CN1049668A

CN1049668A - α-肿瘤坏死因子的反向反信使核糖核酸寡聚核苷酸序列的制备方法

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Publication number: CN1049668A
Application number: CN90107162A
Authority: CN
Inventors: 阿德尔·卡林姆·布拉汉姆; 皮埃尔·施密斯; 勒内·扎利茨
Original assignee: Russo Akerlof
Current assignee: Sanofi Aventis France; Aventis Pharma SA
Priority date: 1989-08-23
Filing date: 1990-08-23
Publication date: 1991-03-06
Anticipated expiration: 2005-08-23
Also published as: CA2023899A1; CA2023899C; CN1028760C; ES2069715T3; DE69017983T2; KR0151153B1; IE68592B1; GR3015527T3; IE903036A1; HUT56113A; HU215242B; DE69017983D1; JPH0391485A; IL95342A0; FR2651130A1; DK0414607T3; FR2651130B1; EP0414607A2; PT95067B; AU6119090A

Abstract

本发明提供制备具有下式结构的新的α-TNF 的反向反信使RNA寡聚核苷酸序列的方法：

5′ 3′

(d) TCA TGG TGT CCT TTG CAG - X

1 18

Description

本发明是关于α-肿瘤坏死因子的反向反信使核糖核酸寡聚核苷酸新序列的制备方法。

已知由巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子（TNF）是引起感染性内毒素休克的绝对代谢障碍的原因。为寻找断绝TNF生成的来源，申请人研究了可以中止TNF产生的反向反信使RNA寡聚核苷酸序列。

在各种序列的研究中，申请人发现了一种特定的寡聚核苷酸序列呈现这种性质。

因此本发明的主题是提供一种新的α-TNF的反向反信使RNA寡聚核苷酸序列的制备方法，该序列的结构式如（Ⅰ）：

其中X代表一个H原子，或一个1～17个核苷酸的序列，可为游离型、烷化型、硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型。

在通式（Ⅰ）和后面的通式中，所谓1～17个核苷酸的序列意指含腺嘌呤和鸟嘌呤（嘌呤碱）、胞嘧啶和胸腺嘧啶（嘧啶碱）的任何序列，

-所谓烷化型是指在磷酸根上有一个烷基（主要是甲基、乙基或丙基）的烷化衍生物。这些烷基可存在于全部或部分磷酸根上，

-所谓硫化型是指磷酸根上的硫化衍生物，主要是硫代酸酯和二硫代酸酯，这些基团可存在于全部或部分磷酸根上。

按照本发明的制备方法所得的产物中，可以提出的相应于上述通式（Ⅰ）的寡聚核苷酸序列，有其中X代表一个氢原子或Ⅰ_A序列的全部或部分，Ⅰ_A序列如下：

它们可以是游离型，烷化型，硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型。

在这些产物中，以通式（Ⅰ）中X为一个氢原子、一个-CC序列或一个Ⅰ_A序列者较好，特别是下式序列：

它们均可为游离型，烷化型，硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型。

本发明的主题，即制备通式（Ⅰ）的各化合物的方法，其特征在于，在载体S上固定待合成的（Ⅱ）链的3′位第一个核苷酸，

式Ⅱ中S代表载体，Z代表含有2～20碳原子的烃基，B₁是相当于第一个核苷酸的嘌呤或嘧啶碱，其功能基团胺基已被保护，R是保护基。用酸试剂将5′位羟基脱去保护则得产物（Ⅲ），

式（Ⅲ）中S，Z和B₁的意义如上所述。化合物Ⅲ与第二个核苷酸单体（Ⅳ）反应，

式（Ⅳ）中R的意义同上，B₂是相当于第二个核苷酸的嘌呤或嘧啶碱，其功能基胺基已被保护，R₁代表一个烷基或一个-OR′或-SR₁′基，其中R₁′代表一个保护基，R₂代表一个保护基，于是，得产物式（Ⅴ），

式（Ⅴ）中S，R，R₁，B₁和B₂的意义已如上述。产物（Ⅴ）经氧化得产物（Ⅵ）。

式（Ⅵ）中S，R，R₁，B₁，B₂和Z的意义如上，X₁代表一个氧或硫原子。于是，如上述从产物（Ⅱ）起的步骤一样，产物（Ⅵ）与一个新的核苷酸单体反应产生一个新的环，直至所需的链生成，以获得最终产物式（Ⅶ）

其中S，R，R₁，B₁，B₂，X₁和Z的意义同上，B_Z代表序列的最后一个核苷酸，然后将寡聚核苷酸脱去保护基，从载体上分离，得产物通式（Ⅰ），再予以纯化。

按照本发明优选的操作条件，上述制备方法的特征在于：

-脱去产物（Ⅱ）的5′位羟基保护基是采用乙酸、二氯或三氯乙酸等酸试剂进行的，

-产物（Ⅲ）与产物（Ⅳ）的偶合反应在乙腈中用四唑活化，

-产物（Ⅴ）中的亚磷酸酯被溶于水/二甲基吡啶/四氢呋喃混合液或水/吡啶/四氢呋喃混合液中的碘氧化为磷酸酯（产物Ⅵ），

-产物（Ⅴ）中的亚磷酸酯由溶于二硫化碳，无水吡啶或无水三乙胺中的硫作用而得硫化型的（Ⅵ），

-在合成结束时，用酸试剂如乙酸，二氯或三氯乙酸使5′位末端的羟基脱去保护基，

-寡聚核苷酸（Ⅶ）脱去保护基是在温和加热反应介质下用浓氢氧化铵进行的。

对于上述操作方法，最好采用“Applied Biosystems”381A型自动合成仪。

本发明中所用的载体S是由二氧化硅或多孔玻璃构成的固相载体。也可用欧洲专利No.0，208，599所介绍的载体。

按照本发明，Z为烃基-（CH₂）_n-，其中n为整数2～20。最好用Z为-（CH₂）₂-的产物。

在式（Ⅱ）到式（Ⅶ）中，碱基B₁，B₂……B_Z为嘌呤或嘧啶碱，其功能基团氨基被保护。所用的保护基可以是例如苯甲酰基或异丁基。对腺嘌呤或胞嘧啶，最好用苯甲酰基。对鸟嘌呤，最好用异丁基。

5′位羟基功能基的保护基R，例如，可以是三苯甲基，单甲氧基三苯甲基，二甲氧基三苯甲基或pixyl基。

磷酸酯基的羟基功能基的保护基R₁′，例如，可以由甲基，氰乙基，邻或对位氯苯基等组成。最好采用氰乙基。保护基R₂可由一个烷基如甲基、乙基、异丙基或吗啉代或哌啶子基组成。最好采用异丙基。

在操作方法中，应将未反应的产物（Ⅲ）的部分立即转变成酯，以免在以后的偶合中生成不良的序列。这种“戴帽”反应最好采用溶在二甲基吡啶/四氢呋喃混合液中的乙酸酐来进行，并且用二甲胺基吡啶或甲基咪唑进行催化。

前面所述的寡聚核苷酸序列的聚L-赖氨酸衍生物可按下法制备，其特征在于使产物（Ⅷ）与产物（Ⅳ）反应得到产物（Ⅸ），

产物（Ⅷ）中S，Z，R，B₁同上述，

产物（Ⅸ）中S，R，Z，R₁，B₁和B₂如上述，然后进行氧化，去除载体和活化基团，得产物（Ⅹ），

产物（Ⅹ）中R，R₁，B₁和B₂同上，X₁代表一个氧或硫原子，末端核糖被氧化后再与L-赖氨酸在还原性介质中反应，得产物（Ⅺ）：

其中R，R₁，B₁，B₂和X₁同上，然后按产物（Ⅵ）开始的步骤继续合成。

聚L-赖氨酸衍生物可按类似J.P.Leonetti等人在Gene 72，（1988）323-332上介绍的方法进行制备。

按本发明方法制得的新的寡聚核苷酸序列具有很有用的药理学性质，尤其是它们具有阻止细胞生成α-TNF的能力。这个作用是通过它们自己特异性地粘附于横跨在密码AUG两侧166～185位序列水平的靶目标信使RNA上完成的。

这些性质将在实验部分进一步详细叙述。

这些性质证明可以将通式（Ⅰ）所示的新寡聚核苷酸序列作为药物应用。

按照本发明所制得的药物中，α-TNF的反向反信使RNA寡聚核苷酸的新序列具有下式结构（Ⅰ）：

其中，X代表一个氢原子或一个1～17个核苷酸的序列，可以是游离型，烷化型，硫化型或聚L-赖氨基衍生物型。尤其是上述通式（Ⅰ）中X代表一个氢原子或全部或部分Ⅰ_A序列者，可以是游离型，烷化型，硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型。

按照本发明所制得的药物中，特别应该保持含有上述的寡聚核苷酸的序列，其中X代表一个氢原子、一个-CC序列或I_A序列，它们可以是游离型、烷化型、硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型，最重要的是相应于下式的寡聚核苷酸：

它们可为游离型、烷化型、硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型。

这些药物可用于治疗例如各种原因的感染性内霉素休克或与α-TNF分泌过度有关的各种病理状态。

其常用剂量，依所用的产品、病人和需治的病而异，例如可静脉注射每天每人1～30mg。

通式（Ⅰ）所示的新寡聚核苷酸序列可用于制备其中至少含一种上述序列作为有效成分的药用组合物。

作为有效成分，相当于上述通式（Ⅰ）所示的寡聚核苷酸序列的游离型、烷化型、硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型，都可以加入到通过消化道、非经胃肠道或局部给药的药用组合物中。

这些药用组合物可以是，例如固体或液体，可以制成人用药品目前常用的剂型，如普通或糖衣片剂，gelules、胶囊、颗粒剂、栓剂、注射剂、气溶胶，它们可以按照通常的方法制备。有效成分可与药用组合物中常用的赋形剂如滑石、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、可可脂、水或非水的溶剂、动物或植物性油脂、石蜡衍生物、甘油、各种湿润剂、分散剂或乳化剂和防腐剂一起混合。

下面列举本发明付诸实践的非限制性的实例。

实例1：序列（抗α-TNF的十八聚核苷酸），游离型

仪器：

“Applied Biosystems 381A型”自动合成仪，负载全部所需试剂。产物（Ⅳ）在轻度氩压下溶于乙腈，以便在需要时可通过电阀门的开口被自动释放出来。

记录待合成的核苷酸序列，指示凝合成的产量。

可预定程序选择是否进行最终的脱三苯甲基作用，以便得到在5′位为羟基化型或三苯甲基化型的式（Ⅰ）产物。

将预先装填功能基化载体的小柱安装在仪器上（CPG多孔玻璃填料）。

于是合成即可进行，自始至终无需手工操作。

每一阶段的脱三苯甲基溶液自动回收于一个联在仪器上的分部收集器中，因而每个阶段的产率均可知。

试剂：

全部试剂必须很纯。

式（Ⅳ）中4个磷酰胺化合物（B₂＝腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶）均装在小瓶中，其溶量足够容纳注入仪器前所需的溶剂量。

注入仪器的其它溶液如下：

-4%四唑-乙腈溶液，作为偶合活化剂，

-乙酸酐/二甲基吡啶/四氢呋喃1/1/8，二甲胺基吡啶/四氢呋喃7/93，在位混合以用于“戴帽”反应，

-碘/水/二甲基吡啶/四氢呋喃3/2/2/93，用于使化合物（Ⅴ）的亚磷酸酯氧化为化合物（Ⅵ）的磷酸酯。

-2%三氯乙酸溶于二氯甲烷中，用于脱三苯甲基反应，

-纯乙腈，用于溶解磷酰胺化合物。

方法：

反应量为0.95μmol，合成结束时产物在仪器中进行脱三苯甲基化反应，

粗品的产率为79%。按下法脱去产物（Ⅶ）的保护基：

1-28%氢氧化铵/环境温度下1小时，

2-饱和氢氧化铵/60℃/5小时

纯化：

1-在NAP 10（Pharmacia）Sephadex G50 柱上进行脱盐作用。

2-在Partisil 10 SAX

柱上进行高效液相层析，用溶剂A+B混合液洗脱20分钟，溶剂A的梯度为50～99%。

A＝0.3M磷酸盐缓冲液/CH₃CN 7/3 pH 6.2

B＝10^-3M磷酸盐缓冲液/CH₃CN 7/3 pH 6.2

流速2毫升/分。

3-在NAP 25（Pharmacia）Sephadex G50 柱上进行脱盐作用。

纯品分析：

-在Partisil 10 SAX 上进行高效液相层析，条件同上，RT＝13.92分。

-在反相微柱C18 上进行高效液相层析，以CH₃CN的10^-2M乙酸三乙胺溶液，pH5.5洗脱20分钟，乙腈的梯度为8.4～15%，流速2ml/分。RT＝12.12分。

最终得0.125μmol纯品，产率13%。

实例2：序列

（抗α-TNF十八聚核苷酸），硫代酸酯型

如例1操作，但碘氧化步骤用硫氧化（450秒钟）代替，得标题产物。

碘氧化步骤用硫的氧化步骤所代替。碘/水/二甲基吡啶/四氢呋喃用下列溶液取代：3g硫，28.5ml二硫化碳，28.5ml无水吡啶，3ml无水三乙胺。

用硫氧化时，氧化前后必须冲洗柱子，用二硫化碳的吡啶溶液1/1反复冲洗以去除任何硫物残余。

其它方面本方法保持不变。

产率1.24μmol，56.5%。

脱去保护基：

1）-28%氢氧化铵/1小时/环境温度

2）-饱和氢氧化铵/1夜/50℃。

纯化：

1-NAP 25（Sephadex）^R水洗脱进行脱盐作用。

2-微柱C18^R高效液相层析对照，RT＝24.46，

溶液A梯度30～50%，洗脱20分钟，流速2ml/分。

A＝乙酸三乙胺10^-2mol/L，pH5.5/CH₃CN7/3

B＝乙酸三乙胺10^-2mol/L，pH5.5

纯品产率：40.3%

实例3：序列（抗α-TNF的廿聚核苷酸），游离型

按例1操作，可得标题产物。

实例5：

按下列配方配制注射用溶液：

-例1的产物……10μg

-无菌水……2ml

实例6：

按下列配方配制片剂：

-例2的产物……20μg

-加入赋形剂适量，使最终成每片100mg的片剂（赋形剂成分：乳糖、淀粉、滑石粉、硬脂酸镁）。

实例7：

按下列配方配制注射用溶液：

-例3的产物……10μg

-无菌水……2ml

实例3中制备的寡聚核苷酸序列的研究

1-生物学实验

1.1人单核细胞（4×10⁶个细胞）与6μmol4型反向寡聚核苷酸一起温育3小时。

1.2加入脂多糖（10μg/ml）和INF（5×10³单位/ml）。

1.3温育18小时。

1.4收集培养上清液。

1.5将上清液加到对TNF敏感的细胞（L929）中，温育24小时。

1.6结晶紫染色，比色测定细胞存活率。

2-免疫学实验

2.1人单核细胞（4×10⁶个细胞）与4型反向寡聚核苷酸一起温育3小时。

2.2加入脂多糖（10μg/ml）和INF（5×10³单位/ml）以刺激TNF的生成。

2.3温育18小时。

2.4收集培养上清液。

2.5用此培养上清液包被酶联板。

2.6加碘标记（RIA-放射免疫测定）或酶标记（ELISA酶联免疫吸附测定）的抗TNF抗体。

2.7温育3小时。

2.8读数

a）加酶的底物（ELlSA），读光密度。

b）测放射活性（RlA）。

2.9测定单核细胞产生的TNF的量。

2.10计算TNF生成的抑制率。

3-结果

经反向寡聚核苷酸处理的单核细胞产生α-TNF的抑制率。

抑制率（%）＝（1- (存在寡聚核苷酸时的产量，V/ml)/(不存在寡聚核苷酸时的产量，V/ml) ）×100＝63.5±9

Claims

1、制备具有式(Ⅰ)结构的α-TNF的反向反信使RNA寡聚核苷酸的方法，

式中X代表一个氢原子或一个1～17个核苷酸的序列，可为游离型、烷化型、硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型。

2、相应于权利要求1中式（Ⅰ）的寡聚核苷酸序列，其特征在于X代表一个氢原子或全部或部分Ⅰ_A序列：

可为游离型、烷化型、硫化型或聚L-赖氨酸型，其特征是在载体S上固定待合成的链（Ⅱ）3′位第一个核苷酸，

其中S代表载体，Z代表一个含2～20碳原子的烃基，B₁相当于第一个核苷酸的嘌呤或嘧啶碱基，其胺基功能基已被保护，R是保护基，用酸试剂将5′位羟基脱去保护基，得产物（Ⅲ），

其中S，Z和B₁意义同上，产物（Ⅲ）与第二个核苷酸单体（Ⅳ）反应，

其中R意义同上，B₂相当于第二个核苷酸的嘌呤或嘧啶碱基，其胺基功能基已被保护，R₁代表烷基或-OR₁′，或-SR₁′，其中R₁′代表一个保护基，R₂代表一个保护基，于是得产物（Ⅴ），

其中S，R，R₁，B₁和B₂意义如上，产物（Ⅴ）经氧化后得产物（Ⅵ），

其中S，R，R₁，B₁，B₂和Z意义如上，X₁代表一个氧或硫原子，然后如上述由产物（Ⅱ）开始的反应，将产物（Ⅵ）与一个新的核苷酸单体反应产生一个新的环，直至所需的链形成，以得到最终的产物（Ⅶ），

其中S，R，R₁，B₁，B₂，X₁和Z意义同上，B_Z代表序列的最后一个核苷酸，然后使寡聚核苷酸脱去保护基，从载体上分离，并将得到的产物纯化。

3、根据权利要求1的方法，其特征在于

-产物（Ⅱ）5′位上羟基的解封采用酸性试剂如乙酸，二氯或三氯乙酸进行，

-产物（Ⅲ）与产物（Ⅳ）的偶合反应由乙腈中的四唑活化，

-产物（Ⅴ）的亚磷酸酯由溶于水/二甲基吡啶/四氢呋喃混合液或水/吡啶/四氢呋喃混合液中的碘氧化为产物（Ⅵ）的磷酸酯，

-产物（Ⅴ）的亚磷酸酯由溶于二硫化碳、无水吡啶和无水三乙胺混合液中的硫作用氧化生成硫化型（Ⅵ），

-在合成结束时5′位上的末端羟基由酸试剂如乙酸，二氯或三氯乙酸脱去保护基，

4、权利要求1所述制备式（Ⅰ）所定义的寡聚核苷酸聚L-赖氨酸衍生物的方法，该方法的特点在于使产物（Ⅷ）与产物（Ⅳ）反应，得产物（Ⅸ），

式（Ⅷ）中S，Z，R，B₁意义如上，

式（Ⅸ）中S，R，Z，R₁，B₁和B₂意义如上，

然后经氧化，并去除载体和活化基团，得产物（Ⅹ）。

其中R，R₁，B₁和B₂意义如上，X₁代表一个氧或硫原子，末端核糖被氧化后在还原性介质中与L-赖氨酸反应，得产物（Ⅺ），

其中R，R₁，B₁，B₂和X₁意义如上，然后按产物（Ⅵ）起始的反应步骤继续合成。

5、按权利要求1，3或4所述的方法，其特征在于待合成的第一个核苷酸或为最终序列的第一个核苷酸，或为Ⅰ_A序列-CC TCA TGC TTT CAG TAG的核苷酸之一，可为游离型、烷化型、硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型。

6、按权利要求1，3，4，5中任何一项所述的方法，其特征在于待合成的核苷酸链3′端第一个核苷酸是序列-CC或－CC TCA TGC TTT CAG TAG的第一个核苷酸。

7、按权利要求1、3、4、5或6中任何一项所述的方法，其特征在于制备相应于下式的寡聚核苷酸序列，

可为游离型、烷化型、硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型。

8、按权利要求1、3、4、5或6中任何一项所述的方法，其特征在于制备相应于下式的寡聚核苷酸序列，

可为游离型、烷化型、硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型。

9、按权利要求1、3、4、5或6中任何一项所述的方法，其特征在于制备相应于下式的寡聚核苷酸序列，

可为游离型、烷化型、硫化型或聚L-赖氨酸衍生物型。