CZ2010441A3 - Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu - Google Patents
Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2010441A3 CZ2010441A3 CZ20100441A CZ2010441A CZ2010441A3 CZ 2010441 A3 CZ2010441 A3 CZ 2010441A3 CZ 20100441 A CZ20100441 A CZ 20100441A CZ 2010441 A CZ2010441 A CZ 2010441A CZ 2010441 A3 CZ2010441 A3 CZ 2010441A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- primers
- region
- primer
- complementary
- genes
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) spocívá v tom, že se v DNA získané ze vzorku biologického materiálu detekuje prítomnost translokace t(11;14)(q13;q32) metodou multiplexní PCR dalekého dosahu (multiplex long-range PCR) s pomocí sad primeru pokrývajících oblasti na chromozómech 11 a 14, v nichž obvykle dochází ke zlomu. Zpusob umožnuje detekci ve vetšine vzorku, ve kterých je translokace prítomna a umožnuje rychlou charakterizaci místa zlomu pro návrh specifických detekcních sad ke sledování minimální zbytkové nemoci.
Description
Způsob detekce chromozomální translokace t( 11; 14)(ql3;q32) a oligonukleotidy pro použití při tomto způsobu
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu detekce chromozomální translokace t(ll;14)(ql3;q32) a charakterizace místa zlomu metodou multiplexní long-range PCR z biologických vzorků odebraných z těla pacientů, zejména ze vzorků tkáně lymfatícké uzliny, kostní dřeně a krve. Dále se týká nových oligonukleotidů, vhodných pro použití při tomto způsobu.
Dosavadní stav techniky
Nádorová onemocnění jsou často provázena cytogenetickými aberacemi jako jsou delece nebo amplifíkace chromozomů nebo jejich úseků nebo chromozomální translokace, při kterých dochází k výměně genetického materiálu mezi nehomologními chromozómy. Jednou z těchto aberací je i chromozomální translokace t(l 1; 14)(ql3;q32), která je nejčastěji detekována u vzorků lymfomu plášťových buněk (Mantle Cell Lymphoma, MCL). Důsledkem této translokace je přemístění genu CCND1 ležícího na chromozómu 1 lql3 do blízkosti zesilovače transkripce genu pro těžký řetězec imunoglobulinu (IGH), který leží na chromozómu 14q32 (Obr.l). Gen CCNDI (dříve označovaný i jako BCL1 nebo PRAD1) kóduje informaci pro tvorbu proteinu cyklin Dl. Cyklin Dl je protoonkogen, který sehrává významnou roli v regulaci buněčného cyklu, kde spolu s ostatními proteiny řídí přechod mezi jednotlivými fázemi cyklu. Gen IGH kóduje informaci pro syntézu těžkého řetězce imunoglobulinu, který je spolu s lehkým řetězem součástí sekretovaných i na membránu vázaných protilátek vytvářených B-lymfocyty a plazmatickými buňkami. Následkem této translokace dochází k nadměrné expresi cyklinu Dl a následné poruše regulace buněčného cyklu.
Translokace t(lI;14)(ql3;q32) bývá detekována u téměř všech vzorků MCL, méně často pak u jiných B-lymfoproliferací. Bylo popsáno několik způsobů detekce t( 11;14)(ql3;q32). Nejspolehlivějším je vyšetření interfázických chromozómů pomocí fluorescenční in-situ hybridizace (FISH) (Detection of t(l 1; 14) using interphase molecular cytogenetics in mantle cell lymphoma and atypical chronic lymphocytic leukemia. Avet-Loiseau H, Garand R, . 2 '
Gaillard F, Daviet A, Mellerin MP, Robillard N, Bouyge I, Arcot S, Batzer M, Talmant P, Harousseau JL, Milpied N, Bataille R. Genes Chromosomes Cancer. 1998 Oct;23(2): 175-82) s použitím dvou různě značených hybridizačních sond (jedna pro chromozóm 11 a druhá pro chromozóm 14). Z cyto genetických metod je použitelná i karyotypizace nebo M-FISH (multicolor FISH) (Detection of diagnostically critical, oťten hidden, anomalies in complex karyotypes of haematological disorders usíng multicolour fluorescence in šitu hybridization. Jalal SM, Law ME, Stamberg J, Fonseca R, Seely JR, Myers WH, Hanson CA. Br J Haematol. 2001 Mař; 112(4):975-80). Mezi metody molekulární biologie pro detekci t( 11;14)(ql3;q32) patří Southemův přenos (Bcl-1 gene rearrangements in B cell lymphoma. Ince C, Blick M, Lee M, Pathak S, Vadhan-Raj S, Selvanayagam P, Gutterman JU, Cabanillas
F. Leukemia. 1988 Jun;2(6):343-6), PCR (Detection of the chromosomal translocation t( 11; 14) by polymerase chain reaction in mantle cell lymphomas. Rimokh R, Berger F, Delsol
G, Digonnet I, Rouault JP, Tigaud JD, Gadoux M, Coiffier B, Bryon PA, Magaud JP. Blood. 1994 Apr 1,83(7):1871-5) a inverzní long-range PCR (Rapid molecular cloning of rearrangements of the IGHJ locus using long-distance inverse polymerase chain reaction. Willis TG, Jadayel DM, Coignet LJ, Abdul-Rauf M, Treleaven JG, Catovsky D, Dyer MJ. Blood. 1997 Sep 15 ;90(6) :2456-64.). Metoda Southemova přenosu spočívá v hybridizaci radioaktivně nebo fluorescenčně značených sond s elektroforeticky rozdělenou a na membránu přenesenou vysokomolekulámí genomovou DNA. Touto metodou lze translokaci pouze detekovat. PCR dokáže translokaci nejen detekovat, ale po sekvenaci i charakterizovat. Metoda je vysoce citlivá (dokáže detekovat přibližně 1 buňku s translokaci mezi 100.000 zdravých buněk), dokáže však zachytit pouze ty translokace, kde zlomové místo na chromozómu II leží v oblasti tzv. MTC (Major Translocation Cluster). Translokace se zlomovým místem v MTC vsak představují pouze 30-?40 % ze všech t( 11; 14)(q 13 ;q32) detekovaných u MCL. Inverzní long-range PCR je navržena tak, aby dokázala zachytit a charakterizovat prakticky všechny translokace bez ohledu na pozici místa zlomu. Tato metoda je však poměrně složitá, zahrnuje několik různých kroků jako je restrikční štěpení, cirkularizace produktů restrikčního štěpení, Southemův přenos, long-range PCR a klonování amplifikačních produktů do bakterií.
Předkládaný vynález umožňuje častější PCR detekci translokace t( 1I;14)(ql3;q32) bez nutnosti využití náročných metod jako je Southemův přenos. Předkládaný vynález zjednodušuje určení sekvence místa zlomu translokace t(l I;14)(ql3;q32).
Cílem předkládaného vynálezu je doplnit a případně nahradit stávající způsob PCR detekce . 3 ‘ translokace t(l 1; 14)(ql3;q32) novou metodou multiplexní long-range PCR.
Podstata vynálezu
Vynález se týká nového způsobu PCR detekce zlomového místa translokace t(l I; 14)(q 13;q32), která zvyšuje četnost záchytu až na 80 % při zachování technické nenáročnosti. Předmětem vynálezu je metoda multiplexní long-range PCR se speciálně navrženým souborem oligonukleotidových primerů určená pro detekci zlomového místa translokace t( 11; 14)(q 13 ;q32) v DNA získané z biologického vzorku získaného z těla pacienta, a použití metody multiplexní long-range PCR pro detekci zlomového místa translokace t(ll;14)(ql3;q32) v DNA získané z biologického vzorku získaného z těla pacienta. Pod pojmem long-range PCR se rozumí metoda polymerázové řetězové reakce (PCR), která využívá speciální enzym schopný účinně amplifikovat dlouhé úseky molekuly DNA (delší než 5 tisíc párů baží, tj. 5 kb). Pojmem multiplexní je označováno použití více než dvou primerů v jedné reakci. Podstata metody spočívá v PCR amplifikaci úseku genomové DNA, který zahrnuje zlomové místo, tj. souvislý úsek molekuly DNA skládající se ze sekvence pocházející z chromozómu 11 i sekvence pocházející z chromozómu 14.
Předmětem vynálezu je způsob detekce zlomového místa translokace t(lI;14)(ql3;q32) metodou multiplexní PCR dalekého dosahu (multiplexní long-range PCR) v DNA získané ze vzorků biologického materiálu, jehož podstata spočívá v tom, že
a) se připraví primery F1 až Fn, kde n je nejvýše 140, komplementární k úsekům ležícím v oblasti chromozómu 11 v rozsahu -5000 až +420000 baží od počátku transkripce genu CCND1 směrem k centromeře, přičemž úseky ležící v této oblasti, k nimž jsou komplementární uvedené primery F1 až Fn, jsou od sebe vzájemně vzdáleny alespoň
1,7 kb, s výhodou 1,7 až 7,6 kb, výhodněji 3,5 až 5,5 kb, a primery F jsou s výhodou číslovány postupně ve směru od počátku transkripce CCND1 k centromeře,
b) se připraví primery JI až J6, které jsou komplementární k úsekům oblasti chromozómu 14, v níž leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinu, přičemž úsek, k němuž je komplementární primer JI, leží mezi geny 1GHJ1 a IGHJ2, úsek, k němuž je komplementární primer J2, leží mezi geny IGHJ2 a 1GHJ3, úsek, k němuž je komplementární primer J3, leží mezi geny IGHJ3 a IGHJ4, úsek, k němuž je komplementární primer J4, leží mezi geny IGI1J4 a IGHJ5, úsek, k němuž je • 4 komplementární primer J5, leží mezi geny IGHJ5 a 1GHJ6 a úsek, k němuž je komplementární primer J6, leží mezi geny IGHJ6 a IGHC,
c) primery FI až Fn se zkombinují s primerem J6 do reakcí multiplexní PCR dalekého dosahu, tak, že vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je alespoň 15 kb,
d) provedou se reakce multiplexní PCR dalekého dosahu s DNA získanou z biologického vzorku získaného z těla pacienta,
e) určí se primer F nejblíže zlomovému místu, který poskytl pozitivní reakci, ve výhodném provedení tedy primer s nejvyšším číslem, který poskytl pozitivní reakci,
f) primer F, který je nejblíže zlomovému místu, se zkombinuje do nové sady reakcí multiplexní PCR dalekého dosahu s primery JI až J6, a to tak, aby v každé reakci byl primer F, který je nejblíže zlomovému místu, a jeden z primerů JI až J6,
g) provedou se reakce PCR dalekého dosahu s DNA získanou z biologického vzorku získaného z těla pacienta,
h) určí se primer J s nejnižším číslem, který poskytl pozitivní reakci, a který je tedy nejblíže zlomovému místu,
i) stanoví se sekvence úseku mezi primerem F, který je nejblíže zlomovému místu, a primerem J, který je nejblíže zlomovému místu, s výhodou se sekvence tohoto úseku stanoví metodami PCR a sekvencování.
Biologickým vzorkem může být s výhodou vzorek periferní krve, vzorek kostní dřeně nebo vzorek tkáně, zejména může být vzorkem tkáně vzorek lymfatické uzliny.
Primery FI až Fn (primery F) tedy mají být navrženy tak, aby pokrývaly oblast, v níž dochází ke zlomu na chromozómu 11. Obvykle ke zlomu dochází blíže ke genu CCND1 než 420 kb, proto primery F nemusí pokrývat celou tuto oblast, mohou pokrývat jen část této oblasti blíže ke genu CCND1. Rozdělení primerů F do reakcí pro multiplexní PCR má být takové, aby se v žádné reakci neamplifikoval víc než jeden řetězec, toho lze dosáhnout tak, že minimální vzdálenost mezi primery v jedné reakci je 15 kb.
Ve výhodném provedení vynálezu je n menší nebo rovno 95 a v kroku c) jsou primery zkombinovány do nejvýše 12 reakcí multiplexní PCR dalekého dosahu.
'
Primery JI až J6 (příměry J) mají být navrženy tak, aby pokrývaly oblast chromozómu 14, v níž leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinu.
S výhodou se jako F primery pro multiplexní PCR dalekého dosahu použijí olígonukleotidy mající alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
| GGAGAAGGTCCTCCAAGCCGATATCCCTGCAGACG | (Fl, SEQ ID NO. 1), |
| TCCATTGTTAAGCCCTTAAGTCGCCCGGGAAAACG | (F2, SEQ ID NO. 2), |
| CAAAGATACTGGTGAGCCCTGCTGGCGGTGATGG | (F3, SEQ ID NO. 3), |
| CCAGGCTGAGCCACAGCAGTAGCAAGGGACAAAGG | (F4, SEQ ID NO. 4), |
| CCTTCAGCTGGTTCGCAGGTGTCTAACGATTTTCG | (F5, SEQ ID NO. 5), |
| GGAAGCTCTAGGGTTTGCAACAGGGCCTGGGAAGG | (F6, SEQ ID NO. 6), |
| CCGTGGTCACGCCACCACCACTTGCTAATATGACG | (F7, SEQ ID NO. 7), |
| CTGGGATGAGGTGCACATGGAAAATGAGGCATTGG | (F8, SEQ ID NO. 8), |
| CGTGCACCGTACCGGAGTTTGTGGATGACTCTAGC | (F9, SEQ ID NO. 9), |
| ACCGTGGTCTTGCACATGTAGGGACCTCATCAAGG | (F10, SEQ ID NO. 10), |
| CAGGTACTCCATGCGCCTTTGGTTTGCAGGTGAGG | (F1I, SEQ ID NO. 11), |
| GGAGACAAGAGTGTTTGCCGCCTGTCATGGTGAGC | (F12, SEQ ID NO. 12), |
| ATTCCACTGGGTCCATAATCCTAGGCCAGCCATGC | (F13,SEQ ID NO. 13), |
| CCCAGTGGAGTGGGTGCTGAGTGTGTGATACTTGG | (F14, SEQ ID NO. 14), |
| AGAGGTCCAGAAGTTGGTGTGGCCATCATGTCAGG | (F15, SEQ ID NO. 15), |
| CGCAACCAGCCTGGCACTGATAAGAAGCACAGAGG | (F16, SEQ ID NO. 16), |
| GTAGACAGGAGAGCCCGGAAGATGTGACCCACTGC | (F17, SEQ ID NO. 17), |
| CAGCTGGAAACAGCTCAGTCTGGGACCACAACACC | (F18, SEQ ID NO. 18), |
| AATAACGTGGGTGCTCGTCTCTCCCTGCCACAAGG | (F19, SEQ ID NO. 19), |
| AGGGCTCTTTCTCCAGTGAAGGGTCCTCGCCTTGG | (F20, SEQ ID NO. 20), |
| GAGGGGATTTCGAGGCTCTAGGGTCCAAGAAGTGG | (F21,SEQ ID NO. 21), |
| CAGGAGCCACGCCGAAGTGTCAGATGTACCTCACC | (F22, SEQ ID NO. 22), |
| GGGTGGCTCCATTC TTGGTTGTAGGCTGGTGAGG | (F23, SEQ ID NO. 23), |
| ACGCAAGCCCGTGAGCTGTGTCTTCTTTGTCTGG | (F24, SEQ ID NO. 24), |
| CAGCCCCTTTGCTCTCAATGCTCCCTAAGCAGTGG | (F25, SEQ ID NO. 25), |
| GGTCACATTCACAGAACCCCAGGTCTCCAGAAAGC | (F26, SEQ ID NO. 26), |
| GTGCCTGTGCCATGGGACTGATTAGGTATTGATGG | (F27, SEQ ID NO. 27), |
CAGGGGAAGGCTACACGCTGCTTCAAAGTCACAGC
CATCTGGGATTCTTGGAAGGTGGGAAGCAGACAGG
CTTGGTGGGACTTTGTGACACCAGGAGGCAGAGC
CACACCCTGCTGAAGAGTCCCCTTTGCTCTCAAGG
GCCCTGCAGAAGCAGTGGTGAACATCCAAAGATGG
TTCAGCCCTGGACACTGCAAATTGTTCCCTTGAGC (F28, SEQ ID NO. 28), (F29, SEQ ID NO. 29), (F30, SEQ ID NO. 30), (F31, SEQ ID NO. 31), (F32, SEQ ID NO. 32).
(F33, SEQ ID NO. 33),
AAAGCACGGATAATGCTGCCGGAAGTTGGTTCTGC (F34, SEQ ID NO. 34),
| CAACCCACAGCATTCCAGGAGGCTTCAGTGTGAGC | (F35, SEQ ID NO. 35), |
| CAGTTCTCGCATGAGATCCAGACTCAGGCATGTGG | (F36, SEQ ID NO. 36), |
| TCACAGACAAGTCCCGACGCTGTTCTACCTTCAGC | (F37, SEQ ID NO. 37), |
| CAGCATGCCAAGGGGACGACAACATTGACTCTGG | (F38, SEQ ID NO. 38), |
| TGAGCGCCTATGGGGTGCCAGATACATGACAAAGG | (F39, SEQ ID NO. 39), |
| CTGCTTCCTCCCAGCTCTTGAGTCCCTCATTTTCC | (F40, SEQ ID NO. 40), |
| ACCACCACCTTCCAGAAACGCCTCATTTTCTTGG | (F41,SEQ ID NO. 41), |
| CCCTTCCACCCAATGGCAAGGTTCAGGTTGGTAGC | (F42, SEQ ID NO. 42), |
| AGCCAGCACTGCCAACCCTTTGCCTAGGGTGTTGG | (F43, SEQ ID NO. 43), |
| TCCTGTCCCTTAGCCAGCACCTGGTGTAGGAATGC | (F44, SEQ ID NO. 44), |
| AGGAGGAAATGAGACCCCGTGTGTGAGGGTTCAGG | (F45, SEQ ID NO. 45), |
| ATCAGCTGAGGTGCCTTCTGTTGCCTGAGTGTTGC | (F46, SEQ ID NO. 46), |
| CTCCCCACAGGTATAGCTCTATGTGGGCCCTTTGC | (F47, SEQ ID NO. 47), |
| GAGAAAGGGGAGTCCACGTGGGAAGCTCAGATGC | (F48, SEQ ID NO. 48), |
| TCTGGTTCAAGTCGCTGCTGGTTTGGGTTCAGAGC | (F49, SEQ ID NO. 49), |
| GAGGTTAAATGACGTGCTGGTGGCCATGGTGTGG | (F50, SEQ ID NO. 50), |
| AGACCCTGCTCGTCAGTGTGCTGTGTGACGTTAGC | (F51.SEQ ID NO. 51), |
| CATGCCTTCTGTTCACCCGAGACCCACAGTCTGC | (F52, SEQ ID NO. 52), |
| ATGTTGCCACGGAAATTCTAATCCCTCCCATCAGG | (F53, SEQ ID NO. 53), |
| GCGCAGATGCTATAAATCACCTGTGACGGGCTTGG | (F54, SEQ ID NO. 54), |
| TTGCACACAGGGTTATTGATGAGTTCGGGGAGTGC | (F55, SEQ ID NO. 55), |
| GATCCCGGACCCCTAATTAGACCGTCCCATCTTCC | (F56, SEQ ID NO. 56), |
| TGCTAGCCCCACAACAAGACCCAGCTATCTTTGC | (F57, SEQ ID NO. 57), |
| GCATGCTCATCAACTCACATGGGTGCCCTTGACC | (F58, SEQ ID NO. 58), |
| CCATGTGTGTCTGGGGTTTCTGCAAGGGGAATGC | (F59, SEQ ID NO. 59), |
| GAACGTGGGTGTGTGTGTCCAATGCACAGTTGAGG | (F60, SEQ ID NO. 60), |
•7
AGGCCCTAGGGAGGAACATGAGGCTGGAAACAAGC
TGCTGAACCATTTCCGCCCATTTCCTGTTCAGTCC CAGGTGTGGCGGTACTGAGCTTTGAAACGGACAGG GTGGCCTCTGTAGAATGTGACCTCGTCCCTCATGG GGCCAGAGGCTGATCTAACATTCCGAGGCCAACC CTGCACAGAAATCCCCAGCTTAGAGCTGCACTTCG ATTTCCGGGCATTTGCAGCACAGCATCTCAAGG TGTCACCCCATCGTGCCCCTAGTTCAACTCACACC GGGTCCCTACACCACCTTGTTCTTGCTCTGTGACC CTAAAGAAGGCAGCAGCTGCTCAGGAAGGCAGCAGG GAGGTGCAGCGGTCACTTCTGGTCTCACTTTGTCC AGAGGGGACACTGTCGTCATCTCCTCCCATGTACC AAGGCTGCATTCTATCGCACAGGTTCTCCGACTGC AGCTTTGCCCGGGTTCCTGAATTCAGGAGACCTGG ACATGAGGGTTGGCAGCACATCTCGACCTCTGTCC CAAGTGGGAACTCCTTTCATGGAGACCAGGCTTGC GGGGATGTTCTCTGCCAATTAGAGCCACGGGTTGG GGGGACCTGGAGTAGGGGTTTTAGCCTCCTGAACC CAATCAGGCCCAAGGCACTCATCACCAAATCTGC TTGGAGCCGTGGGATAATGATCAGCTGCTTCTCG TGTCTCCAGGATGGTGGAGTCCTTAGTCCCGTTCC GGAGCTGAACTTGCGTGTCCTCCCAGCCTCTAACC ACCGTGGTGGATGCTGGACTATGACCAGAGACAGG AAACTCAGTCGTTCTGTGATGGGCCCCAGGAATGG CAAAAGGCATCGTGTACAGAATGGGCGACAACAGG CACGGCGTGTTCCCCTCAAGGATAGCTGACAAAGG AATTCACCACTGCTTAGCCCAGAGAGGCGCAGAGG TGCGATGAATAATGGTAGCCTCGTGGCATCTGTCC TCGGAGCTCAACTCCAAAGCTCCTTGACCCCATCC CAGCCCTCAGTCGTGGCTGTGAGCTCTAGAACAGG GAATGCCAGCCGCATCCTCAAATACCCCTCATACC ATTCCTGCATCCCTGCACTCGGTGGCCTTAATAGG GAGCAATTTGACTGCCCCTCATTTGACACACAACG (F61,SEQ ID NO. 61), (F62, SEQ ID NO. 62), (F63, SEQ ID NO. 63), (F64, SEQ ID NO. 64), (F65, SEQ ID NO. 65), (F66, SEQ ID NO. 66), (F67, SEQ ID NO. 67), (F68, SEQ ID NO. 68), (F69, SEQ ID NO. 69), (F70, SEQ ID NO. 70), (F71,SEQ ID NO. 71), (F72, SEQ ID NO. 72), (F73, SEQ ID NO. 73), (F74, SEQ ID NO. 74), (F75, SEQ ID NO. 75), (F76, SEQ ID NO. 76), (F77, SEQ ID NO. 77), (F78, SEQ ID NO. 78), (F79, SEQ ID NO. 79), (F80, SEQ ID NO. 80), (F81, SEQ ID NO. 81), (F82, SEQ ID NO. 82), (F83, SEQ ID NO. 83), (F84, SEQ ID NO. 84), (F85, SEQ ID NO. 85), (F86, SEQ ID NO. 86), (F87, SEQ ID NO. 87), (F88, SEQ ID NO. 88), (F89, SEQ ID NO. 89), (F90, SEQ ID NO. 90), (F91, SEQ ID NO. 91), (F92, SEQ ID NO. 92), (F93, SEQ ID NO. 93),
(F94, SEQ ID NO. 94),
- 8 '
GGCTGAGTCTCGATCCCAAAGCTCTCTCCCAGACC
GCTTATCATGCATCAGCTTGCCATGGCTCCACAGG (F95, SEQ ID NO. 95).
S výhodou se jako J primery pro multiplexní PCR dalekého dosahu použijí oligonuklcotidy mající alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
| CCGCCCTCCTGCCGACCTCCTTTGCTGAGCACC | (JI, SEQ ID NO. 96), |
| CCTGCTTGCTACCTGTGGAGGGTCCCTGACGGG | (J2, SEQ ID NO. 97), |
| CCCAGTTCCCAAAGAAAGGCCTTCTGCTGAACG | (J3, SEQ ID NO. 98), |
| GCATCTGGAGCCCTTGCCCCTCGTCTGTGTGG | (J4, SEQ ID NO. 99), |
| CCTGAGAATGCTCCAGGTGAAGCGGAGAGAGG | (J5, SEQ ID NO. 100), |
CCTCAGCCATCACTAAGACCCCTGGTTTGTTCAGG (J6, SEQ ID NO. 101).
Sekvence s 80% identitou k uvedeným sekvencím jsou zejména sekvence lišící se zkrácením nebo prodloužením sekvence až o 7 nukleotidů na 3‘ a/nebo 5‘ konci nebo záměnou až 4 nukleotidů nebo kombinací zkrácení/prodloužení se záměnou nukleotidů.
Předmětem předloženého vynálezu je také použití oligonukleotidů vybraných ze skupiny zahrnující sekvence mající alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny
| GGAGAAGGTCCTCCAAGCCGATATCCCTGCAGACG | (Fl), |
| TCCATTGTTAAGCCCTTAAGTCGCCCGGGAAAACG | (F2), |
| CAAAGATACTGGTGAGCCCTGCTGGCGGTGATGG | (F3), |
| CCAGGCTGAGCCACAGCAGTAGCAAGGGACAAAGG | (F4), |
| CCTTCAGCTGGTTCGCAGGTGTCTAACGATTTTCG | (F5), |
| GGAAGCTCTAGGGTTTGCAACAGGGCCTGGGAAGG | (F6), |
| CCGTGGTCACGCCACCACCACTTGCTAATATGACG | (F7), |
| CTGGGATGAGGTGCACATGGAAAATGAGGCATTGCi | (F8), |
| CGTGCACCGTACCGGAGTTTGTGGATGACTCTAGC | (F9), |
| ACCGTGGTCITGCACATGTAGGGACCTCATCAAGG | (F10), |
| CAGGTACTCCATGCGCCTTTGGTTTGCAGGTGAGG | (Fll), |
| GGAGACAAGAGTGTTTGCCGCCTGTCATGGTGAGC | (F12), |
| ATTCCACTGGGTCCATAATCCTAGGCCAGCCATGC | (F13), |
CCC AGTGGAGTGGGTGCTGAGl GTGTGATACTTGG (F14),
AGAGGTCCAGAAGTTGGTGTGGCCATCATGTCAGG (F15),
CGCAACCAGCCTGGCACTGATAAGAAGCACAGAGG (F16),
GTAGAC AGGAGAGCCCGGAAGATGTGACCCACTGC (F17),
CAGCTGGAAACAGCTCAGTCTGGGACCACAACACC (F18),
AATAACGTGGGTGCTCGTCTCTCCCTGCCACAAGG (F19),
AGGGCTCTTTCTCCAGTGAAGGGTCCTCGCCTTGG (F20),
GAGGGGATTTCGAGGCTCTAGGGTCCAAGAAGTGG (F21),
CAGGAGCCACGCCGAAGTGTCAGATGTACCTCACC (F22),
GGGTGGCTCC ATTCTTGGTTGTAGGCTGGTGAGG (F23),
ACGCAAGCCCGTGAGCTGTGTCTTCTTTGTCTGG (F24),
CAGCCCCTTTGCTCTCAATGCTCCCTAAGCAGTGG (F25),
GGTCACATTCACAGAACCCCAGGTCTCCAGAAAGC (F26),
GTGCCTGTGCCATGGGACTGATTAGGTATTGATGG (F27),
CAGGGGAAGGCTACACGCTGCTTCAAAGTCACAGC (F28),
CATCTGGGATTCTTGGAAGGTGGGAAGCAGACAGG (F29),
CTTGGTGGGACTTTGTGACACCAGGAGGCAGAGC (F30),
CACACCCTGCTGAAGAGTCCCCTTTGCTCTCAAGG (F31),
GCCCTGCAGAAGCAGTGGTGAACATCCAAAGATGG (F32),
TTCAGCCCTGGACACTGCAAATTGTTCCCTTGAGC (F33),
AAAGCACGGATAATGCTGCCGGAAGTTGGTTCTGC (F34),
CAACCCACAGCATTCCAGGAGGCTTCAGTGTGAGC (F35),
C AGTTCTCGC ATGAGATCC AGACTC AGGC ATGTGG (F3 6),
TCACAGACAAGTCCCGACGCTGTTCTACCTTCAGC (F37),
CAGCATGCCAAGGGGACGACAACATTGACTCTGG (F38),
TGAGCGCCTATGGGGTGCCAGATACATGACAAAGG (F39),
CTGCTTCCTCCCAGCTCTTGAGTCCCTCATTTTCC (F40),
ACC ACC ACCTTCCAGAAACGCCTCATTTTCTTGG (F41),
CCCTTCCACCCAATGGCAAGGTTCAGGTTGGTAGC (F42),
AGCCAGCACTGCCAACCCTTTGCCTAGGGTGTTGG (F43),
TCCTGTCCCTTAGCCAGCACCTGGTGTAGGAATGC (F44),
AGGAGGAAATGAGACCCCGTGTGTGAGGGTTCAGG (F45),
ATCAGCTGAGGTGCCTTCTGTTGCCTGAGTGTTGC (F46), . 10 ·
CTCCCCACAGGTATAGCTCTATGTGGGCCCTTTGC (F47),
GAGAAAGGGGAGTCCACGTGGGAAGC TCAGATGC (F48),
TCTGGTTCAAGTCGCTGCTGGTTTGGGTTCAGAGC (F49),
GAGGTTAAATGACGTGCTGGTGGCCATGGTGTGG (F50),
AGACCCTGCTCGTC AGTGTGCTGTGTGACGTTAGC (F51).
CATGCCTTCTGTTCACCCGAGACCCACAGTCTGC (F52),
ATGTTGCCACGGAAATTCTAATCCCTCCCATCAGG (F53),
GCGCAGATGCTATAAATCACCTGTGACGGGCTTGG (F54),
TTGCACACAGGGTTATTGATGAGTTCGGGGAGTGC (F55),
GATCCCGGACCCCTAATTAGACCGTCCCATCTTCC (F56),
TGCTAGCCCCACAACAAGACCCAGCTATCTTTGC (F57),
GCATGCTCATCAACTCACATGGGTGCCCTTGACC (F58),
CCATGTGTGTCTGGGGTTTCTGCAAGGGGAATGC (F59),
GAACGTGGGTGTGTGTGTCCAATGCACAGTTGAGG (F60),
AGGCCCTAGGGAGGAAC ATGAGGCTGGAAAC AAGC (F61),
TGCTGAACCATTTCCGCCCATTTCCTGTTCAGTCC (F62),
C AGGTGTGGCGGTACTGAGCTTTGAAACGGAC AGG (F63),
GTGGCCTCTGTAGAATGTGACCTCGTCCCTCATGG (F64),
GGCCAGAGGCTGATCTAACATTCCGAGGCCAACC (F65),
CTGCACAGAAATCCCCAGCTTAGAGCTGCACTTCG (F66),
ATTTCCGGGCATTTGCAGCACAGCATCTCAAGG (F67),
TGTCACCCCATCGTGCCCCTAGTTCAACTCACACC (F68),
GGGTCCCTACACCACCTTGTTCTTGCTCTGTGACC (F69),
CTAAAGAAGGCAGCAGCTGCTCAGGAAGGCAGCAGG (F70),
GAGGTGCAGCGGTCACTTCTGGTCTCACTTTGTCC (F71),
AGAGGGGACACTGTCGTCATCTCCTCCCATGTACC (F72),
AAGGCTGCATTCTATCGCACAGGTTCTCCGACTGC (F73),
AGCTTTGCCCGGGTTCCTGAATTCAGGAGACCTGG (F74),
ACATGAGGGTTGGCAGCACATCTCGACCTCTGTCC (F75),
CAAGTGGGAACTCCTTTCATGGAGACCAGGCTTGC (F76),
GGGGATGTTCTCTGCC AATTAGAGCCACGGGTTGG (F77),
GGGGACCTGGAGTAGGGGTTTTAGCCTCCTGAACC (F78),
CAATCAGGCCCAAGGCACTCATCACCAAATCTGC (F79), . 11 '
TTGGAGCCGTGGGArAATGATCAGCTGCTTCTCG (F80),
TGTCTCCAGGATGGTGGAGTCCTTAGTCCCGTTCC (F81),
GGAGCTGAACTTGCGTGTCCTCCCAGCCTCTAACC (F82),
ACCGTGGTGGATGCTGGACTATGACCAGAGACAGG (F83).
AAACTCAGTCGTTCTGTGATGGGCCCCAGGAATGG (F84),
CAAAAGGCATCGTGTACAGAATGGGCGACAACAGG (F85),
CACGGCGTGTTCCCCTC AAGGATAGCTGACAAAGG (F86),
AATTCACCACTGCTTAGCCCAGAGAGGCGCAGAGG (F87),
TGCGATGAATAATGGTAGCCTCGTGGCATCTGTCC (F88),
TCGGAGCTCAACTCCAAAGCTCCTTGACCCCATCC (F89),
CAGCCCTCAGTCGTGGCTGTGAGCTCTAGAACAGG (F90),
GAATGCCAGCCGCATCCTCAAATACCCCTCATACC (F91),
ATTCCTGCATCCCTGCACTCGGTGGCCTTAATAGG (F92),
GAGCAATTTGACTGCCCCTCATTTGACACACAACG (F93),
GGCTGAGTCTCGATCCCAAAGCTCTCTCCCAGACC (F94),
GCTTATCATGCATCAGCTTGCCATGGCTCCACAGG (F95),
CCGCCCTCCTGCCGACCTCCTTTGCTGAGCACC(JI),
CCTGCTTGCTACCTGTGGAGGGTCCCTGACGGG(J2),
CCCAGTTCCCAAAGAAAGGCCTTCTGCTGAACG(J3),
GCATCTGGAGCCCTTGCCCCTCGTCTGTGTGG(J4),
CCTGAGAATGCTCCAGGTGAAGCGGAGAGAGG(J5),
CCTCAGCCATCACTAAGACCCCTGGTTTGTTCAGG(J6)
pro in vitro stanovení zlomového místa chromozomální translokace t( 11; 14)(ql3;q32).
Dalším předmětem předloženého vynálezu je sada pro detekci translokace t(l I; 14)(ql3;q32) metodou PCR dalekého dosahu (long-range PCR), jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje primery F1 až Fn, kde n je nejvýše 140, komplementární k úsekům oblasti chromozómu 11 v rozsahu -5000 až +420000 baží od počátku transkripce genu CCND1 směrem k centromeře, přičemž úseky této oblasti, k nimž jsou komplementární uvedené primery F1 až Fn, jsou od sebe vzájemně vzdáleny alespoň 1,7 kb, s výhodou 1,7 až 7,6 kb, výhodněji 3,5 až 5,5 kb. a primery F jsou s výhodou číslovány postupně ve směru od počátku transkripce CCND1 k
centromeře, a příměry JI až J6, které jsou komplementární k úsekům oblasti chromozómu 14, v níž leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinu, přičemž úsek, k němuž je komplementární primer JI, leží mezi geny IGHJ1 a IGHJ2, úsek, k němuž je komplementární primer J2, leží mezi geny ÍGHJ2 a IGPIJ3, úsek, k němuž je komplementární primer J3, leží mezi geny IGHJ3 a IGHJ4, úsek, k němuž je komplementární primer J4, leží mezi geny IGHJ4 a IGHJ5, úsek, k němuž je komplementární primer J5, leží mezi geny IGHJ5 a IGHJ6 a úsek, k němuž je komplementární primer J6, leží mezi geny IGHJ6 a IGHC.
Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje sada 95 primerů F, rozdělených do 12 nádobek tak, že vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je alespoň 15 kb, a 6 primerů J, každý z nich v samostatné nádobce.
V jiném výhodném provedení vynálezu obsahuje sada 60 primerů F, rozdělených do 10 nádobek tak, že vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je alespoň 15 kb, a 6 primerů J, každý z nich v samostatné nádobce.
Předkládaný vynález tedy ve výhodném provedení zahrnuje soubor speciálně pro long-range PCR navržených oligonukleotidových primerů. Soubor se skládá z 95 primerů (F1 až F95, F primery) komplementárních k -400 kb dlouhému úseku chromozómu 11, který leží v blízkosti genu CCND1 (http://genome.ucsc.edu/cgi- bin/hgTracks?org=Human&db=hgl8&position=chrll%3A68665053-69188423) a 6 primerů (JI až J6, J primery) komplementárních s částí chromozómu 14 v oblasti kde leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinu (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks? org=Human&db=hgl8&position=chrl4%3A105400000-l05402800). Primery F1 až F95jsou navrženy tak, aby vzdálenost mezi dvěma sousedícími primery byla v rozmezí 1,7 až 7.6 kb (Obr. 2). Primery F1 až F95 mohou například být zkombinovány s primerem J6 do 12 multiplexních long-range reakcí (A až L) tak, aby v každé z reakcí v případě přítomnosti translokace docházelo k amplifíkaci pouze jednoho úseku DNA (Tab. 1). Amplifikace pouze jednoho DNA fragmentu je zajištěna dostatečnou vzdáleností mezi primery F použitými v jednotlivých reakcích. Vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je nejméně 15 tisíc baží, což při reakčních podmínkách long-range PCR zabraňuje účinné amplifíkaci velmi dlouhých fragmentů (Obr. 3). Primery F1 až F95 jsou navrženy a zkombinovány tak, aby v případě přítomnosti translokace došlo k amplifíkaci zlomového místa a okolních úseků DNA v jedné až třech ze dvanácti reakcí. F primery jsou rozděleny do reakcí tak, aby v případě přítomnosti translokace a současné amplifíkace zlomového místa ve dvou a více reakcích umožňovaly ve většině případů identifikaci použitých primerů a tím přibližné určení polohy místa zlomu na chromozómu 11 (Tab. 1). Primery JI až J6 jsou navrženy tak, aby umožnily přesnější lokalizaci místa zlomu na chromozómu 14 (Obr. 3). Primery JI až J6 zároveň slouží jako primery pro sekvenování místa zlomu. Primery JI až J6 jsou využívány v druhé sadě multiplex reakcí, kdy jsou jednotlivě zkombinovány s primery FI až F95 na základě výsledku první sady multiplex PCR reakcí (Obr. 4).
Tabulka 1
| Reakce | F primery |
| A | Fl, F8, F28, F37, F55, F74, F81, F91 |
| B | F3, F10, F16, F52, F61, F72, F83, F90, F95 |
| C | F12, F21, F30, F50, F59, F68, F78, F89 |
| D | F20, F35, F45, F51, F57, F70, F75, F82, F87 |
| E | F2, F18, F27, F39, F47, F66, F92 |
| F | F5, F14, F32, F41, F53, F63, F69, F86 |
| G | F6, F22, F34, F44, F49, F56, F84 |
| H | F11,F26, F33, F60, F67, F77 |
| I | F9, F23, F29, F48, F58, F65, F71 |
| J | F15, F24, F36, F42, F54, F64, F80, F88, F93 |
| K | Fl, F7, F13, F19, F31, F38, F43, F62, F76 |
| L | F4, F25, F40, F46, F73, F79, F85, F94 |
Primery FI až F95, jejichž sekvence jsou zde uvedeny, dovolují pokrýt rovnoměrně oblast chromozómu 11 v rozsahu -5000 až +420000 baží od počátku transkripce genu CCNDI směrem k centromeře. Vzhledem k tomu, že ke zlomu na chromozómu 11 velmi často dochází výrazně blíže, je možno použít jen část těchto primerů s nižšími pořadovými čísly, např. jen FI až F60.
Přehled obrázků
Obr. 1 znázorňuje schématické znázornění translokace t( 11; 14)(q 13 ;q32). Následkem zlomů v . 14 · původních chromozómech 11 a 14 a následné fúze dochází ke vzniku dvou fúzních chromozomů, z nichž jeden nese gen CCND1 translokovaný do blízkosti IGfl lokusu, ve kterém leží velmi silný zesilovač transkripce.
Obr. 2 ukazuje příkladné schéma rozmístění primerů pro detekci translokace t( 11; 14)(ql3;q32) metodou multiplexní long-range PCR. a) Rozmístění primerů na chromozómu 11. Primery pokrývají oblast -400kb centromericky od pozice genu CCNDl. b) Rozmístění primerů na chromozómu 14. Jednotlivé primery jsou lokalizovány centromericky od IGHJ segmentů, c) Příklad, kdy ke zlomu dojde v segmentu 1GHJ5 na chromozómu 14 a v úseku DNA mezi primery F5 a F6 na chromozómu 11.
Obr. 3 ukazuje schéma průběhu reakcí pro příklad, kdy ke zlomu dojde v segmentu IGHJ5 na chromozómu 14 a v úseku DNA mezi primery F5 a F6 na chromozómu 11. a) V první sadě reakcí dochází díky parametrům reakce k amplifikaci tří úseků DNA vymezených primery J6 až F3, J6 až F4 a J6 až F5. Díky rozmístění F primerů do jednotlivých reakcí jsou tyto produkty amplifíkovány každý v jiné reakcí, b) Na základě výsledků první sady reakcí je DNA ve druhé sadě reakcí amplifikována s primery JI až J6 a F primery, které poskytují nejkratší produkt (v tomto příkladu směs primerů obsahující primer F5). Ve druhé sadě dávají pozitivní reakci (tj. amplifikovaný úsek DNA) pouze reakce s primery J6 a J5. Primer J5, který dává kratší amplifikační produkt, je pak použit pro sekvencování místa zlomu.
Obr. 4 ukazuje schéma vyšetření vzorku na translokaci t(l 1; 14)(ql 3 ;q32) metodou multiplex long-range - příklad. A) Vzorek DNA je nejdříve vyšetřen sadou dvanácti multiplex longrange PCR reakcí, ve kterých jsou primery F1 až F95 v kombinaci s primerem J6, Amplifikační produkty jsou detekovány metodou agarosové elektroforézy, v příkladu je vyznačena přítomnost amplifikačního produktu v reakcích C a I, kratší produkt byl získán v reakci C. B) Vzorek je vyšetřen druhou sadou 6 reakcí, ve kterých jsou zkombinovány F primery použité v reakci C s jednotlivými primery JI až J6. Amplifikační produkty jsou detekovány metodou agarosové elektroforézy, v příkladu je vyznačena přítomnost amplifikačního produktu v reakcích IV, V a VI, nejkratší produkt byl detekován v reakci IV. C) Amplifikační produkt z reakce IV je poté sekvencován s použitím primerů J4 jako sekvenačního primerů.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 . 15 '
Byla provedena analýza 16 vzorků DNA získaných z bioptátů mízních uzlin pacientů s lymfomem plášťové zóny. Tyto vzorky byly negativní při vyšetření na přítomnost translokace t(ll;14)(ql3;q32) při použití dosavadní PCR metody určené pro amplifikaci zlomových míst lokalizovaných v MTC. Každý vzorek byl nejdříve otestován sadou 12 multiplex long-range PCR reakcí A až L (viz Tabulka 1). K detekci amplifikačních produktů byla použita agarózová elektroforéza. V případě pozitivity byl vzorek otestován sadou 6 multiplex long-range PCR reakcí (I až VI), kombinujících F primery použité v pozitivní reakci dávající nejkratší amplifikační produkt s jednotlivými primery JI až J6. Pro sekvencování byl pak použit produkt a příslušný primer JI až J6 z reakcí í až VI dávajících nejkratší amplifikační produkt (Obr. 3 a 4).
Složení reakčních směsí je uvedeno v tabulkách 2a a 2b.
Tabulka 2 a
Komponenta Koncentrace Množství (pl) Dodavatel
| h2o | 16,2 | ||
| LA PCR buffer II (Mg2+ plus) | 10x | 4 | TaKaRa |
| dNTP směs | 2,5mM | 6,4 | TaKaRa |
| LA Taq HS polymeráza | 5U/pl | 0,4 | TaKaRa |
| J primer | 2μΜ | 4 | |
| Směs F primerů | 2μΜ každý | 4 | |
| DNA | 5 |
Tabulka 2b
Komponenta Koncentrace Množství (μΙ) Dodavatel
| H2O | 19,5 | ||
| Phusion HF buffer | 5x | 8 | Finnzymes |
| dNTP směs | 10mM | 0,8 | Finnzymes |
| Phusion polymeráza | 2U/pl | 0,7 | Finnzymes |
| J primer | 2 μΜ | 4 | |
| Směs F primerů | 2μΜ každý | 2 | |
| DNA | 5 |
Při tomto reakčním profilu:
1: 95°C/30s
2: 98°C /30s %
3: 72°C /7min
4: jdi na krok 2, 32x
5: 72°C lOmin
Z 16 testovaných vzorků byl amplifikační produkt získán v 11 případech (69 %). U těchto 11 pozitivních vzorků byla místa zlomu amplifikována ve třech různých reakcích A - L ve 2 případech, ve dvou různých reakcích v 5 případech a pouze v jedné z reakcí ve 4 případech. Druhá sada reakcí pak identifikovala u těchto 11 pozitivních vzorků použití těchto J segmentů genu těžkého imunoglobulinového řetězce: IGHJ6 (pozitivní pouze reakce VI s J6 primerem) - 3 vzorky, IGHJ5 (pozitivní reakce V a VI) - 1 vzorek, IGHJ4 (pozitivní reakce IV, V a VI) 6 vzorků, IGHJ3 (pozitivní reakce III, IV, V a VI) - 1 vzorek. J segmenty těžkého imunoglobulinového řetězce IGHJ1 a IGHJ2 nebyly využity u žádného z pozitivních vzorků (viz Tabulka 3).
Tabulka 3
| Číslo vzorku | Pozitivní reakce z reakcí A až L | Primer F nejbližší zlomovému místu | Pozitivní reakce z reakcí I až VI | Primer J nejbližší zlomovému místu |
| 1 | E | F2 | III - VI | J3 |
| 2 | E | F2 | V, VI | J5 |
| 3 | Β, I | F10 | VI | J6 |
| 4 | C, D, K | F21 | VI | J6 |
| 5 | H | F26 | IV-VI | J4 |
| 6 | H, L | F26 | IV-VI | J4 |
| 7 | D,QJ | F34 | IV-VI | J4 |
| 8 | E,K | F39 | IV-VI | J4 |
| 9 | K,G | F43 | VI | J6 |
| 10 | F, J | F15 | IV-VI | J4 |
| 11 | H | F26 | IV-VI | J4 |
Příklad 2
Al
Vzorky DNA izolované z kostní dřeně pacientů s lymfomem z buněk plášťové zóny byly vyšetřeny na přítomnost translokace t(l I;14)(ql3;q32) metodou multiplexní long-range PCR popsanou v příkladu 1 s tou změnou, že jako F primery byly použity pouze oligonukleotidy FI až F60 rozdělené dle stejných pravidel do 10 multiplexních long-range PCR reakcí A - J (Tab. 4). Pro amplifikaci byly použity obdobné reakční podmínky jako v příkladu 1 (Tab. 2b). Celkem bylo vyšetřeno 20 vzorků, z toho pozitivní výsledek byl získán v 5 případech (25 %) (viz Tabulka 5). Celkově nižší míra záchytu je dána především nižším počtem nádorových buněk ve vzorcích kostní dřeně, především u vzorků odebraných po započetí terapie.
Tabulka 4
| Reakce | F primery |
| A | F10, F21, F30, F38, F45, F53 |
| B | F1, F9, F26, F33, F48, F57 |
| C | F2, F8, F15, F23, F35, F43 |
| D | F6, F18, F34, F39, F44, F50, F60 |
| E | F12, F17, F24, F42, F51, F56 |
| F | F3, F11, F29, F36, F49 |
| G | F22, F27, F32, F40, F47, F52 |
| H | F4, F14, F20, F41, F54, F59 |
| 1 | F5, F13, F19, F28, F46, F55 |
| J | F7, F16, F25, F31, F37, F58 |
Tabulka 5
| Číslo vzorku | Pozitivní reakce z reakcí A až J | Primer F nejbližší zlomovému místu | Pozitivní reakce z reakcí I až VI | Primer J nejbližší zlomovému místu |
| 1 | F,H | F4 | IV-VI | J4 |
| 2 | J,G | F32 | V, VI | J5 |
| 3 | C,F | F36 | V, VI | .15 |
| 4 | C, F, J | F36 | IV- VI | J4 |
| 5 | H, J | F59 | IV-VI | J4 |
Příklad 3 •18 ’
Sekvenace amplifikačních produktů získaných v příkladech 1 a 2 s příslušným sckvenačním primerem JI až J6 vedla ve všech 11 provedených případech k získání sekvence a přesné charakterizaci a lokalizaci místa zlomu jak na chromozómu 11 tak i na chromozómu 14. Tyto sekvence pak byly použity k návrhu specifických qPCR (kvantitativní PCR) detekčních sad, umožňujících detekci minimální zbytkové nemoci (MRD, Minímal Residual Disease). Tyto detekční sady sestávají z 6 oligonukleotidových primerů RQJ1 až RQJ6 odvozených ze sekvence chromozómu 14 v jednotlivých IGHJ segmentech a duálně značené oligonukleotidové sondy (TaqMan® technologie) komplementárních k několika úsekům DNA v oblasti IGHJ segmentů na chromozómu 14 (Real-time poiymerase chain reaction estimation of bone marrow tumor burden using clonal immunoglobulin heavy chain gene and bcl-l/JH rearrangements in mantle cell lymphoma. Andersen NS, Donovan JW, Zuckerman A, Pedersen L, Geisler C, Gribben JG. Exp Hematol. 2002 Jul;30(7):703-l). Vhodný primer RQJ je vybrán na základě IGHJ segmentu, identifikovaného sekvenací místa zlomu. Jako druhý primer (RQF) jsou použity individuálně navržené pacient-specifické oligonukleotidy komplementární k sekvenci místa zlomu translokace t(l 1 ;14)(ql3;q32) identifikované v příkladech 1 a 2.
Bylo testováno 5 detekčních sad pro real-time kvantitativní PCR. Bylo navrženo 5 pacientspecifických primerů RQF1 až 5, které byly zkombinovány s vhodnými primery RQJ1 až 6 (Tabulka 6).
Tabulka 6
| Vzorek | Primer RQJ | Primer RQF | Sekvence primem RQF |
| 1 | RQJ4 | RQF1 | GTGCCACACTGCCAGTATACG |
| 2 | RQJ4 | RQF2 | CATTCGGTCCTCGGTGTTCC |
| 3 | RQJ3 | RQF3 | CCTGGACCACGTAAGGGC |
| 4 | RQJ6 | RQF4 | GAGCGCAGAGAATACGGTATGG |
| 5 | RQJ4 | RQF5 | GGAATCTAGTACAGGGTCG |
Primery RQF byly navrženy tak, aby jejich teplota tání (Tm) odpovídala příměrům RQJ. Tyto sady pak byly otestovány na pozitivních a negativních vzorcích. Jako pozitivní vzorek byla vždy použita DNA z příkladů 1 a 2, ve které byla translokace t( 11; 14)(ql 3;32) identifikována, jako negativní kontrola byl použit směsný vzorek DNA dobrovolníků negativních na t( 11; 14)(ql3;32). Složení reakční směsi je uvedeno v tabulce 7, amplifikace probíhala při tomto reakčním profilu:
1:95 °C/15min
2: 95 °C /20 s
3: 60 °C /1 min
4: jdi na krok 2, 49x
Tabulka 7
| Komponenta | Koncentrace | Množství (μΐ) | Dodavatel. |
| H2O | 5,3 | ||
| Primer RQJ | ΙΟμΜ | 1 | |
| Primer RQF | ΙΟμΜ | 1 | |
| TaqMan probe | 25 μΜ | 0,2 | |
| AB gene universal mastermix | 2x | 12,5 | AB Gene |
| DNA | 50 ng/gL | 5 |
Ve všech případech byla získána specifická amplifikační křivka v pozitivních vzorcích a žádná nebo pouze minimální v negativním vzorku.
Průmyslová využitelnost
Stanovení zlomového místa translokace t(l 1 ;14)(ql3;q32) je důležité zejména proto, že umožňuje navrhnout specifické qPCR (kvantitativní PCR) detekční sady, umožňující detekci minimální zbytkové nemoci (MRD, Minimal Residual Disease). Tyto detekční sady sestávají z 6 oligonukleotidových primerů odvozených ze sekvence chromozómu 14 v jednotlivých IGHJ segmentech a duálně značených oligonukleotidových sond (TaqMan® technologie) komplementárních k několika úsekům DNA v oblasti IGHJ segmentů na chromozómu 14 (Real-time polymerase chain reaction estimation of bone marrow tumor burden using clonal immunoglobulin heavy chain gene and bcl-l/JH rearrangements in mantle cell lymphoma. Andersen NS, Donovan JW, Zuckerman A, Pedersen L, Geisler C, Gribben JG. Exp Hematol. 2002 Jul;30(7):703-1). Vhodný primer je vybrán na základě IGHJsegmentu, identifikovaného sekvenací místa zlomu. Jako druhý primer se použijí individuálně navržené pacient-specifícké oligonukleotidy komplementární k sekvenci místa zlomu translokace t( 11; 14)(q 13;q32) identifikovaného způsobem podle předkládaného vynálezu.
Claims (9)
1. Způsob detekce zlomového místa translokace t( 11; 14)(ql3;q32) metodou multiplexní PCR dalekého dosahu v DNA získané ze vzorků biologického materiálu, vyznačený tím, že
a) se připraví primery F1 až Fn, kde n je nejvýše 140, komplementární k úsekům ležícím v oblasti chromozómu 11 v rozsahu -5000 až +420000 baží od počátku transkripce genu CCND1 směrem k centromeře, přičemž úseky ležící v této oblasti, k nimž jsou komplementární uvedené primery F1 až Fn, jsou od sebe vzájemně vzdáleny alespoň 1,7 kb, s výhodou 1,7 až 7,6 kb, výhodněji 3,5 až 5,5 kb, a primery F jsou s výhodou číslovány postupně ve směru od počátku transkripce CCND1 k centromeře,
b) se připraví primery JI až J6, které jsou komplementární k úsekům oblasti chromozómu 14, v níž leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinu, přičemž úsek, k němuž je komplementární primer JI, leží mezi geny IGHJ1 a IGHJ2, úsek, k němuž je komplementární primer J2, leží mezi geny 1GHJ2 a IGHJ3, úsek, k němuž je komplementární primer J3, leží mezi geny IGHJ3 a IGHJ4, úsek, k němuž je komplementární primer J4, leží mezi geny IGHJ4 a IGHJ5, úsek, k němuž je komplementární primer J5, leží mezi geny IGHJ5 a IGHJ6 a úsek, k němuž je komplementární primer J6, leží mezi geny IGHJ6 a IGHC,
c) primery F1 až Fn se zkombinují sprinterem J6 do reakcí niultiplexníPCR dalekého dosahu tak, že vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je alespoň 15 kb,
d) provedou se reakce multiplexní PCR dalekého dosahu s DNA získanou z biologického vzorku získaného z těla pacienta,
e) určí se primer F nejblíže zlomovému místu, který poskytl pozitivní reakci, ve výhodném provedení tedy primer s nejvyšším číslem, který poskytl pozitivní reakci,
f) primer F, který je nejblíže zlomovému místu, se zkombinuje do nové sady reakcí multiplexní PCR dalekého dosahu s primery JI až J6, a to tak, aby v každé reakci byl primer F, který je nejblíže zlomovému místu, a jeden z primerů JI až J6,
g) provedou se reakce PCR dalekého dosahu s DNA získanou z biologického vzorku získaného z těla pacienta,
h) určí se primer J s nejnižším číslem, který poskytl pozitivní reakci, a který je tedy nejblíže zlomovému místu, .21
i) stanoví se sekvence úseku mezi primerem F, který je nejblíže zlomovému místu, a primerem J, který je nejblíže zlomovému místu, s výhodou se sekvence tohoto úseku stanoví metodami PCR a sekvencování.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že biologickým vzorkem je vzorek periferní krve, vzorek kostní dřeně nebo vzorek tkáně.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že je n menší nebo rovno 95 a v kroku c) jsou primery zkombinovány do nejvýše 12 reakcí multiplexní PCR dalekého dosahu.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se jako F primery pro multiplexní PCR dalekého dosahu použijí oligonukleotidy mající alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
GAGGGGATTTCGAGGCTCTAGGGTCC AAGAAGTGG (F21),
CAGGAGCCACGCCGAAGTGTCAGATGTACCTCACC (F22),
GGGTGGCTCCATTCTTGGTTGTAGGCTGGTGAGG (F23),
ACGCAAGCCCGTGAGCTGTGTCTTCTTTGTCTGG (F24),
CAGCCCCTTTGCTCTCAATGCTCCCTAAGCAGTGG (F25),
GGTCACATTCACAGAACCCCAGGTCTCCAGAAAGC (F26),
GTGCCTGTGCCATGGGACTGATTAGGTATTGATGG (F27),
CAGGGGAAGGCTACACGCTGCTTCAAAGTCACAGC (F28),
CATCTGGGATTCTTGGAAGGTGGGAAGCAGACAGG (F29),
CTTGGTGGGACTTTGTGACACCAGGAGGCAGAGC (F30),
CAC ACCCTGCTGAAGAGTCCCCTTTGCTCTCAAGG (F31),
GCCCTGCAGAAGCAGTGGTGAACATCCAAAGATGG (F32),
TTCAGCCCTGGACACTGCAAATTGTTCCCTTGAGC (F33),
AAAGCACGGATAATGCTGCCGGAAGTTGGTTCTGC (F34),
CAACCCACAGCATTCCAGGAGGCTTCAGTGTGAGC (F35),
CAGTTCTCGCATGAGATCCAGACTCAGGCATGTGG (F36),
TCACAGACAAGTCCCGACGCTGTTCTACCTTCAGC (F37),
CAGCATGCCAAGGGGACGACAACATTGACTCTGG (F38),
TGAGCGCCTATGGGGTGCCAGATACATGACAAAGG (F39),
CTGCTTCCTCCCAGCTCTTGAGTCCCTCATTTTCC (F40),
ACCACCACCTTCCAGAAACGCCTCATTTTCTTGG (F41),
CCCTTCCACCCAATGGCAAGGTTCAGGTTGGTAGC (F42),
AGCCAGCACTGCCAACCCTTTGCCTAGGGTGTTGG (F43),
TCCTGTCCCTTAGCCAGCACCTGGTGTAGGAATGC (F44),
AGGAGGAAATGAGACCCCGTGTGTGAGGGTTCAGG (F45),
ATCAGCTGAGGTGCCTTCTGTTGCCTGAGTGTTGC (F46),
CTCCCCACAGGTATAGCTCTATGTGGGCCCTTTGC (F47),
GAGAAAGGGGAGTCCACGTGGGAAGCTCAGATGC (F48),
TCTGGTTCAAGTCGCTGCTGGTTTGGGTTCAGAGC (F49),
GAGGTTAAATGACGTGCTGGTGGCCATGGTGTGG (F50),
AGACCCTGCTCGTC AGTGTGCTGTGTGACGTTAGC (F51),
CATGCCTTCTG1TCACCCGAGACCCACAGTCTGC (F52),
ATGTTGCCACGGAAATTCTAATCCC TCCCATCAGG (F53), •23 '
GCGCAGATGCTATAAATCACCTGTGACGGGCTTGG (F54),
TTGCACACAGGGTTATTGATGAGTTCGGGGAGTGC (F55),
GATCCCGGACCCCTAATTAGACCGTCCCATCTTCC (F56),
TGCTAGCCCCACAACAAGACCCAGCTATCTTTGC (F57),
GCATGCTCATCAACTCACATGGGTGCCCTTGACC (F58),
CCATGTGTGTCTGGGGTTTCTGCAAGGGGAATGC (F59),
GAACGTGGGTGTGTGTGTCCAATGCACAGTTGAGG (F60),
AGGCCCTAGGGAGGAAC ATGAGGCTGGAAACAAGC (F61),
TGCTGAACCATTTCCGCCCATTTCCTGTTCAGTCC (F62),
CAGGTGTGGCGGTACTGAGCTTTGAAACGGACAGG (F63),
GTGGCCTCTGTAGAATGTGACCTCGTCCCTCATGG (F64),
GGCCAGAGGCTGATCTAACATTCCGAGGCCAACC (F65),
CTGCACAGAAATCCCCAGCTTAGAGCTGCACTTCG (F66),
ATTTCCGGGCATTTGCAGCACAGCATCTCAAGG (F67),
TGTCACCCCATCGTGCCCCTAGTTCAACTCACACC (F68),
GGGTCCCTACACCACCTTGTTCTTGCTCTGTGACC (F69),
CTAAAGAAGGCAGCAGCTGCTCAGGAAGGCAGCAGG (F70),
GAGGTGC AGCGGTCACTTCTGGTCTC ACTTTGTCC (F71),
AGAGGGGACACTGTCGTCATCTCCTCCCATGTACC (F72),
AAGGCTGCATTCTATCGCACAGGTTCTCCGACTGC (F73),
AGCTTTGCCCGGGTTCCTGAATTCAGGAGACCTGG (F74),
ACATGAGGGTTGGCAGCACATCTCGACCTCTGTCC (F75),
CAAGTGGGAACTCCTTTCATGGAGACCAGGCTTGC (F76),
GGGGATGTTCTCTGCCAATTAGAGCCACGGGTTGG (F77),
GGGGACCTGGAGTAGGGGTTTTAGCCTCCTGAACC (F78),
CAATCAGGCCCAAGGCACTCATCACCAAATCTGC (F79),
TTGGAGCCGTGGGATAATGATCAGCTGCTTCTCG (F80),
TGTCTCC AGGATGGTGGAGTCCTTAGTCCCGTTCC (F81),
GGAGCTGAACTTGCGTGTCCTCCCAGCCTCTAACC (F82),
ACCGTGGTGGATGCTGGACTATGACCAGAGACAGG (F83),
AAACTCAGTCGTTCTGTGATGGGCCCCAGGAATGG (F84),
CAAAAGGCATCGTGTACAGAATGGGCGACAACAGG (F85),
CACGGCGTGTTCCCCTCAAGGATAGCTGACAAAGG (F86),
5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se jako J primery pro multiplexní PCR dalekého dosahu použijí oligonukleotidy mající alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:
6. Použití oligonukleotidů vybraných ze skupiny zahrnující sekvence mající alespoň 80% identitu nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující
'25 ·
GGAGACAAGAGTGTTTGCCGCCTGTCATGGTGAGC (F12),
ATTCCACTGGGTCCATAATCCTAGGCCAGCCATGC
CCCAGTGGAGTGGGTGCTGAGTGTGTGATACTTGG (F14),
AGAGGTCCAGAAGTTGGTGTGGCCATCATGTCAGG (F15),
CGCAACCAGCCTGGCACTGATAAGAAGCACAGAGG (F16),
GTAGACAGGAGAGCCCGGAAGATGTGACCCACTGC (F17),
CAGCTGGAAACAGCTCAGTCTGGGACCACAACACC (F18),
AATAACGTGGGTGCTCGTCTCTCCCTGCCACAAGG (F19),
AGGGCTCTTTCTCCAGTGAAGGGTCCTCGCCTTGG (F20),
GAGGGGATTTCGAGGCTCTAGGGTCCAAGAAGTGG (F21),
CAGGAGCCACGCCGAAGTGTCAGATGTACCTCACC (F22),
GGGTGGCTCCATTCTTGGTTGTAGGCTGGTGAGG (F23),
ACGCAAGCCCGTGAGCTGTGTCTTCTTTGTCTGG (F24),
CAGCCCCTTTGCTCTCAATGCTCCCTAAGCAGTGG (F25),
GGTCACATTCACAGAACCCCAGGTCTCCAGAAAGC (F26),
GTGCCTGTGCCATGGGACTGATTAGGTATTGATGG (F27),
CAGGGGAAGGCTACACGCTGCTTCAAAGTCACAGC (F28),
CATCTGGGATTCTTGGAAGGTGGGAAGCAGACAGG (F29),
CTTGGTGGGACTTTGTGACACCAGGAGGCAGAGC (F30),
CACACCCTGCTGAAGAGTCCCCTTTGCTCTCAAGG (F31),
GCCCTGCAGAAGCAGTGGTGAACATCCAAAGATGG (F32),
TTCAGCCCTGGACACTGCAAATTGTTCCCTTGAGC (F33),
AAAGCACGGATAATGCTGCCGGAAGTTGGTTCTGC (F34),
CAACCCACAGCATTCCAGGAGGCTTCAGTGTGAGC (F35),
CAGTTCTCGCATGAGATCCAGACTCAGGCATGTGG (F36),
TCACAGACAAGTCCCGACGCTGTTCTACCTTCAGC (F37),
CAGCATGCCAAGGGGACGACAACATTGACTCTGG (F38),
TGAGCGCCTATGGGGTGCCAGATACATGACAAAGG (F39),
CTGCTTCCTCCCAGCTCTTGAGTCCCTCATTTTCC (F40),
ACCACCACCTTCCAGAAACGCCTCATTTTCTTGG (F41),
CCCTTCCACCCAATGGCAAGGTTCAGGTTGGTAGC (F42),
AGCCAGCACTGCCAACCCTTTGCCTAGGGTGTTGG (F43),
TCCTGTCCCTTAGCCAGCACCTGGTGTAGGAATGC (F44),
-26 *
AGGAGGAAATGAGACCCCGTGTGTGAGGGTTCAGG (F45),
ATCAGCTGAGGTGCCTTCTGTTGCCTGAGTGTTGC (F46),
CTCCCCACAGGTATAGCTCTATGTGGGCCCTTTGC (F47),
GAGAAAGGGGAGTCCACGTGGGAAGCTCAGATGC (F48),
TCTGGTTCAAGTCGCTGCTGGTTTGGGTTCAGAGC (F49),
GAGGTTAAATGACGTGCTGGTGGCCATGGTGTGG (F50),
AGACCCTGCTCGTCAGTGTGCTGTGTGACGTTAGC (F51),
CATGCCTTCTGTTCACCCGAGACCCACAGTCTGC (F52),
ATGTTGCCACGGAAATTCTAATCCCTCCCATCAGG (F53),
GCGCAGATGCTATAAATCACCTGTGACGGGCTTGG (F54),
TTGCACACAGGGTTATTGATGAGTTCGGGGAGTGC (F55),
GATCCCGGACCCCTAATTAGACCGTCCCATCTTCC (F56),
TGCTAGCCCCACAACAAGACCCAGCTATCTTTGC (F57),
GCATGCTCATCAACTCACATGGGTGCCCTTGACC (F58),
CCATGTGTGTCTGGGGTTTCTGCAAGGGGAATGC (F59),
GAACGTGGGTGTGTGTGTCCAATGCACAGTTGAGG (F60),
AGGCCCTAGGGAGGAACATGAGGCTGGAAACAAGC (F61),
TGCTGAACCATTTCCGCCCATTTCCTGTTCAGTCC (F62),
CAGGTGTGGCGGTACTGAGCTTTGAAACGGACAGG (F63),
GTGGCCTCTGTAGAATGTGACCTCGTCCCTCATGG (F64),
GGCCAGAGGCTGATCTAACATTCCGAGGCCAACC (F65),
CTGCACAGAAATCCCCAGCTTAGAGCTGCACTTCG (F66)}
ATTTCCGGGCATTTGCAGCACAGCATCTCAAGG (F67),
TGTCACCCCATCGTGCCCCTAGTTCAACTCACACC (F68),
GGGTCCCTACACCACCTTGTTCTTGCTCTGTGACC (F69),
CTAAAGAAGGCAGCAGCTGCTCAGGAAGGCAGCAGG (F70),
GAGGTGCAGCGGTCACTTCTGGTCTCACTTTGTCC (F71),
AGAGGGGACACTGTCGTCATCTCCTCCCATGTACC (F72),
AAGGCTGCATTCTATCGCACAGGTTCTCCGACTGC (F73),
AGCTTTGCCCGGGTTCCTGAATTCAGGAGACCTGG (F74),
ACATGAGGGTTGGCAGCACATCTCGACCTCTGTCC (F75),
CAAGTGGGAACTCCTTTCATGGAGACCAGGCTTGC (F76),
GGGGATGTTCTCTGCCAATTAGAGCCACGGGTTGG (F77),
GGGGACCTGGAGTAGGGGTTTTAGCCTCCTGAACC (F78),
C AATCAGGCCC AAGGC ACTCATC ACC AAATCTGC (F79),
TTGGAGCCGTGGGATAATGATCAGCTGCTTCTCG (F80),
TGTCTCCAGGATGGTGGAGTCCTTAGTCCCG Π CC (F81),
GGAGCTGAACTTGCGTGTCCTCCCAGCCTCTAACC (F82),
ACCGTGGTGGATGCTGGACTATGACCAGAGACAGG (F83),
AAACTCAGTCGTTCTGTGATGGGCCCCAGGAATGG (F84),
CAAAAGGCATCGTGTACAGAATGGGCGACAACAGG (F85),
CACGGCGTGTTCCCCTCAAGGATAGCTGACAAAGG (F86),
AATTCACCACTGCTTAGCCCAGAGAGGCGCAGAGG (F87),
TGCGATGAATAATGGTAGCCTCGTGGCATCTGTCC (F88),
FCGGAGCTCAACTCCAAAGCTCCTTGACCCCATCC (F89),
CAGCCCTCAGTCGTGGCTGTGAGCTCTAGAACAGG (F90),
GAATGCC AGCCGCATCCTCAAATACCCCTCATACC (F91),
ATTCCTGCATCCCTGCACTCGGTGGCCTTAATAGG (F92),
GAGCAATTTGACTGCCCCTCATTTGACACACAACG (F93),
GGCTGAGTCTCGATCCCAAAGCTCTCTCCCAGACC (F94),
GCTTATCATGCATCAGCTTGCCATGGCTCCACAGG (F95),
CCGCCCTCCTGCCGACCTCCTTTGCTGAGC ACC(JI),
CCTGCTTGCTACCTGTGGAGGGTCCCTGACGGG(J2),
CCCAGTTCCCAAAGAAAGGCCTTCTGCTGAACG(J3),
GCATCTGGAGCCCTTGCCCCTCGTCTGTGTGG(J4),
CCTGAGAATGCTCCAGGTGAAGCGGAGAGAGG(J5),
CCTCAGCCATCACTAAGACCCCTGGTTTGTTCAGG(J6) pro in vitro stanovení zlomového místa chromozomální translokace t( 11; 14)(ql3;q32).
7. Sada pro detekci translokace t(ll;14)(ql3;q32) metodou multiplexní PCR dalekého dosahu, vyznačená tím, že obsahuje primery F1 až Fn, kde n je nejvýše 140, komplementární k úsekům oblasti chromozómu 11 v rozsahu -5000 až +420000 baží od počátku transkripce genu CCND1 směrem k centromeře, přičemž úseky této oblasti, k nimž jsou komplementární uvedené primery F1 až Fn, jsou od sebe vzájemně vzdáleny alespoň 1,7 kb, s výhodou 1,7 až 7,6 kb, výhodněji 3,5 až 5,5 kb, a primery F jsou s výhodou číslovány postupně ve směru od počátku transkripce CCND1 k centromeře,
28 ' a primery JI až J6, které jsou komplementární k úsekům oblasti chromozómu 14, v niž leží geny pro J segmenty těžkého řetězce imunoglobulinu, přičemž úsek, k němuž je komplementární primer JI, leží mezi geny IGHJ1 a IGHJ2, úsek, k němuž je komplementární primer J2, leží mezi geny IGHJ2 a 1GHJ3, úsek, k němuž je komplementární primer J3, leží mezi geny IGIIJ3 a IGHJ4, úsek, k němuž je komplementární primer J4, leží mezi geny 1GHJ4 a IGHJ5, úsek, k němuž je komplementární primer J5, leží mezi geny IGHJ5 a IGHJ6 a úsek, k němuž je komplementární primer J6, leží mezi geny IGHJ6 a IGHC.
8. Sada podle nároku 7, vyznačená tím, že obsahuje 95 příměrů F, rozdělených do 12 nádobek tak, že vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je alespoň 15 kb, a 6 primerů J, každý z nich v samostatné nádobce.
9. Sada podle nároku 7, vyznačená tím, že obsahuje 60 primerů F, rozdělených do 10 nádobek tak, že vzdálenost mezi nejbližšími primery F ve stejné reakci je alespoň 15 kb, a 6 primerů J, každý z nich v samostatné nádobce.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100441A CZ302581B6 (cs) | 2010-06-04 | 2010-06-04 | Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100441A CZ302581B6 (cs) | 2010-06-04 | 2010-06-04 | Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010441A3 true CZ2010441A3 (cs) | 2011-07-20 |
| CZ302581B6 CZ302581B6 (cs) | 2011-07-20 |
Family
ID=44278548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20100441A CZ302581B6 (cs) | 2010-06-04 | 2010-06-04 | Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ302581B6 (cs) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1244983B (it) * | 1991-04-29 | 1994-09-13 | Raggio Italgene Spa | Procedimento per rivelare sequenze di acidi nucleici e kit per la sua utilizzazione. |
| JP2007535966A (ja) * | 2004-05-04 | 2007-12-13 | ダコ デンマーク アクティーゼルスカブ | 染色体異常を検出するための方法 |
| US20100124741A1 (en) * | 2008-11-18 | 2010-05-20 | Quest Disgnostics Investments Incorporated | METHODS FOR DETECTING IgH/BCL-1 CHROMOSOMAL TRANSLOCATION |
-
2010
- 2010-06-04 CZ CZ20100441A patent/CZ302581B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ302581B6 (cs) | 2011-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ramaswamy et al. | FISH and chips: the recipe for improved prognostication and outcomes for children with medulloblastoma | |
| Fröhling et al. | Comparison of cytogenetic and molecular cytogenetic detection of chromosome abnormalities in 240 consecutive adult patients with acute myeloid leukemia | |
| Salas et al. | Molecular characterization by array comparative genomic hybridization and DNA sequencing of 194 desmoid tumors | |
| Inoue et al. | Overexpression of PDZK1 within the 1q12-q22 amplicon is likely to be associated with drug-resistance phenotype in multiple myeloma | |
| Kangaspeska et al. | Reanalysis of RNA-sequencing data reveals several additional fusion genes with multiple isoforms | |
| Lange et al. | Detection by enzymatic amplification of bcr-abl mRNA in peripheral blood and bone marrow cells of patients with chronic myelogenous leukemia | |
| US20080312093A1 (en) | Method for detecting cancer and a method for suppressing cancer | |
| Stecklein et al. | Identifying and exploiting defects in the Fanconi anemia/BRCA pathway in oncology | |
| Rifatbegovic et al. | Neuroblastoma cells undergo transcriptomic alterations upon dissemination into the bone marrow and subsequent tumor progression | |
| Burmeister et al. | Evidence-based RT-PCR methods for the detection of the 8 most common MLL aberrations in acute leukemias | |
| Locher et al. | The prognostic value of additional copies of 1q21 in multiple myeloma depends on the primary genetic event | |
| Van Roy et al. | The emerging molecular pathogenesis of neuroblastoma: implications for improved risk assessment and targeted therapy | |
| Takita | Molecular basis and clinical features of neuroblastoma | |
| Fuchs et al. | Identification of twenty-two candidate markers for human osteogenic sarcoma | |
| Aldea et al. | Precision medicine in the era of multi-omics: can the data tsunami guide rational treatment decision? | |
| Pedranzini et al. | Differential cytogenomics and miRNA signature of the Acute Myeloid Leukaemia Kasumi-1 cell line CD34+ 38− compartment | |
| Zerkalenkova et al. | Acute myeloid leukemia with t (10; 11)(p11‐12; q23. 3): Results of Russian Pediatric AML registration study | |
| Wild et al. | Clonal transcriptomics identifies mechanisms of chemoresistance and empowers rational design of combination therapies | |
| CZ2010441A3 (cs) | Zpusob detekce chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32) a oligonukleotidy pro použití pri tomto zpusobu | |
| Ilencikova et al. | MLL Gene Alterations in Acute Myeloid Leukaemia (11q23/MLL+ AML) | |
| Hu et al. | The relationship of REL proto-oncogene to pathobiology and chemoresistance in follicular and transformed follicular lymphoma | |
| Rahimi et al. | Correlation between important genes of mTOR pathway (PI3K and KIT) in Iranian women with sporadic breast cancer | |
| WO2017031230A1 (en) | High-sensitivity sequencing to detect btk inhibitor resistance | |
| Meyer et al. | LDI-PCR: identification of known and unknown gene fusions of the human MLL gene | |
| Nafea et al. | Incidence and prognostic value of NPM1 and FLT3 gene mutations in AML with normal karyotype |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20170604 |