PT95067B - Processo para a preparacao da sequencia de oligonucleotidos anti-sentido,anti-arn mensageiro do tnf (factor da necrose de tumor)alfa - Google Patents

Processo para a preparacao da sequencia de oligonucleotidos anti-sentido,anti-arn mensageiro do tnf (factor da necrose de tumor)alfa Download PDF

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Description

DESCRIÇÃOA presente invenção refere-se a um processo pa ra preparação de novas sequências de oligonucleõtidos anti-senti do, anti-ARN mensageiro do TNF alpha.
Sabe-se que o TNF (Tumor Necrosis Factor) segregado pelos macrófagos e responsável por verdadeiros desastres metabólicos que podem originar um choque endotõxinico infeccioso Ao pretender-se bloquear a fonte de produção do TNF, os inventores foram levados a investigar as sequências de oligonucleõtidos anti-sentido, anti-ARN mensageiro que pudessem desse modo bloque ar a produção do TNF.
Ao estudar diversas sequências, os investigado res descobriram que existia uma sequência particular de oligonucleõtidos que apresentava essa propriedade.
Deste modo, a presente invenção tem por objectivo proporcionar um processo para a preparação de uma nova sequência de oligonucleõtidos anti-sentido, anti-ARN mensageiro do
TNF alpha, possuindo a estrutura de formula (I) seguinte.
5' 3’ (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG - X (I)
18 na qual X representa um átomo de hidrogénio, ou uma sequência de 1 a 17 oligonucleõtidos, sob uma forma livre, sob uma forma alquilada, sob uma forma sulfurada ou sob uma forma de um derivado da poly-L-lisina.
A terminologia válida para a fórmula geral (I) e para a presente memória descritiva ê a seguinte:
-Uma sequência de 1 a 17 oligonucleõtidos ê qualquer sequência que contenha adenina e gianina (bases puricas) , citosina e timina (bases pirimidicas):
-Uma forma alquilada significa derivados alqui. lados que possuam grupos alquilo sobre o radical fosfato e designadamente os grupos metilo, etilo ou propilo. Estes grupos po dem estar presentes em todos ou em parte dos radicais fosfato.
-Uma forma sulforada significa os derivados sulforados sob o radical fosfato, designadamente os tioatos e os ditioatos. Estes grupos podem estar presentes em todos ou em par te dos radicais fosfato.
Entre os compostos obtidos de acordo com o pro cesso da presente invenção ê possível referir as sequências de oligonucleõtidos correspondentes à formula geral (I) anteriormen te referida, na qual se representa um átomo de hidrogénio ou a totalidade ou apenas uma parte da sequência de fórmula (1^):
5' 3'
- CC TCA TGC TTT CAG TAG (1^)
35
Sob uma forma livre, sob uma forma alquilada, sob uma forma sulforada ou sob a forma de um derivado da poly-L-lisina.
Entre estes últimos dã-se preferência às se2
quências de oligonucleõtidos de fórmula geral (I) anteriormente referida, na qual X representa um ãtomo de hidrogénio, uma sequência de fõrmula-CC ou a sequência de fórmula (1^), sob uma forma livre, sob uma forma alquilada, sob uma forma sulforada ou sob a forma de um derivado da poly-L-lisina e designadamente as sequências seguintes:
5' 3' (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC
20
5' 3’ (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG
18
5’ 3'
TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC TCA TGC TTT CAG TAG
35 processo para a preparação dos compostos de fórmula geral (I), que constitui o objectivo da presente invenção, caracteriza-se pelo facto de se imobilizar sobre um suporte S o primeiro nucleótido em 31 da cadeia a sintetizar de fórmula:
na qual S representa o suporte, Z representa um grupo hidrocarboneto possuindo entre 2 e 20 ãtomos de carbono, B^ representa uma base púrica ou pirimidica correspondente ao primeiro nucleõtido cuja função amina ê protegida e R representa um grupo protector, em desbloquear o grupo hidróxilo em 5' utilizando um ácido reactivo para proporcionar o composto de fórmula:
I
na qual os símbolos S, Z e possuem as significações anteriormente definidas, e fazendo reagir depois este último com o monómero do segundo nucleótido de fórmula:
na qual o símbolo R possui as significações re feridas antes, Bg representa uma base púrica ou pirimidica correspondente ao segundo nucleõtido cuja função amina ê protegida.
I representa um radical alquilo ou um grupo -OR'^ ou -SR no qual R i representa um grupo protector, Rg representa um grupo protector, para proporcionar um composto de fórmula:
protegido (V)
Aw\(S na qual os símbolos SzRrR-^ e Bg possuem as significações definidas antes, e depois oxida-se o composto de formula (V) obtido de modo a proporcionar um composto de formula
(VI)
Λζάζκ (S na qual os símbolos S,R,R^,B^,B2 e Z possuem as significações definidas antes e X^ representa um ãtomo de oxi gênio ou de enxofre, e depois, tal como anteriormente, a partir do composto de formula (II) efectua-se um novo ciclo com um composto de fórmula (VI) e com o monõmero de um novo nucleõtido atê se obter um cadeamento desejado, para finalmente proporcionar um composto de fórmula:
°“\/°\ /Β1ΡΓ^· γ \/ gid
3’ *vvu(S
na qual os símbolos S,R,R^,B^,B2,X^ e Z possuem as significações definidas antes e o símbolo Bz representa o ultimo nucleõtido da sequência, e depois faz-se a desprotecção do oligonucleótido, separa-se do suporte e purifica-se o composto de fórmula (I) assim obtido.
De acordo com as condições preferenciais de realização da presente invenção, o processo de preparação anteriormente descrito caracteriza-se por:
-se desbloquear o grupo hidróxilo na posição 51 do composto de fórmula (II) utilizando um ãcido reactivo tal como o ãcido acético, e o ãcido di- ou tri-cloro-acêtico,
- se activar a reacção de acoplamento do composto de fórmula (III) com o composto de fórmula (IV) utilizando tetrazol e recorrendo ao acetonitrilo,
-se efectuar a oxidação do fosfito de fórmula (V) de modo a obter-se um fosfato de fórmula (VI) utilizando iodo em solução numa mistura de ãgua/lutidina/tetra-hidrofurano ou numa mistura de ãgua/piridina/tetra-hidrofurano,
-se efectuar a oxidação do fosfito de fórmula (V) para proporcionar a forma sulforada (VI) utilizando enxofre em solução numa mistura de sulforeto de carbono, piridina e trie til-amina anidra,
-na fase final da sintese efectua-se a desprotecção do grupo hidróxilo terminal em 5’ utilizando um ãcido tal como o ãcido acético, ou o ãcido di- ou tri-cloro-acetico,
-efectua-se a desprotecção do oligonucleótido de fórmula (VII) utilizando amoníaco concentrado e aquecendo sua vemente o meio de reacção.
Para a realização do processo anteriormente descrito, utiliza-se preferencialmente o sintetizador automático Applied Biosystems Modele 381A.
De acordo com o processo da presente invenção, o suporte S e um suporte sólido que pode ser constituido por sílica ou por vidro poroso. Também é possível recorrer à utilização dos suportes descritos na patente europeia N9 0 208 599.
De acordo com a presente invenção, o radical Z representa um grupo hidrocarbonado -(CH2) - no qual n representa
um número inteiro compreendido entre 2 e 20. Utiliza-se preferen cialmente os compostos em que Z representa um radical
Nas fórmulas (II) a (VII), as bases B^, B2·...
B são bases puricas ou pirimidicas cujas funções amina estão z protegidas. Os grupos protectores podem ser, por exemplo, os gru pos benzoilo ou isobutirilo. No caso da adenina e da citosina utiliza-se preferencialmente o grupo benzoilo. No caso da guanina utiliza-se preferencialmente o grupo isobutirilo.
O grupo protector R da função hidroxilo em 51 e, por exemplo, um radical tritilo, mono-metoxi-tritilo, dimetoxi-tritilo ou pixilo.
O grupo protector R'^ das funções hidroxilo dos grupos fosfato pode ser constituido por exemplo, por um radical metilo, ciano - etilo, orto - ou para - cloro - fenilo. Utiliza-se preferencialmente o grupo ciano-etilo. O grupo protec tor R2 pode ser constituido por um radical alquilo tal como o me tilo, o etilo, o isopropilo ou por um radical morfolino ou piperidino. Utiliza-se preferencialmente o grupo isopropilo.
De acordo com o processo da presente invenção, a fracção do produto de fórmula (III) que não tenha reagido ê transformada imediatamente em ester para evitar a formação de uma sequência inconveniente para o acoplamento seguinte. Esta reacção de Remoção do excesso efectua-se preferencialmente uti lizando anidrido acético numa mistura de lutidina/tetra-hidrofurano e ê catalizada pela dimetil-amino-piridina ou pelo metil-imidazol.
Os derivados da poli-L-lisina das sequências dos oligonucleótidos anteriormente referidos, podem ser preparados por um processo que se caracteriza pelo facto de se fazer re agir um composto de fórmula (VIII):
na qual os símbolos S,Z,R,Bb possuem as significações anteriormente referidas, com um composto de fórmula IV, para proporcionar um composto de fórmula (IX):
3ΧΜ na qual os símbolos S,R,Z,Rb,B^ e B% possuem as significações anteriormente definidas, e depois oxida-se, elimina-se o suporte e o grupo activador para se obter um composto de fórmula (X).
B2 protegido
na qual os símbolos R,R^Bb e B2 possuem as significações anteriormente definidas, X^ representa um ãtomo de oxigénio ou de enxofre, oxida-se a ribose terminal e depois faz-se reagir com a L-lisina em meio redutor para proporcionar um composto de fórmula (XI):
resíduo poli-L-lisina
na qual os símbolos Η,Η^,Β^,Β^ e X^ possuem as significações anteriormente definidas, e depois termina-se a sintese tal como no início do composto de fórmula (VI).
Os derivados da poly-L-lisina podem ser preparados designadamente utilizando um processo análogo ao descrito por J.P.LEONETTI e coll. GENE 72 (1988) 323-332.
As novas sequências de oligonucleõtidos obtidas de acordo com o processo da presente invenção possuem propri edades farmacológicas muito interessantes; possuem particularmen te a capacidade de bloquear a produção do TNF alfa pelas células fixando-se especificamente sobre o ARN mensageiro de estrutura correspondente â sequência (166-185) que se encontra sobreposta ao codão AUG.
Estas propriedades encontram-se ilustradas mais adiante na parte experimental.
Estas propriedades justificam a utilização das novas sequências de oligonucleõtidos anteriormente definidas em conformidade com a fórmula (I), como medicamentos.
Entre os medicamentos de acordo com a presente invenção é possível referir as sequências de oligonucleõtidos anti-sentido, anti-ARN mensageiro do TNF alfa, que possuem a fór mula (I) seguinte:
5' 3' (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG - X
18 na qual X representa um ãtomo de hidrogénio, ou uma sequência de 1 a 17 oligonucleõtidos, sob uma forma livre sob uma forma alquilada, sob uma forma sulforada ou sob a forma de um derivado da poly-L-lisina, e particularmente as sequências que possuem a fórmula (I) anteriormente referida na qual X representa um ãtomo de hidrogénio ou a totalidade ou uma parte da sequência de fórmula (I ):
5' 3’
- CC TCA TGC TTT CAG TAG (I,) /λ.
35
sob uma forma livre, sob uma forma alquilada, sob uma forma sulforada ou sob a forma de um derivado da poli-L-lisina.
Entre os medicamentos de acordo com a presente invenção dã-se preferência particular aos que incorporam as sequências de oligonucleõtidos anteriormente definidas, nas-quais X representa um átomo de hidrogénio, uma sequência de fórmula -CC ou a sequência de fórmula (1^), sob uma forma livre, sob uma forma alquilada, sob uma forma alquilada, sob uma forma sulforada ou sob a forma de um derivado da poli-L-lisina e mais particularmente, os oligonucleõtidos que possuem a fórmula:
5' 3' (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC
20
5' 3' (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG
18
5' 3' (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC TCA TGC TTT CAG TAG
35 sob uma forma livre, sob uma forma alquilada, sob uma forma sulforada ou sob a forma de um derivado da poli-L-lisina.
Esses medicamentos podem ser utilizados, por exemplo, no tratamento de choques endotõxinicos infecciosos de todas as origens e de todos os estados patológicos associados a uma hiper secreção do TNF alfa.
A dose habitual, variável de acordo com o produto utilizado, o paciente tratado e a infecção em causa, pode estar compreendida, por exemplo, entre 1 micrograma e 300 mg. por dia, por via intravenosa, no caso dos seres humanos.
As novas sequências de oligonucleõtidos de - 13 -
formula (I) podem ser utilizadas para a preparação de composições farmacêuticas que incorporem como ingrediente activo pelo menos uma das referidas sequências.
Na sua qualidade de ingrediente activo, as sequências de oligonucleõtidos que possuem a formula (I) anteriormente referida, sob uma forma livre, sob uma forma alquilada, sob uma forma sulforada ou sob a forma de um derivado da poli-L-lisina, podem ser incorporadas em composições farmacêuticas des tinadas a serem administradas pela via digestiva, pela via paren teral ou local.
As composições farmacêuticas podem ser, por exemplo, solidas ou líquidas e podem apresentar-se sob as formas farmacêuticas vulgarmente utilizadas em medicina humana tais como por exemplo os comprimidos simples ou drageifiçados, composições gelifiçadas, capsulas, granulados, supositórios, preparações injectãveis e aerosois; a sua preparação faz-se pelos métodos habituais. 0 ingrediente ou os ingredientes activos podem ser incorporados com excipientes normalmente utilizados nas composições farmacêuticas tais como o talco, a goma arábica, a lactose, o amido, o estearato de magnésio, a manteiga de cacau, os veículos aquosos ou não aquosos, as substâncias gordas de origem animal ou vegetal, os derivados parafinicos, os glicois, os diversos agentes humectantes, dispersantes ou emolcionantes e os conservantes.
Apresentar-se-à seguidamente, a título não limitativo, diversos exemplos da presente invenção.
5' 3'
EXEMPLO 1 : Sequência (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG (18 mero anti TNF alfa) sob uma forma livre.
Aparelhagem :
Utiliza-se um sintetizador automático Appliec. Biosystems Modele 381 A. Carrega-se o aparelho com todos os reagentes úteis. Com os compostos de fórmula (IV) prepara-se uma solução em acetonitrilo; são submetidos a uma ligeira pressão em atmosfera de argzno o que lhes permite serem fornecidos automaticamente por abertura de electrovalvulas â medida das necessidades .
Inscreve-se a sequência do nucleótido que se pretende sintetizar. Indica-se a quantidade de produto com a qual se pretende trabalhar.
Programa-se ou não a destritilação final para recuperar o composto de fórmula (I) sob forma hidroxilada ou sob forma tritilada em 5.
Coloca-se uma pequena coluna prêviamente chei a contendo o suporte funcionalizado (II) sobre o aparelho (suporte de vidro poroso CPG).
A sintese ê efectuada seguidamente, passo a passo, sem intervenção manual.
As soluções de destritilação são recuperadas automaticamente em cada fase, num colector de fracções acoplado ao aparelho; deste modo é possível conhecer os rendimentos em cada fase.
Reagentes:
Todos os reagentes utilizados devem possuir uma grande pureza.
As 4 fosforamidites de formula (IV) (B2=adeni na, citosina, guanina ou timina) são condicionadas em pequenos frascos. Basta adicionar a quantidade necessária de solvente antes de as introduzir no aparelho.
As outras soluções introduzidas no aparelho são as seguintes:
-Tetrazol a 4% em acetonitrilo para activar o acoplamento,
-Anidrido acêtico/lutidina/tetra-hidrofurano 1/1/8 conjuntamente com dimetil-amino-piridina/tetra-hidrofurano 7/93, misturadas insito para a reacção de remoção do excesso ,
-Iodo/ãgua/lutidino/tetra-hidrofurano 3/2/2/ /93 para a oxidação do fosfito de formula (V) em fosfato de fórmula (VI),
-Ãcido tricloro-acético a 2% em dicloro-metano para a reacção de distritilação,
-Acetonitrilo para a dissolução das fosforami dites.
ι\
1¾ 'V.
Método :
Efectua-se a reacção na concentração 0,95 micromolare. O produto ê distritilado no aparelho no fim da sintese.
O rendimento da sintese em produto bruto é de 79%. O desbloqueamento do produto de formula (VII) efectua-se do modo seguinte:
1- Amoníaco a 28% / 1 hora à temperatura ambiente,
2- Solução saturada de amoníaco /60°C /5 horas.
Purificação :
R
1- Desalificação em coluna de NAP10 (Parmacia) Sefadex G50 .
2- CLER em coluna de Partisil 10 SAX , com um gradiente variável desde 50 a 99% de solvente A numa mistura de A+B durante 20 minutos .
A=tampão fosfato 0,3 m/CH^CN 7/3 ph 6,2
B=tampão fosfato 10 2M/CH„CN 7/3 ph 6,2 3 J débito de 2cm /minutos.
3- Desalificação em coluna de NAP 25 (Farmacia) Sefadex G50 . Análise do produto purificado :
R ~
-CLER em coluna de Partisil 10 SAX nas mesmas condiçoes anteriormente referidas. TR=13,92 minutos.
R
-CLER de fase inversa em microbondapack C18 , com um gradiente variável desde 8,4 a 15% de CHqCN em acetato de trietil-amonio —2 Z - 3
M ph 5,5 durante 20 minutos, débito de 2cm /minutos,TR=12, ,13 minutos.
Obtêm-se finalmente 0,125 micromoles de produ to puro, rendimento de 13%.
EXEMPLO 2 : Sequência (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG (18mero anti-TNF alfa) sob a forma total de tioato.
Procede-se como no Exemplo 1, substituindo o ciclo de oxidação com iodo por uma fase de oxidação com enxofre durante 450 segundos, obtendo-se o produto referido em epígrafe.
A oxidação com iodo é substituida por uma fa16
se de oxidação com enxofre. A solução de iodo/ãgua/lutidina/tetra-hidrofurano ê substituída por uma solução de:
g de enxofre 3
28,5 cm de sulforeto de carbono 3
28,5 cm de piridina anidra 3 cm de trietil-amina anidra.
No caso de uma oxidação feita com enxofre é indispensável lavar antes e após a oxidação utilizando lavagens repetidas com uma solução de sulforeto de carbono em piridina 1/1 para remover qualquer resíduo de enxofre. Na parte restante o método permanece inalterado.
Rendimento de sintese com 1,24 micromoles: 56,5%
Desbloqueamento :
1- Amoníaco a 28% /1 hora / temperatura ambiente
2- Solução saturada de amoníaco, uma noite â temperatura de 50°C. Purificação :
~ R ~
1- Desalificaçao em NAP 25 (Sefadex) , fazendo a eluiçao com H90.
R
2- CLER em microbondapack C18 .
TR=24,46 minutos
Gradiente varãvel entre 30 a 50% de solvente A durante 20 mi3 nutos, débito de 2 cm .
A=Acetato de trietil-amonio 10 /l,ph 5,5/CH~CN 7/3 _2 J
B=Acetato de trietil-amonio 10 /1, ph 5,5.
Rendimento em produto puro : 40,3%.
5' 3'
EXEMPLO 3 : Sequência (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC 20mero anti -TNF alfa) sob uma forma livre.
Procedendo conforme descrito no Exemplo 1, obteve-se o composto indicado em epígrafe.
5'
EXEMPLO 4 : Sequência (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC TCA TGC 3'
TTT CAG TAG (35mero anti-TNF alfa sob uma forma livre.
Procedendo conforme descrito no Exemplo 1,
obteve-se um composto indicado em epígrafe.
EXEMPLO 5 :
Preparou-se uma solução injectãvel de acordo com a fórmula seguinte:
-Composto do Exemplo 1 ...................... 10 microgramas
-Excipiente aquoso esterilizado ....................... 2 ml
EXEMPLO 6 :
Fez-se a preparação de comprimidos de acordo cora a fórmula seguinte:
-Composto do Exemplo 2 ...................... 20 microgramas
-Excipiente q.s.p. um comprimido de ................. 100 mg (estearato de magnésio)
EXEMPLO 7 :
Preparou-se uma solução injectãvel de acordo com a fórmula seguinte:
-Composto do Exemplo 3 ....................... 10 microgramas
-Excipiente aquoso esterilizado ........................ 2 ml
ESTUDO DA SEQUÊNCIA DO OLIGONUCLEÕTIDO PREPARADO NO EXEMPLO 3.
1- Ensaio biológico
1.1 - Incubar os monocitos humanos (4x106 células) com 6 micromoles de oligonucleõtidos anti-sentido, sob as 4 formas, durante 3 horas.
1.2 - Adicionar depois o LPS (10 microgramas/ml) e o INF (5xl03 u/ml).
1.3- lncubar durante 18 horas,
1.4- Extrair o sobrenadante da cultura.
1.5- Adicionar este sobrenadante âs células sensíveis a lise pelo TNF (L929) durante 24 horas.
1.6-Medir a viabilidade celular por clorometria com cristal violeta.
2- Ensaio imunolõgico
2.1- Incubar os monocitos humanos (4x10^ células) com 6 micromoles de oligonucleõtidos anti-sentido sob as 4 formas duran te 3 horas.
2.2- Adicionar depois o LPS (10 microgramas/ml) e o INF 3 (5x10 u/ml) para estimular a produção de TNF.
2.3- Incubar durante 18 horas.
2.4- Extrair o sobrenadante da cultura.
2.5- Fazer o revestimento com o sobrenadante da cultura.
2.6- Adicionar um anticorpo anti-TNF marcado com iodo (para RIA) ou com uma enzima (para ELISA).
2.7- Incubar durante 3 horas.
2.8- Revelação :
a) adicionar o substracto da enzima (ELISA) e ler a densidade õptica.
b) dosear a radioactividade (RIA).
2.9- Determinar a quantidade de TNF produzida pelos monõcitos.
2.10-Calcular o índice de inibição da produção de TNF.
3- Resultados :
Índice de inibição da produção de TNF alfa pelos monocitos tratados pelos oligonucleõtidos anti-sentido.
V/ml em presença de oligos + índice de inibição=l- xl00=63,5 g y/ml na ausência de oligos

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    Processo para a preparação da sequência de oligonucleotidos anti-sentido, anti-ARN mensageiro do TNF (Factor de Necrose de Tumor) alfa, possuindo a estrutura de fórmula I seguinte:
    5' 3' (d) TCA TGG TGT CCT TTg CAG - X (I)
    1 18 na qual X representa um ãtomo de hidrogénio, ou uma sequência de 1 a 17 oligonucleôtidos, sob forma livre, sob forma alquilada, sob forma sulfurada ou sob forma de derivado da poli-L-lisi na, caracterizado por se imobilizar sobre um suporte S o primei ro nucleótido na posição 31 da cadeia que se pretende sintetizar de fórmula:
    l z
    c
    0“^ na qual S representa o suporte, Z reprsenta um grupo hidrocarboneto contendo de 2 a 20 ãtomos de carbono, B, é uma base purica ou pirimidica correspondendo ao primeiro nucleótido cuja função amina esta protegida e R ê um grupo protector, se desblo quear o hidroxilo na posição 5' com um ácido reactivo para se obter o produto de fórmula:
    na qual S, Z e têm as significações jã indicadas, por se fazer reagir, depois este ultimo com o monómero do segundo nucleó tido de fórmula:
    na qual R tem a significação jã indicada, é uma base purica ou pirimídica correspondente aó segundo nucleõtido cuja função amina estã protegida, R^ representa um radical alquilo ou um grupo -OR'i ou -SR’b no qual R’^ representa um grupo protector, r2, representa um grupo protector, para obter um produto de fõr mula:
    5'
    3'
    Ο.
    \ζ protegido °\c^°
    WL (S na qual S, R, R^, Βχ e B2 têm a significação jã indicada, por se oxidar, depois, o produto de fórmula (V) obtido para se proporcionar um produto de fórmula:
    protegido <^C\ çr \/wa(s na qual S, R, R^, B^, e Z têm a significação jã indicada e X, representa um ãtomo de oxigénio ou de enxofre depois, como anteriormente, â partida do produto de fórmula II, se efectuar um novo ciclo com este produto de fórmula (VI) e o monómero de um novo nucleõtido atê â obtenção do encadeamento desejado para se proporcionar um produto de fórmula:
    p
    R ο -V 0 v v protegido
    0 0
    X c
    I λαλ/ (S na qual S, R, R^, B^, X^ e Z têm a significação indicada an teriormente e Bz representa o último nucleótido da sequência, por se desproteger, depois, o oligonucleótido, por o separar do suporte e purificar o produto de formula I assim obtido.
    - 2a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por
    - o desbloqueamento do hidroxilo na posição 51 do produto de fórmula (II) ser efectuado por um ãcido reactivo tal como o ãcido acético, o ãcido di ou triclorocêtico,
    - a reacção de acoplamento do produto de fórmula (III) com o produto de fórmula (IV) ser activado por meio de tetrazol em acetonitrilo,
    - a oxidação do fosfito de fórmula (V) em fosfato de fórmula (VI) ser efectuada por meio de iodo em solução numa mistura de ãgua/lutidina/tetra-hidrofurano ou numa mistura ãgua/piridina/ /tetra-hidrofurano,
    - a oxidação do fosfito de fórmula (V) para se obter a forma sul furada (VI) ser efectuada por meio de enxofre em solução numa mistura de sulfureto de carbono, de piridina e de trietilamina anidra,
    - para terminar a sintese, se efectuar a desprotecção do grupo hidroxilo terminal na posição 51 por meio de um ãcido tal como o ãcido acético, o ãcido di ou tricloracêtico,
    - se efectuar a desprotecção do oligonucleótido de fórmula (VII) por meio do amoníaco concentrado aquecendo moderadamente o meio reaccional.
    - 3a Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação dos derivados da poli-L-lisina das sequências de oligonucleõtidos tal como definidos pela fórmula I, caracterizado por se fazer reagir um produto de fórmula (VIII):
    R —. Ο protegido (VIII) na gual S, Z, R, tem a significação jã indicada, com um produto de fórmula (IV), para se obter um produto de fórmula (IX):
    na qual S, R, Z, R^, e B2 têm a significação jã indicada, se oxidar, se eliminar o suporte e o grupo activador para se obter um produto de fórmula (X):
    na qual R, R^, e B2 têm a significação jã indicada, X^ representa um átomo de oxigénio ou de enxofre, se oxidar a ribose ter minai e por, depois, se fazer reagir com a L-lisina em meio redutor, para se obter o produto de fórmula (XI):
    protegido resíduo poli-L-lisina c,s55cs«ht^aiv1 na qual R, R^, B^, B^ e X^ têm a significação jã indicada, por depois, se prosseguir a síntese como â partida do produto de fórmula (VI).
    - 4a Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por o primeiro nucleótido na posição 3’ da cadeia a sintetizar ser ou o primeiro *nucleõtido da sequência final
    3'
    TCA TGG TGT CCT TTG CAG ou um dos nucleõtidos da sequência de fórmula (I ):
    Ά
    - CC TCA TGC TTT CAG TAG sob forma livre, sob forma alquilada, sob forma sulfurada ou sob forma de derivado da poli-L-lisina.
    - 5 aProcesso de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por o primeiro nucleótido na posição 31 da cadeia que se pretende sintetizar ê o primeiro nucleótido da sequência - CC ou da sequência - CC TCA TGC TTT CAG TAG.
    - 6a Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por se preparar a sequência de oligonucleõtidos correspondendo à fórmula:
    5' 3' (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC
    1 20 sob forma livre, sob forma alquilada, sob forma sulfurada ou sob forma derivada da poli-L-lisina.
    Processo de acordo com qualquer das reivindi cações de 1 a 5, caracterizado por se preparar a sequência de oligonucleõtidos correspondendo ã fórmula:
    5’ 3' (d) TCA TGG TGT CCT TTg CAG
    1 18 sob forma livre, sob forma alquilada, sob forma sulfurada ou sob forma de derivado da poli-L-lisina.
    - 8a Processo de acordo com qualquer das reivindi cações de 1 a 5, caracterizado por se preparar a sequência de oligonucleõtidos correspondendo à fórmula:
    5' 3' (d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC TCA TGC TTT CAG TAG
    1 35 sob forma livre, sob forma alquilada, sob forma sulfurada ou sob forma de derivado da poli-L-lisina.
    A requerente reivindica a prioridade do pedi do francês apresentado em 23 de Agosto de 1989, sob ο N9 89 - 11171.
    Lisboa, 22 de Agosto de 1990
PT95067A 1989-08-23 1990-08-22 Processo para a preparacao da sequencia de oligonucleotidos anti-sentido,anti-arn mensageiro do tnf (factor da necrose de tumor)alfa PT95067B (pt)

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