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）
では配列番号９に記載の核酸配列であり、クリプトコッ
カス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）
では配列番号１０に記載の核酸配列であり、アスペルギ
ルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）では配列
番号１１に記載の核酸配列であり、ニュウモシスチス・
カリニ（Pneumocistis carinii）では配列番号１２に記
載の核酸配列である。
種に特有の配列を検出してカンジダ・アルビカンスと同
様に検出し得る。例えば、カンジダ・アルビカンスの場
合配列番号６に記載の核酸配列の領域に相当する配列
は、カンジダ・ルシタニエ（Candida lusitaniae）では
配列番号７に記載の核酸配列であり、カンジダ・クルゼ
イ（Candida krusei）では配列番号８に記載の核酸配列
であり、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）
では配列番号９に記載の核酸配列であり、クリプトコッ
カス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）
では配列番号１０に記載の核酸配列であり、アスペルギ
ルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）では配列
番号１１に記載の核酸配列であり、ニュウモシスチス・
カリニ（Pneumocistis carinii）では配列番号１２に記
載の核酸配列である。
【００２７】従って、配列番号６から配列番号１２のい
ずれかに記載の核酸配列の一部または全部を含有するオ
リゴヌクレオチドを核酸プライマーまたは標識プローブ
として使用すれば、それぞれ、カンジダ・アルビカンス
（配列番号６）、カンジダ・ルシタニエ（配列番号
７）、カンジダ・クルゼイ（配列番号８）、カンジダ・
グラブラータ（配列番号９）、クリプトコッカス・ネオ
フォルマンス（配列番号１０）、アスペルギルス・フミ
ガタス（配列番号１１）、およびニュウモシスチス・カ
リニ（配列番号１２）を検出し得る。
ずれかに記載の核酸配列の一部または全部を含有するオ
リゴヌクレオチドを核酸プライマーまたは標識プローブ
として使用すれば、それぞれ、カンジダ・アルビカンス
（配列番号６）、カンジダ・ルシタニエ（配列番号
７）、カンジダ・クルゼイ（配列番号８）、カンジダ・
グラブラータ（配列番号９）、クリプトコッカス・ネオ
フォルマンス（配列番号１０）、アスペルギルス・フミ
ガタス（配列番号１１）、およびニュウモシスチス・カ
リニ（配列番号１２）を検出し得る。
【００２８】本発明におけるオリゴヌクレオチドは、配
列表の配列番号１の１位のＡから６８７位のＡまでの核
酸配列の一部、あるいはその相補配列の一部を、真菌の
菌種に応じて改変した配列を含有する。ここで一部の改
変とは１または２以上のDNAの欠失・挿入・置換などを
いい、部位特異的点突然変異、あるいは欠失突然変異な
どを含む。
列表の配列番号１の１位のＡから６８７位のＡまでの核
酸配列の一部、あるいはその相補配列の一部を、真菌の
菌種に応じて改変した配列を含有する。ここで一部の改
変とは１または２以上のDNAの欠失・挿入・置換などを
いい、部位特異的点突然変異、あるいは欠失突然変異な
どを含む。
【００２９】本発明における検出には、上記の１８Ｓｒ
ＲＮＡの遺伝子配列を検出して、血液、喀痰などのよう
な各種臨床検体中に含まれる真菌および真菌の種を検出
すること以外に、単離および培養された菌体の真菌種を
判定することなども含まれることはいうまでもない。ま
た、本発明における試料には、上記各種臨床検体、上記
単離、培養菌体、およびこれらから単離、精製された核
酸なども含まれる。また、増幅された核酸も含まれ得
る。
ＲＮＡの遺伝子配列を検出して、血液、喀痰などのよう
な各種臨床検体中に含まれる真菌および真菌の種を検出
すること以外に、単離および培養された菌体の真菌種を
判定することなども含まれることはいうまでもない。ま
た、本発明における試料には、上記各種臨床検体、上記
単離、培養菌体、およびこれらから単離、精製された核
酸なども含まれる。また、増幅された核酸も含まれ得
る。
【００３０】本発明はまた、標識プローブに関する。標
識プローブとして使用するオリゴヌクレオチドは、配列
表に記載の配列またはその相補配列の全域を使用する必
要はなく、使用する核酸ハイブリダイゼーション条件に
合わせて解離温度（Ｔｍ値）などを計算し、適当な領域
を適当な長さで使用し得る。しかし、十分な特異性を有
するプローブは、望ましくは１０塩基以上、さらに望ま
しくは２０塩基以上の長さが適当である。本発明の核酸
プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドも、配列
またはその相補配列から、適当な長さの配列を用いて作
製し得る。また、使用する条件および目的などに応じ
て、オリゴヌクレオチド中に、ある程度の改変を行い得
ることは容易に予想できる。
識プローブとして使用するオリゴヌクレオチドは、配列
表に記載の配列またはその相補配列の全域を使用する必
要はなく、使用する核酸ハイブリダイゼーション条件に
合わせて解離温度（Ｔｍ値）などを計算し、適当な領域
を適当な長さで使用し得る。しかし、十分な特異性を有
するプローブは、望ましくは１０塩基以上、さらに望ま
しくは２０塩基以上の長さが適当である。本発明の核酸
プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドも、配列
またはその相補配列から、適当な長さの配列を用いて作
製し得る。また、使用する条件および目的などに応じ
て、オリゴヌクレオチド中に、ある程度の改変を行い得
ることは容易に予想できる。
【００３１】本発明のオリゴヌクレオチドは化学合成に
より調製し得るので、クローン化したオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドに比べて、容易に、大量にか
つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドが得られ得る。
本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のいずれでもあり得る。
リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基
（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。あるいは任
意の位置のＴをＵに変えて合成を行ったウリジン残基を
含むＤＮＡでもあり得る。同様に任意の位置のＵをＴに
変えたチミジン残基を含むＲＮＡでもあり得る。さらに
オリゴヌクレオチド中に欠失、挿入または置換のような
点突然変異、あるいは改変ヌクレオチドがあり得る。
より調製し得るので、クローン化したオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドに比べて、容易に、大量にか
つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドが得られ得る。
本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のいずれでもあり得る。
リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基
（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。あるいは任
意の位置のＴをＵに変えて合成を行ったウリジン残基を
含むＤＮＡでもあり得る。同様に任意の位置のＵをＴに
変えたチミジン残基を含むＲＮＡでもあり得る。さらに
オリゴヌクレオチド中に欠失、挿入または置換のような
点突然変異、あるいは改変ヌクレオチドがあり得る。
【００３２】本発明の標識プローブとしての標識は放射
性物質、酵素、蛍光物質、または発光物質など公知の標
識物が用いられ得る。標識の方法は末端標識または配列
中の標識のいずれでもあり得る。あるいは糖、リン酸
基、または塩基部分への標識もあり得る。例えば、リン
カーアームを有するヌクレオチドを配列中のオリゴヌク
レオチドと置換して酵素標識し得る（Nucleic Acids Re
s.; 14巻6115頁1986年）。５位にリンカーアームを有す
るウリジンを、特開昭60-500717号公報に開示された合
成法によりデオキシウリジンから化学合成し、上記オリ
ゴヌクレオチドに導入し得る。
性物質、酵素、蛍光物質、または発光物質など公知の標
識物が用いられ得る。標識の方法は末端標識または配列
中の標識のいずれでもあり得る。あるいは糖、リン酸
基、または塩基部分への標識もあり得る。例えば、リン
カーアームを有するヌクレオチドを配列中のオリゴヌク
レオチドと置換して酵素標識し得る（Nucleic Acids Re
s.; 14巻6115頁1986年）。５位にリンカーアームを有す
るウリジンを、特開昭60-500717号公報に開示された合
成法によりデオキシウリジンから化学合成し、上記オリ
ゴヌクレオチドに導入し得る。
【００３３】本発明のオリゴヌクレオチドは固相担体に
結合して、捕捉プローブとしても用いられ得る。この場
合、捕捉プローブと標識プローブとの組合せでサンドイ
ッチアッセイ（特開昭58-40099号公報参照）を行い得
る。あるいは、標的核酸を標識して捕捉する方法（特開
昭62-265999 号公報参照）も用いられ得る。あるいは、
オリゴヌクレオチドをビオチンで標識し、ハイブリダイ
ゼーション後にアビジン結合担体で捕捉する方法も用い
られ得る。
結合して、捕捉プローブとしても用いられ得る。この場
合、捕捉プローブと標識プローブとの組合せでサンドイ
ッチアッセイ（特開昭58-40099号公報参照）を行い得
る。あるいは、標的核酸を標識して捕捉する方法（特開
昭62-265999 号公報参照）も用いられ得る。あるいは、
オリゴヌクレオチドをビオチンで標識し、ハイブリダイ
ゼーション後にアビジン結合担体で捕捉する方法も用い
られ得る。
【００３４】本発明は更に核酸プライマーに関する。オ
リゴヌクレオチドをプライマーとして使用する場合、Ｄ
ＮＡポリメラーゼなどによる核酸増幅（例えばＰＣＲ；
特開昭60-281号公報参照）を行い、真菌のみについて共
通の領域の核酸配列の増幅またはカンジダ・アルビカン
スなど特定の菌種に特有の配列のみの増幅がされ得る。
ＰＣＲ反応時に放射性標識ヌクレオチドを取り込ませる
方法またはＰＣＲ増幅産物を電気泳動により分画して特
有のバンドを検出する方法で、容易に１８ＳｒＲＮＡ遺
伝子の核酸配列を検出し得る。あるいは、上記標識オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅産物を直
接検出し得る。
リゴヌクレオチドをプライマーとして使用する場合、Ｄ
ＮＡポリメラーゼなどによる核酸増幅（例えばＰＣＲ；
特開昭60-281号公報参照）を行い、真菌のみについて共
通の領域の核酸配列の増幅またはカンジダ・アルビカン
スなど特定の菌種に特有の配列のみの増幅がされ得る。
ＰＣＲ反応時に放射性標識ヌクレオチドを取り込ませる
方法またはＰＣＲ増幅産物を電気泳動により分画して特
有のバンドを検出する方法で、容易に１８ＳｒＲＮＡ遺
伝子の核酸配列を検出し得る。あるいは、上記標識オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅産物を直
接検出し得る。
【００３５】本発明はまた、真菌の検出、真菌の菌種の
同定、あるいは真菌の検出と菌種の同定とを行う方法で
ある。
同定、あるいは真菌の検出と菌種の同定とを行う方法で
ある。
【００３６】上記真菌共通領域の配列を利用する真菌の
検出と、上記種特異的領域の特定の真菌種に特有の配列
を利用する特定の真菌種の検出とは、それぞれのみでも
臨床診断上有用であるが、これらを有機的に組み合わせ
ることによりさらにその有用性を高め得る。例えば、配
列番号２または配列番号３に記載の核酸配列を含有する
オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて臨床
検体についてＰＣＲを行えば、真菌についてのみ、１８
ＳｒＲＮＡの遺伝子配列の一部を有するＤＮＡが増幅さ
れる。このＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動,または
真菌に共通する配列である配列番号４に記載の核酸配列
を有する標識プローブを用いるハイブリダイゼーション
アッセイにより検出し、各種真菌の存在を検出し得る。
さらに、この増幅したＤＮＡは菌種によって配列が異な
る部分を含有しているので、配列番号６、配列番号７、
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１
および配列番号１２などに記載の核酸配列を含む標識プ
ローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイにより
これらのＤＮＡを検出し、臨床検体中の真菌の菌種を同
定し得る。更に真菌に共通の配列を有するオリゴヌクレ
オチドと菌種に特異的な配列を有するオリゴヌクレオチ
ドとを同時に用いることにより真菌の検出と菌種の同定
が同時に行われ得る。
検出と、上記種特異的領域の特定の真菌種に特有の配列
を利用する特定の真菌種の検出とは、それぞれのみでも
臨床診断上有用であるが、これらを有機的に組み合わせ
ることによりさらにその有用性を高め得る。例えば、配
列番号２または配列番号３に記載の核酸配列を含有する
オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて臨床
検体についてＰＣＲを行えば、真菌についてのみ、１８
ＳｒＲＮＡの遺伝子配列の一部を有するＤＮＡが増幅さ
れる。このＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動,または
真菌に共通する配列である配列番号４に記載の核酸配列
を有する標識プローブを用いるハイブリダイゼーション
アッセイにより検出し、各種真菌の存在を検出し得る。
さらに、この増幅したＤＮＡは菌種によって配列が異な
る部分を含有しているので、配列番号６、配列番号７、
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１
および配列番号１２などに記載の核酸配列を含む標識プ
ローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイにより
これらのＤＮＡを検出し、臨床検体中の真菌の菌種を同
定し得る。更に真菌に共通の配列を有するオリゴヌクレ
オチドと菌種に特異的な配列を有するオリゴヌクレオチ
ドとを同時に用いることにより真菌の検出と菌種の同定
が同時に行われ得る。
【００３７】この方法により、長時間を要する従来の培
養法に比べて極めて短時間（１日以内）に真菌の検出お
よび真菌の菌種の同定を行い得る。具体的には、易感染
性患者などの臨床検体などを配列番号２または配列番号
３に記載の核酸配列を含有する核酸プライマーを用いて
ＤＮＡを増幅し、１８ＳｒＲＮＡの遺伝子配列の一部を
有するＤＮＡの増幅により真菌の存在が証明される。さ
らに、この増幅されたＤＮＡがハイブリダイゼーション
アッセイにおいて配列番号６に記載の核酸配列を含む標
識プローブとの反応により、カンジダ・アルビカンスの
存在が証明され、病原体として疑われる。反応しない場
合、別の真菌が病原体として疑われる。この真菌の菌種
は、増幅したＤＮＡをさらに別の標識プローブで調べて
同定し得る。
養法に比べて極めて短時間（１日以内）に真菌の検出お
よび真菌の菌種の同定を行い得る。具体的には、易感染
性患者などの臨床検体などを配列番号２または配列番号
３に記載の核酸配列を含有する核酸プライマーを用いて
ＤＮＡを増幅し、１８ＳｒＲＮＡの遺伝子配列の一部を
有するＤＮＡの増幅により真菌の存在が証明される。さ
らに、この増幅されたＤＮＡがハイブリダイゼーション
アッセイにおいて配列番号６に記載の核酸配列を含む標
識プローブとの反応により、カンジダ・アルビカンスの
存在が証明され、病原体として疑われる。反応しない場
合、別の真菌が病原体として疑われる。この真菌の菌種
は、増幅したＤＮＡをさらに別の標識プローブで調べて
同定し得る。
【００３８】従来、ｒＲＮＡそのものをハイブリダイゼ
ーションアッセイで検出して真菌の菌種を同定する方法
（特表平1-503356号公報参照）などが開発されている
が、やはり感度が低く、培養を必要とする。さらにＲＮ
Ａは分解し易いため菌体から抽出する操作が難しく、し
かもそのＲＮＡサンプルは保存および扱いが難しい。こ
のため再現性に問題がある。本発明は、１８ＳｒＲＮＡ
の遺伝子ＤＮＡを検出し得る。ＤＮＡは極めて安定であ
り、簡単な操作で抽出し得、保存性もよくＤＮＡ増幅も
容易である。
ーションアッセイで検出して真菌の菌種を同定する方法
（特表平1-503356号公報参照）などが開発されている
が、やはり感度が低く、培養を必要とする。さらにＲＮ
Ａは分解し易いため菌体から抽出する操作が難しく、し
かもそのＲＮＡサンプルは保存および扱いが難しい。こ
のため再現性に問題がある。本発明は、１８ＳｒＲＮＡ
の遺伝子ＤＮＡを検出し得る。ＤＮＡは極めて安定であ
り、簡単な操作で抽出し得、保存性もよくＤＮＡ増幅も
容易である。
【００３９】
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示して、本発明
の効果をより一層明確にする。
の効果をより一層明確にする。
【００４０】（実施例１） （１）真菌検出用ＰＣＲプライマーの合成 ＤＮＡシンセサイザー３９２型（ABI社製）を用いて、
ホスホアミダイト法にて、配列番号２に記載の配列を有
するオリゴヌクレオチド（以下、真菌プライマーＦとい
う）および配列番号３に記載の配列を有するオリゴヌク
レオチド（以下、真菌プライマーＲという）を合成し
た。手法はABI社のマニュアルに従い、各種オリゴヌク
レオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施し
た。精製はＨＰＬＣ（ベックマン社製）を用いて逆相カ
ラムにて実施した。
ホスホアミダイト法にて、配列番号２に記載の配列を有
するオリゴヌクレオチド（以下、真菌プライマーＦとい
う）および配列番号３に記載の配列を有するオリゴヌク
レオチド（以下、真菌プライマーＲという）を合成し
た。手法はABI社のマニュアルに従い、各種オリゴヌク
レオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施し
た。精製はＨＰＬＣ（ベックマン社製）を用いて逆相カ
ラムにて実施した。
【００４１】（２）試料の調製 以下に示すＤＮＡをＰＣＲの試料として使用した。カン
ジダ・アルビカンスの培養、そのスフェロプラストの調
製およびゲノムＤＮＡの調製は、阿部らの方法［昭和６
２年１１月１０日、（株）ソフトサイエンス社発行、口
野嘉幸ほか２名編「遺伝子・タンパク質・実験操作ブロ
ッティング法」（初版）］に従って行った。その他の細
菌および生物試料については、それぞれのＤＮＡ抽出お
よび精製の常法に従って調製したものを、最終１ng／μ
l濃度となるようにＰＣＲ反応液に加えた。
ジダ・アルビカンスの培養、そのスフェロプラストの調
製およびゲノムＤＮＡの調製は、阿部らの方法［昭和６
２年１１月１０日、（株）ソフトサイエンス社発行、口
野嘉幸ほか２名編「遺伝子・タンパク質・実験操作ブロ
ッティング法」（初版）］に従って行った。その他の細
菌および生物試料については、それぞれのＤＮＡ抽出お
よび精製の常法に従って調製したものを、最終１ng／μ
l濃度となるようにＰＣＲ反応液に加えた。
【００４２】 1.カンジダ・アルビカンス（Candida albicans） ６株 2.カンジダ・アルビカンスヴァステラトイデ（Candida albicans var stellatoidea） ２株 3.カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis） ２株 4.カンジダ・クルゼイ（Candida kurusei） ２株 5.カンジダ・グイリエモンヂ（Candida guilliermondii） ２株 6.カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis） ２株 7.カンジダ・カフィル（Candida kafyr） ２株 8.カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata） ２株 9.カンジダ・ルシタニエ（Candida lusitaniae） ２株 10．サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi ae） ２株 11．クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neo formans） ２株 12．トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii） ２株 13．マラセジア・フウフウ（Malassezia furfur） ２株 14．アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus） １８株 15．アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus） ２株 16．アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans） ２株 17．アスペルギルス・オリゼイ（Aspergillus oryzae） １株 18．アスペルギルス・ベルジコラ（Aspergillus versicolor） ２株 19．アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus） ２株 20．ペニシリウム・エクパンズム(Penicillium expansum） １株 21．ペニシリウム・ノタツム（Penicillium notatum） １株 22．ペニシリウム・シトレビリデ（Penicillium citreo-vir ide） １株 23．ペニシリウム・フニクロズム（Penicillium fuiculosum） １株 24．ペニシリウム・オリゼイ（Penicillium oryzae） １株 25．ニュウモシスチス・カリニ（Pneumocistis carinii） １株 26．ハンセヌラ・アノマラ（Hansenula anomala） ２株 27．デバリオマイセス・ポリモロプス（Debaryomyces polymor phus） １株 28.アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger） ２株 （３）ＰＣＲ 反応液の組成は、それぞれ１μMのプライマーＦおよび
プライマーＲ、10mM Tris-HCl(pH8.9)、1.5mM MgCl2、8
0mM KCl、500μg/ml BSA、0.1%コール酸ナトリウム、0.
1% TritonX-100、それぞれ0.2mMのdATP、dCTP、dGTP、
およびdTTP、ならびに耐熱性のTth DNAポリメラーゼ
（東洋紡製）40単位/ml である。反応条件は次の通りで
ある。 熱変性： ９４℃、１分 アニーリング：５５℃、２分 重合反応： ７２℃、１分 上記操作をＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin-Elmer/C
etus社製）を用いて２５回行った。
プライマーＲ、10mM Tris-HCl(pH8.9)、1.5mM MgCl2、8
0mM KCl、500μg/ml BSA、0.1%コール酸ナトリウム、0.
1% TritonX-100、それぞれ0.2mMのdATP、dCTP、dGTP、
およびdTTP、ならびに耐熱性のTth DNAポリメラーゼ
（東洋紡製）40単位/ml である。反応条件は次の通りで
ある。 熱変性： ９４℃、１分 アニーリング：５５℃、２分 重合反応： ７２℃、１分 上記操作をＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin-Elmer/C
etus社製）を用いて２５回行った。
【００４３】（４）検出 ５μlの反応液を1.5％アガロースゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色した後、紫外線による蛍光を検
出した。泳動は、100ｖの定電圧で３０分間行った。操
作方法および他の条件は、ManiatisらのMolecular Clon
ing（1982年）に記載の方法に従った。反応液と同時に
分子量マーカーも泳動し、相対移動度を比較して、検出
されたＤＮＡ断片の長さを算出した。
チジウムブロマイド染色した後、紫外線による蛍光を検
出した。泳動は、100ｖの定電圧で３０分間行った。操
作方法および他の条件は、ManiatisらのMolecular Clon
ing（1982年）に記載の方法に従った。反応液と同時に
分子量マーカーも泳動し、相対移動度を比較して、検出
されたＤＮＡ断片の長さを算出した。
【００４４】（５）結果 アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色
した後に紫外線で６８７塩基対の蛍光バンドが確認され
たものを陽性とする。この結果、真菌の試料はすべてバ
ンドが確認され、陽性と判定されたのに対して、その他
の細菌および生物試料はいずれもバンドがみとめられ
ず、陰性と判定された。
した後に紫外線で６８７塩基対の蛍光バンドが確認され
たものを陽性とする。この結果、真菌の試料はすべてバ
ンドが確認され、陽性と判定されたのに対して、その他
の細菌および生物試料はいずれもバンドがみとめられ
ず、陰性と判定された。
【００４５】従って、本発明のオリゴヌクレオチドをＰ
ＣＲに用いて、真菌を特異的に検出し得ると判明した。
さらにＰＣＲなどのような核酸増幅による検出は高感度
が期待できるため、真菌を単離する前の臨床検体などか
ら直接検出し得、従来の培養に必要な時間（数週間）が
不要になると考えられる。
ＣＲに用いて、真菌を特異的に検出し得ると判明した。
さらにＰＣＲなどのような核酸増幅による検出は高感度
が期待できるため、真菌を単離する前の臨床検体などか
ら直接検出し得、従来の培養に必要な時間（数週間）が
不要になると考えられる。
【００４６】（実施例２） （１）リンカーアームを有する真菌の検出および真菌の
菌種同定用オリゴヌクレオチドの合成 ＤＮＡシンセサイザー３９２型（ABI社製）を用いて、
ホスホアミダイト法にて、配列番号６に記載の配列を有
するオリゴヌクレオチド（以下、プローブ１という）、
配列番号７に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド
（以下、プローブ２という）、配列番号８に記載の配列
を有するオリゴヌクレオチド（以下、プローブ３とい
う）、配列番号９に記載の配列を有するオリゴヌクレオ
チド（以下、プローブ４という）、配列番号１０に記載
の配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プローブ５
という）、配列番号１１に記載の配列を有するオリゴヌ
クレオチド（以下、プローブ６という）、および配列番
号１２に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド（以
下、プローブ７という）を合成した。この合成において
は、５位にリンカーアームを有するウリジンを、上記オ
リゴヌクレオチドに導入した。５位にリンカーアームを
有するウリジンは、特表昭60-500717号公報に開示され
た合成法によりデオキシウリジンから化学合成して調製
した。このウリジンはオリゴヌクレオチド内の任意のＴ
を置換し得るが、この実施例では５'末端のＴを置換し
た。合成リンカーオリゴヌクレオチドはアンモニア水で
５０℃、一夜脱保護処理した後、ＨＰＬＣ（ベックマン
社製）の逆相カラムを用いて精製した。
菌種同定用オリゴヌクレオチドの合成 ＤＮＡシンセサイザー３９２型（ABI社製）を用いて、
ホスホアミダイト法にて、配列番号６に記載の配列を有
するオリゴヌクレオチド（以下、プローブ１という）、
配列番号７に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド
（以下、プローブ２という）、配列番号８に記載の配列
を有するオリゴヌクレオチド（以下、プローブ３とい
う）、配列番号９に記載の配列を有するオリゴヌクレオ
チド（以下、プローブ４という）、配列番号１０に記載
の配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プローブ５
という）、配列番号１１に記載の配列を有するオリゴヌ
クレオチド（以下、プローブ６という）、および配列番
号１２に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド（以
下、プローブ７という）を合成した。この合成において
は、５位にリンカーアームを有するウリジンを、上記オ
リゴヌクレオチドに導入した。５位にリンカーアームを
有するウリジンは、特表昭60-500717号公報に開示され
た合成法によりデオキシウリジンから化学合成して調製
した。このウリジンはオリゴヌクレオチド内の任意のＴ
を置換し得るが、この実施例では５'末端のＴを置換し
た。合成リンカーオリゴヌクレオチドはアンモニア水で
５０℃、一夜脱保護処理した後、ＨＰＬＣ（ベックマン
社製）の逆相カラムを用いて精製した。
【００４７】（２）リンカーオリゴヌクレオチドの酵素
（アルカリ性ホスファターゼ）による標識 上記リンカーオリゴヌクレオチドと、そのリンカーアー
ムを介するアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文献
（Nucleic Acids Res.; 14巻6115頁1986年）に従って
行った。
（アルカリ性ホスファターゼ）による標識 上記リンカーオリゴヌクレオチドと、そのリンカーアー
ムを介するアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文献
（Nucleic Acids Res.; 14巻6115頁1986年）に従って
行った。
【００４８】リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260を0.
2M NaHCO3 12.5μlに溶解し、次いで10mg/mlスベリン酸
ジスクシニミジル（ＤＳＳ）25μlを加えて室温で２分
間反応させた。反応液を1mM CH3COONa（pH5.0)で平衡化
したSephadex G-25（ファルマシア社製）カラム（1cmφ
x30cm)でゲル濾過して過剰のＤＳＳを除去した。
2M NaHCO3 12.5μlに溶解し、次いで10mg/mlスベリン酸
ジスクシニミジル（ＤＳＳ）25μlを加えて室温で２分
間反応させた。反応液を1mM CH3COONa（pH5.0)で平衡化
したSephadex G-25（ファルマシア社製）カラム（1cmφ
x30cm)でゲル濾過して過剰のＤＳＳを除去した。
【００４９】末端のアミノ基が活性化されたリンカーオ
リゴヌクレオチドを、さらにモル比で２倍量のアルカリ
性ホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製、100m
M NaHCO3、3M NaClに溶解したもの）と室温で１６時間
反応させてアルカリ性ホスファターゼ標識プローブを得
た。得られた標識プローブは、ＦＰＬＣ（ファルマシア
社製）で陰イオン交換カラムを用いて精製した。標識プ
ローブを含む画分を集め、セントリコン３０Ｋ（アミコ
ン社製）を用いて限外濾過法により濃縮した。
リゴヌクレオチドを、さらにモル比で２倍量のアルカリ
性ホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製、100m
M NaHCO3、3M NaClに溶解したもの）と室温で１６時間
反応させてアルカリ性ホスファターゼ標識プローブを得
た。得られた標識プローブは、ＦＰＬＣ（ファルマシア
社製）で陰イオン交換カラムを用いて精製した。標識プ
ローブを含む画分を集め、セントリコン３０Ｋ（アミコ
ン社製）を用いて限外濾過法により濃縮した。
【００５０】（３）試料の調製 実施例１の（１）〜（３）の操作で得られたＰＣＲ反応
液（真菌プライマーＦおよび真菌プライマーＲによるＰ
ＣＲ産物）を使用した。
液（真菌プライマーＦおよび真菌プライマーＲによるＰ
ＣＲ産物）を使用した。
【００５１】（４）ドットブロットハイブリダイゼーシ
ョン 実施例１の（１）〜（３）の操作で得られたＰＣＲ反応
液をナイロン膜（Hybond N+ 、アマシャム社製）に滴下
し、0.4N NaOHで核酸を変性させてナイロン膜に固定し
た。この膜を中和後、ハイブリダイゼーションバック
（BRL社製） に移し、上記各アルカリ性ホスファターゼ
標識核酸プローブ液（プロ−ブ１〜７）をそれぞれ含む
ハイブリダイゼーションバッファー（5xSSC、0.5%ウシ
血清アルブミン、0.5%ポリビニルピロリドン、1%ドデシ
ル硫酸ナトリウム）を加えてポリシーラーでシールし、
プローブ６は５０℃で、他のプローブは４２℃で１５分
間ハイブリダイゼーションを行った。
ョン 実施例１の（１）〜（３）の操作で得られたＰＣＲ反応
液をナイロン膜（Hybond N+ 、アマシャム社製）に滴下
し、0.4N NaOHで核酸を変性させてナイロン膜に固定し
た。この膜を中和後、ハイブリダイゼーションバック
（BRL社製） に移し、上記各アルカリ性ホスファターゼ
標識核酸プローブ液（プロ−ブ１〜７）をそれぞれ含む
ハイブリダイゼーションバッファー（5xSSC、0.5%ウシ
血清アルブミン、0.5%ポリビニルピロリドン、1%ドデシ
ル硫酸ナトリウム）を加えてポリシーラーでシールし、
プローブ６は５０℃で、他のプローブは４２℃で１５分
間ハイブリダイゼーションを行った。
【００５２】それぞれの膜をハイブリダイゼーションバ
ッグから取り出し、洗浄液１（2xSSC、1%ドデシル硫酸
ナトリウム）で５０℃、１０分間振盪して洗浄した。更
に洗浄液２（1xSSC、0.5% TritonX-100）で室温、１０
分間振盪して洗浄した。最後に洗浄液３（1xSSC）で室
温、５分間振盪して洗浄した。
ッグから取り出し、洗浄液１（2xSSC、1%ドデシル硫酸
ナトリウム）で５０℃、１０分間振盪して洗浄した。更
に洗浄液２（1xSSC、0.5% TritonX-100）で室温、１０
分間振盪して洗浄した。最後に洗浄液３（1xSSC）で室
温、５分間振盪して洗浄した。
【００５３】膜を新しいハイブリダイゼーションバッグ
に移し、基質液（0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.1M MgC
l2、0.3mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.3mg/mlブ
ロムクロロインドフェリルホスフェート(pH7.5))を加え
てポリシーラーでシールし、３７℃で１時間インキュベ
ートした。
に移し、基質液（0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.1M MgC
l2、0.3mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.3mg/mlブ
ロムクロロインドフェリルホスフェート(pH7.5))を加え
てポリシーラーでシールし、３７℃で１時間インキュベ
ートした。
【００５４】（４）結果 アルカリ性ホスファターゼにより生じる紫色色素のスポ
ットを目視判定した。スポットが確認できたものを陽性
とした。
ットを目視判定した。スポットが確認できたものを陽性
とした。
【００５５】この結果、プローブ１はカンジダ・アルビ
カンス、プローブ２はカンジダ・ルシタニエ、プロ−ブ
３はカンジダ・クルゼイ、プローブ５はクリプトコッカ
ス・ネオフォルマンス、そしてプローブ７はニュウモシ
スチス・カリニと特異的に反応して同程度の紫色色素の
スポットが確認され、陽性と判定されたのに対して、そ
の他の真菌はいずれもスポットが見られず、すべて陰性
と判定された。
カンス、プローブ２はカンジダ・ルシタニエ、プロ−ブ
３はカンジダ・クルゼイ、プローブ５はクリプトコッカ
ス・ネオフォルマンス、そしてプローブ７はニュウモシ
スチス・カリニと特異的に反応して同程度の紫色色素の
スポットが確認され、陽性と判定されたのに対して、そ
の他の真菌はいずれもスポットが見られず、すべて陰性
と判定された。
【００５６】次に、プロ−ブ４はカンジダ・グラブラー
タおよびサッカロマイセス・セレビシエと特異的に反応
した。また、プローブ６はアスペルギルス属およびペニ
シリウム属と反応し陽性と判定された。
タおよびサッカロマイセス・セレビシエと特異的に反応
した。また、プローブ６はアスペルギルス属およびペニ
シリウム属と反応し陽性と判定された。
【００５７】従って、本発明のオリゴヌクレオチドを標
識プローブに用いて、真菌の検出や真菌の菌種の同定が
可能であることが判明した。さらに、実施例１の（１）
〜（３）の操作で得られるＰＣＲ反応液１種類で、その
後のハイブリダイゼーション操作により多種類の真菌の
菌種を同定し得る。これは、高価な試薬および酵素が必
要なＰＣＲ反応を、各菌種毎ではなく１回で行えること
を意味し、検査費用の低減とさらなる検査時間の短縮を
可能にする。この方法により、従来、培養などで数日か
ら数週間かかっていた真菌の検出および真菌の菌種の同
定を１日以内に終わらせ得る。
識プローブに用いて、真菌の検出や真菌の菌種の同定が
可能であることが判明した。さらに、実施例１の（１）
〜（３）の操作で得られるＰＣＲ反応液１種類で、その
後のハイブリダイゼーション操作により多種類の真菌の
菌種を同定し得る。これは、高価な試薬および酵素が必
要なＰＣＲ反応を、各菌種毎ではなく１回で行えること
を意味し、検査費用の低減とさらなる検査時間の短縮を
可能にする。この方法により、従来、培養などで数日か
ら数週間かかっていた真菌の検出および真菌の菌種の同
定を１日以内に終わらせ得る。
【００５８】
【発明の効果】本発明により、直接的で簡便、迅速かつ
確実な真菌の検出および真菌の菌種の同定が可能となっ
た。本発明の配列またはその相補配列の一部または全部
を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ増幅反応のプライ
マーまたは直接検出用のプローブ、あるいはその組合せ
として用い、従来、数日から数週間かかっていた培養お
よびその後の生化学的試験などに比べて、時間を大幅に
短縮し、簡便で、かつ再現性のある確実な結果が得ら
れ、さらに核酸増幅などにより、血液および喀痰などの
臨床検体から直接検出し得るので、その臨床的意義は大
きい。
確実な真菌の検出および真菌の菌種の同定が可能となっ
た。本発明の配列またはその相補配列の一部または全部
を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ増幅反応のプライ
マーまたは直接検出用のプローブ、あるいはその組合せ
として用い、従来、数日から数週間かかっていた培養お
よびその後の生化学的試験などに比べて、時間を大幅に
短縮し、簡便で、かつ再現性のある確実な結果が得ら
れ、さらに核酸増幅などにより、血液および喀痰などの
臨床検体から直接検出し得るので、その臨床的意義は大
きい。
【００５９】
【配列表】
【００６０】
【配列番号：１】 配列の長さ：687 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..687 特徴を決定した方法： 他の特徴：真菌１８ＳｒＲＮＡの遺伝子の配列と相補的
な配列を有する。 配列 ACTTTCGATG GTAGGATAGT GGCCTACCAT GGTGGCAACG GGTAACGGGG AATTAGGGTT 60 CGATTCCGGA GAGGGAGCCT GAGAAACGGC TACCACATCC AAGGAAGGCA GCAGGCGCGC 120 AAATTACCCA ATCCCGACAC GGGGAGGTAG TGACAATAAA TACTGATACG GGGCTCTTTT 180 GGGTCTCGTA ATTGGAATGA GTACAATCTA AATCCCTTAA CGAGGAACAA TTGGAGGGCA 240 AGTCTGGTGC CAGCAGCCGC GGTAATTCCA GCTCCAATAG CGTATATTAA AGTTGTTGCA 300 GTTAAAAAGC TCGTAGTTGA ACCTTGGGTC TGGCTGGCCG GTCCGCCTCA CCGCGAGTAC 360 TGGTCCGGCT GGACCTTTCC TTCTGGGGAA CCTCATGGCC TTCACTGGCT GTGGGGGGAA 420 CCAGGACTTT TACTGTGAAA AAATTAGAGT GTTCAAAGCA GGCCTTTGCT CGAATACATT 480 AGCATGGAAT AATAGAATAG GACGTGCGGT TCTATTTTGT TGGTTTCTAG GACCGCCGTA 540 ATGATTAATA GGGATAGTCG GGGGCGTCAG TATTCAGCTG TCAGAGGTGA AATTCTTGGA 600 TTTGCTGAAG ACTAACTACT GCGAAAGCAT TCGCCAAGGA TGTTTTCATT AATCAGGGAA 660 CGAAAGTTAG GGGATCGAAG ACGATCA 687
な配列を有する。 配列 ACTTTCGATG GTAGGATAGT GGCCTACCAT GGTGGCAACG GGTAACGGGG AATTAGGGTT 60 CGATTCCGGA GAGGGAGCCT GAGAAACGGC TACCACATCC AAGGAAGGCA GCAGGCGCGC 120 AAATTACCCA ATCCCGACAC GGGGAGGTAG TGACAATAAA TACTGATACG GGGCTCTTTT 180 GGGTCTCGTA ATTGGAATGA GTACAATCTA AATCCCTTAA CGAGGAACAA TTGGAGGGCA 240 AGTCTGGTGC CAGCAGCCGC GGTAATTCCA GCTCCAATAG CGTATATTAA AGTTGTTGCA 300 GTTAAAAAGC TCGTAGTTGA ACCTTGGGTC TGGCTGGCCG GTCCGCCTCA CCGCGAGTAC 360 TGGTCCGGCT GGACCTTTCC TTCTGGGGAA CCTCATGGCC TTCACTGGCT GTGGGGGGAA 420 CCAGGACTTT TACTGTGAAA AAATTAGAGT GTTCAAAGCA GGCCTTTGCT CGAATACATT 480 AGCATGGAAT AATAGAATAG GACGTGCGGT TCTATTTTGT TGGTTTCTAG GACCGCCGTA 540 ATGATTAATA GGGATAGTCG GGGGCGTCAG TATTCAGCTG TCAGAGGTGA AATTCTTGGA 600 TTTGCTGAAG ACTAACTACT GCGAAAGCAT TCGCCAAGGA TGTTTTCATT AATCAGGGAA 660 CGAAAGTTAG GGGATCGAAG ACGATCA 687
【００６１】
【配列番号：２】 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..19 特徴を決定した方法：S 他の特徴：カンジダ・アルビカンス１８ＳｒＲＮＡ遺伝
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 ACTTTCGATG GTAGGATAG 19
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 ACTTTCGATG GTAGGATAG 19
【００６２】
【配列番号：３】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：カンジダ・アルビカンス１８ＳｒＲＮＡ遺伝
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 TGATCGTCTT CGATCCCCTA 20
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 TGATCGTCTT CGATCCCCTA 20
【００６３】
【配列番号：４】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：カンジダ・アルビカンス１８ＳｒＲＮＡ遺伝
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 CTGAGAAACG GCTACCACAT 20
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 CTGAGAAACG GCTACCACAT 20
【００６４】
【配列番号：５】 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..19 特徴を決定した方法：S 他の特徴：アスペルギルス・フミガタス１８ＳｒＲＮＡ
遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 CAGAAGGAAA GGTCCAGCC 19
遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 CAGAAGGAAA GGTCCAGCC 19
【００６５】
【配列番号：６】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：カンジダ・アルビカンス１８ＳｒＲＮＡ遺伝
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 GTAGCCATTT ATGGCGAACC 20
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 GTAGCCATTT ATGGCGAACC 20
【００６６】
【配列番号：７】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：カンジダ・ルシタニエ１８ＳｒＲＮＡ遺伝子
の配列と相補的な配列を有する。 配列 AGCAATAAGA GGAGGACTGT 20
の配列と相補的な配列を有する。 配列 AGCAATAAGA GGAGGACTGT 20
【００６７】
【配列番号：８】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：カンジダ・クルゼイ１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の
配列と相補的な配列を有する。 配列 TATGGTAAGC ACTGTTGCGG 20
配列と相補的な配列を有する。 配列 TATGGTAAGC ACTGTTGCGG 20
【００６８】
【配列番号：９】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：カンジダ・グラブラータ１８ＳｒＲＮＡ遺伝
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 CAAGTCCTTG TGGCTTGGCG 20
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 CAAGTCCTTG TGGCTTGGCG 20
【００６９】
【配列番号：10】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：S 他の特徴：クリプトコッカス・ネオフォルマンス１８Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 GTGGTCCTGT ATGCTCTTTA 20
ｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 GTGGTCCTGT ATGCTCTTTA 20
【００７０】
【配列番号：11】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：アスペルギルス・フミガタス１８ＳｒＲＮＡ
遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 ATGGCCTTCA CTGGCTGTGG 20
遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 ATGGCCTTCA CTGGCTGTGG 20
【００７１】
【配列番号：12】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ニュウモシスチス・カリニ１８ＳｒＲＮＡ遺
伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 GAAGTTGTGT GCACTGGCGC ２０
伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 GAAGTTGTGT GCACTGGCGC ２０
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:725） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:68）
Claims (18)
- 【請求項１】 真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列
とハイブリダイズする、真菌の検出および真菌の菌種同
定用オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 前記オリゴヌクレオチドが、配列表の配
列番号１の１位のＡから６８７位のＡまでの核酸配列の
一部および全部、あるいはその相補配列の一部または全
部、から選択される配列を含有する、請求項１に記載の
オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 前記オリゴヌクレオチドが、 ＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧ ＧＴＡＧＧＡＴＡＧ（配列番号
２）、 ＴＧＡＴＣＧＴＣＴＴ ＣＧＡＴＣＣＣＣＴＡ（配列番
号３）、 ＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧ ＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴ（配列番
号４）、または ＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡ ＧＧＴＣＣＡＧＣＣ（配列番号
５）、で示される核酸配列の一部または全部、あるいは
それらの相補配列の一部または全部、から選択される配
列を含有する、請求項１または２に記載のオリゴヌクレ
オチド。 - 【請求項４】 前記オリゴヌクレオチドがカンジダ・ア
ルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ルシタニ
エ（Candida lusitaniae）、カンジダ・クルゼイ（Cand
ida krusei）、カンジダ・グラブラータ（Candida glab
rata）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Crypto
coccus neoformans）、アスペルギルス・フミガタス（A
spergillus fumigatus）、またはニュウモシスチス・カ
リニ（Pneumocistis carinii）のいずれかを検出および
同定するためのオリゴヌクレオチドである、請求項１に
記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５】 前記カンジダ・アルビカンスを検出およ
び同定するオリゴヌクレオチドが、核酸配列ＧＴＡＧＣ
ＣＡＴＴＴ ＡＴＧＧＣＧＡＡＣＣ（配列番号６）の一
部または全部、あるいはその相補配列の一部または全
部、から選択される配列を含有する、請求項４に記載の
オリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】 前記カンジダ・ルシタニエを検出および
同定するオリゴヌクレオチドが、核酸配列ＡＧＣＡＡＴ
ＡＡＧＡ ＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴ（配列番号７）の一部
または全部、あるいはその相補配列の一部または全部、
から選択される配列を含有する、請求項４に記載のオリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項７】 前記カンジダ・クルゼイを検出および同
定するオリゴヌクレオチドが、核酸配列ＴＡＴＧＧＴＡ
ＡＧＣ ＡＣＴＧＴＴＧＣＧＧ（配列番号８）の一部ま
たは全部、あるいはその相補配列の一部または全部、か
ら選択される配列を含有する、請求項４に記載のオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項８】 前記カンジダ・グラブラータを検出およ
び同定するオリゴヌクレオチドが、核酸配列ＣＡＡＧＴ
ＣＣＴＴＧ ＴＧＧＣＴＴＧＧＣＧ（配列番号９）の一
部または全部、あるいはそれらの相補配列の一部または
全部、から選択される配列を含有する、請求項４に記載
のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項９】 前記クリプトコッカス・ネオフォルマン
スを検出および同定するオリゴヌクレオチドが、核酸配
列ＧＴＧＧＴＣＣＴＧＴ ＡＴＧＣＴＣＴＴＴＡ（配列
番号１０）の一部または全部、あるいはそれらの相補配
列の一部または全部、から選択される配列を含有する、
請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１０】 前記アスペルギルス・フミガタスを検
出および同定するオリゴヌクレオチドが、核酸配列ＡＴ
ＧＧＣＣＴＴＣＡ ＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧ（配列番号１
１）の一部または全部、あるいはそれらの相補配列の一
部または全部、から選択される配列を含有する、請求項
４に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１１】 前記ニュウモシスチス・カリニを検出
および同定するオリゴヌクレオチドが、核酸配列ＧＡＡ
ＧＴＴＧＴＧＴ ＧＣＡＣＴＧＧＣＧＣ（配列番号１
２）の一部または全部、あるいはそれらの相補配列の一
部または全部、から選択される配列を含有する、請求項
４に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１２】 前記オリゴヌクレオチドが、配列表の
配列番号１の１位のＡから６８７位のＡまでの核酸配列
の一部、あるいはその相補配列の一部を、真菌の菌種に
応じて改変した配列を含有する、請求項１に記載のオリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項１３】 請求項１から請求項１２のいずれかに
記載のオリゴヌクレオチドを含有する標識プローブ。 - 【請求項１４】 請求項１から請求項１２のいずれかに
記載のオリゴヌクレオチドを含有する核酸プライマー。 - 【請求項１５】 真菌の検出、真菌の菌種の同定、ある
いは真菌の検出と菌種の同定とを行う方法であって、該
方法は、 （１）請求項１から請求項１４のいずれかに記載のオリ
ゴヌクレオチドを標識プローブまたは核酸プライマーと
して、１または２以上選択する工程； （２）該標識プローブまたは核酸プライマーとして用い
たオリゴヌクレオチドと試料とをハイブリダイズさせる
工程； （３）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出す
る工程、を含む方法。 - 【請求項１６】 真菌の検出、真菌の菌種の同定、ある
いは真菌の検出と菌種の同定とを行うための試薬キット
であって、請求項１３に記載の標識プローブを含む、キ
ット。 - 【請求項１７】 真菌の検出、真菌の菌種の同定、ある
いは真菌の検出と菌種の同定とを行うための試薬キット
であって、請求項１４に記載の核酸プライマーを含む、
キット。 - 【請求項１８】 真菌の検出、真菌の菌種の同定、ある
いは真菌の検出と菌種の同定とを行うための試薬キット
であって、請求項１３に記載の標識プローブおよび請求
項１４に記載の核酸プライマーを含む、キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23533994A JP3608823B2 (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | 真菌の検出および真菌の菌種同定用オリゴヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23533994A JP3608823B2 (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | 真菌の検出および真菌の菌種同定用オリゴヌクレオチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0889254A true JPH0889254A (ja) | 1996-04-09 |
| JP3608823B2 JP3608823B2 (ja) | 2005-01-12 |
Family
ID=16984642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23533994A Expired - Lifetime JP3608823B2 (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | 真菌の検出および真菌の菌種同定用オリゴヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3608823B2 (ja) |
Cited By (52)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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