JPH0824600B2 - 病原真菌遺伝子増幅プライマー - Google Patents
病原真菌遺伝子増幅プライマーInfo
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- JPH0824600B2 JPH0824600B2 JP5130779A JP13077993A JPH0824600B2 JP H0824600 B2 JPH0824600 B2 JP H0824600B2 JP 5130779 A JP5130779 A JP 5130779A JP 13077993 A JP13077993 A JP 13077993A JP H0824600 B2 JPH0824600 B2 JP H0824600B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、病原真菌のリボソーム
ＲＮＡ遺伝子の検出方法に関する。本発明はまた、該遺
伝子検出のための検出キットに関する。
ＲＮＡ遺伝子の検出方法に関する。本発明はまた、該遺
伝子検出のための検出キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】高度医療の普及に伴い、易感染患者は増
加の一途をたどっている。カンジダ症、アスペルギルス
症を初めとする深部（全身性）真菌症は、易感染患者が
高率に罹患する重要な感染症として医療上の問題となっ
ている。しかし深部真菌症の診断は極めて困難であり、
様々な抗真菌剤の開発されている今日においても、有効
な診断法が未だに確立されていないために、多くの患者
が治療を受けられないままに亡くなっているのが現状で
ある。現在までに市販されている深部真菌症の診断方法
としては、カンジダ抗原または抗体を免疫学的に検出す
る方法、病原真菌の菌体成分または代謝産物を生化学的
に検出する方法があるが、いずれの方法も、病理学的に
真菌感染が認められない患者（健常人を含む）に対して
も有意に高値を示すという偽陽性の問題があり、また感
度の点でも臨床的な要請に十分答えられるものとはなっ
ていない。また近年、ＰＣＲ法によって、特定の病原真
菌のみの遺伝子を迅速・特異的に検出する方法が開発さ
れつつあるが、深部真菌症起因菌が多様化している現状
を考慮すると、特定の菌種のみを検出する従来のＰＣＲ
法は、単独では治療に直結する診断法とはなっていな
い。すなわち、検出出来る菌種が限られているうえに、
プライマーが開発されている菌種に対してのみ検出を試
みえたとしても、一つの限られた検体を、検出しようと
する菌種分だけ分割して操作を行わなければならない。
そのために操作が煩雑になる上に、実際的には検出しよ
うとする菌種当りの検体量が少なくなるために、偽陰性
を生じる危険性が高くなる。そこで、より広い範囲の病
原真菌感染症全体を迅速・特異的に診断できる方法の確
立が求められている。
加の一途をたどっている。カンジダ症、アスペルギルス
症を初めとする深部（全身性）真菌症は、易感染患者が
高率に罹患する重要な感染症として医療上の問題となっ
ている。しかし深部真菌症の診断は極めて困難であり、
様々な抗真菌剤の開発されている今日においても、有効
な診断法が未だに確立されていないために、多くの患者
が治療を受けられないままに亡くなっているのが現状で
ある。現在までに市販されている深部真菌症の診断方法
としては、カンジダ抗原または抗体を免疫学的に検出す
る方法、病原真菌の菌体成分または代謝産物を生化学的
に検出する方法があるが、いずれの方法も、病理学的に
真菌感染が認められない患者（健常人を含む）に対して
も有意に高値を示すという偽陽性の問題があり、また感
度の点でも臨床的な要請に十分答えられるものとはなっ
ていない。また近年、ＰＣＲ法によって、特定の病原真
菌のみの遺伝子を迅速・特異的に検出する方法が開発さ
れつつあるが、深部真菌症起因菌が多様化している現状
を考慮すると、特定の菌種のみを検出する従来のＰＣＲ
法は、単独では治療に直結する診断法とはなっていな
い。すなわち、検出出来る菌種が限られているうえに、
プライマーが開発されている菌種に対してのみ検出を試
みえたとしても、一つの限られた検体を、検出しようと
する菌種分だけ分割して操作を行わなければならない。
そのために操作が煩雑になる上に、実際的には検出しよ
うとする菌種当りの検体量が少なくなるために、偽陰性
を生じる危険性が高くなる。そこで、より広い範囲の病
原真菌感染症全体を迅速・特異的に診断できる方法の確
立が求められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＰＣＲ法は、特定のプ
ライマー対を用いることによって任意の遺伝子を迅速か
つ簡便に増幅する事ができる、現在のところ最も鋭敏な
遺伝子検出法である。各種病原真菌の特徴はその遺伝子
により規定されているが、各々の病原真菌に共通した特
徴的な遺伝子領域に対応するプライマー対を用いてＰＣ
Ｒ法を施行し、各種病原真菌に共通した特徴的遺伝子を
検出する事ができれば、そのような菌の存在を確定する
ことができる。本発明者は、病原真菌に共通し、かつ、
ヒトその他のほ乳動物には共通しない配列を、病原真菌
のリボソームＲＮＡ遺伝子（ＤＮＡ）中に見いだした。
従って、リボソームＲＮＡ遺伝子中の各種病原真菌に共
通かつ特異的な配列をプライマー対として用いるＰＣＲ
法によって、増幅させ、該遺伝子を高感度かつ迅速に検
出できれば、病原真菌の存在を簡便に確定することが出
来る。すなわち、本発明は、試料中の病原真菌に共通の
特徴的なリボソームＲＮＡ遺伝子の検出方法およびそれ
に用いるキットを提供することを目的とする。
ライマー対を用いることによって任意の遺伝子を迅速か
つ簡便に増幅する事ができる、現在のところ最も鋭敏な
遺伝子検出法である。各種病原真菌の特徴はその遺伝子
により規定されているが、各々の病原真菌に共通した特
徴的な遺伝子領域に対応するプライマー対を用いてＰＣ
Ｒ法を施行し、各種病原真菌に共通した特徴的遺伝子を
検出する事ができれば、そのような菌の存在を確定する
ことができる。本発明者は、病原真菌に共通し、かつ、
ヒトその他のほ乳動物には共通しない配列を、病原真菌
のリボソームＲＮＡ遺伝子（ＤＮＡ）中に見いだした。
従って、リボソームＲＮＡ遺伝子中の各種病原真菌に共
通かつ特異的な配列をプライマー対として用いるＰＣＲ
法によって、増幅させ、該遺伝子を高感度かつ迅速に検
出できれば、病原真菌の存在を簡便に確定することが出
来る。すなわち、本発明は、試料中の病原真菌に共通の
特徴的なリボソームＲＮＡ遺伝子の検出方法およびそれ
に用いるキットを提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、第
１の発明は、カンジダ属、ハンセヌラ属、サッカロマイ
セス属、トリコスポロン属、クリプトコッカス属、アス
ペルギルス属、ペニシリウム属、ブラストマイセス属、
コクシジオイデス属及びニュウモシスチス属を含む広い
範囲の病原真菌の検出方法に関し、配列表の配列番号１
及び２で表される合成プライマー対を用いて、該真菌の
リボソームＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により検出すること
を特徴とする。第２の発明は、病原真菌の検出用キット
に関し、上記第１の発明の方法に用いて該病原真菌の検
出を行うための検出キットであって、該病原真菌のリボ
ソームＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により増幅させるための
上記合成プライマー対、及び増幅されたＤＮＡを検出す
るためのプローブからなることを特徴とする。
１の発明は、カンジダ属、ハンセヌラ属、サッカロマイ
セス属、トリコスポロン属、クリプトコッカス属、アス
ペルギルス属、ペニシリウム属、ブラストマイセス属、
コクシジオイデス属及びニュウモシスチス属を含む広い
範囲の病原真菌の検出方法に関し、配列表の配列番号１
及び２で表される合成プライマー対を用いて、該真菌の
リボソームＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により検出すること
を特徴とする。第２の発明は、病原真菌の検出用キット
に関し、上記第１の発明の方法に用いて該病原真菌の検
出を行うための検出キットであって、該病原真菌のリボ
ソームＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により増幅させるための
上記合成プライマー対、及び増幅されたＤＮＡを検出す
るためのプローブからなることを特徴とする。
【０００５】リボソームＲＮＡ遺伝子中の、病原真菌に
共通する特徴的なプライマー対の配列は、以下の手順で
決定することができる。 （１）遺伝子配列データバンク（GenBank ）に登録され
ている遺伝子配列のうち、各種病原真菌、ヒトおよび大
腸菌の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ＤＮＡ）を各々
の塩基配列間で比較し、表１に示す各種病原真菌に共通
であって、ヒト（登録番号Ｍ１００９８）及び大腸菌
（登録番号Ｍ２４９９６）には共通しない配列領域を限
定する。
共通する特徴的なプライマー対の配列は、以下の手順で
決定することができる。 （１）遺伝子配列データバンク（GenBank ）に登録され
ている遺伝子配列のうち、各種病原真菌、ヒトおよび大
腸菌の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ＤＮＡ）を各々
の塩基配列間で比較し、表１に示す各種病原真菌に共通
であって、ヒト（登録番号Ｍ１００９８）及び大腸菌
（登録番号Ｍ２４９９６）には共通しない配列領域を限
定する。
【０００６】表１ アスペルギルス・フミガタス Ｍ５５６２６ ペニシリウム・ノタツム Ｍ５５６２８ カンジダ・アルビカンス Ｍ６０３０２ カンジダ・ギリエルモンディイ Ｍ６０３０４ カンジダ・ケフィル Ｍ６０３０３ カンジダ・クルゼイ Ｍ６０３０５ カンジダ・ルシタニエ Ｍ６０３０６ カンジダ・パラプシローシス Ｍ６０３０７ カンジダ・ヴィスワナティイ Ｍ６０３０９ カンジダ・グラブラータ Ｍ６０３１１ ハンセヌラ・ポリモルファ Ｍ６０３１０ サッカロマイセス・セレビシエ Ｖ０１３３５ クリプトコッカス・ネオフォルマンス Ｍ５５６２５ ブラストマイセス・デルマチチジス Ｍ５５６２４ コクシジオイデス・イミチス Ｍ５５６２７ ニュウモシスチス・カリニイ Ｘ１２７０８
【０００７】（２）上記の病原真菌に特異的な配列領域
から、表１に示した全ての病原真菌の１８Ｓリボソーム
ＲＮＡ遺伝子のみを特異的に増幅することのできるプラ
イマー対ＤＮＡ配列（配列表配列番号１及び２）を決定
する。プライマーは、オリゴヌクレオチドＤＮＡとして
ＤＮＡ合成機により合成でき、ＨＰＬＣにて精製でき
る。
から、表１に示した全ての病原真菌の１８Ｓリボソーム
ＲＮＡ遺伝子のみを特異的に増幅することのできるプラ
イマー対ＤＮＡ配列（配列表配列番号１及び２）を決定
する。プライマーは、オリゴヌクレオチドＤＮＡとして
ＤＮＡ合成機により合成でき、ＨＰＬＣにて精製でき
る。
【０００８】検出する病原真菌ＤＮＡは、血液等の病原
真菌感染試料より調製することができる。ＰＣＲ法につ
いては、タック・ポリメラーゼ（Taq polymerase）を含
む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が市販され
ており、これと本発明のプライマー対を用い、病原真菌
ＤＮＡの増幅反応を行わせることができる。ＰＣＲ法で
は、酵素として、例えば耐熱性タック・ポリメラーゼを
用い、ＤＮＡの変性（９４℃）の過程、プライマーＤＮ
Ａのアニーリング（５５℃）の過程及びＤＮＡ相補鎖の
酵素的合成（７２℃）の過程、より成る温度サイクルを
任意の回数繰り返すことで、目的遺伝子のみを指数的に
増幅させることができる。例えば温度サイクルを２５回
繰り返せば、目的ＤＮＡは約１０万倍に増幅される。微
量試料より高感度にＤＮＡを検出するには、現在このＰ
ＣＲ法が最も有効な方法である。増幅後のリボソームＲ
ＮＡ遺伝子の検出は、例えばアガロースゲル電気泳動、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、スポット法、及びサ
ザンブロット法等を用いて行うことができる。スポット
法、サザンブロット法の際は、増幅領域内に特異的なＤ
ＮＡ配列をプローブとして選択すればよい。その一例と
して配列表の配列番号３のプローブ１がある。
真菌感染試料より調製することができる。ＰＣＲ法につ
いては、タック・ポリメラーゼ（Taq polymerase）を含
む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が市販され
ており、これと本発明のプライマー対を用い、病原真菌
ＤＮＡの増幅反応を行わせることができる。ＰＣＲ法で
は、酵素として、例えば耐熱性タック・ポリメラーゼを
用い、ＤＮＡの変性（９４℃）の過程、プライマーＤＮ
Ａのアニーリング（５５℃）の過程及びＤＮＡ相補鎖の
酵素的合成（７２℃）の過程、より成る温度サイクルを
任意の回数繰り返すことで、目的遺伝子のみを指数的に
増幅させることができる。例えば温度サイクルを２５回
繰り返せば、目的ＤＮＡは約１０万倍に増幅される。微
量試料より高感度にＤＮＡを検出するには、現在このＰ
ＣＲ法が最も有効な方法である。増幅後のリボソームＲ
ＮＡ遺伝子の検出は、例えばアガロースゲル電気泳動、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、スポット法、及びサ
ザンブロット法等を用いて行うことができる。スポット
法、サザンブロット法の際は、増幅領域内に特異的なＤ
ＮＡ配列をプローブとして選択すればよい。その一例と
して配列表の配列番号３のプローブ１がある。
【０００９】プローブＤＮＡは、前記プライマーＤＮＡ
と同様の方法で合成、精製することができる。プローブ
ＤＮＡは、標識することにより、高感度な検出が可能と
なる。 標識化の方法は放射性同位元素標識法に限ら
ず、アビジン・ビオチン系標識を含む酵素標識、ケミプ
ローブ標識を含む蛍光標識法等、公知の方法なら何でも
よい。実際選定されたプライマーを用い、病原真菌のリ
ボソームＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ反応を行い、電気泳動
法、サザンハイブリダイゼーション法等により高感度に
検出することができる。
と同様の方法で合成、精製することができる。プローブ
ＤＮＡは、標識することにより、高感度な検出が可能と
なる。 標識化の方法は放射性同位元素標識法に限ら
ず、アビジン・ビオチン系標識を含む酵素標識、ケミプ
ローブ標識を含む蛍光標識法等、公知の方法なら何でも
よい。実際選定されたプライマーを用い、病原真菌のリ
ボソームＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ反応を行い、電気泳動
法、サザンハイブリダイゼーション法等により高感度に
検出することができる。
【００１０】このように病原真菌のリボソームＲＮＡ遺
伝子に特有な塩基配列から設計したプライマー対を用い
たＰＣＲ法によって、病原真菌を高感度に検出すること
ができる。また、本発明に従って、病原真菌のリボソー
ムＲＮＡ遺伝子領域を増幅させるためのプライマー対及
び増幅されたＤＮＡ領域を検出するためのプローブをそ
ろえてキットとしておくことにより、病原真菌の検出を
簡便に行うことができる。なお、キットに用いる試薬は
溶液状、凍結乾燥物あるいはプレート等に固定化された
状態等でもよい。以上、本発明によって病原真菌の早期
発見が可能となり、その早期治療に結びつく。
伝子に特有な塩基配列から設計したプライマー対を用い
たＰＣＲ法によって、病原真菌を高感度に検出すること
ができる。また、本発明に従って、病原真菌のリボソー
ムＲＮＡ遺伝子領域を増幅させるためのプライマー対及
び増幅されたＤＮＡ領域を検出するためのプローブをそ
ろえてキットとしておくことにより、病原真菌の検出を
簡便に行うことができる。なお、キットに用いる試薬は
溶液状、凍結乾燥物あるいはプレート等に固定化された
状態等でもよい。以上、本発明によって病原真菌の早期
発見が可能となり、その早期治療に結びつく。
【００１１】
【実施例】以下、本発明を実施例をもって詳細に説明す
るが、本発明はこれら実施例によって制限されるもので
はない。
るが、本発明はこれら実施例によって制限されるもので
はない。
【００１２】実施例１ 主要病原真菌カンジダ・アルビカンス及びアスペルギル
ス・フミガタスのリボソームＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ法に
よる検出 （１）プライマー（ＤＮＡ）及びプローブ（ＤＮＡ）の
合成及び精製 配列表の配列番号１〜３に示したプライマー（ＤＮＡ）
及びプローブ（ＤＮＡ）の合成、精製は、クラボウ（倉
敷紡績株式会社）、バイオメディカル部に依頼した。 （２）カンジダ・アルビカンスＴＩＭＭ０１６９のゲノ
ムＤＮＡの調製 カンジダ・アルビカンスの培養、スフェロプラストの調
製及びゲノムＤＮＡの調製は、阿部らの方法〔昭和６２
年１１月１０日、（株）ソフトサイエンス社発行、口野
嘉幸ほか２名編「遺伝子・タンパク質・実験操作ブロッ
ティング法」（初版）〕により行い、最終的に培養液１
５mlから約１００μg のゲノムＤＮＡを得た。 （３）アスペルギルス・フミガタスＪＣＭ１７３８のゲ
ノムＤＮＡの調製 アスペルギルス・フミガタスの培養及びゲノムＤＮＡの
調製は、Bainbridgeらの方法〔Bainbridge BW et.al.FE
MS Microbiology Letters 66:113-118,1990.〕により行
い、最終的に培養液１. ５mlから約２５μg のゲノムＤ
ＮＡを得た。 （４）カンジダ・アルビカンスＴＩＭＭ０１６９及びア
スペルギルス・フミガタスＪＣＭ１７３８のリボソーム
ＲＮＡ遺伝子に特異的な領域のＰＣＲ法による増幅 実施例１−（２）、（３）で調製したカンジダ・アルビ
カンスＴＩＭＭ０１６９のＤＮＡ １０ng、アスペルギ
ルス・フミガタスＪＣＭ１７３８のＤＮＡ １０ng、公
知の方法で調製したヒトのＤＮＡ １μg 、ウシのＤＮ
Ａ １μg 及び大腸菌のＤＮＡ１０ngをそれぞれ０. ５
ml用チューブに取り、１０μl の１０×増幅用緩衝液
（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．３，５００mM
ＫＣｌ，１５mM ＭｇＣｌ2 ，０．０１％(w/v) ゼラチ
ン）、８μl のｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ；各１００mM）、１μl の３０pmol
／μl プライマー１、１μl の３０pmol／μl プライマ
ー２及び０. ５μl の５ユニット／μl タックポリメラ
ーゼを加え、更に滅菌水を加えて１００μl の溶液にし
た。この反応液に、上層に１００μl のミネラルオイル
を加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーに
より増幅反応を行った。反応条件は、９４℃で５分間の
変性の後、９４℃で１分間の変性→５５℃で２分間のプ
ライマーのアニーリング→７２℃で１分間の合成反応の
サイクルを２５サイクル行った後、７２℃で１０分間反
応させた。反応後、下層の反応液を５μl 取り、１. ２
％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイ
ドでＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡを確認した。そ
の結果、カンジダ・アルビカンスＴＩＭＭ０１６９及び
アスペルギルス・フミガタスＪＣＭ１７３８を鋳型にし
た場合のみに６８７bpの単一のバンドを確認した。他の
ＤＮＡを鋳型にしたときは増幅は認められなかった。 （５）サザンハイブリダイゼーションによる、ＰＣＲ法
により増幅されたカンジダ・アルビカンス及びアスペル
ギルス・フミガタスのリボソームＲＮＡ遺伝子の検出 実施例１−（４）に記載のＰＣＲ反応液を電気泳動し
た、１．２％アガロースゲルをアルカリ変性後、ナイロ
ンメンブラン（アマーシャムハイボンド−Ｎ）に一晩サ
ザンブロットした。紫外線トランスイルミネーター（２
５４nm）で１０分間照射し、ＤＮＡをメンブランに固定
した。このメンブランからのＤＮＡ検出は、ＥＣＬ ３
´−オリゴラベリング・検出システム（アマシャム・ジ
ャパン社）を用いた蛍光発光によって、次のように行っ
た。ハイブリダイゼーション緩衝液（０．５％ブロッキ
ング液、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５％硫酸デキス
トラン及び１００μg ／mlサケ精子ＤＮＡ）５ml中で３
７℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。
次にターミナルトランスフェラーゼを用いて、フルオレ
セイン修飾ｄＵＴＰをテーリングさせたプローブ１を加
え、３７℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーション後、メンブランを洗浄バッファー
１（１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）中で１５分間、６０
℃で振とうしながら洗浄し、続いて洗浄バッファー２
（０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）中で１５分間、６
０℃で振とうしながら洗浄した。更にバッファー１の中
でメンブランを１分間軽く洗浄後、室温で６０分間、
０．５％ブロッキング液中で振とうを行った。次にバッ
ファー２を用いて１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗フル
オレセイン抗体溶液中で、室温で６０分間インキュベー
ションを行った。メンブランは乾燥させた後、ハイパー
フィルム−ＥＣＬ（アマシャム・ジャパン社）を入れた
カセット内で４０分間露光を行った。この結果、カンジ
ダ・アルビカンス及びアスペルギルス・フミガタスのＰ
ＣＲ増幅ＤＮＡは、プローブ１とハイブリダイズして、
バンドが現れたが、その他のサンプルではバンドが認め
られなかった。このことは、プライマー１及びプライマ
ー２でカンジダ・アルビカンス及びアスペルギルス・フ
ミガタスのゲノムＤＮＡのみが特異的に増幅され、その
増幅されたＤＮＡがプローブ１とハイブリダイズするこ
とにより、カンジダ・アルビカンス及びアスペルギルス
・フミガタスのリボソームＲＮＡ遺伝子に特異的な配列
が検出できることを示すものである。
ス・フミガタスのリボソームＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ法に
よる検出 （１）プライマー（ＤＮＡ）及びプローブ（ＤＮＡ）の
合成及び精製 配列表の配列番号１〜３に示したプライマー（ＤＮＡ）
及びプローブ（ＤＮＡ）の合成、精製は、クラボウ（倉
敷紡績株式会社）、バイオメディカル部に依頼した。 （２）カンジダ・アルビカンスＴＩＭＭ０１６９のゲノ
ムＤＮＡの調製 カンジダ・アルビカンスの培養、スフェロプラストの調
製及びゲノムＤＮＡの調製は、阿部らの方法〔昭和６２
年１１月１０日、（株）ソフトサイエンス社発行、口野
嘉幸ほか２名編「遺伝子・タンパク質・実験操作ブロッ
ティング法」（初版）〕により行い、最終的に培養液１
５mlから約１００μg のゲノムＤＮＡを得た。 （３）アスペルギルス・フミガタスＪＣＭ１７３８のゲ
ノムＤＮＡの調製 アスペルギルス・フミガタスの培養及びゲノムＤＮＡの
調製は、Bainbridgeらの方法〔Bainbridge BW et.al.FE
MS Microbiology Letters 66:113-118,1990.〕により行
い、最終的に培養液１. ５mlから約２５μg のゲノムＤ
ＮＡを得た。 （４）カンジダ・アルビカンスＴＩＭＭ０１６９及びア
スペルギルス・フミガタスＪＣＭ１７３８のリボソーム
ＲＮＡ遺伝子に特異的な領域のＰＣＲ法による増幅 実施例１−（２）、（３）で調製したカンジダ・アルビ
カンスＴＩＭＭ０１６９のＤＮＡ １０ng、アスペルギ
ルス・フミガタスＪＣＭ１７３８のＤＮＡ １０ng、公
知の方法で調製したヒトのＤＮＡ １μg 、ウシのＤＮ
Ａ １μg 及び大腸菌のＤＮＡ１０ngをそれぞれ０. ５
ml用チューブに取り、１０μl の１０×増幅用緩衝液
（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．３，５００mM
ＫＣｌ，１５mM ＭｇＣｌ2 ，０．０１％(w/v) ゼラチ
ン）、８μl のｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ；各１００mM）、１μl の３０pmol
／μl プライマー１、１μl の３０pmol／μl プライマ
ー２及び０. ５μl の５ユニット／μl タックポリメラ
ーゼを加え、更に滅菌水を加えて１００μl の溶液にし
た。この反応液に、上層に１００μl のミネラルオイル
を加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーに
より増幅反応を行った。反応条件は、９４℃で５分間の
変性の後、９４℃で１分間の変性→５５℃で２分間のプ
ライマーのアニーリング→７２℃で１分間の合成反応の
サイクルを２５サイクル行った後、７２℃で１０分間反
応させた。反応後、下層の反応液を５μl 取り、１. ２
％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイ
ドでＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡを確認した。そ
の結果、カンジダ・アルビカンスＴＩＭＭ０１６９及び
アスペルギルス・フミガタスＪＣＭ１７３８を鋳型にし
た場合のみに６８７bpの単一のバンドを確認した。他の
ＤＮＡを鋳型にしたときは増幅は認められなかった。 （５）サザンハイブリダイゼーションによる、ＰＣＲ法
により増幅されたカンジダ・アルビカンス及びアスペル
ギルス・フミガタスのリボソームＲＮＡ遺伝子の検出 実施例１−（４）に記載のＰＣＲ反応液を電気泳動し
た、１．２％アガロースゲルをアルカリ変性後、ナイロ
ンメンブラン（アマーシャムハイボンド−Ｎ）に一晩サ
ザンブロットした。紫外線トランスイルミネーター（２
５４nm）で１０分間照射し、ＤＮＡをメンブランに固定
した。このメンブランからのＤＮＡ検出は、ＥＣＬ ３
´−オリゴラベリング・検出システム（アマシャム・ジ
ャパン社）を用いた蛍光発光によって、次のように行っ
た。ハイブリダイゼーション緩衝液（０．５％ブロッキ
ング液、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５％硫酸デキス
トラン及び１００μg ／mlサケ精子ＤＮＡ）５ml中で３
７℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。
次にターミナルトランスフェラーゼを用いて、フルオレ
セイン修飾ｄＵＴＰをテーリングさせたプローブ１を加
え、３７℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーション後、メンブランを洗浄バッファー
１（１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）中で１５分間、６０
℃で振とうしながら洗浄し、続いて洗浄バッファー２
（０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）中で１５分間、６
０℃で振とうしながら洗浄した。更にバッファー１の中
でメンブランを１分間軽く洗浄後、室温で６０分間、
０．５％ブロッキング液中で振とうを行った。次にバッ
ファー２を用いて１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗フル
オレセイン抗体溶液中で、室温で６０分間インキュベー
ションを行った。メンブランは乾燥させた後、ハイパー
フィルム−ＥＣＬ（アマシャム・ジャパン社）を入れた
カセット内で４０分間露光を行った。この結果、カンジ
ダ・アルビカンス及びアスペルギルス・フミガタスのＰ
ＣＲ増幅ＤＮＡは、プローブ１とハイブリダイズして、
バンドが現れたが、その他のサンプルではバンドが認め
られなかった。このことは、プライマー１及びプライマ
ー２でカンジダ・アルビカンス及びアスペルギルス・フ
ミガタスのゲノムＤＮＡのみが特異的に増幅され、その
増幅されたＤＮＡがプローブ１とハイブリダイズするこ
とにより、カンジダ・アルビカンス及びアスペルギルス
・フミガタスのリボソームＲＮＡ遺伝子に特異的な配列
が検出できることを示すものである。
【００１３】実施例２ 病原真菌各菌種のリボソームＲＮＡ遺伝子のＰＣＲによ
る検出 （１）ゲノムＤＮＡの調製 表２に示した各種病原真菌について、アスペルギルス属
及びペニシリウム属各菌種は実施例１−（３）、そのほ
かの菌種は実施例１−（２）の方法で培養及びゲノムＤ
ＮＡの調製を行った。
る検出 （１）ゲノムＤＮＡの調製 表２に示した各種病原真菌について、アスペルギルス属
及びペニシリウム属各菌種は実施例１−（３）、そのほ
かの菌種は実施例１−（２）の方法で培養及びゲノムＤ
ＮＡの調製を行った。
【００１４】 表２ アスペルギルス・フミガタス ＪＣＭ１７３８ アスペルギルス・フミガタス ＴＩＭＭ１３３５ アスペルギルス・フミガタス Ｎｏ．２００５ アスペルギルス・フミガタス Ｎｏ．２０１４ アスペルギルス・フミガタス Ｎｏ．２０２１ アスペルギルス・フミガタス Ｎｏ．２０２２ アスペルギルス・テレウス Ｎｏ．２０３６ アスペルギルス・フラーブス ＴＩＭＭ００５７ アスペルギルス・ベルシカラー ＴＩＭＭ１２９０ アスペルギルス・ニドゥランス ＴＩＭＭ０１１１ アスペルギルス・ニゲル ＴＩＭＭ０１１３ ペニシリウム・エクスパンスム ＴＩＭＭ１２９３ カンジダ・アルビカンス ＴＩＭＭ１６２３ カンジダ・アルビカンス ＴＩＭＭ２７２６ カンジダ・アルビカンス （ステラトイデア） ＴＩＭＭ０３１０ カンジダ・ギリエルモンディイ ＴＩＭＭ０２６０ カンジダ・ケフィル ＴＩＭＭ０３０２ カンジダ・クルゼイ ＴＩＭＭ０２６９ カンジダ・トロピカリス ＴＩＭＭ０３１３ カンジダ・パラプシローシス ＴＩＭＭ０２９２ カンジダ・グラブラータ ＴＩＭＭ１０６４ ハンセヌラ・アノマラ ＪＣＭ３５８５ サッカロマイセス・セレビシエ ＴＩＭＭ０９２５ クリプトコッカス・ネオフォルマンス ＴＩＭＭ０３５４ クリプトコッカス・ネオフォルマンス Ｎｏ．００６１ トリコスポロン・ベイゲリイ Ｎｏ．００６５
【００１５】（２）プライマー１及びプライマー２を用
いたＰＣＲ法によるリボソームＲＮＡ遺伝子の検出 上記ＤＮＡ１０ngをそれぞれ０. ５ml用チューブに取
り、実施例１と同じ組成に調製した１０μl の１０×増
幅用緩衝液、８μl のｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ；各１００mM）、１μl の３
０pmol／μl プライマー１、１μl の３０pmol／μl プ
ライマー２及び０. ５μl の５ユニット／μl タックポ
リメラーゼを加え、更に滅菌水を加えて１００μl の溶
液にした。この反応液に、上層に１００μl のミネラル
オイルを加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイク
ラーにより増幅反応を行った。反応条件は、９４℃で５
分間の変性の後、９４℃で１分間の変性→５５℃で２分
間のプライマーのアニーリング→７２℃で１分間の合成
反応のサイクルを２５サイクル行い、７２℃で１０分間
伸長反応を行なった。反応後、下層の反応液を５μl 取
り、１. ２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウ
ムブロマイドでＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡを確
認した。この結果、表２に示した１８種２６株の病原真
菌全てに６８７bpの単一のバンドを確認した。
いたＰＣＲ法によるリボソームＲＮＡ遺伝子の検出 上記ＤＮＡ１０ngをそれぞれ０. ５ml用チューブに取
り、実施例１と同じ組成に調製した１０μl の１０×増
幅用緩衝液、８μl のｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ；各１００mM）、１μl の３
０pmol／μl プライマー１、１μl の３０pmol／μl プ
ライマー２及び０. ５μl の５ユニット／μl タックポ
リメラーゼを加え、更に滅菌水を加えて１００μl の溶
液にした。この反応液に、上層に１００μl のミネラル
オイルを加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイク
ラーにより増幅反応を行った。反応条件は、９４℃で５
分間の変性の後、９４℃で１分間の変性→５５℃で２分
間のプライマーのアニーリング→７２℃で１分間の合成
反応のサイクルを２５サイクル行い、７２℃で１０分間
伸長反応を行なった。反応後、下層の反応液を５μl 取
り、１. ２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウ
ムブロマイドでＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡを確
認した。この結果、表２に示した１８種２６株の病原真
菌全てに６８７bpの単一のバンドを確認した。
【００１６】実施例３ 病原真菌ＤＮＡの増幅・検出キットの作製 試料中の病原真菌遺伝子を増幅・検出するためのキット
を作製した。ＤＮＡ増幅用プライマーとしてプライマー
１及びプライマー２が各３０pmol／μl 溶液となるよう
にＴＥ緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ，１mM ＥＤＴＡ pH
８．２）４０μl に溶解し、病原真菌遺伝子増幅プライ
マー液（Ａ剤）とした。ＤＮＡ検出用プローブとして、
プローブ１の１μg をＴＥ緩衝液２０μl に溶解し、病
原真菌遺伝子検出プローブ液（Ｂ剤）とした。Ａ剤、Ｂ
剤を１組として、病原性真菌遺伝子の増幅・検出キット
とした（表３）。
を作製した。ＤＮＡ増幅用プライマーとしてプライマー
１及びプライマー２が各３０pmol／μl 溶液となるよう
にＴＥ緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ，１mM ＥＤＴＡ pH
８．２）４０μl に溶解し、病原真菌遺伝子増幅プライ
マー液（Ａ剤）とした。ＤＮＡ検出用プローブとして、
プローブ１の１μg をＴＥ緩衝液２０μl に溶解し、病
原真菌遺伝子検出プローブ液（Ｂ剤）とした。Ａ剤、Ｂ
剤を１組として、病原性真菌遺伝子の増幅・検出キット
とした（表３）。
【００１７】表３ Ａ剤 病原真菌遺伝子増幅プライマーＡ液 ４０μl
（２μl ×２０回分） Ｂ剤 病原真菌遺伝子検出プローブＢ液 ２０μl
（１μl ×２０回分）
（２μl ×２０回分） Ｂ剤 病原真菌遺伝子検出プローブＢ液 ２０μl
（１μl ×２０回分）
【００１８】
【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
り、病原真菌のリボソームＲＮＡ遺伝子を検出すること
による、試料中の病原真菌の高感度検出法及び検出キッ
トが提供される。
り、病原真菌のリボソームＲＮＡ遺伝子を検出すること
による、試料中の病原真菌の高感度検出法及び検出キッ
トが提供される。
配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴： 1-19 E primer 配列： ACTTTCGATGGTAGGATAG 19 配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴： 1-20 E primer 配列： TGATCGTCTTCGATCCCCTA 20 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴： 1-20 E probe 配列： ＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴ ２０
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:67） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:74） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:865） (56)参考文献 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，36〜４！ （1992）（英）Ｐ．255−263 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡ Ｌ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，29〜11！ （1991）（米）Ｐ．2543−2549 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡ Ｌ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，30〜５！ （1992）（米）Ｐ．1210−1215
Claims (2)
- 【請求項１】 配列表番号１及び２で表される合成ＤＮ
Ａプライマー対を用いて、広い範囲の病原真菌のリボソ
ームＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により増幅させて検出する
ことを特徴とする病原真菌の検出方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の合成ＤＮＡプライマー
対、及び増幅されたＤＮＡを検出するためのプローブか
らなることを特徴とする病原真菌の検出キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5130779A JPH0824600B2 (ja) | 1993-06-01 | 1993-06-01 | 病原真菌遺伝子増幅プライマー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5130779A JPH0824600B2 (ja) | 1993-06-01 | 1993-06-01 | 病原真菌遺伝子増幅プライマー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06339399A JPH06339399A (ja) | 1994-12-13 |
| JPH0824600B2 true JPH0824600B2 (ja) | 1996-03-13 |
Family
ID=15042474
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5130779A Expired - Fee Related JPH0824600B2 (ja) | 1993-06-01 | 1993-06-01 | 病原真菌遺伝子増幅プライマー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0824600B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7504494B2 (en) * | 2005-11-14 | 2009-03-17 | Vishali Gupta | Multiplex PCR assay |
| JP5317430B2 (ja) | 2007-05-14 | 2013-10-16 | キヤノン株式会社 | プローブセット、プローブ担体、及び真菌の判別同定方法 |
| WO2019187240A1 (ja) * | 2018-03-28 | 2019-10-03 | 国立大学法人 富山大学 | 不完全なマッチプローブを用いたカンジダ菌の迅速同定法 |
-
1993
- 1993-06-01 JP JP5130779A patent/JPH0824600B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＬＩＮＩＣＡＬＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２９〜１１！（１９９１）（米）Ｐ．２５４３−２５４９ |
| ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＬＩＮＩＣＡＬＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，３０〜５！（１９９２）（米）Ｐ．１２１０−１２１５ |
| ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＭＥＤＩＣＡＬＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，３６〜４！（１９９２）（英）Ｐ．２５５−２６３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06339399A (ja) | 1994-12-13 |
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