CZ302581B6 - Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu - Google Patents

Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu Download PDF

Info

Publication number
CZ302581B6
CZ302581B6 CZ20100441A CZ2010441A CZ302581B6 CZ 302581 B6 CZ302581 B6 CZ 302581B6 CZ 20100441 A CZ20100441 A CZ 20100441A CZ 2010441 A CZ2010441 A CZ 2010441A CZ 302581 B6 CZ302581 B6 CZ 302581B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
primers
primer
region
complementary
genes
Prior art date
Application number
CZ20100441A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2010441A3 (cs
Inventor
Tichý@Boris
Šupíková@Jana
Pospíšilová@Šárka
Mayer@Jirí
Original Assignee
Masarykova Univerzita
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Masarykova Univerzita filed Critical Masarykova Univerzita
Priority to CZ20100441A priority Critical patent/CZ2010441A3/cs
Publication of CZ302581B6 publication Critical patent/CZ302581B6/cs
Publication of CZ2010441A3 publication Critical patent/CZ2010441A3/cs

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) spocívá v tom, že se v DNA získané ze vzorku biologického materiálu detekuje prítomnost translokace t(11;14)(q13;q32) metodou multiplexní PCR dalekého dosahu (multiplex long-range PCR) s pomocí sad primeru pokrývajících oblasti na chromozómech 11 a 14, v nichž obvykle dochází ke zlomu. Zpusob umožnuje detekci ve vetšine vzorku, ve kterých je translokace prítomna a umožnuje rychlou charakterizaci místa zlomu pro návrh specifických detekcních sad ke sledování minimální zbytkové nemoci.

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu detekce chromozomální translokace t(l I;14)(ql3;q32) a charakterizace místa zlomu metodou multiplexní long-range PCR z biologických vzorků odebraných z těla pacientů, zejména ze vzorků tkáně lymfatické uzliny, kostní dřeně a krve. Dále se týká nových oligonukleotidů, vhodných pro použití při tomto způsobu.
Dosavadní stav techniky
Nádorová onemocnění jsou často provázena cytogenetickými aberacemi jako jsou delece nebo amplifikace chromozomů nebo jejich úseků nebo chromozomální translokace, při kterých dochází k výměně genetického materiálu mezi nehomologními chromozómy. Jednou z těchto aberací je i chromozomální translokace t(l I;14)(ql3;q32), kteráje nejčastěji detekována u vzorků lymfomu plášťových buněk (Mantle Cell Lymphoma, MCL). Důsledkem této translokace je přemístění genu CCND1 ležícího na chromozómu 1 lql3 do blízkosti zesilovače transkripce genu pro těžký řetězec imunoglobulinu (IGH), který leží na chromozómu 14q32 (Obr.l). Gen CCND1 (dříve označovaný i jako BCL1 nebo PRAD1) kóduje informaci pro tvorbu proteinu cyklin Dl. Cyklin Dl je protoonkogen, který sehrává významnou roli v regulaci buněčného cyklu, kde spolu s ostatními proteiny řídí přechod mezi jednotlivými fázemi cyklu. Gen IGH kóduje informaci pro syntézu těžkého řetězce imunoglobulinu, kterýje spolu s lehkým řetězcem součástí sekretovaných i na membránu vázaných protilátek vytvářených B-lyrnfocyty a plazmatickými buňkami. Následkem této translokace dochází k nadměrné expresi cyklinu Dl a následné poruše regulace buněčného cyklu.
Translokace t( 11; 14)(ql 3;q32) bývá detekována u téměř všech vzorků MCL, méně často pak u jiných B-lymťoproliferací. Bylo popsáno několik způsobů detekce t(l I;14)(ql3;q32). Nejspolehlivějším je vyšetření interfázických chromozómů pomocí fluorescenční in situ hybridizace (FISH) (Detection of t(l 1 ;14) using interphase molecular cytogenetics in mantle cell lymphoma and atypical chronic lymphocytic leukemia. Avet-Loiseau H, Garand R, Gaillard F, Daviet A, Mellerin MP, Robil lard N, Bouyge I, Arcot S, Batzer M, Talmant P, Harousseau JL, Milpied N, Bataille R. Genes Chromosomes Cancer. 1998 Oct;23(2): 175-82) s použitím dvou různě značených hybridizačních sond (jedna pro chromozóm 11 a druhá pro chromozóm 14). Z cytogenetických metod je použitelná i karyotypizace nebo M -FISH (multicolor FISH) (Detection of diagnostically critical, often hidden, anomalies in complex karyotypes of haematological disorders using multicolour fluorescence in šitu hybridization. Jalal SM, Law ME, Stamberg J, Fonseca R, Seely JR, Myers WH, Hanson CA. Br J Haematol. 2001 Mar;l 12(4):975-80). Mezi metody molekulární biologie pro detekci t(l I;14)(ql3;q32) patří Southemův přenos (Bcl-1 gene rearrangements ín B cell lymphoma. Ince C, BlickM, LeeM, Pathak S, Vadhan-Raj S, Selvanayagam P, Gutterman JU, Cabanillas F. Leukemia. 1988 Jun;2(6):343-6), PCR (Detection of the chromosomal translocation t(l 1; 14) by polymerase chám reaction in mantle cell lymphomas. Rimokh R, Berger F, Delsol G, Digonnet I, Rouault JP, Tigaud JD, Gadoux M, Coiffier B, Bryon PA, Magaud JP. Blood. 1994 Apr 1 ;83(7): 1871 -5) a inverzní long-range PCR (Rapid molecular cloning of rearrangements of the IGHJ locus using long-distance inverse polymerase chain reaction. Willis TG, Jadayel DM, Coignet LJ, Abdul-RaufM, Treleaven JG, Catovsky D, Dyer MJ. Blood. 1997 Sep 15;90(6):2456-64). Metoda Southemova přenosu spočívá v hybridizací radioaktivně nebo fluorescenčně značených sond s elektroforeticky rozdělenou a na membránu přenesenou vysokomolekulámí genomovou DNA. Touto metodou lze translokaci pouze detekovat. PCR dokáže translokaci nejen detekovat, ale po sekvenaci i charakterizovat. Metoda je vysoce citlivá (dokáže detekovat přibližně 1 buňku s translokaci mezi 100.000 zdravých buněk), dokáže však zachytit pouze ty translokace, kde zlomové místo na chromozómu 11 leží v oblasti
- 1 CZ 302581 B6 tzv. MTC (Major Translocation Cluster), Translokace se zlomovým místem v MTC však představují pouze 30 až 40 % ze všech t(l 1; 14)(q 13;q32) detekovaných u MCL. Inverzní long-range PCR je navržena tak, aby dokázala zachytit a charakterizovat prakticky všechny translokace bez ohledu na pozici místa zlomu. Tato metoda je však poměrně složitá, zahrnuje několik různých kroků jako je restrikční štěpení, cirkularizace produktů restrikčního štěpení, Southemův přenos, long-range PCR a klonování amplifikačních produktů do bakterií.
Předkládaný vynález umožňuje častěji PCR detekci translokace t(l I;14)(ql3;q32) bez nutnosti využití náročných metod jako je Southemův přenos. Předkládaný vynález zjednodušuje určení sekvence místa zlomu translokace t( 11; 14)(q 13;q32).
Cílem předkládaného vynálezu je doplnit a případně nahradit stávající způsob PCR detekce translokace t(l I;14)(ql3;q32) novou metodou multiplexní long-range PCR.
Podstata vynálezu
Vynález se týká nového způsobu PCR detekce zlomového místa translokace t(l I;14)(ql3;q32), která zvyšuje četnost záchytu až na 80 % pri zachování technické nenáročnosti. Předmětem vynálezu je metoda multiplexní long-range PCR se speciálně navrženým souborem oligonukleotidových primerů určená pro detekci zlomového místa translokace t(l I;14)(ql3;q32) v DNA získané z biologického vzorku získaného z těla pacienta, a použití metody multiplexní long-range PCR pro detekci zlomového místa translokace t( 11;14)(ql3;q32) v DNA získané z biologického vzorku získaného z těla pacienta. Pod pojmem long-range PCR se rozumí metoda polymerázové řetězové reakce (PCR), která využívá speciální enzym schopný účinně amplifikovat dlouhé úseky molekuly DNA (delší než 5 tisíc párů bází, tj. 5 kb). Pojmem multiplexní je označováno použití více než dvou primerů v jedné reakci. Podstata metody spočívá v PCR amplifikaci úseku genomové DNA, který zahrnuje zlomové místo, tj. souvislý úsek molekuly DNA skládající se ze sekvence pocházející z chromozómu 11 i sekvence pocházející z chromozómu 14.
Předmětem vynálezu je způsob detekce zlomového místa translokace t(l I;14)(ql3;q32) metodou multiplexní PCR dalekého dosahu (multiplexní long-range PCR) v DNA získané ze vzorků biologického materiálu, jehož podstata spočívá v tom, že
a) se připraví primery Fl až Fn, kde n je nejvýše 140, komplementární k úsekům ležícím v oblasti chromozómu 11 v rozsahu -5000 až +420000 baží od počátku transkripce genu CCNDI směrem k centromeře, přičemž úseky ležící v této oblasti, k nimž jsou komplementární uvedené primery Fl až Fn, jsou od sebe vzájemně vzdáleny alespoň 1,7 kb, s výhodou 1,7 až 7,6 kb, výhodněji 3,5 až 5,5 kb, a primery F jsou s výhodou číslovány postupně ve směru od počátku transkripce CCNDI k centromeře,
b) se připraví primery JI až J6, které jsou komplementární k úsekům oblasti chromozómu 14, v níž leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinu, přičemž úsek, k němuž je komplementární primer JI, leží mezi geny ÍGHJl a IGHJ2, úsek, k němuž je komplementární primer J2, leží mezi geny 1GHJ2 a IGHJ3, úsek, k němuž je komplementární primer J3, leží mezi geny 1GHJ3 a IGHJ4, úsek, k němuž je komplementární primer J4, leží mezi geny IGHJ4 a IGHJ5, úsek, k němuž je komplementární primer J5, leží mezi geny IGHJ5 a IGHJ6 a úsek, k němuž je komplementární primer J6, leží mezi geny IGHJ6 a IGHC,
c) primery Fl až Fn se zkombinují s primerem J6 do reakcí multiplexní PCR dalekého dosahu, tak, že vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je alespoň 15 kb,
d) provedou se reakce multiplexní PCR dalekého dosahu s DNA získanou z biologického vzorku získaného z těla pacienta,
-2 CZ 302581 B6
e) určí se primer F nejblíže zlomovému místu, který poskytl pozitivní reakci, ve výhodném provedení tedy primer s nejvyšším číslem, který poskytl pozitivní reakci,
f) primer F, kterýje nejblíže zlomovému místu, se zkombinuje do nové sady reakcí multiplex5 ní PCR dalekého dosahu s příměry Jl až J6, a to tak, aby v každé reakci byl primer F, který je nejblíže zlomovému místu, a jeden z primerů J1 až J6,
g) provedou se reakce PCR dalekého dosahu s DNA získanou z biologického vzorku získaného z těla pacienta, io
h) určí se primer J snejnižším číslem, který poskytl pozitivní reakci, a kterýje tedy nejblíže zlomovému místu,
i) stanoví se sekvence úseku mezi primerem F, který je nejblíže zlomovému místu, a prime15 remJ, kterýje nejblíže zlomovému místu, s výhodou se sekvence tohoto úseku stanoví metodami PCR a sekvencování.
Biologickým vzorkem může být s výhodou vzorek periferní krve, vzorek kostní dřeně nebo vzorek tkáně, zejména může být vzorkem tkáně vzorek lymfatické uzliny.
Primery Fl až Fn (primery F) tedy mají být navrženy tak, aby pokrývaly oblast, v níž dochází ke zlomu na chromozómu 11. Obvykle ke zlomu dochází blíže ke genu CCND] než 420 kb, proto primery F nemusí pokrývat celou tuto oblast, mohou pokrývat jen část této oblasti blíže ke genu CCNDI. Rozdělení primerů F do reakcí pro multiplexní PCR má být takové, aby se v žádné reakci neamplifíkovat víc než jeden řetězec, toho lze dosáhnout tak, že minimální vzdálenost mezí primery v jedné reakcí je 15 kb.
Ve výhodném provedení vynálezu je n menší nebo rovno 95 a v kroku c) jsou primery zkombinovány do nejvýše 12 reakcí multiplexní PCR dalekého dosahu.
Primery Jl až J6 (primery J) mají být navrženy tak, aby pokrývaly oblast chromozómu 14, v níž leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinu.
- j CZ 302581 B6
S výhodou se jako F primery pro multiplexní PCR dalekého dosahu použijí oligonukleotidy mají cí alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
GGAGAAGGTCCTCCAAGCCGATATCCCTGCAGACG
TCCATTGTTAAGCCCTTAAGTCGCCCGGGAAAACG
CAAAGATACTGGTGAGCCCTGCTGGCGGTGATGG
CCAGGCTGAGCCACAGCAGTAGCAAGGGACAAAGG
CCTTCAGGTGGTTCGCAGGTGTCTAACGATTTTCG
GGAAGCTCTAGGGTTTGCAACAGGGCCTGGGAAGG
CCGTGGTCACGCCACCACCACTTGCTAATATGACG
CTGGGATGAGGTGCACATGGAAAATGAGGCATTGG
CGTGCACCGTACCGGAGTTTGTGGATGACTCTAGC
ACCGTGGTCTTGCACATGTAGGGACCTCATCAAGG
CAGGTACTCCATGCGCCTTTGGTTTGCAGGTGAGG
GGAGACAAGAGTGTTTGCCGCCTGTCATGGTGAGC
ATTCCACTGGGTCCATAATCCTAGGCCAGCCATGC
CCCAGTGGAGTGGGTGCÍGAGTGTGTGATACTTGG
AGAGGTCCAGAAGTTGGTGTGGCCATCATGTCAGG
CGCAACCAGCCTGGCACTGATAAGAAGCACAGAGG
GTAGACAGGAGAGCCCGGAAGATGTGACCCACTGC
CAGCTGGAAACAGCTCAGTCTGGGACCACAACACC
AATAACGTGGGTGCTCGTCTCTCCCTGCCACAAGG
AGGGCTCTTTCTCCAGTGAAGGGTCCTCGCCTTGG
GAGGGGATTTCGAGGCTCTAGGGTCCAAGAAGTGG
CAGGAGCCACGCCGAAGTGTCAGATGTACCTCACC
GGGTGGCTCCATTCTTGGTTGTAGGCTGGTGAGG
ACGCAAGCCCGTGAGCTGTGTCTTCTTTGTCTGG
CAGCCCCTTTGCTCTCAATGCTCCCTAAGCAGTGG
GGTCACATTCACAGAACCCCAGGTCTCCAGAAAGC
GTGCCTGTGCCATGGGACTGATTAGGTATTGATGG (Fl; SEQ ID NO. 1), (F2, SEQ ID NO. 2), (F3, SEQ ID NO. 3), (F4, SEQ ID NO. 4), (F5, SEQ ID NO, 5), (F6, SEQ ID NO. 6), (F7, SEQ ID NO. 7), (F8, SEQ ID NO. 8), (F9, SEQ ID NO. 9), (F10, SEQ ID NO. 10), (FIl.SEQ ID NO. 11), (F12, SEQ ID NO. 12), (F13, SEQ ID NO, 13), (F14, SEQ ID NO. 14), (F15, SEQ ID NO. 15), (F16, SEQ ID NO. 16), (F17, SEQ ID NO. 17), (F18, SEQ ID NO. 18), (F19, SEQ ID NO. 19), (F20, SEQ ID NO. 20), (F21, SEQ ID NO.21), (F22, SEQ ID NO. 22), (F23, SEQ ID NO. 23), (F24, SEQ ID NO. 24), (F25, SEQ ID NO. 25), (F26, SEQ ID NO. 26), (F27, SEQ ID NO. 27),
-4CZ 302581 B6
CAGGGGAAGGCTACACGCTGCTTCAAAGTCACAGC
CATCTGGGATTCTTGGAAGGTGGGAAGCAGACAGG
CTTGGTGGGACTTTGTGACACCAGGAGGCAGAGC
CACACCCTGCTGAAGAGTCCCCTTTGCTCTCAAGG
GCCCTGCAGAAGCAGTGGTGAACATCCAAAGATGG
TTCAGCCCTGGACACTGCAAATTGTTCCCTTGAGC
AAAGCACGGATAATGCTGCCGGAAGTTGGTTCTGC
CAACCCACAGCATTCCAGGAGGCTTCAGTGTGAGC
CAGTTCTCGCATGAGATCCAGACTCAGGCATGTGG
TCACAGACAAGTCCCGACGCTGTTCTACCTTCAGC
CAGCATGCCAAGGGGACGACAACATTGACTCTGG
TGAGCGCCTATGGGGTGCCAGATACATGACAAAGG
CTGCrrCCTCCCAGCTCTTGAGTCCCTCATTTTCC
ACCACCACCTTCCAGAAACGCCTCATTTTCTTGG
CCCTTCCACCCAATGGCAAGGTTCAGGTTGGTAGC
AGCCAGCACTGCCAACCCTTTGCCTAGGGTGTTGG
TCCTGTCCCTTAGCCAGCACCTGGTGTAGGAATGC
AGGAGGAAATGAGACCCCGTGTGTGAGGGTTCAGG
ATCAGCTGAGGTGCCTTCTGTTGCCTGAGTGTTGC
CTCCCCACAGGTATAGCTCTATGTGGGCCCTTTGC
GAGAAAGGGGAGTCCACGTGGGAAGCTCAGATGC
TCTGGTTCAAGTCGCTGCTGGTTTGGGTTCAGAGC
GAGGTTAAATGACGTGCTGGTGGCCATGGTGTGG
AGACCCTGCTCGTCAGTGTGCTGTGTGACGTTAGC
CATGCCTTCTGTTCACCCGAGACCCACAGTCTGC
ATGTTGGCACGGAAATTCTAATCCČTCCCATCAGG
GCGCAGATGCTATAAATCACCTGTGACGGGCTTGG
TTGCACACAGGGTTATTGATGAGTTCGGGGAGTGC
GATCCCGGACCCCTAATTAGACCGTCCCATCTTCC
TGCTAGCCCCACAACAAGACCCAGCTATCTTTGC
GCATGCTCATCAACTCACATGGGTGCCCTTGACC
CCATGTGTGTCTGGGGTTTCTGCAAGGGGAATGC
GAACGTGGGTGTGTGTGTCCAATGCACAGTTGAGG (F28, SEQ ID NO. 28), (F29, SEQ ID NO. 29), (F30, SEQ ID NO. 30), (F31, SEQ ID NO. 31), (F32, SEQ ID NO. 32), (F33, SEQ ID NO. 33), (F34, SEQ ID NO. 34), (F35, SEQ ID NO. 35), (F36, SEQ ID NO. 36), (F37, SEQ ID NO. 37), (F38, SEQ ID NO. 38), (F39, SEQ ID NO. 39), (F40, SEQ ID NO. 40), (F41,SEQ ID NO. 41), (F42, SEQ ID NO. 42), (F43, SEQ ID NO. 43), (F44, SEQ ID NO. 44), (F45, SEQ ID NO. 45), (F46, SEQ ID NO. 46), (F47, SEQ ID NO. 47), (F48, SEQ ID NO. 48), (F49, SEQ ID NO. 49), (F50, SEQ ID NO, 50), (F5I,SEQ ID NO. 51), (F52, SEQ ID NO. 52), (F53,SEQ ID NO. 53), (F54, SEQ ID NO. 54), (F55, SEQ ID NO. 55), (F56, SEQ ID NO. 56), (F57, SEQ ID NO, 57), (F58, SEQ ID NO. 58), (F59, SEQ ID NO. 59), (F60, SEQ ID NO. 60),
-5CZ 302581 B6
AGGCCCTAGGGAGGAACATGAGGCTGGAAACAAGC
TGCTGAACCATTTCCGCCCATTTCCTGTTCAGTCC
CAGGTGTGGCGGTACTGAGCTTTGAAACGGACAGG
GTGGCCTCTGTAGAATGTGACCTCGTCCCTCATGG
GGCCAGAGGCTGATCTAACATTCCGAGGCCAACC
CTGCACAGAAATCCCCAGCTTAGAGCTGCACTTCG
ATTTCCGGGCATTTGCAGCACAGCATCTCAAGG
TGTCACCCCATCGTGCCCCTAGTTCAACTCACACC
GGGTCCCTACACCACCTTGTTCTTGCTCTGTGACC
CTAAAGAAGGCAGCAGCTGCTCAGGAAGGCAGCAGG
GAGGTGCAGCGGTCACTTCTGGTCTCACTTTGTCC
AGAGGGGACACTGTCGTCATCTCCTCCCATGTACC
AAGGCTGCATTCTATCGCACAGGTTCTCCGACTGC
AGCTTTGCCCGGGTTCCTGAATTCAGGAGACCTGG
ACATGAGGGTTGGCAGCACATCTCGACCTCTGTCC
CAAGTGGGAACTCCTTTCATGGAGACCAGGCTTGC
GGGGATGTTCTCTGCCAATTAGAGCCACGGGTTGG
GGGGACCTGGAGTAGGGGTTTTAGCCTCCTGAACC
CAATCAGGCCCAAGGCACTCATCACCAAATCTGC
TTGGAGCCGTGGGATAATGATCAGCTGCTTCTCG
TGTCTCCAGGATGGTGGAGTCCTTAGTCCCGTTCC
GGAGCTGAACTTGCGTGTCCTCCCAGCCTCTAACC
ACCGTGGTGGATGCTGGACTATGACCAGAGACAGG
AAACTCAGTCGTTCTGTGATGGGCCCCAGGAATGG
CAAAAGGCATCGTGTACAGAATGGGCGACAACAGG
CACGGCGTGTTCCCCTCAAGGATAGCTGACAAAGG
AATTCACCACTGCTTAGCCCAGAGAGGCGCAGAGG
TGCGATGAATAATGGTAGCCTCGTGGCATCTGTCC
TCGGAGCTCAACTCCAAAGCTCCTTGACCCCATCC
CAGCCCTCAGTCGTGGCTGTGAGCTCTAGAACAGG
GAATGCCAGCCGCATCCTCAAATACCCCTCATACC
ATTCCTGCATCCCTGCACTCGGTGGCCTTAATAGG
GAGCAATTTGACTGCCCCTCATTTGACACACAACG (F61,SEQ ID NO. 61), (F62, SEQ ID NO. 62), (F63, SEQ ID NO. 63), (F64, SEQ ID NO. 64), (FÓ5, SEQ ID NO. 65), (F66, SEQ ID NO. 66), (F67, SEQ ID NO. 67), (F68, SEQ ID NO. 68), (F69, SEQ ID NO. 69), (F70, SEQ ID NO. 70), (F71, SEQ ID NO. 71), (F72, SEQ ID NO. 72), (F73, SEQ ID NO. 73), (F74, SEQ ID NO. 74), (F75, SEQ ID NO. 75), (F76, SEQ ID NO. 76), (F77, SEQ ID NO. 77), (F78, SEQ ID NO, 78), (F79, SEQ ID NO. 79), (F80, SEQ ID NO. 80), (F81,SEQ ID NO. 81), (F82, SEQ ID NO. 82), (F83, SEQ ID NO. 83), (F84, SEQ ID NO. 84), (F85, SEQ ID NO. 85), (F86, SEQ ID NO. 86), (F87, SEQ ID NO. 87), (F88, SEQ ID NO. 88), (F89, SEQ ID NO. 89), (F90, SEQ ID NO. 90), (F91,SEQ ID NO. 91), (F92, SEQ ID NO. 92), (F93, SEQ ÍD NO. 93),
-6CZ 302581 B6
GGCTGAGTCTCGATCCCAAAGCTCTCTCCCAGACC (F94, SEQ ID NO. 94),
GCTTATCATGCATCAGCTTGCCATGGCTCCACAGG (F95, SEQ ID NO. 95).
S výhodou se jako J primery pro multiplexní PCR dalekého dosahu použijí oligonukleotidy mající alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
CCGCCCTCCTGCCGACCTCCTTTGCTGAGCACC (J1, SEQ ID NO. 96), CCTGCTTGCTACCTGTGGAGGGTCCCTGACGGG (J2. SEQ ID NO. 97), CCC AGTTCCCAAAGAAAGGCCTTCTGCTGAACG (J3, SEQ ID NO. 98), GCATCTGGAGCCCTTGCCCCTCGTCTGTGTGG (J4, SEQ ID NO. 99), CCTGAGAATGCTCCAGGTGAAGCGGAGAGAGG (J5, SEQ ID NO. 100), CCTCAGCCATCACTAAGACCCCTGGTTTGTTCAGG (J6, SEQ ID NO. 101).
Sekvence s 80% identitou k uvedeným sekvencím jsou zejména sekvence lišící se zkrácením nebo prodloužením sekvence až o 7 nukleotidů na 3' a/nebo 5' konci nebo záměnou až 4 nukleotidů nebo kombinací zkrácení/prodloužení se záměnou nukleotidů.
Předmětem předloženého vynálezu je také použiti oligonukleotidů vybraných ze skupiny zahrnulo jící sekvence mající alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny
GGAGAAGGTCCTCCAAGCCGATATCCCTGCAGACG (F1),
TCCATTGTTAAGCCCTTAAGTCGCCCGGGAAAACG (F2),
CAAAGATACTGGTGAGCCCTGCTGGCGGTGATGG (F3),
CCAGGCTGAGCCACAGCAGTAGCAAGGGACAAAGG (F4),
CCTTCAGCTGGTTCGCAGGTGTCTAACGATTTTCG (F5),
GGAAGCTCTAGGGTTTGCAACAGGGCCTGGGAAGG (F6),
CCGTGGTCACGCCACCACCACTTGCTAATATGACG (F7),
CTGGGATGAGGTGCACATGGAAAATGAGGCATTGG (F8),
CGTGCACCGTACCGGAGTTTGTGGATGACTCTAGC (F9),
ACCGTGGTCTTGC ACATGTAGGGACCTCATCAAGG (F10),
CAGGTACTCCATGCGCCTTTGGTTTGCAGGTGAGG (F11),
GGAGACAAG AGTGTTTGCCGCCTGTC ATGGTGAGC (F12),
ATTCCACTGGGTCCATAATCCTAGGCCAGCCATGC (F13),
-7CZ 302581 B6
CCCAGTGGAGTGGGTGCTGAGTGTGTGATACTTGG (F14),
AGAGGTCCAGAAGTTGGTGTGGCCATCATGTCAGG (F15),
CGC AACC AGCCTGGC ACTGATAAGAAGC AC AGAGG (F16).
GTAGAC AGGAGAGCCCGGAAGATGTGACCCACTGC (F17),
CAGCTGGAAACAGCTCAGTCTGGGACCACAACACC (F18),
AATAACGTGGGTGCTCGTCTCTCCCTGCCACAAGG (F19),
AGGGCTCTTTCTCCAGTGAAGGGTCCTCGCCTTGG (F20),
G AGGGGATTTCGAGGCTCTAGGGTCCAAGAAGTGG (F21),
CAGGAGCCACGCCGAAGTGTCAGATGTACCTCACC (F22),
GGGTGGCTCCATTCTTGGTTGTAGGCTGGTGAGG (F23),
ACGCAAGCCCGTGAGCTGTGTCTTCTTTGTCTGG (F24),
CAGCCCCTTTGCTCTCAATGCTCCCTAAGCAGTGG (F25),
GGTCACATTCACAGAACCCCAGGTCTCCAGAAAGC (F26),
GTGCCTGTGCCATGGGACTGATTAGGTATTGATGG (F27),
CAGGGGAAGGCTACACGCTGCTTCAAAGTCACAGC (F28),
CATCTGGGATTCTTGGAAGGTGGGAAGCAGACAGG (F29),
CTTGGTGGGACTTTGTGACACCAGGAGGCAGAGC (F30),
C ACACCCTGCTGAAGAGTCCCCTTTGCTCTC AAGG (F31),
GCCCTGCAGAAGCAGTGGTGAACATCCAAAGATGG (F32),
TTCAGCCCTGGACACTGCAAATTGTTCCCTTGAGC (F33),
AAAGCACGGATAATGCTGCCGGAAGTTGGTTCTGC (F34),
C AACCCAC AGCATTCCAGGAGGCTTC AGTGTGAGC (F3 5),
CAGTTCTCGCATGAGATCCAGACTCAGGCATGTGG (F36),
TCACAGACAAGTCCCGACGCTGTTCTACCTTCAGC (F37),
CAGCATGCCAAGGGGACGACAACATTGACTCTGG (F38),
TGAGCGCCTATGGGGTGCCAGATACATGACAAAGG (F39),
CTGCTTCCTCCCAGCTCTTGAGTCCCTCATTTTCC (F40),
ACCACCACCTTCCAGAAACGCCTCATTTTCTTGG (F41),
CCCTTCCACCCAATGGCAAGGTTCAGGTTGGTAGC (F42),
AGCCAGCACTGCCAACCCTTTGCCTAGGGTGTTGG (F43),
TCCTGTCCCTTAGCCAGCACCTGGTGTAGGAATGC (F44),
AGGAGGAAATGAGACCCCGTGTGTGAGGGTTCAGG (F45),
ATCAGCTGAGGTGCCTTCTGTTGCCTGAGTGTTGC (F46),
-8CZ 302581 B6
CTCCCCACAGGTATAGCTCTATGTGGGCCCTTTGC (F47), GAGAAAGGGGAGTCCACGTGGGAAGCTCAGATGC (F48), TCTGGTTCAAGTCGCTGCTGGTTTGGGTTCAGAGC (F49), GAGGTTAAATGACGTGCTGGTGGCCATGGTGTGG (F50), AGACCCTGCTCGTCAGTGTGCTGTGTGACGTTAGC (F51), CATGCCTTCTGTTCACCCGAGACCCACAGTCTGC (F52), ATGTTGCCACGGAAATTCTAATCCCTCCCATCAGG (F53), GCGCAGATGCTATAAATCACCTGTGACGGGCTTGG (F54), TTGCACACAGGGTTATTGATGAGTTCGGGGAGTGC (F55), GATCCCGGACCCCTAATTAGACCGTCCCATCTTCC (F56), TGCTAGCCCCACAACAAGACCCAGCTATCTTTGC (F57), GCATGCTCATCAACTCACATGGGTGCCCTTGACC (F58), CCATGTGTGTCTGGGGTTTCTGCAAGGGGAATGC (F59), GAACGTGGGTGTGTGTGTCCAATGCACAGTTGAGG (F60), AGGCCCTAGGGAGGAACATGAGGCTGGAAACAAGC (F61), TGCTGAACCATTTCCGCCCATTTCCTGTTCAGTCC (F62), CAGGTGTGGCGGTACTGAGCTTTGAAACGGACAGG (F63), GTGGCCTCTGTAGAATGTGACCTCGTCCCTCATGG (F64), GGCCAGAGGCTGATCTAACATTCCGAGCCCAACC (F65), CTGCACAGAAATCCCCAGCTTAGAGCTGCACTTCG (F66), ATTTCCGGGCATTTGCAGCACAGCATCTCAAGG (F67), TGTCACCCCATCGTGCCCCTAGTTCAACTCACACC (F68), GGGTCCCTACACCACCTTGTTCTTGCTCTGTGACC (F69), CTAAAGAAGGCAGCAGCTGCTCAGGAAGGCAGCAGG (F70), GAGGTGCAGCGGTCACTTCTGGTCTCACTTTGTCC (F71), AGAGGGGACACTGTCGTCATCTCCTCCCATGTACC (F72), AAGGCTGCATTCTATCGCACAGGTTCTCCGACTGC (F73), AGCTTTGCCCGGGTTCCTGAATTCAGGAGACCTGG (F74), ACATGAGGGTTGGCAGCACATCTCGACCTCTGTCC (F75), CAAGTGGGAACTCCTTTCATGGAGACCAGGCTTGC (F76), GGGGATGTTCTCTGCCAATTAGAGCCACGGGTTGG (F77), GGGGACCTGGAGTAGGGGTTTTAGCCTCCTGAACC (F78). CAATCAGGCCCAAGGCACTCATCACCAAATCTGC (F79),
-9 CZ 302581 B6
TTGGAGCCGTGGGATAATGATCAGCTGCTTCTCG (F80),
TGTCTCCAGGATGGTGGAGTCCTTAGTCCCGTTCC (F81),
GGAGCTGAACTTGCGTGTCCTCCCAGCCTCTAACC (F82),
ACCGTGGTGGATGCTGGACTATGACCAGAGACAGG (F83),
AAACTCAGTCGTTCTGTGATGGGCCCCAGGAATGG (F84),
CAAAAGGCATCGTGTACAGAATGGGCGACAACAGG (F85),
CACGGCGTGTTCCCCTCAAGGATAGCTGACAAAGG (F86),
AATTCACCACTGCTTAGCCCAGAGAGGCGCAGAGG (F87),
TGCGATGAATAATGGTAGCCTCGTGGCATCTGTCC (F88),
TCGGAGCTCAACTCCAAAGCTCCTTGACCCCATCC (F89),
CAGCCCTCAGTCGTGGCTGTGAGCTCTAGAACAGG (F90),
GAATGCCAGCCGCATCCTCAAATACCCCTCATACC (F91),
ATTCCTGCATCCCTGCACTCGGTGGCCTTAATAGG (F92),
GAGCAATTTGACTGCCCCTCATTTGACACACAACG (F93),
GGCTGAGTCTCGATCCCAAAGCTCTCTCCCAGACC (F94),
GCTTATCATGCATCAGCTTGCCATGGCTCCACAGG (F95),
CCGCCCTCCTGCCGACCTCCTTTGCTGAGCACC (JI),
CCTGCTTGCTACCTGTGGAGGGTCCCTGACGGG (J2),
CCCAGTTCCCAAAGAAAGGCCTTCTGCTGAACG (J3).
GCATCTGGAGCCCTTGCCCCTCGTCTGTGTGG (J4),
CCTGAGAATGCTCCAGGTGAAGCGGAGAGAGG (J5),
CCTCAGCCATCACTAAGACCCCTGGTTTGTTCAGG (J6) pro in vitro stanovení zlomového místa chromozomální translokace t(l 1 ;14)(ql3;q32).
Dalším předmětem předloženého vynálezu je sada pro detekci translokace t( 11; 14)(q 13;q32) metodou PCR dalekého dosahu (tong-range PCR), jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje prímery Fl až Fn, kde n je nejvýše 140, komplementární k úsekům oblasti chromozómu 11 v rozsahu -5000 až +420000 baží od počátku transkripce genu CCND1 směrem k centromeře, přičemž úseky této oblasti, k nimž jsou komplementární uvedené prímery Fl až Fn, jsou od sebe vzájemně vzdáleny alespoň 1,7 kb, s výhodou 1,7 až 7,6 kb, výhodněji 3,5 až 5,5 kb, a prímery F jsou io s výhodou číslovány postupně ve směru od počátku transkripce CCND1 k centromeře, a prímery JI až J6, kteréjsou komplementární k úsekům oblasti chromozómu 14, v níž leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinů, přičemž úsek, k němuž je komplementární přiměř JI, leží mezi geny IGHJ1 a IGHJ2, úsek, k němuž je komplementární primer J2, leží mezi geny IGHJ2 a IGHJ3, úsek, k němuž je komplementární primer J3, leží mezí geny IGHJ3 a IGHJ4, úsek, k němuž je komplementární primer J4, leží mezi geny IGHJ4 a IGHJ5, úsek, k němuž je komplementární primer J5, leží mezi geny IGHJ5 a IGHJ6 a úsek, k němuž je komplementární primer J6, leží mezi geny IGHC.
- 10CZ 302581 B6
Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje sada 95 primerů F, rozdělených do 12 nádobek tak, že vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je alespoň 15 kb, a 6 primerů J, každý z nich v samostatné nádobce.
s V jiném výhodném provedení vynálezu obsahuje sada 60 primerů F, rozdělených do 10 nádobek tak, že vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je alespoň 15 kb, a 6 primerů J, každý z nich v samostatné nádobce.
Předkládaný vynález tedy ve výhodném provedení zahrnuje soubor speciálně pro long-range io PCR navržených oligonukleotidových primerů. Soubor se skládá z 95 primerů (Fl až F95, F příměry) komplementárních k -400 kb dlouhému úseku chromozómu 11, který leží v blízkosti genu
CCNDI (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?org=Human&db=hgl8&position- =chrl 1%3A68665053- 69188423) a 6 primerů (Jl až J6, J primery) komplementárních s částí chromozómu 14 v oblasti kde leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinu (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?org=Human&db=hgl 8&position=chrl4%3A105400000-105402800). Primery Fl až F95 jsou navrženy tak, aby vzdálenost mezi dvěma sousedícími primery byla v rozmezí 1,7 až 7,6 kb (Obr. 2). Primery Fl až F95 mohou například být zkombinovány s primerem J6 do 12 multiplexních long-range reakcí (A až L) tak, aby v každé z reakcí v případě přítomnosti translokace docházelo k amplifikací pouze jed20 noho úseku DNA (Tab. 1). Amplifikace pouze jednoho DNA fragmentu je zajištěna dostatečnou vzdáleností mezi primery F použitými v jednotlivých reakcích. Vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je nejméně 15 tisíc bází, což při reakčních podmínkách long-range PCR zabraňuje účinné amplifikací velmi dlouhých fragmentů (Obr. 3). Primery Fl až F95 jsou navrženy a zkombinovány tak, aby v případě přítomnosti translokace došlo k amplifikací zlomo25 vého místa a okolních úseků DNA v jedné až třech ze dvanácti reakcí. F primery jsou rozděleny do reakcí tak, aby v případě přítomnosti translokace a současné amplifikace zlomového místa ve dvou a více reakcích umožňovaly ve většině případů identifikaci použitých primerů a tím přibližné určení polohy místa zlomu na chromozómu 11 (Tab. 1). Primery Jl až J6 jsou navrženy tak, aby umožnily přesnější lokalizaci místa zlomu na chromozómu 14 (Obr. 3). Primery Jl až J6 zároveň slouží jako primery pro sekvenování místa zlomu. Primery Jl až J6 jsou využívány v druhé sadě multiplex reakcí, kdy jsou jednotlivě zkombinovány s primery Fl až F95 na základě výsledku první sady multiplex PCR reakcí (Obr. 4).
Tabulka 1
Reakce F primery
A Fl, F8, F28, F37, F55, F74, F81, F91
B F3, F10, F16, F52, F61, F72, F83, F90, F95
C F12, F21, F30, F50, F59, F68, F78, F89
D F20, F35, F45, F51, F57, F70, F75, F82, F87
E F2, Fl 8, F27, F39, F47, F66, F92
F F5, F14, F32, F41, F53, F63, F69, F86
G F6, F22, F34, F44, F49, F56, F84
H F11.F26, F33, F60, FÓ7, F77
1 F9, F23, F29, F48, F58, FÓ5, F71 i
J F15, F24, F36, F42, F54, F64, F80, F88, F93
K. Fl, F7, FIS, F19, F31, F38, F43, F62, F76
L F4, F25, F40, F46, F73, F79, F85, F94
- 11 CZ 302581 B6
Primery Fl až F95, jejichž sekvence jsou zde uvedeny, dovolují pokrýt rovnoměrné oblast chromozómu 11 v rozsahu -5000 až +420000 baží od počátku transkripce genu CCND1 směrem k centromeře. Vzhledem k tomu, že ke zlomu na chromozómu 11 velmi často dochází výrazně blíže, je možno použít jen část těchto příměrů s nižšími pořadovými čísly, např. jen Fl až F60.
Přehled obrázků
Obr. 1 znázorňuje schematické znázornění translokace t(l I;l4)(ql3;q32). Následkem zlomů v původních chromozómech 11 a 14 a následné fúze dochází ke vzniku dvou fúzních chromozomů, z nichž jeden nese gen CCND1 translokovaný do blízkosti IGH lokusu, ve kterém leží velmi silný zesilovač transkripce.
Obr. 2 ukazuje příkladné schéma rozmístění primerů pro detekci translokace t(l 1; 14)(ql3;q32) metodou multiplexní long-range PCR. a) Rozmístění primerů na chromozómu 11, Primery pokrývají oblast ~400kb centrometricky od pozice genu CCND1. b) Rozmístění primerů na chromozómu 14. Jednotlivé primery jsou lokalizovány centrometricky od IGHJ segmentů, c) Příklad, kdy ke zlomu dojde v segmentu IGHJ5 na chromozómu 14 a v úseku DNA mezi primery F5 a F6 na chromozómu 11.
Obr. 3 ukazuje schéma průběhu reakcí pro příklad, kdy ke zlomu dojde v segmentu IGHJ5 na chromozómu 14 a v úseku DNA mezi primery F5 a F6 na chromozómu 11. a) V první sadě reakcí dochází díky parametrům reakce k amplifikaci tří úseků DNA vymezených primery J6 až F3, J6 až F4 a J6 až F5. Díky rozmístění F primerů do jednotlivých reakcí jsou tyto produkty amplifikovány každý v jiné reakci, b) Na základě výsledků první sady reakcí je DNA ve druhé sadě reakcí amplifikována s primery JI až J6 a F primery, které poskytují nej kratší produkt (v tomto příkladu směs primerů obsahující primer F5). Ve druhé sadě dávají pozitivní reakci (tj. amplifikovaný úsek DNA) pouze reakce s primery J6 a J5. Primer J5, který dává kratší amplifíkační produkt, je pak použít pro sekvencování místa zlomu.
Obr. 4 ukazuje schéma vyšetření vzorku na translokaci t(l I;14)(ql3;q32) metodou multiplex long-range - příklad. A) Vzorek DNA je nejdříve vyšetřen sadou dvanácti multiplex long-range PCR reakcí, ve kterých jsou primery Fl až F95 v kombinaci sprinterem J6. Amplifikaění produkty jsou detekovány metodou agarosové elektroforézy, v příkladu je vyznačena přítomnost amplifikačního produktu v reakcích C a I, kratší produkt byl získán v reakci C. B) Vzorek je vyšetřen druhou sadou 6 reakcí, ve kterých jsou zkombinovány F primery použité v reakci C sjednotlivými primery JI až J6. Amplifikaění produkty jsou detekovány metodou agarosové elektroforézy, v příkladu je vyznačena přítomnost amplifikačního produktu v reakcích IV, V a VI, nej kratší produkt byl detekován v reakci IV. C) Amplifikaění produkt z reakce IV je poté sekvencován s použitím primeru J4 jako sekvenačního primeru.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Byla provedena analýza 16 vzorků DNA získaných z bíopiátů mízních uzlin pacientů s lymfomem plášťové zóny. Tyto vzorky byly negativní při vyšetření na přítomnost translokace t(l I;14)(ql3;q32) při použití dosavadní PCR metody určené pro amplifikaci zlomových míst lokalizovaných v MTC. Každý vzorek byl nejdříve otestován sadou 12 multiplex long-range PCR reakcí A až L (viz Tabulka 1). K detekci amplifikačních produktů byla použita agarózová elektroforéza. V případě pozitivity byl vzorek otestován sadou 6 multiplex long-range PCR reakcí (I až VI), kombinujících F primery použité v pozitivní reakci dávající nej kratší amplifikaění
- 12CZ 302581 B6 produkt s jednotlivými primery JI až J6. Pro sekvencování byl pak použít produkt a příslušný primer JI až J6 z reakcí I až VI dávajících nejkratší amplifikační produkt (Obr. 3 a 4).
Složení reakčních směsí je uvedeno v tabulkách 2a a 2b.
Tabulka 2a
Komponenta Koncentrace Množství (μΙ) Dodavatel
h2o 16,2
LA PCR buffer II (Mg2+plus) 10x 4 TaKaRa
dNTP směs 2,5mM 6.4 TaKaRa
LATaqHS polymeráza 5U/pl 0,4 TaKaRa
J primer 2μΜ 4
Směs F primerů 2μΜ každý 4
DNA 5
io Tabulka 2b
Komponenta Koncentrace Množství (μΙ) Dodavatel
h2o 19,5
Phusion HF buffer 5x 8 Finnzymes
dNTP směs 10mM 0,8 Fínnzymes
Phusion polymeráza 2U/pl 0,7 Finnzymes
J primer 2 μΜ 4
Směs F primerů 2μΜ každý 2
DNA 5
Při tomto reakčním profilu:
1: 95 °C/30 s
2: 98 °C/30 s
3: 72 °C/7 min 4: jdi na krok 2, 32x 5:72 °C 10 min
Z 16 testovaných vzorků byl amplifikační produkt získán v 11 případech (69%). U těchto 11 pozitivních vzorků byla místa zlomu amplifikována ve třech různých reakcích A - L ve 2 případech, ve dvou různých reakcích v 5 případech a pouze vjedné z reakcí ve 4 případech. Druhá sada reakcí pak identifikovala u těchto 11 pozitivních vzorků použití těchto J segmentů genu těžkého imunoglobulinového řetězce: IGHJ6 (pozitivní pouze reakce VI s J6 primerem)
- 3 vzorky, IGHJ5 (pozitivní reakce V a VI) - 1 vzorek, 1GHJ4 (pozitivní reakce IV, V a VI)
- 6 vzorků, IGHJ3 (pozitivní reakce III, IV, V a VI) - 1 vzorek. J segmenty těžkého imunoglobulinového řetězce IGHJ1 a 1GHJ2 nebyly využity u žádného z pozitivních vzorků (viz Tabulka 3).
- 13 CZ 302581 B6
Tabulka 3
Číslo vzorku Pozitivní reakce z reakcí A až L Primer F nejbližší zlomovému místu Pozitivní reakce z reakcí I až VI Primer J nejbiižší zlomovému místu
1 E F2 III - VI J3
2 E F2 V, VI J5
3 Β,ϊ F10 VI J6
4 C, D, K F21 VI Jó
5 H F26 IV-VI J4
6 H,L F26 IV-VI J4
7 D,G,J F34 rv-vi J4
8 E, K F39 rv-vi J4
9 K, G F43 VI J6
10 F,J F15 IV-VI J4
ί π 1_ H F26 IV-VI J4
Příklad 2
Vzorky DNA izolované z kostní dřeně pacientů s lymfomem z buněk plášťové zóny byly vyšetřeny na přítomnost translokace t(l 1; 14Xq 13;q32) metodou multiplexní long-range PCR popsanou v příkladu 1 s tou změnou, že jako F primery byly použity pouze oligonukleotidy Fl až F60 rozdělené dle stejných pravidel do 10 multiplexních long-range PCR reakcí A až J (Tab. 4). ío Pro amplifikaci byly použity obdobné reakční podmínky jako v příkladu 1 (Tab. 2b). Celkem bylo vyšetřeno 20 vzorků, z toho pozitivní výsledek byl získán v 5 případech (25 %) (viz Tabulka 5). Celkově nižší míra záchytu je dána především nižším počtem nádorových buněk ve vzorcích kostní dřeně, především u vzorků odebraných po započetí terapie.
Tabulka 4
Reakce F primery
A F10, F21, F30, F38, F45, F53
B F1, F9, F26, F33, F48, F57
C I F2, F8, F15, F23, F35, F43
D F6, F18, F34, F39, F44, F50, F60
E F12, F17, F24, F42, F51, F56
F ^F3, F11, F29, F36, F49
G F22, F27, F32, F40, F47, F52
, H 1 F4, F14, F20, F4f, F54( F59
1 F5, F13, F19, F28. F46, F55
J F7, F16, F25, F31, F37, F58
- 14CZ 302581 B6
Tabulka 5
Číslo vzorku Pozitivní reakce z reakcí A až J Primer F nejbližší zlomovému místu Pozitivní reakce z reakcí I až VI Primer J nejbližší zlomovému místu
1 F, H F4 IV-VI J4
2 J,G F32 V, VI J5
3 C,F F36 V, VI J5
4 C,F,J F36 IV-VI J4
5 H,J F59 IV-VI J4
Příklad 3
Sekvence amplifikačních produktů získaných v příkladech 1 a 2 s příslušným sekvenačním příměrem JI až J6 vedla ve všech 11 provedených případech k získání sekvence a přesné charakterizaci a lokalizaci místa zlomu jak na chromozómu 11 tak i na chromozómu 14. Tyto sekvence io pak byly použity k návrhu specifických qPCR (kvantitativní PCR) detekčních sad, umožňujících detekci minimální zbytkové nemoci (MRD, Mínimal Residual Disease). Tyto detekční sady sestávají z 6 oligonukleotidových primerů RQJ1 až RQJ6 odvozených ze sekvence chromozómu v jednotlivých IGHJ segmentech a duálně značené oligonukleotidové sondy (TaqMan® technologie) komplementárních k několika úsekům DNA v oblasti IGHJ segmentů na chromozómu
14 (Real-time polymerase chain reaction estimation of bone marrow tumor burden using ctonal immunoglobulin heavy chain gene and bcl-l/JH rearrangements in mantle cell lymphoma. Andersen NS, Donovan JW, Zuckerman A, Pedersen L, Geisler C, Grtbben JG. Exp Hematol. 2002 Jul;30(7):703-1). Vhodný primer RQJ je vybrán na základě IGHJ segmentu, identifikovaného sekvenací místa zlomu. Jako druhý primer (RQF) jsou použity individuálně navržené pacient-specifické oligonukleotidy komplementární k sekvenci místa zlomu translokace t( 11; 14)(q 13;q32) identifikované v příkladech 1 a 2.
Bylo testováno 5 detekčních sad pro real- time kvantitativní PCR. Bylo navrženo 5 pacient-specifických primerů RQF1 až 5, které byly zkombinovány s vhodnými priméry RQJ1 až 6 (Tabul25 ka 6).
Tabulka 6
Vzorek Primer RQJ Primer RQF Sekvence primerů RQF
1 RQJ4 RQF1 GTGCCACACTGCCAGTATACG
2 RQJ4 RQF2 CATTCGGTCCTCGGTGTTCC
3 RQJ3 RQF3 CCTGGACCACGTAAGGGC
4 RQJ6 RQF4 GAGCGCAGAGAATACGGTATGG
5 RQJ4 RQF5 i GGAATCTAGTACAGGGTCG
Priméry RQF byly navrženy tak, aby jejich teplota tání (Tm) odpovídala primerům RQJ. Tyto sady pak byly otestovány na pozitivních a negativních vzorcích. Jako pozitivní vzorek byla vždy použita DNA z příkladů 1 a 2, ve které byla translokace t(l I;l4)(ql3;32) identifikována, jako
- 15 CZ 302581 B6 negativní kontrola byl použit směsný vzorek DNA dobrovolníků negativních na t(l 1 ;14)(ql3;32). Složení reakční směsi je uvedeno v tabulce 7, amplifikace probíhala při tomto reakčním profilu:
1:95 °C/15min 5 2: 95 °C/20 s
3:60°C/1 min 4: jdi na krok 2, 49x ío Tabulka 7
Komponenta Koncentrace Množství (μΐ) Dodavatel.
H2O 5,3
Primer RQJ 10μΜ 1
Primer RQF 10μΜ 1
TaqMan probe 25μΜ 0,2
AB gene universal mastermix 2χ 12,5 AB Gene
DNA 50 ng/pL 5
Ve všech případech byla získána specifická amplifikační křivka v pozitivních vzorcích a žádná nebo pouze minimální v negativním vzorku.
Průmyslová využitelnost
Stanovení zlomového místa translokace t(l l;14)(ql3;32) je důležité zejména proto, že umožňuje navrhnout specifické qPCR (kvantitativní PCR) detekční sady, umožňující detekci minimální zbytkové nemoci (MRD, Minimal Residual Disease). Tyto detekční sady sestávají z 6 olígonukleotídových prímerů odvozených ze sekvence chromozómu 14 v jednotlivých IGHJ segmentech a duálně značených oligonukleotidových sond (TaqMan® technologie) komplementárních k několika úsekům DNA v oblasti IGHJ segmentů na chromozómu 14 (Real-time polymerase chain reaction estimation of bone marrow tumor burden using clonal immunoglobulin heavy chain gene and bcl-l/JH rearrangements in mantle cell lymphoma. Andersen NS, Donovan JW, Zuckerman A, Pedersen L, Geisler C, Gribben JG. Exp Hematol. 2002 Jul;30(7):703-l). Vhodný primer je vybrán na základě IGHJ segmentu, identifikovaného sekvenací místa zlomu. Jako druhý primer se použijí individuálně navržené pacient-specifické oligonukleotidy komplementární k sekvenci místa zlomu translokace t(l 1; 14)(q 13;32) identifikovaného způsobem podle před30 kládaného vynálezu.

Claims (9)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob detekce zlomového místa translokace t(l l;14)(ql3;32) metodou multiplexní PCR dalekého dosahu v DNA získané ze vzorků biologického materiálu, vyznačený tím, že
    a) se připraví primery Fl až Fn, kde n je nejvýše 140, komplementární k úsekům ležícím v oblasti chromozómu 11 v rozsahu -5000 až +420000 baží od počátku transkripce genu CCNDI směrem k centromeře, přičemž úseky ležící v této oblasti, k nimž jsou komplementární uvedené primery Fl až Fn, jsou od sebe vzájemně vzdáleny alespoň 1,7 kb, s výhodou 1,7 až 7,6 kb, výhodněji 3,5 až 5,5 kb, a primery F jsou s výhodou číslovány postupně ve směru od počátku transkripce CCNDI k centromeře,
    b) se připraví primery JI až J6, které jsou komplementární k úsekům oblasti chromozómu 14, v níž leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinu, přičemž úsek, k němuž je komplementární primer JI, leží mezi geny IGHJ1 a IGHJ2, úsek, k němuž je komplementární primer J2, leží mezi geny IGHJ2 a IGHJ3, úsek, k němuž je komplementární primer J3, leží mezi geny IGHJ3 a IGHJ4, úsek, k němuž je komplementární primer J4, leží mezi geny IGHJ4 a IGHJ5, úsek, k němuž je komplementární primer J5, leží mezi geny IGHJ5 a IGHJ6 a úsek, k němuž je komplementární primer J6, leží mezi geny IGHJ6 a IGHC,
    c) primery Fl až Fn se zkombinují s primerem J6 do reakcí multiplexní PCR dalekého dosahu, tak, že vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je alespoň 15 kb,
    d) provedou se reakce multiplexní PCR dalekého dosahu s DNA získanou z biologického vzorku získaného z těla pacienta,
    e) určí se primer F nejblíže zlomovému místu, který poskytl pozitivní reakci, ve výhodném provedení tedy primer s nejvyšším číslem, který poskytl pozitivní reakci,
    f) primer F, kterýje nejblíže zlomovému místu, se zkombinuje do nové sady reakcí multiplexní PCR dalekého dosahu s primery JI až J6, a to tak, aby v každé reakci byl primer F, který je nejblíže zlomovému místu, a jeden z primerů JI až J6,
    g) provedou se reakce PCR dalekého dosahu s DNA získanou z biologického vzorku získaného z těla pacienta,
    h) určí se primer J s nejnižším číslem, který poskytl pozitivní reakci, a který je tedy nejblíže zlomovému místu,
    i) stanoví se sekvence úseku mezi primerem F, který je nejblíže zlomovému místu, a primerem J, který je nejblíže zlomovému místu, s výhodou se sekvence tohoto úseku stanoví metodami PCR a sekvencování.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že biologickým vzorkem je vzorek periferní krve, vzorek kostní dřeně nebo vzorek tkáně.
  3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, ženje menší nebo rovno 95 a v kroku c) jsou primery zkombinovány do nejvýše 12 reakcí multiplexní PCR dalekého dosahu.
    - 17 CZ 302581 B6
  4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se jako F primery pro multiplexní PCR dalekého dosahu použijí oligonukleotidy mající alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
    GGAGAAGGTCCTCCAAGCCGATATCCCTGCAGACG (Fl),
    TCCATTGTTAAGCCCTTAAGTCGCCCGGGAAAACG (F2),
    CAAAGATACTGGTGAGCCCTGCTGGCGGTGATGG (F3),
    CCAGGCTGAGCCACAGCAGTAGCAAGGGACAAAGG (F4),
    CCTTCAGCTGGTTCGCAGGTGTCTAACGATTTTCG (F5),
    GGAAGCTCTAGGGTTTGCAACAGGGCCTGGGAAGG (F6),
    CCGTGGTCACGCCACCACCACTTGCTAATATGACG (F7),
    CTGGGATGAGGTGCACATGGAAAATGAGGCATTGG (F8),
    CGTGCACCGTACCGGAGTTTGTGGATGACTCTAGC (F9),
    ACCGTGGTCTTGCACATGTAGGGACCTCATCAAGG (F10),
    C AGGTACTCCATGCGCCTTTGGTTTGCAGGTGAGG (F11),
    GGAGACAAGAGTGTTTGCCGCCTGTC ATGGTGAGC (F12),
    ATTCCACTGGGTCCATAATCCTAGGCCAGCCATGC (F13),
    CCCAGTGGAGTGGGTGCTGAGTGTGTGATACTTGG (F14),
    AGAGGTCCAGAAGTTGGTGTGGCCATCATGTCAGG (F15),
    CGCAACCAGCCTGGCACTGATAAGAAGCACAGAGG (F167,
    GTAGACAGGAGAGCCCGGAAGATGTGACCCACTGC (F17),
    CAGCTGGAAACAGCTCAGTCTGGGACCACAACACC (Fl8),
    AATAACGTGGGTGCTCGTCTCTCCCTGCCACAAGG (Fl 9),
    AGGGCTCTTTCTCCAGTGAAGGGTCCTCGCCTTGG (F20),
    - 18 CZ 302581 B6
    GAGGGGATTTCGAGGCTCTAGGGTCCAAGAAGTGG (F21), CAGGAGCCACGCCGAAGTGTCAGATGTACCTCACC (F22), GGGTGGCTCCATTCTTGGTTGTAGGCTGGTGAGG (F23), ACGCAAGCCCGTGAGCTGTGTCTTCTTTGTCTGG (F24), CAGCCCCTTTGCTCTCAATGCTCCCTAAGCAGTGG (F25), GGTCACATTCACAGAACCCCAGGTCTCCAGAAAGC (F26), GTGCCTGTGCCATGGGACTGATTAGGTATTGATGG (F27), CAGGGGAAGGCTACACGCTGCTTCAAAGTCACAGC (F28), CATCTGGGATTCTTGGAAGGTGGGAAGCAGACAGG (F29), CTTGGTGGGACTTTGTGACACCAGGAGGCAGAGC (F30), CACACCCTGCTGAAGAGTCCCCTTTGCTCTCAAGG (F31), GCCCTGCAGAAGCAGTGGTGAACATCCAAAGATGG (F32), TTCAGCCCTGGACACTGCAAATTGTTCCCTTGAGC (F33), AAAGCACGGATAATGCTGCCGGAAGTTGGTTCTGC (F34), CAACCCACAGCATTCCAGGAGGCTTCAGTGTGAGC (F35), CAGTTCTCGCATGAGATCCAGACTCAGGCATGTGG (F36), TCACAGACAAGTCCCGACGCTGTTCTACCTTCAGC (F37), CAGCATGCCAAGGGGACGACAACATTGACTCTGG (F38), TGAGCGCCTATGGGGTGCCAGATACATGACAAAGG (F39), CTGCTTCCTCCCAGCTCTTGAGTCCCTCATTTTCC (F40), ACCACCACCTTCCAGAAACGCCTCATTTTCTTGG (F41), CCCTTCCACCCAATGGCAAGGTTCAGGTTGGTAGC (F42), AGCCAGCACTGCCAACCCTTTGCCTAGGGTGTTGG (F43), TCCTGTCCCTTAGCCAGCACCTGGTGTAGGAATGC (F44), AGGAGGAAATGAGACCCCGTGTGTGAGGGTTCAGG (F45), ATCAGCTGAGGTGCCTTCTGTTGCCTGAGTGTTGC (F46), CTCCCCACAGGTATAGCTCTATGTGGGCCCTTTGC (F47), GAGAAAGGGGAGTCCACGTGGGAAGCTCAGATGC (F48), TCTGGTTCAAGTCGCTGCTGGTTTGGGTTCAGAGC (F49), GAGGTTAAATGACGTGCTGGTGGCCATGGTGTGG (F50), AG ACCCTGCTCGTC AGTGTGCTGTGTGACGTTAGC (F51), CATGCCTTCTGTTCACCCGAGACCCACAGTCTGC (F52), ATGTTGCCACGGAAATTCTAATCCCTCCCATCAGG (F53),
    -19CZ 302581 B6
    GCGCAGATGCTATAAATCACCTGTGACGGGCTTGG (F54),
    TTGCACACAGGGTTATTGATGAGTTCGGGGAGTGC (F55),
    GATCCCGGACCCCTAATTAGACCGTCCCATCTTCC (F56),
    TGCTAGCCCCACAACAAGACCCAGCTATCTTTGC (F57),
    GCATGCTCATCAACTCACATGGGTGCCCTTGACC (F58),
    CCATGTGTGTCTGGGGTTTCTGCAAGGGGAATGC (F59),
    GAACGTGGGTGTGTGTGTCCAATGCACAGTTGAGG (F60),
    AGGCCCTAGGGAGGAACATGAGGCTGGAAACAAGC (F61),
    TGCTGAACCATTTCCGCCCATTTCCTGTTCAGTCC (F62),
    CAGGTGTGGCGGTACTGAGCTTTGAAACGGACAGG (F63),
    GTGGCCTCTGTAGAATGTGACCTCGTCCCTCATGG (F64),
    GGCCAGAGGCTGATCTAACATTCCGAGGCCAACC (F65),
    CTGCACAGAAATCCCCAGCTTAGAGCTGCACTTCG (F66),
    ATTTCCGGGCATTTGCAGCACAGCATCTCAAGG (F67),
    TGTCACCCCATCGTGCCCCTAGTTCAACTCACACC (F68),
    GGGTCCCTACACCACCTTGTTCTTGCTCTGTGACC (F69),
    CTAAAGAAGGCAGCAGCTGCTCAGGAAGGCAGCAGG (F70),
    G AGGTGC AGCGGTC ACTTCTGGTCTC ACTTTGTCC (F71),
    AGAGGGGACACTGTCGTCATCTCCTCCCATGTACC (F72),
    AAGGCTGCATTCTATCGCACAGGTTCTCCGACTGC (F73),
    AGCTTTGCCCGGGTTCCTGAATTCAGGAGACCTGG (F74),
    ACATGAGGGTTGGCAGCACATCTCGACCTCTGTCC (F75),
    CAAGTGGGAACTCCTTTCATGGAGACCAGGCTTGC (F76),
    GGGGATGTTCTCTGCCAATTAGAGCCACGGGTTGG (F77),
    GGGGACCTGGAGTAGGGGTTTTAGCCTCCTGAACC (F78),
    CAATCAGGCCCAAGGCACTCATCACCAAATCTGC (F79),
    TTGGAGCCGTGGGATAATGATCAGCTGCTTCTCG (F80),
    TGTCTCCAGGATGGTGGAGTCCTTAGTCCCGTTCC (F81),
    GGAGCTGAACTTGCGTGTCCTCCCAGCCTCTAACC (F82),
    ACC GTGGTGGATGCTGGACTATGACCAGAGACAGG (F83),
    AAACTCAGTCGTTCTGTGATGGGCCCCAGGAATGG (F84),
    CAAAAGGCATCGTGTACAGAATGGGCGACAACAGG (F85),
    CACGGCGTGTTCCCCTCAAGGATAGCTGACAAAGG (F86),
    -20CZ 302581 B6
    AATTCACCACTGCTTAGCCCAGAGAGGCGCAGAGG (F87),
    TGCGATGAATAATGGTAGCCTCGTGGCATCTGTCC (F88),
    TCGGAGCTCAACTCCAAAGCTCCTTGACCCCATCC (F89),
    CAGCCCTCAGTCGTGGCTGTGAGCTCTAGAACAGG (F90),
    GAATGCCAGCCGCATCCTCAAATACCCCTCATACC (F91),
    ATTCCTGCATCCCTGCACTCGGTGGCCTTAATAGG (F92),
    GAGCAATTTGACTGCCCCTCATTTGACACACAACG (F93),
    GGCTGAGTCTCGATCCCAAAGCTCTCTCCCAGACC (F94).
    GCTTATCATGCATCAGCTTGCCATGGCTCCACAGG (F95).
  5. 5. Způsob podle nároku I, vyznačený tím, že se jako J primery pro multiplexní PCR dalekého dosahu použijí oligonukleotidy mající alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
    CCGCCCTCCTGCCGACCTCCTTTGCTGAGC ACC (JI),
    CCTGCTTGCTACCTGTGGAGGGTCCCTGACGGG (J2),
    CCCAGTTCCCAAAGAAAGGCCTTCTGCTGAACG (J3),
    GCATCTGGAGCCCTTGCCCCTCGTCTGTGTGG (J4),
    CCTGAGAATGCTCCAGGTGAAGCGGAGAGAGG <J5),
    CCTCAGCCATCACTAAGACCCCTGGTTTGTTCAGG (J6).
  6. 6. Použití oligonukleotidů vybraných ze skupiny zahrnující sekvence mající alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující
    GGAGAAGGTCCTCCAAGCCGATATCCCTGCAG ACG (F1),
    TCCATTGTTAAGCCCTTAAGTCGCCCGGGAAAACG (F2),
    CAAAGATACTGGTGAGCCCTGCTGGCGGTGATGG (F3),
    CCAGGCTGAGCCACAGCAGTAGCAAGGGACAAAGG (F4),
    CCTTCAGCTGGTTCGCAGGTGTCTAACGATTTTCG (F5),
    GGAAGCTCTAGGGTTTGCAACAGGGCCTGGGAAGG (F6),
    CCGTGGTCACGCCACCACCACTTGCTAATATGACG (F7),
    CTGGGATGAGGTGCACATGGAAAATGAGGCATTGG (F8),
    CGTGCACCGTACCGGAGTTTGTGGATGACTCTAGC (F9),
    ACCGTGGTCTTGCACATGTAGGGACCTCATCAAGG (F10),
    CAGGTACTCCATGCGCCTTTGGTTTGCAGGTGAGG (Fl 1),
    -21 CZ 302581 B6
    GGAGACAAGAGTGTTTGCCGCCTGTCATGGTGAGC (F12), ATTCCACTGGGTCCATAATCCTAGGCCAGCCATGC (F13), CCCAGTGGAGTGGGTGCTGAGTGTGTGATACTTGG (F14), AGAGGTCCAGAAGTTGGTGTGGCCATC ATGTCAGG (F15), CGCAACCAGCCTGGC ACTGATAAGAAGC ACAGAGG (F16), GTAGACAGGAGAGCCCGGAAGATGTGACCCACTGC (F17), CAGCTGGAAACAGCTCAGTCTGGGACCACAACACC (F18), AATAACGTGGGTGCTCGTCTCTCCCTGCCACAAGG (F19), AGGGCTCTTTCTCCAGTGAAGGGTCCTCGCCTTGG (F20), GAGGGGATTTCGAGGCTCTAGGGTCCAAGAAGTGG (F21), CAGGAGCCACGCCGAAGTGTCAGATGTACCTCACC (F22), GGGTGGCTCCATTCTTGGTTGTAGGCTGGTGAGG (F23), ACGCAAGCCCGTGAOCTGTGTCTTCTTTGTCTGG (F24), CAGCCCCTTTGCTCTCAATGCTCCCTAAGCAGTGG (F25), GGTCACATTCACAGAACCCCAGGTCTCCAGAAAGC (F26), GTGCCTGTGCCATGGGACTGATTAGGTATTGATGG (F27), CAGGGGAAGGCTACACGCTGCTTCAAAGTCACAGC (F28), CATCTGGGATTCTTGGAAGGTGGGAAGCAGACAGG (F29), CTTGGTGGGACTTTGTGACACCAGGAGGCAGAGC (F30), CACACCCTGCTGAAGAGTCCCCTTTGCTCTCAAGG (F31), GCCCTGCAGAAGCAGTGGTGAACATCCAAAGATGG (F32), TTCAGCCCTGGACACTGCAAATTGTTCCCTTGAGC (F33), AAAGCACGGATAATGCTGCCGGAAGTTGGTTCTGC (F34), CAACCCACAGCATTCCAGGAGGCTTCAGTGTGAGC (F35), CAGTTCTCGCATGAGATCCAGACTCAGGCATGTGG (F36), TCACAGACAAGTCCCGACGCTGTTCTACCTTCAGC (F37), CAGCATGCCAAGGOGACGACAACATTGACTCTGG (F38), TGAGCGCCTATGGGGTGCCAGATACATGACAAAGG (F3 9), CTGCTTCCTCCCAGCTCTTGAGTCCCTCATTTTCC (F40), ACCACCACCTTCCAGAAACGCCTCATTTTCTTGG (F41), CCCTTCCACCCAATGGCAAGGTTCAGGTTGGTAGC (F42), AGCCAGCACTGCCAACCCTTTGCCTAGGGTGTTGG (F43), TCCTGTCCCTTAGCCAGCACCTGGTGTAGGAATGC (F44),
    -22CZ 302581 B6
    AGGAGGAAATGAGACCCCGTGTGTGAGGGTTCAGG (F45),
    ATCAGCTGAGGTGCCTTCTGTTGCCTGAGTGTTGC (F46),
    CTCCCCACAGGTATAGCTCTATGTGGGCCCTTTGC (F47),
    GAGAAAGGGGAGTCCACGTGGGAAGCTCAGATGC (F48),
    TCTGGTTCAAGTCGCTGCTGGTTTGGGTTCAGAGC (F49),
    GAGGTTAAATGACGTGCTGGTGGCCATGGTGTGG (F50),
    AGACCCTGCTCGTC AGTGTGCTGTGTGACGTTAGC (F51),
    CATGCCTTCTGTTCACCCGAGACCCACAGTCTGC (F52),
    ATGTTGCCACGGAAATTCTAATCCCTCCCATCAGG (F53),
    GCGCAGATGCTATAAATCACCTGTGACGGGCTTGG (F54),
    TTGCACACAGGGTTATTGATGAGTTCGGGGAGTGC (F55),
    GATCCCGGACCCCTAATTAGACCGTCCCATCTTCC (F56),
    TGCTAGCCCCACAACAAGACCCAGCTATCTTTGC (F57),
    GC ATGCTCATCAACTCAC ATGGGTGCCCTTGACC (F5 8),
    CCATGTGTGTCTGGGGTTTCTGCAAGGGGAATGC (F59),
    GAACGTGGGTGTGTGTGTCCAATGCACAGTTGAGG (F60),
    AGGCCCTAGGGAGGAACATGAGGCTGG AAACAAGC (F61),
    TGCTGAACCATTTCCGCCCATTTCCTGTTCAGTCC (F62),
    CAGGTGTGGCGGTACTGAGCTTTGAAACGGACAGG (F63),
    GTGGCCTCTGTAGAATGTGACCTCGTCCCTCATGG (F64),
    GGCCAGAGGCTGATCTAACATTCCGAGGCCAACC (F65),
    CTGCACAGAAATCCCCAGCTTAGAGCTGCACTTCG (F66),
    ATTTCCGGGCATTTGCAGCACAGCATCTCAAGG (F67),
    TGTCACCCCATCGTGCCCCTAGTTCAACTCACACC (F68),
    GGGTCCCTACACCACCTTGTTCTTGCTCTGTGACC (F69),
    CTAAAGAAGGCAGCAGCTGCTCAGGAAGGCAGCAGG (F70),
    G AGGTGCAGCGGTC ACTTCTGGTCTCACTTTGTCC (F71).
    AGAGGGGACACTGTCGTCATCTCCTCCCATGTACC (F72),
    AAGGCTGCATTCTATCGCACAGGTTCTCCGACTGC (F73),
    AGCTTTGCCCGGGTTCCTGAATTCAGGAGACCTGG (F74),
    ACATGAGGGTTGGCAGCACATCTCGACCTCTGTCC (F75),
    CAAGTGGGAACTCCTTTCATGGAGACCAGGCTTGC (F76),
    GGGGATGTTCTCTGCCAATTAGAGCCACGGGTTGG (F77),
    -23CZ 302581 B6
    GGGGACCTGGAGTAGGGGTTTTAGCCTCCTGAACC
    CAATCAGGCCCAAGGCACTCATCACCAAATCTGC
    TTGGAGCCGTGGGATAATGATCAGCTGCTTCTCG (F78), (F79), (F80).
    TGTCTCCAGGATGGTGGAGTCCTTAGTCCCGTTCC (F81),
    GGAGCTGAACTTGCGTGTCCTCCCAGCCTCTAACC (F82),
    ACCGTGGTGGATGCTGGACTATGACCAGAGACAGG (F83),
    AAACTCAGTCGTTCTGTGATGGGCCCCAGGAATGG (F84),
    CAAAAGGCATCGTGTACAGAATGGGCGACAACAGG (F85),
    CACGGCGTGTTCCCCTCAAGGATAGCTGACAAAGG (F86),
    AATTCACCACTGCTTAGCCCAGAGAGGCGCAGAGG (F87),
    TGCGATGAATAATGGTAGCCTCGTGGCATCTGTCC (F88),
    TCGGAGCTCAACTCCAAAGCTCCTTGACCCCATCC (F89),
    CAGCCCTCAGTCGTGGCTGTGAGCTCTAGAACAGG (F90),
    GAATGCCAGCCGCATCCTCAAATACCCCTCATACC (F91),
    ATTCCTGCATCCCTGCACTCGGTGGCCTTAATAGG (F92),
    GAGCAATTTGACTGCCCCTCATTTGACACACAACG (F93),
    GGCTGAGTCTCGATCCCAAAGCTCTCTCCCAGACC (F94),
    GCTTATCATGCATCAGCTTGCCATGGCTCCACAGG (F95),
    CCGCCCTCCTGCCGACCTCCTTTGCTGAGCACC (JI),
    CCTGCTTGCTACCTGTGGAGGGTCCCTGACGGG (J2),
    CCCAGTTCCCAAAGAAAGGCCTTCTGCTGAACG (J3),
    GCATCTGGAGCCCTTGCCCCTCGTCTGTGTGG (J4),
    CCTGAGAATGCTCCAGGTGAAGCGGAGAGAGG (J5),
    CCTCAGCCATCACTAAGACCCCTGGTTTGTTCAGG (J6) pro in vitro stanovení zlomového místa chromozomální translokace t( 11; 14)(q 13;q32).
  7. 7. Sada pro detekci translokace t( 11 ;14)(ql3;q32) metodou multíplexní PCR dalekého dosahu, 5 vyznačená tím, že obsahuje příměry Fl až Fn, kde n je nejvýše 140, komplementární k úsekům ležícím v oblasti chromozómu 11 v rozsahu -5000 až +420000 baží od počátku transkripce genu CCND1 směrem kcentromeře, přičemž úseky této oblasti, k nimž jsou komplementární uvedené primery Fl až Fn, jsou od sebe vzájemně vzdáleny alespoň 1,7 kb, s výhodou 1,7 až 7,6 kb, výhodněji 3,5 až 5,5 kb, a primery F jsou s výhodou číslovány postupně ve směru od ío počátku transkripce CCND1 k centromere, a primery JI až J6, které jsou komplementární k úsekům oblasti chromozómu 14, v níž leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinu, přičemž úsek, k němuž je komplementární primer JI, leží mezi geny IGHJ 1 a IGHJ2, úsek, k němuž je komplementární primer J2, leží mezi geny IGHJ2 a IGHJ3, úsek, k němuž je komplementární primer J3, leží mezi geny 1GHJ3 a IGHJ4, úsek, k němuž je komplementární primer J4, leží mezi
    15 geny IGHJ4 a IGHJ5, úsek, k němuž je komplementární primer J5, leží mezi geny 1GHJ5 a IGHJ6 a úsek, k němuž je komplementární primer J6, leží mezi geny IGHJ6 a IGHC.
    -24CZ 302581 B6
  8. 8. Sada podle nároku 7, vyznačená tím, že obsahuje 95 primerů F, rozdělených do 12 nádobek tak, že vzdálenost mezi nejbližšími primeiy F ve stejné reakci je alespoň 15 kb, a 6 primerů J, každý z nich v samostatné nádobce.
  9. 9. Sada podle nároku 7, vyznačená tím, že obsahuje 60 primerů F, rozdělených do 10 nádobek tak, že vzdálenost mezi nejbližšími priméry F ve stejné reakci je alespoň 15 kb, a 6 primerů J, každý z nich v samostatné nádobce.
    18 stránek sekvencí
CZ20100441A 2010-06-04 2010-06-04 Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu CZ2010441A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20100441A CZ2010441A3 (cs) 2010-06-04 2010-06-04 Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20100441A CZ2010441A3 (cs) 2010-06-04 2010-06-04 Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ302581B6 true CZ302581B6 (cs) 2011-07-20
CZ2010441A3 CZ2010441A3 (cs) 2011-07-20

Family

ID=44278548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20100441A CZ2010441A3 (cs) 2010-06-04 2010-06-04 Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ2010441A3 (cs)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992019775A1 (en) * 1991-04-29 1992-11-12 Raggio-Italgene Spa Assay and kit for the detection of chromosomal abnormalities
WO2006117596A2 (en) * 2004-05-04 2006-11-09 Dako Denmark A/S Nucleic acid probes and nucleic acid analog probes
WO2010059499A1 (en) * 2008-11-18 2010-05-27 Quest Diagnostics Investments Incorporated METHODS FOR DETECTING IgH/BCL-1 CHROMOSOMAL TRANSLOCATION

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992019775A1 (en) * 1991-04-29 1992-11-12 Raggio-Italgene Spa Assay and kit for the detection of chromosomal abnormalities
WO2006117596A2 (en) * 2004-05-04 2006-11-09 Dako Denmark A/S Nucleic acid probes and nucleic acid analog probes
WO2010059499A1 (en) * 2008-11-18 2010-05-27 Quest Diagnostics Investments Incorporated METHODS FOR DETECTING IgH/BCL-1 CHROMOSOMAL TRANSLOCATION

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Detection of translocation t(11,14)(q13,q32) in mantle cell lymphoma by fluorescence in situ hybridization, Am. J. Pathol., Vol. 154(5), 1449-1452, 1999 *
Rimokh R. et al.: " Detection of the Chromosomal translocation t(11,14) by polymerase chain reaction in mantle cell lymphomas", Blood, vol. 83, 1871-1875, 1994 *
Vieira L. et al.: "Combined molecular diagnosis of B-cell lymphomas with t(11,14)(q13,q32) or t(14,18)(q32,q21) using multiplex- and long distance inverse-polymerase chain reaction", Diagn. Mol. Pathol., 17(2), 73-81, 2008 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2010441A3 (cs) 2011-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kangaspeska et al. Reanalysis of RNA-sequencing data reveals several additional fusion genes with multiple isoforms
Fröhling et al. Comparison of cytogenetic and molecular cytogenetic detection of chromosome abnormalities in 240 consecutive adult patients with acute myeloid leukemia
Rochette et al. SW480, a p53 double-mutant cell line retains proficiency for some p53 functions
Lange et al. Detection by enzymatic amplification of bcr-abl mRNA in peripheral blood and bone marrow cells of patients with chronic myelogenous leukemia
Burmeister et al. Evidence-based RT-PCR methods for the detection of the 8 most common MLL aberrations in acute leukemias
Thiel et al. Comprehensive array CGH of normal karyotype myelodysplastic syndromes reveals hidden recurrent and individual genomic copy number alterations with prognostic relevance
Chang et al. Functional genomics identify a regulatory risk variation rs4420550 in the 16p11. 2 schizophrenia-associated locus
Basso et al. Improved long-distance polymerase chain reaction for the detection of t (8; 14)(q24; q32) in Burkitt's lymphomas
Honda et al. Loss-of-function mutations in BCOR contribute to chemotherapy resistance in acute myeloid leukemia
Matthews et al. The Crohn’s disease associated SNP rs6651252 impacts MYC gene expression in human colonic epithelial cells
Williams et al. Assessment of sequence-based p53 gene analysis in human breast cancer: messenger RNA in comparison with genomic DNA targets
Demin et al. Adversary of DNA integrity: A long non‐coding RNA stimulates driver oncogenic chromosomal rearrangement in human thyroid cells
Wild et al. Clonal transcriptomics identifies mechanisms of chemoresistance and empowers rational design of combination therapies
Zerkalenkova et al. Acute myeloid leukemia with t (10; 11)(p11‐12; q23. 3): Results of Russian Pediatric AML registration study
Witte et al. Primary refractory plasmablastic lymphoma: a precision oncology approach
CZ302581B6 (cs) Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu
Hu et al. The relationship of REL proto-oncogene to pathobiology and chemoresistance in follicular and transformed follicular lymphoma
Meyer et al. LDI-PCR: identification of known and unknown gene fusions of the human MLL gene
Balcárková et al. Gain of chromosome arm 1q in patieznts in relapse and progression of multiple myeloma
Cecener et al. Investigation of MMAC/PTEN gene mutations and protein expression in low grade gliomas
RU2225612C2 (ru) Способ прогнозирования течения множественной миеломы
Villarreal et al. Nucleophosmin 1 cooperates with the methyltransferase DOT1L to regulate H3K79me2 levels and DNA satellites expression at peri-nucleolar heterochromatin
Lübbert et al. Detection of allele‐specific expression of N‐RAS oncogenes in human leukaemia cells
Dziulko Retroviral Dysregulation of an Immune Chromatin Regulator
Thorsen et al. Myelodysplastic syndrome with at (2; 11)(p21; q23-24) and translocation breakpoint close to miR-125b-1

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20170604