JPH0391485A - α―腫瘍壊死因子の逆向アンチメッセンジャーＲＮＡのオリゴヌクレオチド配列、その製造方法、およびそれを用いた医薬品並びに製剤組成物 - Google Patents

α―腫瘍壊死因子の逆向アンチメッセンジャーＲＮＡのオリゴヌクレオチド配列、その製造方法、およびそれを用いた医薬品並びに製剤組成物

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JPH0391485A
JPH0391485A JP2220177A JP22017790A JPH0391485A JP H0391485 A JPH0391485 A JP H0391485A JP 2220177 A JP2220177 A JP 2220177A JP 22017790 A JP22017790 A JP 22017790A JP H0391485 A JPH0391485 A JP H0391485A
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Abdel Karim Braham
アブデル・カリム・ブラハム
Pierre Smets
ピエール・スメツ
Rene Zalisz
ルネ・ザリス
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、α−腫瘍壊死因子の逆向（ａｎｔｉ−ｄｉｒ
ｅｃｔｉｏｎ）アンチメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ
）の新規オリゴヌクレオチド配列、その製造方法、およ
び、医薬品としての前記新規配列の利用並びにこれらを
含有する製剤組成物の利用に関する。
［従来の技術］ マクロファージが分泌する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、
感染性内毒素ショックを生起し得る代謝上の絶対的な危
機の原因であることが公知である。ＴＮＦ産生源の失活
を意図した研究中に、発明者らは、前記ＴＮＦ産生を停
止させ得る逆向アンチｍＲＮＡオリゴヌクレオチド配列
の探索へと導かれるに至った。
各種配列の研究から、特定のオリゴヌクレオチド配列が
このような特性を示すことが発見された。従来の文献中
には、このような逆向アンチｍＲＮＡオリゴヌクレオチ
ド配列の報告は皆無である。
［発明が解決しようとする課題］ 上記により、本発明の目的は、α−腫瘍壊死因子の新規
な逆向アンチｍＲＮＡのオリゴヌクレオチド配列を提供
すること番こある。
また、本発明は、前記新規な逆向アンチｍＲＮＡのオリ
ゴヌクレオチド配列の製造方法の提供をも目的とする。
前記新規な逆向アンチｍＲＮＡオリゴヌクレオチド配列
は、非常に有用な薬理学的特性を有し、特に、ＡＵＧな
るコドンにまたがることが見出された第１６６〜１８５
番の配列の部分で、標的ｍＲＮＡに細胞自体を特異的に
付着させることによって、α−ＴＮＦの産生を停止させ
る能力を保有している。
これらの特性については、実施例の項で更に詳細に説明
されるが、これによって、前記一般式（Ｉ）で示される
新規オリゴヌクレオチド配列を医薬品として利用する正
当な根拠が与えられる。
したがって、α−ＴＮＦの新規な逆向アンチｍＲＮＡオ
リゴヌクレオチド配列の医薬品としての利用法の提供も
また、本発明の目的の一つである。
更に、活性成分として前記オリゴヌクレオチド配列の少
なくとも一種類を含有する製剤組成物の提供をも本発明
は目的としている。
［課題を解決するための手段Ｊ 本発明の、α−腫瘍壊死因子の新規な逆向アンチｍＲＮ
Ａオリゴヌクレオチド配列は、一般式％式％ （式中、Ｘは水素原子、あるいは、遊離形態、アルキル
化形態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リジン誘導体の形
態をなす塩基数１〜１７のオリゴヌクレオチド配列を意
味する） で示される構造であることを特徴とする。
一般式（Ｉ）、および以下において、 １、塩基数１〜１７のオリゴヌクレオチド配列は、アデ
ニンおよびグアニン（プリン塩基）、並びにシトシンお
よびチミジン（ピリミジン塩基）のいずれを含有するヌ
クレオチド配列であっても良く、 ２、アルキル化された形態とは、リン酸基にアルキル基
、特にメチル、エチル、あるいはプロピルの各基が結合
したアルキル化誘導体を意味し、かつ、リン酸基の全部
または一部がこのような形態であることが可能であり、 ３、硫化形態とは、リン酸基が、特にチオ酸塩、あるい
はジチオ酸塩を形成している硫化誘導体を意味し、かつ
、リン酸基の全部または一部にこのような基が存在する
ことが可能である。
本発明の生成物のうち、一般式（Ｉ）においてＸが、水
素原子、あるいは、遊離形態、アルキル化形態、硫化形
態、またはポリ−Ｌ−リシン誘導体の形態をなす式 で示される配列の全部または一部である場合のオリゴヌ
クレオチド配列を例示することができる。
上記の最後の置換形のうち、一般式（１）においてＸが
、水素原子、式−ＣＣで示される配列、あるいは、遊離
形態、アルキル化形態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リ
シン誘導体の形態をなす式（ｒ　Ａ）の配列である場合
のオリゴヌクレオチド配列、特に下記のオリゴヌクレオ
チド配列１　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｇ５
゜ （ｄ）ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＣＡ
Ｇ　ＣＣＴＣＡ　ＴＧＣ３゜ ＴＴＴ　　ＣＡＧ　　ＴＡＧ が好適である。
上記の式（Ｉ）によって定義される逆向アンチｍＲＮＡ
オリゴヌクレオチド配列の製造方法は、一般式 （式中、Ｓは支持体、Ｚは炭素原子数２〜２０の炭化水
素の基、Ｂ＋はアミン官能部分が保護されたこのヌクレ
オチドに対応するプリン塩基またはピリミジン塩基、Ｒ
は保護基をそれぞれ意味する） で示される、前記オリゴヌクレオチド配列の第１ヌクレ
オチドをその３°位で支持体Ｓに固定化する段階と、 酸性試薬を用いて前記第１ヌクレオチドの５０位のヒド
ロキシル基を脱保護して一般式 （式中、Ｓ、Ｚ、Ｂ、は上式に同じ） で示される生成物を得る段階と、 （ＩＩＩ）の生成物を一般式 （式中、Ｒは前式と同じ、Ｂ、はアミン官能部分が保護
されたこのヌクレオチドに対応するプリン塩基またはピ
リミジン塩基、Ｒ１はアルキルラジカル、あるいはＲ’
＋を保護基とする一ＯＲ’、または−ＳＲ’＋なる基、
Ｒ２は保護基をそれぞれ意味する） で示される第２ヌクレオチド単量体と反応させて一般式 （式中、 Ｒ３、 Ｂ　。
およびＢ２ は前 式に同じ） で示される生成物を得る段階と、 得られた一般式 の生成物を酸化して、 般式 （式中、Ｓ、Ｒ，Ｒ，、Ｂ１．Ｂ、、および２は前式と
同じ、Ｘｌは酸素または硫黄原子を意味する） で示される生成物を得る段階と、 上記一般式（ＶＴ）の生成物と新しいヌクレオチドとを
用いて、前記一般式（ｎ）の生成物から新しい環を生成
させる段階を所望のＲＮ　Ａ　鎮が形成されるまで繰り
返し、最終的には一般式（式中、Ｓ、Ｒ，Ｒ，、Ｂ、、
Ｂ、、ＸＩ　、およびＺは前式と同じ、Ｂ、は前記オリ
ゴヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドに対応するプ
リン塩基またはピリミジン塩基をそれぞれ意味する） で示される生成物を得る段階と、 得られた一般式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを脱保護し
、前記支持体から分離し、かつ精製する段階と からなることを特徴とする。
本発明の好適な実行条件においては、 １、−ｉ式（ＩＩ）の生成物の５゛位のヒドロキシル基
の脱保護には、酸性試薬、例えば酢酸、ジクロロ酢酸、
あるいはトリクロロ酢酸が用いられることと、 ２、一般式（ｍ）の生成物と一般式（ＩＶ）の生成物と
のカプリング反応の活性化には、アセトニトリル中で作
用するテトラゾールが用いられることと、 ３、一般式（Ｖ）の亜リン酸塩から一般式（ＶＩ）のリ
ン酸塩への酸化が、水、ルチジン、およびテトラヒドロ
フランの混合液、あるいは水、ピリジン、テトラヒドロ
フランの混合液に溶かしたヨウ素溶液を用いて実行され
ることと、４、一般式（Ｖ）の亜リン酸塩から一般式（
ＶＴ）の硫化形態への酸化が、硫化炭素、無水ピリジン
、および無水トリエチルアミンの混合液に溶かした硫黄
を用いて実行されることと、５、合成の最終段階におけ
る５゛位の末端ヒドロキシル基の脱保護が、酸、例えば
酢酸、ジクロロ酢酸、あるいはトリクロロ酢酸を用いて
実行されることと、 ６、一般式（■）のオリゴヌクレオチドの脱保護が、濃
水酸化アンモニウムを用いた反応混液の穏やかに加熱に
よって実行されることとを特徴とする。
上記製造方法の実行には、「アプライド・バイオシステ
ムズ・モデル第３８１Ａ号（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−
ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８１Ａ）Ｊなる自動合
成装置を用いるのが好適である。
上記の製造方法の実行に際しては、シリカまたは多孔質
ガラスで支持体Ｓを構成することができる。ヨーロッパ
特許公開公報第０．２０８．５９９号明細書に記載の支
持体を用いることもできる。
本発明によれば、Ｚは、ｎを２〜２０の範囲で変化が可
能な整数とする炭化水素の基−（ＣＨ，）。−である。
Ｚが−（ＣＨ，）、−である生成物を用いるのが好適で
ある。
一般式（ＩＩ）〜（■）において、Ｂ、　、Ｂ、、・・
・Ｂ！なる塩基は、そのアミン官能部分が保護されたプ
リンまたはピリミジン塩基である。例えばベンゾイル基
、あるいはイソブチル基を保護基とすることができる。
アデニンまたはシトシンの場合は、ベンゾイル基を用い
るのが好適である。グアニンの場合は、イソブチル基を
用いるのが好適である。
５０位のヒドロキシル官能部分の保護基Ｒは、例えばト
リチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、
あるいはビキシルなどの各ラジカルである。
リン酸基のヒドロキシル官能部分の保護基Ｒ１は、例え
ば、メチル、シアノエチル、０−クロロフェニル、ある
いはｐ−クロロフェニルなどの各ラジカルでこれを構成
することができる。シアノエチル基を用いるのが好適で
ある。Ｒ１の保護基の構成には、例えば、メチル、エチ
ル、イソプロピルなどのアルキルラジカルを用い、ある
いは、モルホリノまたはピペリジノラジカルを用いるこ
とができる。
上記製造方法の実行の際は、反応しなかった一般式（Ｉ
Ｕ）の生成物の分画を直ちにエステルに転化して、その
後のカプリング反応に不都合な配列の形成を回避しなけ
ればならない。このいわゆる「キャッピング」なる反応
は、ルチジンとテトラヒドロフランとの混合液に溶かし
た無水酢酸を用い、ジメチルアミノピリジンまたはメチ
ルイミダゾールを触媒としてこれを行わせるのが好適で
ある。
前記に定義のオリゴヌクレオチド配列のポリ−Ｌ−リシ
ン誘導体の調製は、一般式 （式中、Ｓ、Ｚ、Ｒ，ｊ１５よびＢ１は前式と同じ） で示される生成物を一般式（ＩＶ）の生成物と反応させ
て、一般式 （式中、Ｓ、Ｒ，Ｚ、Ｒ１、Ｂｌ　、およびＢ２は前式
と同じ） で示される生成物を得る段階と、 これを酸化させ、かつ支持体および活性化原子団を除去
して、一般式 （式中、Ｒ，Ｒ，、Ｂ、、およびＢ２は前式と同じ、Ｘ
、は酸素または硫黄原子を意味する）で示される生成物
を得る段階と、 上記一般式（Ｘ）の生成物の末端リボースを酸化し、更
に還元性媒体中でＬ−リシンと反応させて、一般式 ポリ−Ｌ−リシンの残余分 （式中、Ｒ，Ｒ＋　、Ｂ 前式と同じ） ＢＮ、およびＸｌ は で示される生成物を得る段階と この生成物を用いて一般式（ＶＩ）の生成物に対する処
理の段階以降の合成を続ける段階と、からなることを特
徴とする方法を用いてこれを行うことができる。
特に、レオネッティ（Ｊ、Ｐ、　Ｌｅｏｎｅｔｔｉ）ら
によるＧＥＮＥ　［第７２巻（１９８８年）３２３〜３
３２頁］に記載されたと同様な方法に従って、ポリ−Ｌ
−リシン誘導体を調製することができる。
本発明の医薬品は、一般式 （式中、Ｘは水素原子、あるいは、遊離形態、アルキル
化形態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リシン誘導体の形
態をなす塩基数１〜１７のオリゴヌクレオチドを意味す
る） として示される化学構造であることを特徴とする。
本発明の医薬品のうち、前記一般式（Ｉ）においてＸが
、水素原子、あるいは、遊離形態、アルキル化形態、硫
化形態、またはポリ−Ｌ−リシン誘導体の形態をなす式 ％式％ で示される配列の全部または一部である場合のオリゴヌ
クレオチド配列で構成されていることを特徴とする医薬
品が特に好適である。
上記の最後の形態のうち、一般式（Ｉ）においてＸが、
水素原子、式−〇Ｃで示される配列、あるいは、遊離形
態、アルキル化形態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リシ
ン誘導体の形態をなす式（ＩＡ）の配列である場合のオ
リゴヌクレオチド配列を含有する医薬品が好適である。
本発明の好適な医薬品のうち、一般式（１）が、遊離形
態、アルキル化形態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リシ
ン誘導体の形態をなす式％式％： で示されるオリゴヌクレオチドであるのが特に好適であ
る。
前記医薬品は、例えば、あらゆる病因による感染性内毒
素ショック、およびα−ＴＮＦの分泌過多に関連したす
べての病理的状態の治療にこれを用いることができる。
通常の投与量は、用いられる製品、治療される患者、お
よび問題となる病状に従って、これを変化させることが
でき、例えばヒトに対する静脈内注射の場合、１日あた
り１μｇ〜３０ｍ　ｇとすることができる。
本発明のオリゴヌクレオチド配列の少なくとも１種類を
、活性成分として製剤組成物に含有させることもできる
。
活性成分として、遊離形態、アルキル化形態、硫化形態
、またはポリ−Ｌ−リシン誘導体の形態をなす前記一般
式（Ｉ）で示されるオリゴヌクレオチド配列を、消化管
、非経口的経路、あるいは局所的経路からの投与が意図
される製剤組成物に組み込むことができる。
これら製剤組成物は、例えば、固体または液体であるこ
とが可能であって、ヒトに対する慣用の製剤形態、例え
ば、単純錠剤または糖衣錠、ゼラチンカプセル、カプセ
ル、顆粒、座薬、注射可能な調合剤、あるいはエアゾル
としてこれを供与することができる。調剤は慣用の方法
による。これら活性成分を、前記製剤組成物に慣用的に
用いられる賦形剤、例えばタルク、アラビヤゴム、乳糖
、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、カカオ油、水性ま
たは油性のビヒクル、動植物起源の脂肪性物質、パラフ
ィン誘導体、グリコール類、各種の湿潤剤、分散剤また
は乳化剤、あるいは防腐剤と混合することができる。
［実施例］ 以下、本発明の非制約的な実施例について説明する。
実」を例ヨ、：　遊離形態での配列（ｄ）　ＴＣＡ　Ｔ
ＧＧ　ＴＧＴＣＣＴ丁丁Ｇ　ＣＡＧ（抗α−ＴＮＦ１８
量体）饅ヱ： 前記「アプライド・バイオシステムズ・モデル第３８１
Ａ号」なる自動合成装置を用いる。必要なすべての試薬
をこの装置に装荷する。一般式（ＩＶ　）の化合物は、
アセトニトリルに溶かした溶液として、アルゴンを用い
て軽く加圧し、電子弁の開放によって必要に応じて随時
自動的に供給され得るようにする。
合成すべきヌクレオチド配列を登録する０作用させよう
と望む生成物の量が表示される。
式（Ｉ）の生成物を５０位がヒドロキシル化された形態
で、あるいはトリチル化された形態で回収するように、
最終的脱トリチル化を選択的にプログラムする。
活性化された一般式（ｎ）の支持体を含有する、予め充
填された小カラムを装置に取り付ける（ＣＰＧ多孔質ガ
ラス支持体）。
次いで、手動によって中断することなく、合成を開始か
ら終了まで実行する。
それぞれの段階ごとに、装置と連動するフラクションコ
レクタに脱トリチル化溶液を自動的に回収する。これに
より、各段階での収率を知ることができる。
ＴＬＭ： 使用される試薬はすべて、高純度でなければならない。
一般式（ＩＶ　）の４種類のホスホルアミド化合物（Ｂ
２＝アデニン、シトシン、グアニン、またはチミン）を
小フラスコに充填する。これらを装置に投入する前に、
必要量の溶媒を加えれば充分である。
装置に投入されるその他の溶液は下記の通り。
１、カプリング活性剤としてアセトニトリルに溶かした
４％テトラゾール溶液。
２、無水酢酸、ルチジン、およびテトラヒドロフランの
１：１：８の混合物を一方とし、ジメチルアミノピリジ
ン、およびテトラヒドロフランの７：９３の混合物を他
方として、「キャッピング」反応の直前に両者を混合す
る。
３、一般式（Ｖ）の亜リン酸塩を酸化して一般式（ＶＴ
）のリン酸塩とするためのヨウ素、水、ルチジン、およ
びテトラヒドロフランの３：２：２：９３の混合液。
４、脱トリチル化のためのジクロロメタンに溶かした２
％トリクロロ酢酸溶液。
５、ホスホルアミド化合物を溶解させるための純アセト
ニトリル。
亙恭： ０．９５μＭについて反応を行わせる。合成の最後の時
点で生成物を装置中で脱トリチル化する。
合成によって得られた粗製生成物の収率は７９％である
。一般式（ＶＩｌ）の化合物の脱保護は、下記の要領で
これを行う。
１．２８％水酸化アンモニウムを大気温で１時間作用さ
せる。
２、飽和水酸化アンモニウムを６０℃にて５時間作用さ
せる。
後１： １、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製ＮＡＰＩ
ＯなるセファデックスＧ−５０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
５０　：商品名）カラムを用いて脱塩。
２、パーティジル１０・ニスニーエックス（Ｐａｒｔｉ
ｓｉｌ　１０　ＳＡＸ：商品名）を用いた高速液体クロ
マトグラフィーを、Ａ液十Ｂ液の混合液に溶かしたＡ溶
媒の濃度勾配を５０〜９９％として２０分間実施。
Ａ液は、ｐＨ６，２の０．３Ｍリン酸：　ＣＨ，ＣＮの
７＝３緩衝液、Ｂ液は、ｐＨ６，２の１０−”Ｍリン酸
：　ＣＨ，ＣＮの７：３緩衝液、注入速度は毎分２ａｍ
” ３、ファルマシア社製ＮＡＰ２５なるセファデックスＧ
−５０を用いて脱塩。
様去ユ１−魁先立逝： １、パーティジル１０　ＳＡＸを用い、上記と同じ条件
にて高速液体クロマトグラフィーを実施。
ＴＲ＝　１３．９２分。
２、逆相マイクロボンダバック・シー１８（Ｍｉｃｒｏ
ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８；商品名）を用いた高速液体
クロマトグラフィーを、１０−”Ｍ　トリエチルアンモ
ニウムアセタートに溶かしたＣＨｓＣＮの濃度勾配を８
．４〜１５％とし、ｐＨ５，５、注入速度を毎分２ｃｍ
”として２０分間実施。ＴＲ＝　１２．１２分。
３、最終的に、０．１２５μＭの精製生成物が得られる
。収率１３％。
３゜ ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＣＡＧ（抗α−Ｔ　
Ｎ　Ｆ　１ａ量体）実施例１と同じ要領で操作するが、
ヨウ素を用いた亜リン酸塩の酸化段階を、４５０秒間の
硫黄を用いた酸化段階に置き換えることによって、標記
生成物が得られる。ヨウ素を用いた酸化段階を硫黄を用
いた酸化段階に置き換えるには、ヨウ素、水、ルチジン
、およびテトラヒドロフランの混合液を、 硫黄３ｇ、 硫化炭素２８．５ｃｍ” 無水ピリジン２８．５ｃｍ”、および 無水トリエチルアミン３ｃｍ’ の溶液に置き換える。
硫黄による酸化の場合、酸化の前後にカラムをすすぎ、
ピリジンに１；ｌで溶かした硫化炭素の溶液で繰り返し
洗浄して、残留硫黄を完全に除去することが不可欠であ
る。方法における上記以外の項目は不変である。
Ｌ腹立藍崖： １．２４μＭで５６．５％である。
ＵｕＩ： ｌ、２８％水酸化アンモニウムを大気温で１時間作用さ
せる。
２、飽和水酸化アンモニウムを５０℃にて１晩作用させ
る。
！Ｕ！： １　、　ＮＡＰ２５なるセファデックスＧ−５０を用い
て脱塩、溶離剤は水である。
２、マイクロボンダバックＣ１ｇを用いた高速液体クロ
マトグラフィーによる制御。
ＴＲ＝２４．４６　、　Ａ液＋Ｂ液に対するＡ液の濃度
勾配を３０〜５０％として２０分間実施、注入速度は毎
分２ｃｍ”、Ａ液は、ｐＨ５，５のｔｏ−”Ｍ／ｆｉ　
ｌ−リエチルアンモニウムアセクート：　ＣＨ，ＣＮの
７：３混合液、Ｂ液は、ｐＨ５，５の１０−”Ｍ／氾ト
リエチルアンモニウムアセタート。
桓１己し炙北ｊと又塵： ４０．３％。
′ＬＭＪ！！Ｌ３Ｌ＝遊離形態での配列（ｄ）　ＴＣＡ
　ＴＧＧ　ＴＧＴ３′ ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　ＣＣ（抗α−ＴＮＦ２０量体
）実施例１と同じ要領で操作し、標記生成物が得られる
。
５゜ 及血皿１：遊離形態での配列（ｄ）　ＴＣＡ　ＴＧＧ　
ＴＧＴ３゜ （：ＣＴ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴＣＡ　ＴＧＣＴＴＴ
　ＣＡＧ　ＴＡＧ　（抗α−ＴＮＦ３５ＮＦ３ ５量例１と同じ要領で操作し、標記生成物が得られる。
叉ＪＩＪ糺旦： 下記の処方に従って、注射可能な溶質を調製した。
イ、実施例１の生成物　　　　　　　１０４ｇ口、無菌
水性賦形剤　　　　　　　　２ｍ氾及五員亙： 下記の処方に従って、錠剤を調製した。
イ、実施例２の生成物　　　　　２０μｇ口１錠剤調製
充分量の賦形剤　１００ｍ　ｇで終了（賦形剤の組成：
乳糖、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム） 及五史二二 下記の処方に従って、注射可能な溶質を調製した。
イ、実施例３の生成物　　　　　　　１０４ｇ口、無菌
水性賦形剤　　　　　　　　２ｍｆ２３で　　されたオ
リゴヌクレオチド　　の遺封 １、土韮」リエ歳埜 １．１　　ヒト単核球（細胞数：４Ｘ１０’）を４種類
の形態の６μＭ逆向オリゴヌクレオチドとともに３時間
装置する。
１．２　　次いで、リボ多糖（ＬＰＳ：１０μｇ／ｍＪ
２）、およびＩＮＦ（５ＸＩＯ”単位／　ｍ　Ｉ２）を
加える。
１．３　１８時間温１する。
１．４　　培地上清を採取する。
１．５　　この上清をＴＮＦによる溶解に感受性のある
細胞（Ｌ　９２９系）に２４時間加える。
１．６　　クリスタルバイオレットによる比色法を用い
て、細胞生存度を測定する。
２、友交ヱ皿試豫 ２．１　　ヒト単核球（細胞数：４Ｘ１０’）を４種類
の形態の６μＭ逆向オリゴヌクレオチドとともに３時間
製置する。
２．２　　次いで、ＬＰＳ　（１０ｕｇ／ｍｌ２）　、
およびＩＮＦ（５Ｘ１０”単位／　ｍ　Ｉ２）を加えて
、ＴＮＦ産生を刺激する。
２．３　１８時間温１する。
２．４　　培地上清を採取する。
２．５　　この培地上清を用いて被膜を作成する。
２．６　　ヨウ素で標識した（放射線免疫検定用）、Ｓ
Ａ用） 抗 あるいは酵素で標識した（ＥＬＩ ＴＮＦ抗体を加える。
２．７３時間製置する。
２．８　　測定 仁 酵素基質を加え（ＥＬＩＳＡの場 合）、光学密度を測定する。
口、放射能を測定する（放射線免疫検定法） ２．９　　単核球が産生したＴＮＦを定量する。
２．１０　７ＮＦ産主に対する阻害値を算出する。
３、綴１ 逆向オリゴヌクレオチドを投与した単核球によるα−Ｔ
ＮＦ産生の阻害値。
阻害値： ただし、 ■Ａ：オリゴヌクレオチド存在下での１ｍβあたりの測
定値。
ｖｏｏ：オリゴヌクレオチド不在下での１ｍｊ２あたり
の測定値。

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）α−腫瘍壊死因子の逆向（ａｎｔｉ−ｄｉｒｅｃ
    ｔｉｏｎ）アンチメッセンジャーＲＮＡのオリゴヌクレ
    オチド配列であって、一般式 【遺伝子配列があります。】（ I ） （式中、Ｘは水素原子、あるいは、遊離形態、アルキル
    化形態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リシン誘導体の形
    態をなす塩基数１〜１７のオリゴヌクレオチド配列を意
    味する） で示される化学構造であることを特徴とする逆向アンチ
    メッセンジャーＲＮＡのオリゴヌクレオチド配列。
  2. （２）一般式（ I ）においてＸが、水素原子、あるい
    は、遊離形態、アルキル化形態、硫化形態、またはポリ
    −Ｌ−リシン誘導体の形態をなす式【遺伝子配列があり
    ます。】（ I ＿Ａ） で示される配列の全部または一部であることを特徴とす
    る請求項（１）記載の逆向アンチメッセンジャーＲＮＡ
    オリゴヌクレオチド配列。
  3. （３）一般式（ I ）においてＸが、水素原子、式−Ｃ
    Ｃで示される配列、あるいは、遊離形態、アルキル化形
    態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リシン誘導体の形態を
    なす式（ I ＿Ａ）の配列であることを特徴とする請求
    項（２）記載の逆向アンチメッセンジャーＲＮＡオリゴ
    ヌクレオチド配列。
  4. （４）一般式（ I ）の物質が、遊離形態、アルキル化
    形態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リシン誘ノ導体の形
    態をなす式 【遺伝子配列があります。】 で示されるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする
    請求項（１）ないし（３）のいずれかに記載の逆向アン
    チメッセンジャーＲＮＡオリゴヌクレオチド配列。
  5. （５）一般式（ I ）の物質が、遊離形態、アルキル化
    形態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リシン誘導体の形態
    をなす式 【遺伝子配列があります。】 で示されるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする
    請求項（１）ないし（３）のいずれかに記載の逆向アン
    チメッセンジャーＲＮＡオリゴヌクレオチド配列。
  6. （６）一般式（ I ）の物質が、遊離形態、アルキル化
    形態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リシン誘導体の形態
    をなす式 【遺伝子配列があります。】 で示されるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする
    請求項（１）ないし（３）のいずれかに記載の逆向アン
    チメッセンジャーＲＮＡオリゴヌクレオチド配列。
  7. （７）一般式 【遺伝子配列があります。】（ I ） （式中、Ｘは水素原子、あるいは、遊離形態、アルキル
    化形態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リシン誘導体の形
    態をなす塩基数１〜１７のオリゴヌクレオチドを意味す
    る） で示されるオリゴヌクレオチド配列の製造方法であって
    、 一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｓは支持体、Ｚは炭素原子数２〜２０の炭化水
    素の基、Ｂ＿１はアミン官能部分が保護されたこのヌク
    レオチドに対応するプリン塩基またはピリミジン塩基、
    Ｒは保護基をそれぞれ意味する） で示される、前記オリゴヌクレオチド配列の第１ヌクレ
    オチドをその３’位で支持体Ｓに固定化する段階と、 酸性試薬を用いて前記第１ヌクレオチドの５’位のヒド
    ロキシル基を脱保護して、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中、Ｓ、Ｚ、Ｂ＿１は上式に同じ） で示される生成物を得る段階と、 一般式（III）の生成物を一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） （式中、Ｒは前式と同じ、Ｂ＿２はアミン官能部分が保
    護されたこのヌクレオチドに対応するプリン塩基または
    ピリミジン塩基、Ｒ＿１はアルキルラジカル、あるいは
    Ｒ’＿１を保護基とする−ＯＲ’、または−ＳＲ’＿１
    なる基、Ｒ＿２は保護基をそれぞれ意味する） で示される第２ヌクレオチド単量体と反応させて一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） （式中、Ｓ、Ｒ、Ｒ＿１、Ｂ＿１、およびＢ＿２は前式
    に同じ） で示される生成物を得る段階と、 得られた一般式（Ｖ）の生成物を酸化して、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） （式中、Ｓ、Ｒ、Ｒ＿１、Ｂ＿１、Ｂ＿２、およびＺは
    前式と同じ、Ｘ＿１は酸素または硫黄原子を意味する） で示される生成物を得る段階と、 上記一般式（VI）の生成物と新しいヌクレオチドとを用
    いて、前記一般式（II）の生成物から新しい環を生成さ
    せる段階を所望のＲＮＡ鎖が形成されるまで繰り返して
    、最終的には一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） （式中、Ｓ、Ｒ、Ｒ＿１、Ｂ＿１、Ｂ＿１、Ｘ＿１、お
    よびＺは前式と同じ、Ｂ＿２は前記オリゴヌクレオチド
    配列の最後のヌクレオチドに対応するプリン塩基または
    ピリミジン塩基をそれぞれ意味する） で示される生成物を得る段階と、 得られた一般式（ I ）のオリゴヌクレオチドを脱保護
    し、前記支持体から分離し、かつ精製する段階と からなることを特徴とする逆向アンチメッセンジャーＲ
    ＮＡオリゴヌクレオチド配列の製造方法。
  8. （８）一般式（II）の生成物の５０位のヒドロキシル基
    の脱保護に酸性試薬、例えば酢酸、ジクロロ酢酸、ある
    いはトリクロロ酢酸が用いられることと、 一般式（III）の生成物と一般式（IV）の生成物とのカ
    プリング反応の活性化にアセトニトリル中で作用するテ
    トラゾールが用いられることと、一般式（Ｖ）の亜リン
    酸塩から一般式（VI）のリン酸塩への酸化が、水、ルチ
    ジン、およびテトラヒドロフランの混合液、あるいは水
    、ピリジン、テトラヒドロフランの混合液に溶かしたヨ
    ウ素溶液を用いて実行されることと、 一般式（Ｖ）の亜リン酸塩から一般式（VI）の硫化形態
    への酸化が、硫化炭素、無水ピリジン、および無水トリ
    エチルアミンの混合液に溶かした硫黄を用いて実行され
    ることと、 合成の最終段階における５’位の末端ヒドロキシル基の
    脱保護が、酸、例えば酢酸、ジクロロ酢酸、あるいはト
    リクロロ酢酸を用いて実行されることと、 一般式（VII）のオリゴヌクレオチドの脱保護が、濃水
    酸化アンモニウムを用いた反応混液の穏やかに加熱によ
    って実行されることと を特徴とする請求項（７）記載の逆向アンチメッセンジ
    ャーＲＮＡオリゴヌクレオチド配列の製造方法。
  9. （９）一般式（ I ）のオリゴヌクレオチド配列のポリ
    −Ｌ−リシン誘導体の製造方法が、一般式▲数式、化学
    式、表等があります▼（VIII） （式中、Ｓ、Ｚ、Ｒ、およびＢ＿１は前式と同じ） で示される生成物を一般式（IV）の生成物と反応させて
    、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IX） （式中、Ｓ、Ｒ、Ｚ、Ｒ＿１、Ｂ＿１、およびＢ＿２は
    前式と同じ） で示される生成物を得る段階と、 これを酸化させ、かつ支持体および活性化原子団を除去
    して、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｘ） （式中、Ｒ、Ｒ＿１、Ｂ＿１、およびＢ＿２は前式と同
    じ、Ｘ＿１は酸素または硫黄原子を意味する）で示され
    る生成物を得る段階と、 上記一般式（Ｘ）の化合物の末端リボースを酸化し、更
    に還元性媒体中でＬ−リシンと反応させて、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｘ I ） ポリ−Ｌ−リシンの残余分 （式中、Ｒ、Ｒ＿１、Ｂ＿１、Ｂ＿２、およびＸ＿１は
    前式と同じ） で示される生成物を得る段階と、 この生成物を用いて一般式（VI）の生成物に対する処理
    の段階以降の合成を続ける段階と からなることを特徴とする請求項（７）記載の逆向アン
    チメッセンジャーＲＮＡオリゴヌクレオチド配列の製造
    方法。
  10. （１０）一般式 【遺伝子配列があります。】（ I ） （式中、Ｘは水素原子、あるいは、遊離形態、アルキル
    化形態、硫化形態、またはポリ−Ｌ−リシン誘導体の形
    態をなす塩基数１〜１７のオリゴヌクレオチドを意味す
    る） で示されるα−腫瘍壊死因子の逆向アンチメッセンジャ
    ーＲＮＡのオリゴヌクレオチド配列を用いて構成される
    ことを特徴とする医薬品。
  11. （１１）請求項（２）ないし（６）のいずれかに記載の
    新規オリゴヌクレオチド配列を用いて構成されることを
    特徴とする医薬品。
  12. （１２）請求項（１０）または（１１）記載の医薬品の
    少なくとも１種類を活性成分として含有することを特徴
    とする製剤組成物。
JP2220177A 1989-08-23 1990-08-23 α―腫瘍壊死因子の逆向アンチメッセンジャーＲＮＡのオリゴヌクレオチド配列、その製造方法、およびそれを用いた医薬品並びに製剤組成物 Pending JPH0391485A (ja)

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