HU215242B - Eljárás anti-szensz anti-mRNS alfa-TNF oligonukleotid-szekvenciák és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents

Eljárás anti-szensz anti-mRNS alfa-TNF oligonukleotid-szekvenciák és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU215242B
HU215242B HU905302A HU530290A HU215242B HU 215242 B HU215242 B HU 215242B HU 905302 A HU905302 A HU 905302A HU 530290 A HU530290 A HU 530290A HU 215242 B HU215242 B HU 215242B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
formula
oligonucleotide
product
nucleotide
sequence
Prior art date
Application number
HU905302A
Other languages
English (en)
Other versions
HU905302D0 (en
HUT56113A (en
Inventor
Abdel Karim Braham
Pierre Smets
René Zalisz
Original Assignee
Hoechst Marion Roussel
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Marion Roussel filed Critical Hoechst Marion Roussel
Publication of HU905302D0 publication Critical patent/HU905302D0/hu
Publication of HUT56113A publication Critical patent/HUT56113A/hu
Publication of HU215242B publication Critical patent/HU215242B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • H—ELECTRICITY
    • H02—GENERATION; CONVERSION OR DISTRIBUTION OF ELECTRIC POWER
    • H02K—DYNAMO-ELECTRIC MACHINES
    • H02K2203/00—Specific aspects not provided for in the other groups of this subclass relating to the windings
    • H02K2203/03—Machines characterised by the wiring boards, i.e. printed circuit boards or similar structures for connecting the winding terminations

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Thin Magnetic Films (AREA)
  • Silver Salt Photography Or Processing Solution Therefor (AREA)
  • Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás anti-szensz anti–mRNS alfa-TNF (I)általánős képletű őligőnűkleőtid-szekvenciák előállítására 5'3' (d)TCATGG TGT CCT TTG CAG – X 118 ahől X jelentése hidrőgénatőm vagy egy 1–17-tagú őligőnűkleőtid, szabadfőrmában, alkilezett főrmában, kénezett főrmában vagy pőli-L-lizin-származéka főrmájában. A találmány kiterjed az (I) általánős képletűőligőnűkleőtidőkat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására is,amelyek fertőzéses endőtőxinős sőkk, illetve a TNF túltermelésébőleredő patőlógiás állapőtők kezelésére alkalmazhatók. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás anti-szensz, anti-mRNS alfaTNF oligonukleotid-szekvenciák előállítására.
Ismeretes, hogy a makrofágok által kiválasztott
TNF (tumor nekrozis faktor) felelős az abszolút metabolikus katasztrófákért, amelyek fertőzéses endotoxin sokkot okoznak. A TNF-termelést leállító anyagok kutatása során jutottunk az anti-szensz, anti-mRNS oligonukleotid-szekvenciákhoz, amelyek leállíthatják a TNF termelését.
A különböző szekvenciák tanulmányozása során úgy találtuk, hogy ezt a tulajdonságot az oligonukleotidnak bizonyos szekvenciája jelenti.
Oligonukleotidok foszfit-triészter-módszerrel történő előállítását az EP-090789 számú dokumentum, míg foszforamidit-módszerrel történő előállítását Μ. H. Caruters et al., Gene Amplif. Anal., 1983(3), 1-26 helyen ismertetik.
A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás antiszensz irányú, anti-mRNS alfa-TNF oligonukleotidjainak új szekvenciái előállítására, amelyek a következő (I) általános képlettel szemléltethetők:
5’ 3’ (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG - X (I)
18 ahol
X jelentése hidrogénatom vagy egy 1-17 tagú oligonukleotid-szekvencia szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában vagy poli-L-lizin származéka formájában.
5’ (d) TCA TGG TGT CCT 1
5’ (d) TCA TGG TGT CCT 1
5’ (d) TCA TGG TGT CCT 1
Az (I) általános képletű termékeket a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy a szintetizálandó lánc 3’helyzetének első, (Π) általános képletű nukleotidját egy hordozón rögzítjük - a képletben Z jelentése 2-20 szénatomos szénhidrogéncsoport, B! az első nukleotidnak megfelelő purin- vagy pirimidin-bázis, amelynek aminocsoportja védett és R jelentése védőcsoport - az 5’-helyzetű hidroxilcsoport védőcsoportját egy savas reagenssel eltávolítjuk, a kapott (III) általános képletű vegyületet, ahol Z és B] jelentése a fenti, a második nukleotid (IV) általános képletű monomerjével reagáltatjuk, ahol R jelentése a fenti, B2 jelentése a második nukleotidnak megfelelő purin- vagy pirimidin-bázis, amelynek amincsoportja védett, Rj egy alkilcsoport vagy egy -OR1! vagy -SR’i-csoport, ahol R’! jelentése védőcsoport, R2 jelentése védőcsoport, a kapott (V) általános képletű vegyületet, ahol R, Rb B] és B2 jelentése a fenti, oxidáljuk, így egy (VI) általános képletű terméket kapunk, ahol R, Rb Bb B2 és Z jelentése a fenti, X, jelentése oxigénAz (I) általános képletben és a leírás további részében az „1-17-tagú oligonukleotid-szekvencia” kifejezésen bármely olyan szekvenciát értünk, amely adenint és guanint (purin bázisok), citozint és timint (pirimidin bázisok) tartalmaz. Az „alkilezett forma” kifejezésen olyan alkilezett származékokat értünk, amelyek a foszfátcsoporton egy alkilcsoportot, közelebbről metil-, etil- vagy propilcsoportot tartalmaznak. Ezek a csoportok jelen lehetnek minden foszfátcsoporton vagy azok egy részén. A „kénezett forma” kifejezésen a foszfonát kénezett származékát értjük, és pedig tioátokat és ditioátokat. Ezek a csoportok jelen lehetnek minden foszfátcsoporton vagy azok egy részén.
A találmány szerinti eljárással előállított termékek közül kiemelhetők azok az (I) általános képletű oligonukleotid-szekvenciák, amelyekben X jelentése hidrogénatom vagy az (IA) képletnek megfelelő szekvencia egésze vagy egy része:
5’ 3’
- CC TCA TGC TTT CAG TAG (IA)
35 szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában vagy poli-L-lizin-származéka formájában.
Ez utóbbiak közül előnyösek azok az (I) általános képletnek megfelelő oligonukleotid-szekvenciák, amelyekben X jelentése hidrogénatom, CC szekvencia vagy az (IA) képletnek megfelelő szekvencia szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában vagy poliL-lizin-származéka formájában, különösen a következő szekvenciák:
3’
CAGCC
3’
CAG
3’
CAG CC TCA TGC TTT CAG TAG 35 vagy kénatom. Ezután a fenti módon a (II) általános képletű termékből ezzel a (VI) általános képletű termékkel és egy új nukleotid monomeijéből új gyűrűt képzünk, a kívánt lánc kialakításához a (VII) általános képletű végső termék előállítása érdekében. A (VII) általános képletben R, Rb Bb B2, X1 és Z jelentése a fenti, Bz jelentése a szekvencia utolsó nukleotidja. Végül az oligonukleotidról a védőcsoportot eltávolítjuk, és a terméket a hordozóról lehasítjuk, így az (I) általános képletű terméket kapjuk, amelyet tisztítunk.
A találmány szerinti eljárást előnyösen a következő körülmények között végezzük:
- a (II) általános képletű termék 5'-helyzetében levő hidroxilcsoportról a védőcsoportot savas reagenssel, például ecetsavval, di- vagy triklór-ecetsavval távolítjuk el;
- a (III) általános képletű tennék és a (IV) általános képletű termék kapcsolását tetrazol segítségével aktiválva, acetonitrilben végezzük;
HU 215 242 Β
- az (V) általános képletű foszfít (VI) általános képletű foszfáttá történő oxidálását jód segítségével oldószerben, előnyösen víz, lutidin és tetrahidrofurán elegyében, vagy víz, piridin és tetrahidrofurán elegyében végezzük;
- az (V) általános képletű foszfít (VI) általános képletű kénezett formába történő oxidálását kén segítségével oldószerben előnyösen szén-dioszulfid, vízmentes piridin és vízmentes trietil-amin elegyében végezzük;
- a szintézis végén az 5’-helyzetben levő terminális hidroxilcsoportról a védőcsoportot savas reagens, például ecetsav, di- vagy triklór-ecetsav segítségével távolítjuk el;
- a (VII) általános képletű oligonukleotidról a védőcsoportokat koncentrált ammónium-hidroxid segítségével a reakcióelegy enyhe melegítése közben távolítjuk el.
Az eljárás fenti műveleteinek elvégzésére előnyösen az Applied Biosystems Model 381A automatikus szintetizálót alkalmazzuk.
A találmány szerinti eljárásban hordozóként szilárd hordozót alkalmazunk, amely lehet szilicium-dioxid vagy porózus üveg. A 208 599 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett hordozók szintén használhatók.
Z jelentése egy -(CH2)n- általános képletű csoport, ahol n értéke 2-20 egész szám. Előnyösek azok a termékek, amelyekben Z jelentése egy -(CH2)2- képletű csoport.
A (II)—(VII) általános képletekben a Bb B2 ... Bz csoport purin- vagy pirimidin-bázis, amelyeknek az amincsoportjai védettek. A védőcsoportok lehetnek például benzoil- vagy izobutilcsoportok. Adenin és citozin esetén előnyös a benzoilcsoport. Guanin esetén előnyös az izobutiril-csoport.
Az 5’-helyzetben levő hidroxilcsoport R védőcsoportja lehet például tritil-, monometoxi-tritil-, dimetoxitritil- vagy pixilcsoport.
A foszfátcsoportok hidroxilcsoportjának R’! védőcsoportja lehet például metil-, ciano-etil-, orto- vagy para-klór-fenil-csoport. Előnyös a ciano-etil-csoport alkalmazása. Az R2 védőcsoport lehet alkilcsoport, például metil-, etil-, izopropil- vagy morfolino- vagy piperidinocsoport. Előnyös az izopropilcsoport.
Az eljárás során a (III) általános képletű tennék azon frakcióját, amely nem reagált el, azonnal észterré alakítjuk azért, hogy a következő kapcsolás során megakadályozzuk a számunkra nem megfelelő szekvencia kialakulását. Ezt az úgynevezett „sapkázási” reakciót előnyösen ecetsav-anhidrid segítségével lutidin és tetra5’ (d) TCA TGG TGT CCT 1
5’ (d) TCA TGG TGT CCT 1
5’ (d) TCA TGG TGT CCT 1 hidroíurán elegyében, katalizátorként dimetil-amino-piridin vagy metil-imidazol jelenlétében végezzük.
Az oligonukleotid-szekvenciák poli-L-lizin-származékai úgy állíthatók elő, hogy egy (VIII) általános képletű terméket - ahol Z, R, B] jelentése a fenti, egy (IV) általános képletű termékkel reagáltatunk, a kapott (IX) általános képletű terméket - ahol R, Z, Rb B, és B2 jelentése a fenti - oxidáljuk, és az aktiválócsoportot és a hordozót lehasítjuk, a kapott (X) általános képletű termék terminális ribóz részét - ahol R, Rb B, és B2 jelentése a fenti, X! jelentése oxigén- vagy kénatom - oxidáljuk, majd Llizinnel reagáltatjuk redukálóközegben, így a (XI) általános képletű terméket kapjuk - ahol R, Rb Bb B2 és X! jelentése a fenti, majd a szintézist a (VI) általános képletű termék képzésénél leírt módon folytatjuk.
A poli-L-lizin-származékok a J. P. Leonetti és munkatársai Gene 72, (1988) 323-332. irodalmi helyen ismert eljáráshoz hasonló eljárással állíthatók elő.
A találmány szerinti eljárással előállított új oligonukleotid-szekvenciák nagyon hasznos farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek, különösen képesek megállítani a sejtek alfa-TNF termelését úgy, hogy specifikusan kapcsolódnak a 166-185 szekvencia cél mRNS-hez, amely átfogja az AUD kodont.
Ezeket a tulajdonságokat a kísérleti részben mutatjuk be.
Ezek a tulajdonságok alkalmassá teszik a találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű új oligonukleotid-szekvenciákat, hogy gyógyszerhatóanyagokként alkalmazzuk.
A találmány tárgya tehát továbbá eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek hatóanyagként az (I) általános képletű, alfa-TNF ellentétes irányú, antimRNS új oligonukleotid-szekvenciáit tartalmazzák, a képletben X jelentése hidrogénatom, egy 1-17-tagú oligonukleotid-szekvencia szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában vagy poli-L-lizin-származéka formájában. Különösen előnyösek azok az (I) általános képletű vegyületek, ahol X jelentése hidrogénatom vagy az (IA) szekvencia egésze vagy annak egy része, szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában, vagy poli-L-lizin-származéka formájában.
A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények közül különösen előnyösek azok, amelyek olyan fenti oligonukleotid-szekvenciát tartalmaznak, ahol X jelentése hidrogénatom, -CC szekvencia vagy az (IA) szekvencia, szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában vagy poli-L-lizin-származéka formájában. Különösen előnyösek azok a gyógyszerkészítmények, amelyek a következő oligonukleotid-szekvenciákat tartalmazzák:
3’
CAG CC 20
3’
CAG
3’
CAG CC TCA TGC TTT CAG TAG 35
HU 215 242 Β szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában vagy poli-L-lizin-származék formájában.
A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények mindenfajta eredetű fertőzéses endotoxin sokk, illetve az alfa-TNF hiperszekréciójával kapcsolatos patológiás állapot kezelésére alkalmazhatók.
Az alkalmazott dózis az alkalmazott terméktől, a kezelt személytől és a kérdéses betegségtől függően változik, például 1 pg és 30 mg között változhat naponta intravénás úton adagolva embernek.
A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények hatóanyagként legalább egy (I) általános képletű új oligonukleotid-szekvenciát tartalmaznak. Ezek lehetnek szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában vagy poli-L-lizin-származékok formájában. A gyógyszerkészítmények elkészíthetők emészthető, parenterális vagy helyi kezelésre szánt formában.
A gyógyszerkészítmények lehetnek például szilárd vagy folyékony formájúak a humán gyógyászatban alkalmazott szokásos formáknak megfelelően, így például sima vagy cukorral bevont tabletták, kapszulák, granulátumok, kúpok vagy injektálható készítmények vagy aeroszolok formájában, amelyek szokásos módszerrel állíthatók elő. A készítmények a hatóanyag mellett az ilyen gyógyszerkészítményekben szokásosan alkalmazott segédanyagokat és vivőanyagokat tartalmazhatják, így például talkumot, gumiarábikumot, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátot, kakaóvajat, vizes vagy nemvizes vivőanyagot, állati vagy növényi eredetű zsiradékot, paraffmszármazékokat, glikolokat, különböző nedvesítő-, diszpergáló- vagy emulgeálószereket és konzerválószereket.
A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa
5’ 3’ (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG szekvencia (18 mer anti-alfa-TNF) szabad formában
Berendezés:
,,Applied Biosystems Model 381 A” automata szintetizálót alkalmazunk. A berendezést feltöltjük a szükséges reagensekkel. A (IV) képletű terméket enyhe argon túlnyomás alatt oldjuk acetonitrilben, ami lehetővé teszi az automatikus adagolást az elektromos szelepek nyitásával akkor és úgy, ahogyan szükséges.
Rögzítjük a szintetizálandó nukleotid-szekvenciát, és jelezzük az előállítandó termék mennyiségét.
A végső detritilezést úgy programozzuk, hogy az (I) általános képletű terméket az 5’-helyzetben hidroxilezett formában vagy tritilezett formában kapjuk meg.
Egy kis, előzőleg a (II) képletű fünkcionalizált hordozót tartalmazó oszlopot helyezünk a berendezésbe (CPG porózus üveg hordozó).
A szintézist ezután végig lefolytatjuk kézi közbeavatkozás nélkül.
A detritilező oldatokat automatikusan visszanyerjük minden lépésben egy, a berendezéshez kapcsolt frakciógyűjtőben, így minden lépés kitermelése mérhetővé válik.
Reagensek:
Minden használt reagensnek nagyon tisztának kell lennie.
A (IV) általános képletű 4-foszforamiditet (B2 jelentése adenin, citozin, guanin vagy timin) kis üvegekbe helyezzük. A berendezésbe történő helyezés előtt a szükséges mennyiségű oldószert adagolni kell.
A berendezésbe a következő további oldatokat helyezzük:
- 4% tetrazol acetonitrilben a kapcsolás aktiválásához,
- ecetsav-anhidrid, lutidin és tetrahidrofurán 1:1:8 térfogatarányú elegye egyrészt, másrészt dimetil-amino-piridin és tetrahidrofurán 7:93 térfogatarányú elegye helyben összekeverve a „sapkázó” reakcióhoz,
-jód, víz, lutidin és tetrahidrofurán 3:2:2:93 térfogatarányú elegye az (V) általános képletű foszfit (VI) általános képletű foszfáttá történő oxidációjához,
- 2% triklór-ecetsav diklór-metánban a detritilezési reakcióhoz,
- tiszta acetonitril a foszforamiditek oldásához.
Módszer:
A reakciót 0,95 pmol mennyiségben hajtjuk végre. A terméket a berendezésben detritilezzük a szintézis végén.
A tiszta termék kitermelése a szintézisben 79%.
A (VII) általános képletű termékről a védőcsoportokat a következőképpen távolítjuk el:
- 28% ammónium-hidroxid 1 óra hosszat szobahőmérsékleten,
- telített ammónium-hidroxid (60 °C, 5 óra).
Tisztítás:
- sótalanítás NAP 10 (Pharmacia) Sephadex G50R oszlopon,
- HPLC Partisii 10 SAXR oszlopon.
A oldat 50-99%-ig változó gradiense A és B oldat elegyében 20 percig
A: 0,3 mol/l-es foszfát-puffer és metil-cianid 7:3 arányú elegye, pH = 6,2.
B: 10~3 mol/l-es foszfát-puffer és metil-cianid 7:3 arányú elegye, pH = 6,2.
átfolyási arány 2 ml/perc.
- sótalanítás NAP 25 (Pharmacia) Sephadex G50R oszlopon.
A tisztított termék analízise:
- HPLC Partisii 10 SAXR oszlopon, ugyanolyan körülmények között, mint fent, R, = 13,92 perc.
- HPLC inverz fázisú microbondapack C18R oszlopon, 8,4%-tól 15%-ig változó metil-cianid gradiens 10~1 2 mol/l-es trietil-ammónium-acetátban, pH = 5,5, 20 percig, átfolyási arány 2 ml/perc, Rt = 12,12 perc.
Végül 0,125 pmol tiszta terméket kapunk, kitermelés 13%.
2. példa
5’ 3’ (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG szekvencia (18 mer,anti-alfa-TNF) tioát formában
HU 215 242 Β
Az 1. példa szerinti módon járunk el, azonban a jóddal végzett oxidálási lépést kénnel 450 másodpercig végzett oxidálással helyettesítjük, így a cím szerinti terméket kapjuk.
A jóddal végzett oxidálás helyett, amelyben jód, víz, lutidin és tetrahidrofurán elegyét alkalmazzuk, kénnel végzett oxidálást végzünk, amelynek során a következő oldatot alkalmazzuk:
g kén
28,5 ml szén-diszulfid
28,5 ml vízmentes piridin ml vízmentes trietil-amin.
Kénnel végzett oxidálás esetén elengedhetetlenül fontos az oszlopot az oxidálás előtt és után ismételten mosni szén-diszulfid és piridin 1:1 arányú elegyével a kénmaradék eltávolítása céljából.
Az eljárás többi része változatlan.
Szintézis kitermelése: 1,24 μιηοΐ 56,5%.
Védőcsoport-eltávolítás:
- 28% ammónium-hidroxid, 1 óra, szobahőmérséklet
- telített ammónium-hidroxid, egy éjszakán át, 50 °C-on.
Tisztítás:
- sótalanítás NAP 25 (Sephadex)R oszlopon, eluálószer: víz.
- HPLC microbondapack Cl 8R oszlopon, R, = 24,46, A oldat 30%-tól 50%-ig változó gradiens 20 percen át, átfolyási arány 2 ml/perc
A: 10~2 mol/1 trietil-ammónium-acetát, pH = 5,5 és metil-cianid 7:3 arányú elegye,
Β: 102 mol/1 trietil-ammónium-acetát, pH = 5,5.
Tiszta termék kitermelése: 40,3%.
3. példa
5’ 3’ (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC szekvencia (20 mer anti-alfa-TNF) szabad formában
Az eljárást az 1. példa szerinti módon végezzük.
4. példa
5’ (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC TCA TGC 3’
TTT CAG TAG szekvencia (35-mer anti-alfa-TNF) szabad formában
A terméket az 1. példa szerinti módon állítjuk elő.
5. példa
Injektálható oldatot készítünk a következő összetétellel:
- 1. példa terméke 10 pg
- steril injekciós víz 2 ml
6. példa
Tablettákat készítünk a következő összetétellel:
- 2. példa terméke 20 pg
- tablettázási segédanyagok 100 mg-ig (Segédanyagok: laktóz, keményítő, talkum, magnézium-sztearát).
7. példa
Injektálható oldatot készítünk a következő összetétellel:
- 3. példa terméke 10 pg
- steril vizes vivőanyag 2 ml
A 3. példa szerint előállított oligonukleotid-szekvencia vizsgálata
1. Biológiai teszt
- Humán monocitákat (4χ106 sejt) inkubálunk 6 pmol ellentétes irányú oligonukleotiddal, 4 formában 3 óra hosszat.
- Hozzáadunk 10 pg/ml LPS-t és 5χ103 egység/ml INF-t.
-18 óra hosszat inkubálunk.
- A tenyészet felülúszóját elválasztjuk.
- A felülúszót TNF (L 929) által okozott lízisre érzékeny sejtekhez adjuk, és 24 óra hosszat reagáltatjuk.
- Mérjük sejtek életképességét, kristályibolya segítségével, kolorimetriásan.
2. Immunológiai teszt
- Humán monocitákat (4*106 sejt) 6 pmol ellentétes irányú oligonukleotiddal inkubálunk 4 formában, 3 óra hosszat.
-Hozzáadunk 10 pg/ml LPS-t és 5X1O3 egység/ml INF-t a TNF termelésének stimulálására.
- 18 óra hosszat inkubálunk.
- A tenyészet felülúszóját elválasztjuk.
- Bevonatot készítünk ezzel a tenyészet felülúszójával.
- Jóddal jelzett (RIA-hoz), illetve enzimmel jelzett (ELISA-hoz) anti-TNF antitestet adunk hozzá.
- 3 óra hosszat inkubálunk.
Leolvasások:
a) Hozzáadjuk az enzim-szubsztrátot (ELISA) és leolvassuk az optikai sűrűséget.
b) Mérjük a radioaktivitást (RIA).
- Mérjük a monociták által termelt TNF mennyiségét.
- Számoljuk a TNF-termelés gátlásának értékét.
- Eredmények:
Anti-szensz oligonukleotidokkal kezelt monociták által termelt alfa-TNF gátlási értéke.
Gátlási érték:
V/ml oligonukleotid jelenlétében
1------χ 100 = 63,5±9.
V/ml oligonukleotid hiányában

Claims (9)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás anti-szensz, anti-mRNS alfa-TNF (I) általános képletű oligonukleotid-szekvenciák előállítására
    5’ 3’ (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG - X (I)
    1 18 ahol
    X jelentése hidrogénatom, vagy egy l-I7-tagú oligonukleotid, szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában vagy poli-L-lizin-származéka formájában,
    HU 215 242 Β azzal jellemezve, hogy a szintetizálandó lánc 3'-helyzetében levő első, (II) általános képletű nukleotidot egy hordozón rögzítünk, ahol Z jelentése 2-20 szénatomos szénhidrogéncsoport, Bj jelentése az első nukleotidnak megfelelő purin- vagy pirimidin-bázis, amelynek aminocsoportja védett, R jelentése védőcsoport, az 5’helyzetben levő hidroxilcsoportról a védőcsoportot egy savas reagenssel eltávolítjuk, így egy (III) általános képletű terméket kapunk, ahol Z és Bt jelentése a fenti, amelyet a második nukleotid (IV) általános képletű monomerjével reagáltatunk, ahol R jelentése a fenti, B2 jelentése a második nukleotidnak megfelelő purin- vagy pirimidinbázis, amelynek amincsoportja védett, R! jelentése alkilcsoport vagy -OR’! vagy -SR’i általános képletű csoport, ahol R’j jelentése védőcsoport, R2 jelentése védőcsoport, a kapott (V) általános képletű terméket, ahol R, Rb B| és B2 jelentése a fenti, oxidáljuk, így egy (VI) általános képletű terméket kapunk, ahol R, Rb B], B2 és Z jelentése a fenti, X| jelentése oxigénvagy kénatom, majd a fenti módon a (II) általános képletű termékből kiindulva a (VI) általános képletű termékkel és új nukleotid monomerrel az eljárást a végső, (VII) általános képletű lánc kialakításáig folytatjuk, ahol R, Rj, Β], B2, X] és Z jelentése a fenti, Bz jelentése a szekvencia utolsó nukleotidja, majd az oligonukleotidról a védőcsoportokat eltávolítjuk, és a hordozót lehasítjuk, és a kapott (I) általános képletű terméket tisztítjuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy
    - a (II) általános képletű termék 5'-helyzetében levő hidroxilcsoportról a védőcsoportot egy savas reagenssel, előnyösen ecetsavval, di- vagy triklór-ecetsavval hasítjuk le,
    - a (III) általános képletű termék és a (IV) általános képletű termék kapcsolási reakcióját tetrazollal aktiváljuk, és acetonitrilben hajtjuk végre,
    - az (V) általános képletű foszfit (VI) általános képletű foszfáttá történő oxidálását jód segítségével oldószerben, előnyösen víz, lutidin és tetrahidrofurán elegyében vagy víz, piridin és tetrahidrofurán elegyében hajtjuk végre,
    - az (V) általános képletű foszfit (VI) általános képletű kénezett formává történő oxidálását kén segítségével, oldatban, előnyösen szén-diszulfid, vízmentes piridin és vízmentes trietil-amin elegyében hajtjuk végre,
    - a szintézis végén az 5'-helyzetben levő terminális hidroxilcsoportról a védőcsoportot savas reagens, előnyösen ecetsav, di- vagy triklór-ecetsav segítségével távolítjuk el,
    - a (VII) általános képletű oligonukleotidról a védőcsoportokat koncentrált ammónium-hidroxid segítségével, a reakcióközeg enyhe melegítésével távolítjuk el.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű oligonukleotid-szekvenciák poli-L-lizin-származékainak előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (VIII) általános képletű vegyületet, ahol Z, R, Bj jelentése a fenti, egy (IV) általános képletű vegyülettel reagáltatunk, a kapott (IX) általános képletű terméket, ahol R, Z, Rb B! és B2 jelentése a fenti, oxidáljuk, és az aktiválócsoportot és a hordozót lehasítjuk, a kapott (X) általános képletű termék terminális ribóz-részét oxidáljuk, ahol R, Rb Bj és B2 jelentése a fenti, majd redukálóközegben L-lizinnel reagáltatjuk, a kapott (XI) általános képletű termékkel, ahol R, Rb Bb B2 és X[ jelentése a fenti, a szintézist a (VI) általános képletű vegyülettől kezdődő módon folytatjuk.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan (I) általános képletű oligonukleotid-szekvencia előállítására, ahol a szintetizálandó első nukleotid X jelentése hidrogénatom esetén a végső szekvencia első nukleotidja vagy az (IA) képletű szekvencia egy nukleotidja:
    - CC TCA TGC TTT CAG TAG (IA)
    19 35 szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában vagy poli-L-lizin-származéka formájában, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
  5. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan (I) általános képletű oligonukleotid-szekvenciák előállítására, ahol a szintetizálandó lánc 3’-helyzetében levő első nukleotid a -CC szekvencia vagy az (IA) képletű szekvencia első nukleotidja, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás
    5’ 3’ (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC 1 20 szekvenciával rendelkező oligonukleotid előállítására szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában vagy poli-L-lizin-származéka formájában, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
  7. 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás
    5’ 3’ (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG 1 18 szekvenciával rendelkező oligonukleotid előállítására szabad formában, alkilezett formában, kénezett formában vagy poli-L-lizin-származéka formájában, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
  8. 8. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás
    5’ 3’ (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC TCA TGC TTT CAG TAG
    1 35 szekvenciával rendelkező oligonukleotid előállítására vagy poli-L-lizin-származéka formájában, azzal jellemezszabad formában, alkilezett formában, kénezett formában 60 ve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
    HU 215 242 Β
    10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely, a 2-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított oligonukleotidszekvenciát alkalmazunk.
  9. 9. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (I) általános képletű oligonukleotid-szekvenciát, ahol X jelentése az 1. igénypont szerinti, a gyógyszerkészítésben szokásos vivő- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
HU905302A 1989-08-23 1990-08-23 Eljárás anti-szensz anti-mRNS alfa-TNF oligonukleotid-szekvenciák és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására HU215242B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8911171A FR2651130B1 (fr) 1989-08-23 1989-08-23 Sequence d'oligonucleotides anti-sens, anti-arn message du tnf alpha, procede de preparation, application a titre de medicaments et compositions pharmaceutiques.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU905302D0 HU905302D0 (en) 1991-02-28
HUT56113A HUT56113A (en) 1991-07-29
HU215242B true HU215242B (hu) 1998-11-30

Family

ID=9384878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU905302A HU215242B (hu) 1989-08-23 1990-08-23 Eljárás anti-szensz anti-mRNS alfa-TNF oligonukleotid-szekvenciák és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5705389A (hu)
EP (1) EP0414607B1 (hu)
JP (1) JPH0391485A (hu)
KR (1) KR0151153B1 (hu)
CN (1) CN1028760C (hu)
AT (1) ATE120201T1 (hu)
AU (1) AU642423B2 (hu)
CA (1) CA2023899C (hu)
DE (1) DE69017983T2 (hu)
DK (1) DK0414607T3 (hu)
ES (1) ES2069715T3 (hu)
FR (1) FR2651130B1 (hu)
GR (1) GR3015527T3 (hu)
HU (1) HU215242B (hu)
IE (1) IE68592B1 (hu)
IL (1) IL95342A (hu)
PT (1) PT95067B (hu)
RU (1) RU2066325C1 (hu)
ZA (1) ZA906675B (hu)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9399061B2 (en) 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
US9546212B2 (en) 2001-06-08 2017-01-17 Abbvie Biotechnology Ltd. Methods of administering anti-TNFα antibodies

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1250722B (it) * 1991-07-30 1995-04-21 Univ Degli Studi Milano Oligonucleotidi antisenso
TW323284B (hu) * 1992-03-23 1997-12-21 Novartis Ag
WO1994018325A1 (en) * 1993-02-03 1994-08-18 N.V. Innogenetics S.A. Tnf-alpha muteins and a process for preparing them
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
WO1999027086A1 (en) * 1997-11-25 1999-06-03 Brax Group Limited Chimeric antisense oligonucleotides against tnf-alpha and their uses
US20020077276A1 (en) * 1999-04-27 2002-06-20 Fredeking Terry M. Compositions and methods for treating hemorrhagic virus infections and other disorders
US20040006036A1 (en) * 2000-04-12 2004-01-08 Gmr, A Delaware Corporation Silencing transcription by methylation
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
EP2371859A3 (en) * 2002-07-19 2011-12-28 Abbott Biotechnology Ltd Treatment of TNF alpha related disorders
US20060083741A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-20 Hoffman Rebecca S Treatment of respiratory syncytial virus (RSV) infection
AU2006246721B2 (en) 2005-05-16 2012-12-13 Abbvie Biotechnology Ltd Use of TNF inhibitor for treatment of erosive polyarthritis
US20070041905A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
US20080118496A1 (en) * 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
US9624295B2 (en) 2006-04-10 2017-04-18 Abbvie Biotechnology Ltd. Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
WO2008154543A2 (en) 2007-06-11 2008-12-18 Abbott Biotechnology Ltd. Methods for treating juvenile idiopathic arthritis
CN101235064B (zh) * 2008-02-27 2011-08-10 东南大学 可脱保护的硫代核苷酸单体

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0090789A1 (en) * 1982-03-26 1983-10-05 Monsanto Company Chemical DNA synthesis
US4959314A (en) * 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
FR2584090B1 (fr) 1985-06-27 1987-08-28 Roussel Uclaf Nouveaux supports, leur preparation et les intermediaires obtenus, leur application a la synthese d'oligonucleotides et les nouveaux nucleosides et oligonucleotides relies aux supports ainsi obtenus
WO1988006625A2 (en) * 1987-02-26 1988-09-07 Cetus Corporation Arginine-depleted human tumor necrosis factor
WO1990000624A1 (en) * 1988-07-05 1990-01-25 Baylor College Of Medecine Antisense oligonucleotide antibiotics complementary to the macromolecular synthesis operon, methods of treating bacterial infections and methods for identification of bacteria

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9546212B2 (en) 2001-06-08 2017-01-17 Abbvie Biotechnology Ltd. Methods of administering anti-TNFα antibodies
US9399061B2 (en) 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis

Also Published As

Publication number Publication date
CA2023899C (fr) 2002-05-14
JPH0391485A (ja) 1991-04-17
CA2023899A1 (fr) 1991-02-24
KR910004198A (ko) 1991-03-28
RU2066325C1 (ru) 1996-09-10
FR2651130A1 (fr) 1991-03-01
IL95342A0 (en) 1991-06-30
PT95067B (pt) 1997-05-28
ZA906675B (en) 1991-10-30
AU642423B2 (en) 1993-10-21
DK0414607T3 (da) 1995-06-06
EP0414607A3 (en) 1991-04-03
AU6119090A (en) 1991-02-28
ATE120201T1 (de) 1995-04-15
IL95342A (en) 1995-01-24
CN1028760C (zh) 1995-06-07
HU905302D0 (en) 1991-02-28
IE68592B1 (en) 1996-06-26
DE69017983D1 (de) 1995-04-27
GR3015527T3 (en) 1995-06-30
IE903036A1 (en) 1991-02-27
FR2651130B1 (fr) 1991-12-13
EP0414607A2 (fr) 1991-02-27
ES2069715T3 (es) 1995-05-16
KR0151153B1 (ko) 1998-08-17
DE69017983T2 (de) 1995-09-28
HUT56113A (en) 1991-07-29
CN1049668A (zh) 1991-03-06
PT95067A (pt) 1991-04-18
US5705389A (en) 1998-01-06
EP0414607B1 (fr) 1995-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU215242B (hu) Eljárás anti-szensz anti-mRNS alfa-TNF oligonukleotid-szekvenciák és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
US5614622A (en) 5-pentenoyl moiety as a nucleoside-amino protecting group, 4-pentenoyl-protected nucleotide synthons, and related oligonucleotide syntheses
US8138330B2 (en) Process for the synthesis of oligonucleotides
AU777049B2 (en) Xylo-LNA analogues
EP0759927B1 (en) Pteridine nucleotide analogs as fluorescent dna probes
US5278043A (en) Ruthenium-lumazine energy transfer systems
KR101032008B1 (ko) 폴리뉴클레오티드 표지 시약
JP3186795B2 (ja) 末端３′−３′または５′−５′ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチド類似体
EP0843684B1 (en) Universal solid supports and methods for their use
MXPA96004355A (en) Oligonucleotides and used modified intermediaries in nucleic acids therapeuti
JPH0714954B2 (ja) ヌクレオチド架橋試薬として使用するためのクマリン誘導体
JP4398517B2 (ja) 新規な３′−変性されたオリゴヌクレオチド誘導体
CA2089668A1 (en) Oligo (alpha-arabinofuranosyl nucleotides) and alpha-arabinofuranosyl precursors thereof
JPH02503146A (ja) ヌクレオチドプローブ用非ヌクレオチド連結試薬
US5623068A (en) Synthesis of DNA using substituted phenylacetyl-protected nucleotides
KR101437824B1 (ko) 올리고뉴클레오티드의 합성
JPH0665280A (ja) 蛍光標識化合物、その調製法および使用
JP2000506849A (ja) オリゴヌクレオチド類似体
JP2835630B2 (ja) 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成
JPH02502283A (ja) ヌクレオチド・プローブのアクリジニウムエステル標識および精製
Seela et al. Phosphoramidites of base-modified 2′-deoxyinosine isosteres and solid-phase synthesis of d (GCI* CGC) oligomers containing an ambiguous base
Guzaev et al. Solid support synthesis of ester linked hydrophobic conjugates of oligonucleotides
US6531589B1 (en) Base protecting groups and synthons for oligonucleotide synthesis
CA2196306A1 (en) Sequence-specific binding oligomers for nucleic acids and their use in antisense strategies
US6509459B1 (en) Base protecting groups and rapid process for oligonucleotide synthesis

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: HOECHST MARION ROUSSEL, FR

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: AVENTIS PHARMA S.A., FR