JPH06509464A - 染色体異常の検出用アッセイおよびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 染色体異常の検出用アッセイおよびキット発明の分野 本発明は、染色体異常において生じる核酸配列の検出に有用な方法およびキット に関する。

発明の背景 染色体異常は、濾胞性リンパ腫などの新生物性状態を含む、遺伝性または非遺伝 性の、ヒトにおける種々の望ましくない状態の原因である。染色体転座、転位、 遺伝子間もしくは遺伝子内組換え、挿入、欠失または点突然変異のいずれによっ て引き起こされようと、簡易および高信頼試験によって初期の段階でかがる異常 を検出することはきわめて重大なことであるのは明らかである。

転座と病理学的状態、例えば、新生物性変性との間の関連は、ルッソ（Ｒｕｓｓ ｏ）らによって、「リースント・アドバンノズ・イン・ヘマトロノーＪ　（Ｒｅ ｃｅｎｔ、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、エイ・ブイ・ホ フブランド（Ａ、　Ｖ、　Ｈｏｆｆｂｒａｎｄ）編、５．１２１−１３０．チャ ーチル・リヴイングストーン（ＣｈｕｒｃｈｉｌｌＬ　ｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ） に記載されている。より詳しくは、遺伝子ｂｃｌ−２およびＪＩＩの部分に関係 する転座ｔ（１４：１８）は、ヒト濾胞性リンパ腫と非常に関係している：ツシ モト（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ）ら（１９８５）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２ ２８　：１４４０−１４４３およびサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２９　： １３９０−１３９３１ステ、トラーースチーブンソン（Ｓ　ｔｅｔｌｅｒ　−Ｓ 　ｔｅｖｅｎｓｏｎ）ら（１９８８）ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）７２　：１８２２ −１８２５　；およびフレラセンライ（Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉ）ら、（１９８８） プロンーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニ ー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ 、　Ａ、　）　８５　：４８６９−４８７３を参照。

濾胞性リンパ腫（Ｆ　Ｌ）は、ｂｃｌ−２転座と称される遺伝子異常の存在に関 連するＢ−細胞障害である。濾胞性Ｂ−細胞リンパ腫の約９０％および大型広汎 性（ｌａｒｇｅ　ｄｉｆｆｕｓｅ）　Ｂ−細胞リンパ腫の２０％は、第１４染色 体上のＩｇＨ座位および第１８染色体上のｂｃｌ−２座位に直接関係するｔ（１ ４：　１８）（ｑ３２；ｑ２１）転座を持っている。バーキットリンパ腫におけ るｍｙｃ転座と同様に、ｔ（１４；　１８Ｘｑ３２　：　Ｑ２１）転座は、ｂｃ ｌ−２遺伝子に対して５′または３°で生じるが、該遺伝子のタンパク暗号部分 内では生じない。ＦＬにおいて、該転座は、ＩｇＨ鎖座位のＪＨ領領域組換えの 間にＢ前駆細胞中で起こると思われる。ｂｃｌ−２癌遺伝子と重鎮座位との組合 せの結果、高レベルのｂｃｌ−２発現が生じる。

ＦＬ転座は、構造的に均一である。ヒトＦＬの約７０％において、ブレークポイ ントは、「主ブレークポイント領域（ＭＢＲ）Ｊと称される、遺伝子の３°未翻 訳領域内に群をなしている。他の１０〜２０％の場合、ブレークポイントは、「 副クラスター領域（ｍａ　ｒ）Ｊと称される、ｂｃｌ−２の第２エキソンから下 流の２０Ｋｂを超える領域中に群をなしている。

現在利用可能なりｃｌ−２転座の検出方法は、細胞遺伝学的アッセイ（ＭＢＲお よびｍｃｒ間で区別できない核型分析）または制限酵素によるＤＮＡ消化および 一般に放射性プローブの使用を含む次なるサザーンブロッティングによる。

近年では、多くの核酸配列同定方法が開発された。それらは、一般に、固相法で あり、比較的迅速かつ簡単に行うことができるが、定量化が困難であり、臨床学 的および診断学的研究には適合し難い。操作の容易さのために放射性標識を避け ると、該方法の感度が犠牲になる。この欠点は、例えば、欧州特許出願公開Ａ第 ０２００３６２号および欧州特許出願公開Ａ第０２５８０１７号に記載されてい るような、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、検出されるべき配列を 増幅することによって克服することができる。

英国特許出願公開Ａ第２１６９４０３号には、ハイブリダイジング条件下、単一 溶液中で、２つの独立して標識されたオリゴヌクレオチドプローブを標的アナラ イトと反応させる、核酸の同定方法が記載されている。アナライトが両プロ−ブ にハイブリダイズする配列を含有する場合、これは、１つの標識によってハイブ リッドを分離させ、他の標識によってそれを検出させるという事実によって容易 に検出される。同一または同様の技術は、例えば、欧州特許出願公開Ａ第０１２ ８３３２号、欧州特許出願公開Ａ第０１４５３５６号、欧州特許出願公開Ａ第０ １５９７１９号、欧州特許出願公開Ａ第０１７７１９１号、欧州特許出願公開Ａ 第０１９２１６８号および欧州特許出願公開Ａ第０１９８６６２号に記載されて いる。オリゴヌクレオチドプローブおよび染色体異常の検出におけるその使用は 、例えば、米国特許Ａ第４７０１４０９号、米国特許Ａ第５０１５５６８号、米 国特許Ａ第５０２４９３４号、欧州特許出願公開Ａ第０１８１６３５号および欧 州特許出願公開Ａ第０２５２６８５号に記載されている。

発明の概要 本発明によると、英国特許公開Ａ第２１６９４０３号に記載されている一般的な タイプの方法は、例えば、転座の反対側のような、標的配列の異なる領域に対し て各々相補的な捕捉プローブおよびレポータープローブを使用して、染色体異常 、例えば、転座の検出に適用される。個々のプローブ、および、所望により、該 方法において使用される他のいずれの成分も、該成分が分配される複数の容器か らなる新規なキットに製剤化されてもよい。

染色体異常についてアッセイすることが重要である場合、本発明は多（の価値あ る特徴を提供する。まず、例えば、病院およびあまり専門的ではない研究室で比 較的未熟な者による使用が簡単であり：それは、迅速であり、非放射性であり、 簡単な装置だけを必要とする。

第２に、吸光度によって、最終シグナルの定量測定を行う。ゲル電気泳動／サザ ーンブロツティングまたはドツト−ブロッティングなどの他の方法については、 このンーグナルの定量測定は、精巧な装置の使用によって可能なだけである。こ れらの従来の方法は、非常に、主観的に解釈し易い。シグナルの定量化によって 、実験間、および研究間の結果が非常に簡単に比較される。

第３に、鎖糸は、（ブレークポイントのいずれかの側の配列に対して相補的な） レポータープローブおよび捕捉プローブが共に結合する場合にシグナルを生じる だけであろう。これによって非常に高度な特異性が得られ、これは偽陽性の危険 性を最小限にするのに役立つ：これは、この技術が主として悪性疾患に関連する 染色体転座を検出するように設計されたので特に重要である。

ＰＣＨによる増幅に使用されるプライマーに関して内部的に「営巣された」（ｎ ｅｓｔｅｄ）　２つのプローブの使用によって、平滑末端化延長、プライマーフ ン力テナマー（ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｎｃａｔｅｎａｍｅｒｓ）のようなＰＣＲ生 成物の検出によって偽陽性を得るという危険性、ならびにＰＣＲ反応の特異性お よびＴａｑ　Ｉポリメラーゼ酵素の既知の非精密度に関係する他の問題点も減少 する。

発明の説明 アナライト中の核酸は、二本鎖ＤＮＡからなるのが好ましい。それらを、一本鎖 配列アナライトの端部に対して相補的なプライマーの存在下、鋳型から相補鎖を ５’−３’方向に合成することができるＤＮＡポリメラーゼの作用によって増幅 させる。増幅が配列アナライトの両方の鎖について起こり、ＤＮＡポリメラーゼ が熱安定であるのが好ましい。

次いで、増幅した鎖を変性させる。好都合には、該変性は、例えば、９０〜９７ ℃の温度で、またはＮａＯＨの存在下で、インキュベーションによって生じる。

好ましくは、捕捉プローブをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）な どのハブテンに結合させる。次いで、固相、好ましくは磁気プレートに引き付け られる磁性微粒子に固定される、例えば、抗−ＦＩＴＣなどの抗ハプテン抗体に よって分離する。遊離検出プローブを含む液相を洗浄によって除去する。

検出プローブを酵素またはビオチンと結合させるのが好ましい。次いで、好まし くは色素産生性の、酵素に対して特異的な基質とのインキュベーション、例えば 、停止溶液の添加による、反応の停止、および溶液自体の比色測定によって検出 を行う。好ましくは、該酵素は、アルカリホスファターゼであり、特異的な色素 産生性基質は、フェノールフタレイン・−リン酸塩であり、比色測定は、５５４ ｎｍの波長で行う。ビオチンに結合したプローブは、酵素に結合したアビジンに よって検出される。

一般に、本発明は、特に、異なる染色体由来の、または同一染色体の異なるゾー ン由来の、隣接したＤＮＡ断片からなる核酸配列の検出に有用である。これは、 以下の生物学的プロセスのいずれか・染色体転座、転位、遺伝子間もしくは遺伝 子内組換え、挿入、欠失または点突然変異の結果である。

本発明は、特に、配列アナライトの起源である微生物の病理学的状態に関係する ような生物学的プロセスの検出に適合する。かくして、転座は、例えば、Ｔおよ びＢリンパ球と関係するものとして新生物性状態に関係する；例えば、転座は、 ｔ（１４：１８）であり、配列アナライトはｂｃｌ−２／ＪＨであり、新生物性 状態は濾胞性リンパ腫である。この場合、ＤＮＡアナライトの配列は、ヒトの第 １４染色体および第１８染色体の２つの染色体の組換え点を含有し、該プローブ は、例えば、ネガティブ鎖のような、同一のＤＮＡ鎖の標的配列のいずれかの側 に結合する。プライマーが、自己的な、または他のプライマーに対して相補的な りＮＡ断片アナライトの部分とのハイブリダイゼーションを生じさせないような 長さおよび組成のものであることが重要である。したがって、好ましくは、熱安 定性であり、かつ、末端部分を各プライマーの３′位に延長するＤＮＡポリメラ ーゼを用いて、延長生成物を合成する。

次いで、高温変性（９２〜９４℃）によって、延長生成物をそれらの鋳型と分離 する。検出することができる濃度まで標的配列の量を増加させるのに充分に多（ のサイクルを介して、この変化を繰り返す。増幅サイクルが終了した後、好適な 量の配列アナライトを好適な濃度のＮａＯＨ，例えば、０．０８ＮＮａＯＨと反 応させて、二本鎖断片の変性を生起させる。別法としては、変性は、９４〜９７ ℃の温度に５〜１０分間、Ｄ　Ｎ　、Ａを暴露し、次いで、急激に０℃に冷却す ることによって行うことができる。

変性が終了した後、第２のオリゴヌクレオチド対を使用する。これらは、増幅方 法で使用したプライマーとは異なり、かつ、増幅に使用されるものに対するゾー ン中の、ＤＮＡアナライトの同−鎖に対して共に相補的なプローブである。該プ ローブを配列アナライトに対して過剰の濃度で反応混合物に添加する。このプロ ーブ対は、捕捉オリゴヌクレオチドおよびレポーターオリゴヌクレオチドからな る。各プローブを、その５′末端を介して、反応性基と結合して、適当な標識が 得られる。

リバー（ｒｅｐｅｒ）分子としては、ハブテン、酵素および放射性標識が挙げら れるか、または、色素産生性、蛍光性または化学発光性シグナルを提供するいず れの基質も挙げることができる。例えば、レポートプローブをアルカリホスファ ターゼで標識化し、捕捉プローブをＦＩＴＣなどのハブテンで標識化する。

プラスチックビーズ、マイクロプレート、被覆試験管、ラテックス、または、好 ましくは磁性微粒子などの固相への結合によって、捕捉プローブを分離するのが 好適である。例えば、ハブテンは、固相に固定された抗体、例えば、磁性微粒子 上の抗−ＦＩＴＣによって特異的に結合することができる。

次に、該反応混合物に、ＮａＯＨを緩衝化し、かつ、該プローブの、ＤＮＡアナ ライトへのハイブリダイゼーションを生起させるような量で、中和溶液、例えば 、０．５Ｍ　トリス（Ｔｒｉｓ）　（ｐＨ７，５）を添加する。

恒温で好適なインキュベーション時間後、例えば、＋３７℃で３０分後、遊離物 およびＤＮＡ配列と反応するものの両方の、ＦＩＴＣ標識セパレータープローブ の全量を結合することができる抗ＦＩＴＣ抗体で被覆した、磁性微粒子からなる 過剰量の固相を、反応混合物に添加して、配列アナライト−プローブ複合体を形 成する。恒温で好適なインキュベーション時間後、例えば、＋３７℃で１０分後 、反応試験管を磁気プレート上に置き、短時間、例えば、３分間で、試験管の底 自体に磁性粒子を沈降させる。

次いで、磁気プレートをひっくり返すことによるデカンテーションによって上清 を除去する。磁性化粒子は試験管の底に付着している。次いで、磁気プレートか ら試験管を外し、好適な洗浄溶液、例えば、０．０７５Ｍトリス緩衝化生理食塩 水（ｐＨ＝７．５）　１ｍｌに面相を再懸濁させ、再度、沈降させ、デカンテー ションを行う。試薬の、特に、固相と一緒に酵素に結合されるレポータープロー ブの、非特異的結合を除去するのに必要な回数、洗浄サイクルを繰り返す。デカ ンテーションおよび洗浄の間に、磁気粒子に特異的に結合しないこれらの全ての 反応物を反応試験管から除去する。

次に、該磁気粒子に、好適な量の酵素特異的な色素産生性基質、例えば、フェノ ールフタレイン・−リン酸塩２００μ！を添加し、恒温で所定の時間、例えば、 ３７℃で１時間、反応させる。この時間の後、停止溶液、例えば、ＮａＩＣＯｓ 溶液（ｐＨ１２）７５０μｌを添加することによって、反応を停止させる。

停止溶液の添加によって、色の形成および安定化が生じ、比色計で、好適な波長 、例えば、５５４ｎｍで、その吸光度を測定する。ブランク試料のものよりも有 意に高い発色現象は、増幅の間に、延長生成物が、特異的なプライマーから、お よび鋳型として作用したＤＮＡ配列アナライトから始まって形成されたことを示 す。配列アナライトの不在下では、特異的な延長生成物の形成は生じなかった。

該生成物は、磁気粒子と、シグナルを発生することができる酵素を持っているリ ポータ−プローブとの間の架橋として作用することができる唯一の化合物である 。

既知の濃度のＤＮＡアナライトを用いて標準曲線を作成して、分析される各試料 の濃度を得る。

反応性基とオリゴヌクレオチドプローブとの結合方法は、明らかに、使用される 基のタイプに左右される。一般に、好ましい結合は、オリゴヌクレオチドの５゛ 位の○Ｈ基を介して生じる。ホスホロアミダイト化学を使用して、オリゴヌクレ オチドの自動合成の間、アミノリンク（Ａｏ＋１ｎｏｌｉｎｋ）　２　（ＡＢ　 Ｉ　）反応物またはアミノモディファイヤー（Ａｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ）　 ＩＩ　（クローンチク（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ））反応物を使用して５°末端で脂肪 族アミンを導入することができる；このアミノ基は、特異的なハプテン、例えば 、ＦＩＴＣまたはビオチン−ヒドロキシ−スフノンイミドエステル、または活性 化され、第一アミン反応することができるエステルを含有するいずれかの他の基 と、連続して反応することができる。

酵素との結合について、４−（Ｎ−マレイミドメチル）フクロヘキサン−１−カ ルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）および２−イミノチオラン（２−ＩＴ） （ピアス（Ｐ　１ｅｒｃｅ）から入手可能）などの異種二官能性反応物を使用す るのが好ましい。例えば、ＳＭＣＣは、レポータープローブの５゛位の第一アミ ンと反応して遊離マレイミド基を持つ誘導体を与えることができる；２−ＩＴは 、アルカリホスファターゼのりシンのＮＨ２″にと反応して遊離−８Ｈ基を持つ 誘導体を得ることができる。マレインイミド基および−ＳＨ基は、好適な条件下 で反応させると、同時に反応して、非常に安定な炭素−硫黄共有結合を形成する 。このように、オリゴヌクレオチドの非変性相補的配列との特異的ノゾブリダイ ズ能を維持しつつ、かつ、酵素のその特異的基質との相互作用能を維持しつつ、 レポータープローブを、その５゛末端を介して、長い可撓性の炭素原子鎖を介し てアルカリホスファターゼに結合させるコンジュゲートを得ることができ、着色 溶液が得られる。

抗ＦＩＴＣ抗体で被覆された磁性粒子は、（エリーズーセロノ、アドバンスト・ マグネティクス（Ａｒｅｓ　−５ｅｒｏｎｏ、　Ａｄｖｅｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅ ｔｉｃｓ）から）商業的に入手可能であるか、または、それらは、よく知られて いる方法によって製造することができる。ホスファターゼに対して特異的な基質 および停止溶液も（シグマ（Ｓ　ｉｇ＋ａａ）から）商業的に入手可能である。

延長生成物は、好ましくは熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、欧州特許出 願公開Ａ第０２５８０１７号に記載されているＴａｑポリメラーゼへの、鋳型に ハイブリダイズされたプライマーの暴露によって得ることができる。ＤＮＡポリ メラーゼは、鋳型の配列を複製して、５’−３’方向でプライマーからいくつか の新しいＤＮＡを合成する。熱安定性ポリメラーゼが好ましいが、最も簡単な二 本鎖延長生成物の変性方法は、米国特許Ａ！４６８３２０２号に記載されている ように、ＰＣＲのサイクルの間、高温（約９５℃）に暴露することによるので、 それは必須ではない。別の延長生成物変性方法を用いることによって、フレノウ （Ｋ　１ｅｎｏｖ）断片を含む他のポリメラーゼを使用することができる。

ｔ（１４；　１８）ｂｅ　１２　（ＪＨ）転座を検出することに特異的に関して 、しかし、より一般的な適応にも関して、主ブレークポイントクラスター領域（ ＭＢＲ）または副クラスター領域（ｍａｒ）のいずれの増幅も、プライマーの混 合物（合計３個）を使用して、標的が存在するかに依存して、同時に行うことが できることが判明した。これらのプライマーは、各々、（１）第１４染色体のＪ ８領域、（Ｕ）第１８染色体のＭＢＲ領域（ｂｃｌ−２遺伝子の３゛未翻訳領域 内）；および（ｆｆｌ）ｂｃｌ−２第２エキソンから下流の２０Ｋｂを超える領 域の第１８染色体のｍａｒ領域に対して特異的である。お互いに妨害し合わず、 ＭＢＲおよびｍｃｒ配列の両方について同一の増幅効力が得られる、これらのタ イプの好ましいプライマーは、配列番号３で示されるＪ、プライマー、配列番号 １で示されるＭＢＲプライマー、および配列番号２で示されるｍａｒプライマー である（下記配列表を参照）。

増幅に次いで、ＭＢＲまたはｍａｒ増幅配列を、特異的なレポーターを使用して 検出することができる。さらに、ＩｇＨ座位には６つのＪＨ領領域存在すること が知られている。ｔ（１４；１８）染色体転座に任意に関係する個々のＪ、領域 を検出することができるように、６個の修飾オリゴヌクレオチドの混合物を使用 するのが好ましい。各オリゴヌクレオチドは、６つの特異的なＪ、領域のうちの １つに対して相補的である。それらは、配列番号４〜９で示される個々の配列を 持つ。

これらのオリゴヌクレオチドの各々は、自動合成の間に、ＮＨ，基で、３゛およ び５゛の両末端で修飾される。かくして、各レポーターは、両ＮＨ，基でＦＩＴ Ｃと結合され、次いで、ＨＰＬＣ精製される。３′および５゛結合の使用によっ て、系の感度が増大される。

ＦＩＴＣ結合オリゴヌクレオチドは、検出アッセイの間に抗ＦＩＴＣ被覆磁気粒 子と反応するので、それは捕捉プローブとして作用する。６個の結合オリゴヌク レオチドの混合物を、ＭＢＲおよびｍａｒ増幅配列の両方の検出に使用する。

ブレークポイントが存在するかの決定は、ｂｃｌ−２遺伝子のＭＢＲ領域または ｍａｒ領域のいずれかに対して特異的なプローブの使用によって行うことができ る。

ＭＢＲおよびｍａｒレポーターオリゴヌクレオチドは、共に、自動合成の間、Ｎ Ｈ２基で、３′および５′の両末端で修飾される。次いで、それらは、アルカリ ホスファターゼ酵素に結合され、前記のとおり精製される。酵素結合オリゴヌク レオチドは、「シグナル発生」プローブとして作用する。

（アルカリホスファターゼへの結合の後に）レポーターとして使用される修飾オ リゴヌクレオチドは、配列番号１ｏおよび１１で示される（各々、ＭＢＲおよび ｍａｒレポータープローブ）。オリゴヌクレオチドの両端でのＮＨ２修飾によっ て、プローブに結合することができる酵素の量および次なる検出方法の感度が増 加する。

ＭＢＲまたはｍａｒ検出プローブを溶解する反応緩衝液は、お互いにわずかに異 なっているのが好ましく、増幅配列の異なる長さくＭＢＲについては２００ｂｐ 、ｍａｒについては４００ｂｐ）の原因となる。また、ＰＣＲ試料の初期希釈は 、２つの標的について変化しく例えば、ＭＢＲについての実際の希釈は１：１０ ：ｍｃｒについては１：４）、同様に、ハイブリダイゼーション工程についての インキュベーション時間も変化する（例えば、ＭＢＲについては＋３７℃で３０ 分間、ｍＣｒについては＋３７℃で１５分間）。

以下の説明は、本発明の特定の具体例を構成する。「試薬」は、本発明の詳細な 説明し、「推奨方法」は、本発明の詳細な説明する。これらは、ラッジョーイタ ルジェネ・ソンエタ・ベル・アチオニ（Ｒａｇｇｉｏ　−Ｉ　ｔａｌｇｅｎｅ　 Ｓ、　ｐ、　Ａ、　）　ｌ：よって商標名Ｃ−ＴＲＡＫ　ＦＬの下に市販されて いるキットに関連する指示書から入手した。このキットは、凍結生検、パラフィ ン包埋組織、末梢血液および骨髄中のｔ（１４：　１８ＸＱ３２　；　ｑ２１） 染色体転座の検出のための、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

研究用に特に設計されている。先のＤＮＡ単離は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ）らによって「モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュア ル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ ａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバ−に記載されているよう な、標準的な方法で行うことができる。

各キットは、２５回の増幅を行うのに充分なＰＣＲプライマーを念有する。これ らの増幅は、各操作ごとに試料３個十ＰＣＲ対照２個で、最大５回の操作に細分 することができる。

ＭＢＲおよびｍｃｒの両方について全ての増幅試料をアッセイするために、およ び必要な検出対照を行うために充分な検出試薬がある。

以下の試薬を供給する。

Ｎｏ、Ｉ　ＰＣＲＣラブ７−（Ｊｎ；ＭＢＲ：ｍｃｒ）　１バイアル（凍結乾燥 ）内容物、各プライマー３ナノモル 希釈水（試料Ｎｏ、１４）３００μｌで再構成しなければならない。再構成後、 −２０℃で貯蔵する。

Ｎｏ、２　試料希釈剤　１バイアル（１５ｍ７り内容物ニドリス／ＥＤＴＡ　（ ＴＥ）緩衝液（ｐＨ７，５）使用の準備ができている。

Ｎｏ、　３　変性溶液　１バイアル（３，５ｍ／）内容物・希釈したＮａＯＨ／ ＳＤＳ／ＥＤＴＡ使用の準備ができている。室温で貯蔵する。冷蔵してはいけな い。

Ｎｏ、４　ｂｃｌ−２−ＭＢＲ検出プローブ　１バイアル（１５，４ｍ１）内容 物：反応緩衝液中のＪ、、−ＦＩＴＣレポーター（ＦＩＴＣに結合したＪｌｌｌ −６ブローブ）および（アルカリホスファターゼ酵素に結合した）ｂｃ　］−２ −ＭＢＲプローブのセット使用の準備ができている。

Ｎｏ、５　ｂｃｌ−２−ｍａｒ検出プローブ　１バイアル（１５，４ｍ／）内容 物：反応緩衝液中のＪＨ−ＦＩＴＣレポーター（ＦＩＴＣに結合したＪ　ｌ１ｌ −６ブローブ）および（アルカリホスファターゼ酵素に結合した）ｂｃｌ−２ｍ ｃｒプローブのセット使用の準備ができている。

Ｎｏ、６　分離試薬　１ノくイアル（１５，４，／）内容物：抗ＦＩＴＣ被覆常 磁性ビーズのトリス緩衝化生理食塩水中懸濁液 使用の準備ができているが、使用直前に、まず、再懸濁する。

Ｎ００７　洗浄溶液（２０Ｘ濃縮物）　１バイアル（１３，２ｍ１）内容物ニド リス緩衝化生理食塩水 希釈水２５０ｄで調製しなければならない。

Ｎｏ、　８　基質溶液　２バイアル（各１５．４．７’）内容物・トリエタノー ルアミン緩衝液中のフェノールフタレイン・−リン酸塩 使用の準備ができている。直射日光に暴露してはいけない。

Ｎｏ、９　停止溶液　１ビン（１１５＋＊ｌ）内容物：炭酸ナトリウム／水酸化 ナトリウム溶液（ｐＨ＞１２）使用の準備ができている。注意：腐食性物質。

Ｎｏ、１０　ｔ（１４；１８）転座の正のＰＣＲ対照　１バイアル（６０１’） 内容物：ＴＥ緩衝液中の、各々、ＭＢＲおよびｍｃｒ　ｔ（１４；１８）転座を 持つ２つの細胞株から抽出されたＤＮＡ使用の準備ができている。

Ｎｏ、　１１　負のＰＣＲ対照　１バイアル（６０μ／）内容物：ＴＥ緩衝液中 の、ｔ（１４；１８）転座を持っていない細胞株から抽出されたＤＮＡ 使用の準備ができている。

ＮＯ，１２ｔ（１４；１８）転座の正の検出対照　１バイアル（４８０μｌ）内 容物：ＴＥ緩衝液中のＭＢＲおよびｍａｒ増幅配列使用の準備ができている。

Ｎｏ、　１３　負の検出対照　１バイアル（４８０μｌ）内容物：ＴＥ緩衝液中 の、ｔ（１４：　１８）転座を持っていないが、ｒｂｃ　ｌ−２４ＰＣＲ増幅に 付された細胞株から抽出されたＤＮＡ 使用の準備ができている。

Ｎ０１４　希釈水　１バイアル（３ｍｌ）内容物：ＨＰＬＣ用希釈水 使用の準備ができている。

さらなる試薬 Ａ、パーキン−エルマー・セタス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）　 ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ Ｂ、パーキン−エルマー・セタス１０ｘ増幅緩衝液Ｃ，パーキン−エルマー・セ タスＭｇＣ１２ｍ液り、デオキシヌクレオチド三リン酸 内容物：ｄＡＴＰＳａｃＴｐ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの２５ｍＭ溶液希釈水（ 試薬Ｅ）で１：２０に希釈しなければならない。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｂｃｌ−２転座ＤＮＡ配列の増幅１、希 釈水（試薬Ｎｏ、１４）３００μ／でＰＣＲプライマー（試薬Ｎｏ、１）を再構 成し、数分間、渦動混合し、マイクロフユージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で高速 回転する。再構成後、−２０℃で貯蔵する。

２、希釈水（試薬Ｅ）２．０９ｍＡ’をピペットで移したバイアル中に試験管の 内容物（１１０μｌ）を移すことによって、ｄＮＴＰ　（試薬１０）を希釈水（ 試薬Ｅ）で１・２０に希釈する。アリコツトを採取し、−２０℃で貯蔵する。

３、ＰＣＲサーマルサイクラ−に対して好適な、オートクレーブした試験管中に 、以下のものをピペットで移す・ 希釈水（試薬Ｎｏ、　４）　４６．５μ１ＰＣＲプライマー（試薬Ｎｏ、１）１ ０．０μ１１０Ｘ増幅緩衝液（試薬Ｂ）１０．０１’ＭｇＣＡ’２溶液（試薬Ｃ ）７．０μ１ｄＮＴＰ溶液（試薬Ｄ）１６．０μｌ Ａｍｐｌｉｔａｑ　（試薬Ａ）　ｏ、５ｔｔｉ−酵素２．５単位と等価試料１０ ．０μｌ：合計ＤＮＡ　１μｍ最終容量１００．０μ１０ 溶液の上部に鉱油５０μｌを積層し、マイクロフユージ中で高速回転し、サーマ ルサイクルを開始する。

本発明者らは、以下の方法を示唆する：１）ＤＮＡ試料を除く、ＰＣＲ反応に必 要な試薬全ての「主要混合物」を（「保護」環境下、０〜４℃で）調製する。試 料十正および負のＰＣＲ対照の各々について、充分な「主要混合物」を調製すべ きである（＋５％過剰）。

ｉｆ）該「主要混合物」を４℃でＰＣＲ試験管中にピペットで移す。

伍）該ＤＮＡ試料をそれらの個々のＰＣＲ試験管中にピペットで移す。

ｆｖ）鉱油を添加する。

Ｖ）マイクロフユージ中で高速回転する。

■）サーマルサイクルを素早く開始する。

パーキン−エルマー・サーモサイクラ−９６００についての推奨されるプロトコ ールは、以下の使用を含む。

０．５１の薄膜バイアル 反応容量１００μｌ／鉱油５０μ！ 時定数１２．５　（１００μｌ）およびＸ　温度低下を設定する＝０．５度／サ イクルｎ時間増加を設定する＝１秒／サイクル別のバイアルおよび別の加熱／冷 却装置を使用する他のＰＣＲ装置について、本発明者らは、以下の設定パラメー ターを示唆する（注意：使用者は、各々、自停止し、４℃で維持する。

増幅ＤＮＡ配列の検出 使用前に、全ての試薬を室温にし、ローリングミキサーもしくはオービタルミキ サー、または同様の装置を使用して、ゆっくりではあるが、完全に、それらを混 合する（使用前に、少な（とも半時間、それらを冷蔵庫がら取り出しておく）。

直射日光に暴露してはいけない。

直接加熱源に暴露してはいけない。

注意：ＭＢＲおよびｍｃｒの検出は、２つの別々の実験で行われなければならな い。

１、希釈水２５０ｍＡに、洗浄溶液（２０Ｘ濃縮物（試薬Ｎ０．７））の全内容 物を添加し、よ（混合する。

２、ＰＣＲ試料を確実に透明にし、透明でない場合は、次いで、渦動混合し、マ イクロフユージ中で高速回転する。

３ａ、ＭＢＲを検出するために、少な（とも２０μｌの試料を使用して、試料希 釈剤（試薬Ｎｏ、２）で各ＰＣＲ反応混合物を１：４に希釈し、渦動混合し、マ イクロフユージ中で高速回転する。

３ｂ、ｍａｒを検出するために、少なくとも２０ｔｔｌの試料を使用して、試料 希釈剤（試薬Ｎｏ、２）で各ＰＣＲ反応混合物を１．４に希釈し、渦動混合し、 マイクロフユージ中で高速回転する。

４、磁気セパレーターの外に試験１立て（ｔｕｂｅ　ｒａｃｋ）を取り出す。希 釈したＰＣＲ試料の各々について、および正の検出対照（系試薬Ｎｏ、１２）お よび負の検出対照（系試薬Ｎｏ、１３）について、該試験１立てに反応試験管２ 本を置（。

該試験管を適当に標識する。

５、二重反復試験において、試験管の底に確実にピペットで移して、それらの個 々の試験管中に各試料および対照２０μｌをピペットで移す。

６、マルチピペットを使用して、変性溶液（試薬Ｎｏ、３）２０μｌを各試験管 中に分配する。

注意：全ての試験管への変性溶液の添加は、３分以内で完了すべきである。

７、試験１立てを、数秒間、左右運動を使用して手動で振盪し、該試料を変性溶 液と確実に接触させる。

８．３７℃で１０分間、水浴中で試験１立てをインキュベートする。

９、マルチピペットを使用して、各試験管中に、ＭＢＲ検出プローブ（試薬Ｎｏ 、４）またはｍａｒ検出プローブ（試薬Ｎｏ、５）のいずれが２００μｌを分配 する。

１０、該試験１立てを、数秒間、左右運動を使用して手動で振盪する。

１１、ＭＢＲを検出する場合は３０分間、あるいは、ｍａｒを検出する場合は１ ５分間、３７℃で、水浴中で試験１立てをインキュベートする。

１２、各試験管中に、完全に混合した分離試薬（試薬Ｎｏ、　６）　０．１＋＋ ｉを分配する。

注意： 分離試薬を混合するのに磁気撹拌器を使用してはいけない。

磁気抗体懸濁液は、使用前に完全に混合して、磁気粒子を確実に均一に懸濁させ なければならない。試験管１０〜２０本中にピペットで移した後、バイアルを渦 動させる。

全ての試験管への分離試薬の添加は、３分以内に完了すべきである。

１３　試験管を覆う。マルチフォルテックスを使用して、試験１立てをゆっくり と渦動混合する。別法としては、左右運動を使用して試験１立て全体を振盪させ る。

注意　良好なアッセイを確実に行うために、ゆっくりではあるが完全な、かつ、 同時の混合は重大である １４．３７℃で１０分間、水浴中で試験１立てをインキュベートする。

１５、試験１立てを磁気分離器中に滑り込ませ、全ての試験管を、分離器の表面 と確実に接触させて、磁気沈降を４分間生じさせる。

１６．１つの大きくゆっ（つとした円運動で分離器をひっくり返すことによって 、全試験管から上清をデカントする。ひっくり返した分離器を、トレイ中の吸収 紙の上に置き、分離器の底をしっかりと数回たたいて、試験管の側面に付着して いる液滴を追い出す。

注意： 黒色の磁気粒子の消失は、間違ったデカント技術を示す。

「アンブリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎｅ）Ｊエーロゾル形成を最小限にするために 、過剰のスブラッシングを避けるようにする。

使用直後に、０５％ブリーチで完全に該領域を浄化する。

密封バッグ中の吸収紙を捨てる。

手／ピペットで試験管のふちに接触してはいけない。

該方法のこの段階で、充分な予防手段が取られない場合、重大な汚染問題を生じ る反応試験管中に多量の増幅配列が存在することに気づく。

１７　分離器を垂直に置き、すでに希釈した洗浄溶液（試薬Ｎｏ、　７）　０． ５ｍ／を各試験管に添加する。

１８、分離器から該試験１立てを取り出す。マルチ−フォルテツクスミキサ−中 に貫く。良好なアッセイを確実に行うために、強く完全な渦動混合が必須である 。

１９、該試験１立てを磁気分離器中に滑り込ませる。全ての試験管が分離器の表 面と接触することを確かめるために調べる。３分間待って、粒子を磁気的に沈降 させる。

２０　工程１５におけると同様に、全ての試験管がら上清をデカントする。

２１、工程１６〜１９を２回繰り返す（合計３回の洗浄工程）。

注意：磁気的分離工程の最後に、全ての試験管の完全な排水は、バックグラウン ドシグナルの増加を回避するために重大である。

２２、分光光度計の「ブランキング」のために２本の試験管を標識し、試験１立 てに厘く。

２３、分離器から試験１立てを取り出し、ブランク試験管を含む各試験管中に基 質溶液（試薬Ｎｏ、８）０．２ｍｌをピペットで移す。

注意：全ての試験管への基質溶液の添加は、５分以内に完了すべきである。

２４、プラスチックフィルムで該試験１立てを覆う。左右運動を使用して全ての 試験管を完全に混合する。（注意：アンブリコンでひどく汚染されるので、非常 に注意してプラスチックフィルムを捨てる。）２５．３７℃で６０分間、水浴中 で該試験１立てをインキュベートする。

２６、ブランク試験管を含む各試験管中に停止溶液（試薬Ｎｏ、　９）　０．７ ５ｍ／をピペットで移す。

注意：基質溶液を添加する場合と同様に、はぼ同一速度で、かつ、同一シーケン スで、停止溶液を添加するのは重要である。

２７　磁気分離器中に該試験１立てを滑り込ま也少なくとも５分間、粒子を磁気 的に沈降させる。

２８、ブランク試験管を使用して５５０ｎｍで分光光度計をブランクし、次いで 、試料および対照について吸光度（Ａ）を測定する。

注意：吸光度が分光光度計の上限を超える試料は、４９２止で測定すべきである 。Ａｓｓ。は、５ＸＡ４１Ｈとほぼ等しいが、正確な関係は、各装置について決 定すべきである。

結果の解説 アッセイの結果は、吸光度の数値によって示される。負のＰＣＲ対照よりも有意 に高いＡ　３６６が得られる試料は、正と記録すべきである。例えば、ＣＡＸｓ ｓ。−３Ｓ、Ｄ、）　＞　（Ａｃｔｇ。＋３　８．Ｄ、）。

ココテ、Ｘ＝試料、Ｃ＝負のＰＣＲ対照、Ｓ、　Ｄ、　＝標準偏差。

負のＰＣＲ対照についてのＣＶ（変異係数）予想値は、はぼ１５％である（ここ で、ＣＶ＝Ｓ、Ｄ、／Ａｓ５ｏ）。

ＰＣＲキャリオーバー汚染のきわめて重大な流出についての検査および偽陽性の 結果として、負のＰＣＲ対照のＡｓ５ｏは、負の検出対照のＡ　Ｓ　Ｍ　Ｏとは 有意に異なるべきではない。負のＰＣＲ対照のＡｓ５ａが負の検出対照のＡ　Ｓ Ｓ　Ｏよりも有意に過剰である場合［すなわち、（Ａｃｓｓｏ　３　Ｓ、Ｄ、） 　＞　（Ａｄｓｓｏ＋３　Ｓ、Ｄ、）　（ここで、ｄは、負の検出対照を示す） ］、全試験操作の結果は、無視されるべきであり、さらなるＰＣＲキャリオーバ ーを回避するように処置を行うべきである。

ＰＣＲ増幅および検出方法が、共に、正しく行われたことを確認するために、正 のＰＣＲ対照および正の検出対照は、共に、各キットで与えられたロット特異的 データシート中で示される範囲内でＡ　５５６値が得られなければならない。

感度 本発明者らの研究では、本発明者らは、５０．０００個の細胞中の１個の転座細 胞の存在を検出することができた。転座アッセイにおける負の結果は、試料中で 非常に低い濃度の転座細胞の結果として簡単に生じ得た。さらに、有効に低いレ ベルのｔ（１４；１８）転座の発生を研究する場合、統計的サンプリング法を使 用すべきである。

精度 検出工程のアッセイ内精度は、同一のＰＣＲ増幅試料のＡｓｓ。複製を測定する ことによって決定され、その結果、平均８〜１０％のＣＶとなる。

（前記に従って測定した）検出工程のアッセイ間精度は、１０〜１５％のＣｖで あった。

配列番号、８ 配列の型：オリゴヌクレオチド 配列の長さ＝２７塩基 鎖の数ニー重鎮 トポロジー：直鎖状 Ｎｉｌ、−ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＧＣＣＡＡＧ　 ＧＡＡ−Ｎｔｌ。

配列番号−９ 配列の型：オリゴヌクレオチド 配列の長さ：２７塩基 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直鎖状 ＮＨｌ−ＡＣＣＧＴＡ　ＴＧＧ　ＡＣＧ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＧＧＣ、ＡＡＧ　Ｇ Ｇ＾−ＮＯ２配列番号：１０ 配列の型・オリゴヌクレオチド 配列の長さ　２７塩基 鎖の数、−重鎖 トポロジー　直鎖状 ＮＦＩ、−ＴＴＴ　ＣＡＡ　ＣＡＣＡＧＡ　ＣＣＣＡＣＣＣＡＧ　ＡＧＣＣＣＴ −Ｎｌ’１２配列番号：１１ 配列の型二オリゴヌクレオチド 配列の長さ＝２５塩基 鎖の数、−重鎖 トポロジー・直鎖状 ＮＩｌ、−ＣＧＣＴＣＴ　ＴＧＴ　ＴＧＡ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＧＣＴＴＡ　Ｇ −Ｎｔ１２１工１．１−−Ｎ・　ＰＣＴ／ＥＰ　９２１００９２９フロントペー ジの続き （７２）発明者　マルコリニ、スタニスラヴオイタリア、イー００１８７０−マ 、ヴイア・クィンティノ・セルラ３番 イタリア、イー０００１２０−マ、セッテヴイルレ、ヴイア・ジュセッペ・シュ スティ９／ディ番

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．アナライト中の標的配列を増幅し；均一相中で、ハイブリダイジング条件下 、増幅した標的配列と、各々、該標的配列の異なる領域に対して相補的な、２つ の、別々に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの過剰量とを反応させ（ここ で、１つの標識は、そのプローブを分離可能にし、他の標識は、そのプローブを 検出可能にする）；次いで、結果として生じた両標識を有するハイブリッドを分 離および検出する工程からなるアナライト中の染色体異常を含む標的配列の検出 方法。
2. ２．増幅が、標的配列の領域に対して相補的なプライマーの存在下、一本鎖鋳型 から５′−３′方向に相補鎖を合成するＤＮＡポリメラーゼの作用を介して生じ 、オリゴヌクレオチドプローブがこれらの領域に対して内部的に官巣される請求 項１記載の方法。
3. ３．二本鎖ＤＡＮの両方の鎖が増幅され、ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性である 請求項２記載の方法。
4. ４．分離可能なプローブがハプテンと結合され、分離が固相上に固定化された抗 ハプテン抗体によって行われる請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. ５．固相が磁性微粒子からなる請求項４記載の方法。
6. ６．ハプテンがフルオレセインイソチオシアネートであり、抗体が抗−ＦＩＴＣ である請求項４または５記載の方法。
7. ７．検出可能なプローブまたはレポータープローブが酵素またはビオチンに結合 し、検出が、酵素に対して特異的な基質と、またはストレプトアビジン−酵素コ ンジュゲートとのインキュベーションからなる請求項１〜６のいずれか１項記載 の方法。
8. ８．基質が色素産生性であり、検出が、反応を停止する溶液の添加後の比色測定 からなる請求項７記載の方法。
9. ９．酵素がアルカリホスファターゼであり、色素産生性基質がフェノールフタレ イン・一リン酸塩であり、比色測定が５５４ｎｍの波長で行われる請求項８記載 の方法。
10. １０．さらに、増幅配列を変性させることからなる請求項１〜９のいずれか１項 記載の方法。
11. １１．少なくとも１つの標識が放射性標識でない請求項１〜１０のいずれか１項 記載の方法。
12. １２．異常がＴまたはＢリンパ球の新生物性状態に関連する請求項１〜１１のい ずかれ１項記載の方法。
13. １３．異常が染色体転座であり、プローブが転座の反対側の領域に対して相補的 である請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
14. １４．転座がｔ（１４；１８）であり、配列アナライトがブレークポイントｂｃ １−２／ＪＨからなり、新生物性状態が濾胞性リンパ種からなる請求項１２また は１３記載の方法。
15. １５．１種類を超える異常を検出するために、２つ以上の標的配列が、同時に、 増幅され、および／またはハイブリダイズされる請求項１〜１４のいずれか１項 記載の方法。
16. １６．標識プローブ、および、所望により、請求項１〜１５に定義されたいずれ かの他の手段または成分からなる請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法を行 うために適しているキット。