JPH0714954B2 - ヌクレオチド架橋試薬として使用するためのクマリン誘導体 - Google Patents

ヌクレオチド架橋試薬として使用するためのクマリン誘導体

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JPH0714954B2
JPH0714954B2 JP2505859A JP50585990A JPH0714954B2 JP H0714954 B2 JPH0714954 B2 JP H0714954B2 JP 2505859 A JP2505859 A JP 2505859A JP 50585990 A JP50585990 A JP 50585990A JP H0714954 B2 JPH0714954 B2 JP H0714954B2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、相補的核酸配列を架橋するために使用するこ
とができる光反応性核酸類似体に関する。
背景技術 試料、とりわけ臨床試料中の生物学的起源の分析物の存
在を決定するための技術開発には、かなりの興味が存在
する。ある技術は、DNA及びRNAのような核酸の相補鎖間
で起こる、ハイブリダイゼーションとして知られる相補
的結合を用いて、試料中のDNAまたはRNAを含有する分析
物の存在を同定する。
動物細胞中の遺伝的欠陥を検出することと同様に、生物
学的試料中の特定のウイルス、細菌、または他の生物の
存在を決定することのために、特異的ハイブリダイゼー
ション技術が開発されてきた。最近開発された技術の中
に、標的及び試薬ポリヌクレオチド鎖の間に共有結合を
形成させることによるものがある。このような技術の一
つでは、光活性化時に分析物と共有結合を形成すること
ができる光活性化可能な部分を共有結合で含有する核酸
試薬（プローブ）が創製されている。プローブ及び分析
物をハイブリダイジング条件下で混合しそして結合基を
光活性化すると、２本の鎖を結合する共有結合が形成さ
れる。プローブがまた検出可能な標識をも含有する場合
には、１本及び２鎖核酸を分離する厳密な技術を利用し
て、架橋した核酸鎖の存在を決定することによって試料
中の分析物の存在を決定することが可能である。例え
ば、Yabusakiらの米国特許第4,599,303号には、標的配
列に対して架橋可能であるプローブを用いたハイブリダ
イゼーション技術が記述されている。
これらの先行技術は典型的には、ポリヌクレオチドの塩
基性残基に共有結合する光活性化可能な基の使用に依存
している。しかしながら、公知の光活性化可能なプロー
ブの合成、とりわけ大量合成は困難である。
従って、より容易に利用できる光活性化可能な核酸類似
体が望まれる。
発明の開示 本発明は、ハイブリダイゼーション測定において光架橋
性試薬として使用することができる光活性化可能な化合
物、並びにその最終製品を調製するために使用すること
ができる中間体及び技術を提供する。本化合物は、クマ
リンまたはクマリン類似体のフェニル環（特に７−位
で）をＤ−リボースまたはＤ−２−デオキシリボース分
子の１−位に結合することによって調製されたヌクレオ
シド類似体を含んで成る。このヌクレオシド類似体を含
有するプローブがハイブリダイゼーション測定に用いら
れた場合、クマリン環系の３−及び４−位の間の二重結
合が、相補鎖中のヌクレオシドに共有結合で架橋する光
活性化可能な基である。大部分、この光活性化可能な化
合物は、以下の化学式、 を有し、式中の置換基及び結合基は以降に詳細に記述す
る。
発明を実施するための最良の形態 本発明は、ハイブリダイゼーション測定において二価の
光活性化可能な架橋性基として作用する各種クマリン誘
導体の使用についての研究から部分的に生じた。特に、
プソラレンの二重結合の一つをヌクレオシドと反応させ
て、光活性化可能な二重結合を（典型的には、遮断基の
除去後に）保持した付加物を生産した。この付加物をオ
リゴヌクレオチド中に取り込み、そして相補的オリゴヌ
クレオチドとハイブリダイズさせると、光活性化時に架
橋が起こる。このような分子は、同時係属出願第07/06
3,239号に記述されている。この種の架橋性基は多くの
用途に対して満足なものであるが、架橋性基／ヌクレオ
シド付加物は、特に大量に合成することが困難である。
より小さい架橋性基を検討している中で、本発明者は、
隣接領域におけるハイブリダイゼーションに悪影響を及
ぼすことなく、ヌクレオシド塩基を完全に脱離させるこ
とが可能であることを決定した。本発明のヌクレオシド
類似体は、塩基が通常占有する位置において糖に結合し
た、光活性化可能なクマリンを含んで成る。通常は核酸
鎖間の認識にあずかる塩基がここでは欠失しているにも
かかわらず、比較的小さい光活性化可能な基を付与する
ことによってハイブリダイゼーションが効率よく起こ
る。クマリン部分は、ハイブリダイゼーション中に相補
的オリゴヌクレオチド鎖に挿入し、そしてそれによって
相補鎖のチミン残基に光架橋するのに適当に位置する。
さらに、光活性化を用いてプソラレン及びヌクレオシド
塩基間に付加物を形成させた先行技術によって可能であ
ったものよりも、容易に大量の架橋性プローブを調製す
ることが可能である。
本発明の特定の光活性化可能な化合物は、クマリン部分
のフェニル環を（好ましくは７−位で）Ｄ−リボースま
たはＤ−２−リボース部分の１−位に結合することによ
って調製される。クマリン部分は、（糖への必須結合を
除いて）未置換であるかまたは置換したものであること
ができる、クマリン中央の1,2−ベンゾピロン構造を最
小限に含有する。置換基がフェニル環にまたはクマリン
部分の３−若しくは４−位に存在する場合には、典型的
には、芳香族環上に及びビニル置換基として通常見いだ
される種類の１〜３個の安定な有機置換基が存在する
が、置換基が、立体障害を避けるように選択されそして
それ以外は有機化学の標準に従い適合するように選択さ
れる場合には、（可能な最大数以下の）より多くの置換
基が存在することが可能である。これらの置換基は一般
に小さく、（水素を含み）総数15個以下の原子を含有す
る。このような置換基は一般に、ハロゲン、ニトロ、シ
アノ、カルボニル、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、
及びアミド基；一つ以上の前記基で置換されたヒドロカ
ルビル基；並びに未置換ヒドロカルビル基から選択され
る。クマリン部分の３−及び４−位の置換基は、典型的
には低級ヒドロカルビル基、一般には低級アルキル基で
ある。
本発明の化合物は、以下の化学式を有することが好まし
い。すなわち、 式中、ｎは0,1,2、または３（好ましくは0,1,2;より好
ましくは０または１）であり；各Ｗは、独立的に、15個
以下の原子を含有する小さな安定置換基（特に、低級ヒ
ドロカルビル基；ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボニ
ル、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、若しくはアミド
基；またはヘテロ原子を含んで成る一つ以上の前記基を
含有するヒドロカルビル置換基）であり;Y及びＺは、独
立的に、Ｈまたは低級アルキル基を表し;Xは、（ａ）炭
素原子１〜５個、（ｂ）O,S、及びＮから成る群より選
択されたヘテロ原子０〜４個、（ｃ）及びハロゲン原子
０〜2m個（ｍはＸ中の炭素原子数であり； のようなヘテロ原子に対してα位にあるハロゲンは、安
定性に関する問題のため許さない）を含有する有機結合
基であり、そしてＸは１〜４個の原子の結合鎖を含んで
成り;RはＨまたはOR1であり；そしてR1,R2、及びR3は、
独立的に、Ｈまたはポリヌクレオチド自動合成中にヒド
ロキシル基とカップリング若しくはヒドロキシル基を保
護できる基を表わすか、或はR2またはR3は、３′,5′−
リン酸ジエステル結合によって前記化合物に結合したヌ
クレオチドまたはポリヌクレオチドを表わす。好ましい
ヒドロキシルカップリング有機基には、ホスファイト、
ホスホラミダイト（phosphoramidites）、ホスフェー
ト、Ｈ−ホスホネート、ホスホロチオエート（phosphor
othioates）、及びメチルホスホネート類のような、リ
ン含有結合基が含まれる。他の非リンカップリング基に
は、カルバメート及びアミド類が含まれる。低級ヒドロ
カルビル基には、直鎖及び分岐鎖両方のC1〜C6アルキル
基（並びにC3〜C6環状基と同様にC2〜C6アルケニル及び
アルキニル基）が含まれ、そして好ましくはC1〜C4アル
キル基、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル
ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、及びｔ−ブチル基、
が含まれる。ヘテロ原子置換基を有する典型的なヒドロ
カルビル基には、−COCH3,−CH2OH,−CF3,−NHCH3,−CO
2CH2CH3、及び−CON（CH3）２が含まれる。リボースま
たは２−デオキシリボース糖部分の立体化学は、天然の
ヌクレオチドに存在するものと同じもの（すなわち、Ｄ
−糖）である。本明細書中における糖部分に関するすべ
ての参照は、特に断わらない限りＤ−糖を意味する。
本発明の化合物は、ハイブリダイゼーション測定におけ
る試薬（典型的に「プローブ」として知られている）と
して使用される光活性化可能なポリヌクレオチドの、調
製における中間体として、または成分として、どちらに
も使用可能である。目的はこれらの分子が最終的にポリ
ヌクレオチドの一部を形成することであるので、この分
子の一部を形成する糖部分はリボースまたはデオキシリ
ボース分子のどちらかに由来する。リボースまたはデオ
キシリボース分子は重合性糖主鎖に取り込まれ、その中
で個別の糖基が３′−及び５′−ヒドロキシル基間でリ
ン酸ジエステル基によって結合される。本明細書中で用
いた付番方式は、ヌクレオチドで使用されるものと同じ
である。すなわち、「塩基」（ここではクマリン誘導
体）の原子はアラビア数字で区別し、そして糖部分の原
子位置はプライム符号付アラビア数字で区別する。
本発明の化合物のクマリン部分は、クマリン自体または
すべてのいくつかの置換クマリンから由来することがで
きる。糖が結び付くことになる位置（本明細書中におい
て結合位置と称される）の基は、典型的には最終生成物
においてクマリン部分を糖部分に結合する結合基の前駆
体として機能する。しかしながら、最終生成物はしばし
ば別の合成経路によって調製されうるので、すべての特
定の最終生成物はおそらくいくつかの前駆体を有するこ
とが可能である。さらに、結合基の一部だけがクマリン
の結合位置における置換基から調製され、結合基の残り
の部分が糖部分から由来することは可能である。実際
に、共有結合を形成させるために糖の１′−位における
ヒドロキシ基または１′−位におけるアミノ若しくはチ
オ基のような別の反応性置換基を、置換基上で脱離基
（leaving group）と反応させる場合が典型的である。
結合位置以外の位置では、クマリン環系は未置換または
置換のどちらでもよい。フェニル環上の典型的置換基
は、有機化合物の芳香環上に通常見いだされる小さな置
換基である。置換基を所望のとうりに選択して、クマリ
ンの励起波長を変化させることが可能である。３−及び
４−位における置換基は、典型的には非極性であり、そ
してたいがいは炭化水素置換基（メチル置換基が最も普
通）である。置換基の位置は変化させることができる
が、多くは４−及び８−位において見いだされる。
ある好ましい実施態様において、糖部分と反応する前の
クマリン部分は、化学式、 （式中、Y,Z,n、及びＷは先に定義した意味を持ち、そ
してX1はＸ結合基の全体的または部分的前駆体である）
を典型的に有する。X1基が糖部分の有機官能基と反応し
て最終結合基Ｘ中の共有結合を形成するので、反応性官
能基がX1中に存在しなければならない。典型的な反応性
官能基は、求核性または求電子性の置換または付加反応
を経ることができる、求核性または求電子性基である。
官能基は、（糖部分の脱離基とのSN2反応に関与するヒ
ドロキシ基のような）最終生成物において完全に若しく
は部分的に保持されるもの、または（糖部分のヒドロキ
シ基とのSN1反応若しくはSN2反応に関与するハロゲンの
ような）最終生成物において存在しない脱離基、である
ことができる。特定の官能基の例として、ヒドロキシ、
アミノ、ハロゲン、チオール、カルボニル、及びカルボ
キシ（エステル及びアミドを含む）基が挙げられる。こ
れらの誘導体は、クマリン自体または多くの市販されて
いるクマリン誘導体から、標準的有機合成方法によって
合成することができる。例えば、生化学及び有機化合物
のカタログ（シグマケミカル社、1988年452頁）、並び
にファインケミカルのアルドリッヒカタログハンドブッ
ク（1988−1989年、406及び407頁）を参照できる。
X1前駆体の残りの部分は、先述の寸法及び極性に関する
条件、すなわち、最終Ｘ基が、非極性から適度の極性
（典型的には、先述の基の遊離ヒドロキシルまたはアミ
ノ基を含有しない）であり、且つ１〜５個の炭素原子並
びにO,S、及びＮから成る群より選択された０〜４個の
ヘテロ原子を含有し、そして最終Ｘ基が、糖の１′−位
とクマリン誘導体の結合位置との間に１〜４個の原子の
結合鎖を含んで成ること、が存在する限り、特に限定さ
れない。ハロゲンもまた、典型的にはハロゲン化炭化水
素架橋基中に（2m個以下で、（ｍは架橋基中の炭素原子
数である））存在することができる。好ましくは、Ｘ結
合基は化学式X2,OX2,SX3、またはNHX2（式中、X2はC1〜
C5ヒドロカルビル基またはC1〜C5ヒドロカルボキシ基で
あり、そのどちらもケト若しくはエステル官能価（また
は類似物）状の０〜２個のカルボニル酸素で置換されて
いる）を有するが、但し、O,S、またはNHがＸの一部と
して存在する場合、このO,S、若しくはNH（または２個
以上存在する場合、このような基の一つ）が、糖環の
１′−位に結合し、そしてX2基が前記ヘテロ原子と結合
して安定な共有結合を形成する。特に好ましい結合基
は、以下の化学式、 （式中ｍは２〜４の整数であり、そしてX3はO,S、また
はNHである）を有するものである。とりわけ好ましい結
合基は、前文の最初の六つの基のように、結合鎖中に原
子を２個有する。
一般式中の糖部分上に示された基、すなわちR,R2、及び
R3は、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または合成化
学的手段によるポリヌクレオチドの合成における前駆
体、の糖部分に典型的に存在するもの、とりわけ固相合
成において存在する保護基及び活性化基である。ＲはＨ
またはOR1のどちらかであり、R1は以下に定義する。Ｒ
がＨである場合、糖はデオキシリボースであり、そして
このヌクレオシド類似体はDNA分子に取り込まれるよう
に予定される。ＲがOR1である場合、糖はリボースまた
はリボース誘導体であり、そしてこのヌクレオシド類似
体はRNA分子に取り込まれるように予定される。
R1,R2、及びR3は、独立的に、Ｈまたはヒドロキシル保
護基若しくはヒドロキシルカップリング有機基を表し、
そしてR2及びR3は、典型的に３′,5′−リン酸ジエステ
ル結合によって分子の残り部分に結合したヌクレオチド
またはポリヌクレオチドをさらに含んで成ることができ
る。より詳細には、ヒドロキシル保護基及びヒドロキシ
ルカップリング有機基は、ヌクレオチド化学において、
とりわけヌクレオシド、ヌクレオシド誘導体、ポリヌク
レオチド、またはポリヌクレオチドとの３′−または
５′−ヒドロキシル基を介する化学結合が合成方法の目
的であるDNA及びRNA分子の固相化学合成において、通常
用いられる基である。ポリヌクレオチドの合成中に糖部
分に典型的に存在する保護基及びカップリング基並びに
このような化学を回顧するためには、「オリゴヌクレオ
チド合成、実用的方法」（M.J.Gait,ed.,IRL Press Lt
d.,Oxford,Great Britain 1984）;Reese,G.B.,Tetrahed
ron（1978）34;3143;及びAmarnath,V.and A.D.Broom,Ch
emical Reviews（1977）77;183を参照できる。特に好ま
しい化学物は、R1,R2、及びR3が、H;ベンゾイル;C1〜C4
アルキル、C1〜C4アルコキシ、シアノ、ニトロ、若しく
はハロゲンで置換されたベンゾイル；トリアリールメチ
ル（アリールはフェニル及びナフチルから通常選択され
る）；またはC1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシル、シ
アノ、ニトロ、若しくは他の小さな有機基で置換された
トリアリールメチル、から独立的に選択された化合物で
ある。トリチル及び置換トリチル（とりわけ4,4′−ジ
メトキシトリチル）置換基は、R3に対して特に好まし
い。何故なら、これらの基はこの位置における固相合成
にしばしば用いられるからである。ピキシル（９−フェ
ニルキサンテニル）基もまた通常使用される。トリチル
及び置換トリチル基を、R1及びR2として通常使用するこ
とはより少ない。R1に対しては、４−メトキシテトラヒ
ドラピラン−４−イル基が好ましい。
本発明の化合物は、本明細書において記述したガイドラ
インを用いる、合成有機化学の標準的技法によって調製
することができる。例えば、市販の出発原料に基づく典
型的合成方法を以下の反応機構に記述する。反応機構に
用いられた略号は以下のとうりである:NBS＝Ｎ−ブロモ
スクシンイミド;DME＝1,2−ジメトキシエタン;pry＝ピ
リジン;DMT−C1＝ジメトキシトリチルクロリド；（iP
r）2EtN＝ジイソプロピルエチルアミン。示した反応に
関するさらなる詳細は、以降の例中に記述する。糖の１
−位における二つの可能なアノマーの一つだけを示す。
合成では、α−及びβ−アノマーが通常得られる。純粋
な単一アノマーを提供するためのアノマーの分離が、以
下の例（例えば、例６）に示されるように、合成の各種
段階において達成されうる。
先に示した反応機構における官能基を転換するために用
いられる技法の改変、または他の出発原料の選択、のど
ちらかによる本反応機構の多くの変法を用いて他の分子
を調製することが可能である。例えば７−ブロモメチル
基は、より複雑な結合基の前駆体として使用することが
できる、容易にアルキル化された基を提供する。芳香族
クマリン環に直接結合しした酸素または他のヘテロ原子
を有する分子の前駆体として使用できる市販のクマリン
には、７−ヒドロキシ−３−メチルクマリンが含まれ
る。７−ヒドロキシ基がクロロカルボニルメチレン基に
転換された前記分子の誘導体もまた利用可能である。他
の有用な市販化合物には、６−メチルクマリン、７−メ
チルクマリン、７−ヒドロキシクマリン、７−ヒドロキ
シ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−メチルクマ
リン、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン、
７−カルボキシメチル−４−メチルクマリン、７−メト
キシクマリン、４′−ヒドロキシメチル−4,5′,8−ト
リメチルプソラレン、４′−アミノメチル−4,5′,8−
トリメチルプソラレン、及びアンゲリシンが含まれる。
プソラレン及びアンゲリシンにおいては、結合基はフラ
ン環の一部分を含んで成る；例えば、HMT−プソラレン
では、結合鎖は４′炭素及びヒドロキシメチル置換基、
またはフラン酸素、５′及び４′炭素、並びにヒドロキ
シメチル置換基であると考えることができる。出発原料
の糖には、リボース及びデオキシリボース自体と同様
に、各種位置において既に遮断基を有している他の市販
化合物が含まれる。例として、メチル−２−デオキシ−
3,5−ジ−Ｏ−（ｐ−ニトロベンゾイル）−Ｄ−リボフ
ラノース、トリ−Ｏ−ベンゾイル−１−アセチル−Ｄ−
リボフラノース、及びテトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−リボ
フラノースが挙げられる。
上述の反応機構に示したように、得られた最初の生成物
は、典型的にはR2及びR3が保護されたヒドロキシ基とし
て存在する化合物である。このような化合物は典型的に
は脱保護され、次いで本発明のヌクレオシド類似体を含
有するポリヌクレオチドを調製するために、特定の保護
または活性化基を付加される。重合反応が塩基類似体を
含まず、糖部分だけなので、ポリヌクレオチド調製用の
標準的技法を少しだけ改変して用いることができる。ほ
とんどの場合、必要な唯一の改変は、新たに合成された
樹脂オリゴヌクレオチドを、熱アンモニアで脱ブロック
化する前に、1M炭酸ナトリウムを用いて50℃で２時間処
理することである。この処理によってクマリン環が開環
し、そしてクマリン環の２−位におけるアンモニアの攻
撃によるアミド生成が防止される。アミド生成は、続く
緩酸条件下でのクマリン環の再閉環を妨げるので、避け
られるべきである。有用な技法が、M.J.Gait,ed.,op．c
it．に記述されている。
本発明のヌクレオシド類似体は、３′−末端、５′−末
端、または内側位置のいずれかにおいてポリヌクレオチ
ドに取り込ませることが可能である。天然のポリヌクレ
オチドを本発明のヌクレオシド類似体で標識する場合、
標識は典型的には、ヌクレオチドの操作がより容易であ
る制限部位または分子の一末端で起こる。本発明のヌク
レオシド類似体が、合成調製されたポリヌクレオチドに
含まれる場合には、前記類似体は合成中において分子内
のすべての位置に容易に挿入されうる。プローブは、そ
れが本発明のヌクレオシドを含有することの例外を除い
て、その他の分析物ヌクレオチドの一部と相補的である
ように選択され、これが分析物ポリヌクレオチド中のヌ
クレオシドと誤対合する。本発明のヌクレオチド類似体
は、プローが目的の分析物ポリヌクレオチドとハイブリ
ダイズした場合に、本発明のヌクレオシド類似体と誤対
合した分析物ポリヌクレオチド中のヌクレオシド残基の
５′側に隣接してチミジンまたはウリジン残基が存在す
るように、プローブ中に位置させるべきである。この関
係は、２本のハイブリダイズしたポリヌクレオチド鎖中
の二つの隣接ヌクレオチドを示す化学式、すなわち、 ...XpT...（５″） （５′）...YpA... （式中、Ｔはチミジン、Ａはアデノシン、Ｘはすべての
ヌクレオチド、そしてＹは本発明のヌクレオチド類似体
であり、そして両鎖の５′端が示される）で理解するこ
とができる。
本発明のヌクレオシド類似体は、ハイブリダイゼーショ
ン測定において相補鎖中の対応する塩基と水素結合しな
いので、プローブ末端の一つの架橋剤を取り込ませるこ
とによって、ある利点が得られる。例えば、ポリヌクレ
オチドプローブ15塩基長中の中央位置に本発明の架橋剤
を含むと、中央位置に中断が存在しうる７塩基長の二つ
の相補配列が残るだろう。結合親和力は連続する結合対
数の増加に伴い対数的に増大するので、連続する７塩基
の二つの群より、連続する12または13塩基が相補的であ
るように、架橋剤が分子の一末端付近に存在する場合
に、より大きな結合親和力が存在する。プローブ末端か
ら１または２塩基のところにヌクレオシド類似体を位置
させることは、非特異的架橋を低減し、そしてプローブ
末端に類似体を位置させることよりも好ましい。
プローブ末端の一つにまたその付近に位置させる場合、
ヌクレオシドは、架橋効率にほとんどまたは全く影響を
及ぼさないので、α−またはβ−アノマーのどちらでも
よい。プローブ中の中央位置に位置させる場合、ヌクレ
オシドは、架橋効率を増大させるためにβ−アノマーで
あることが好ましい。
ここでは本発明を一般的に記述してきたが、例示目的で
提供しそして本発明を限定するものではない以下の詳細
例を参照することによって、本発明はより良く理解され
る。
例１ ７−ブロモメチルクマリンの調製 ７−メチルクマリン（10g,62.4mmol）及びＮ−ブロモス
クシンイミド（11.1g,62.4mmol）を、クロロホルム50ml
に加えた。次いでこの懸濁液を24時間還流すると、透明
な溶液になった。還流を５日間継続した。この時点で、
球状塊の結晶が生成した。反応混合物を室温に冷却し、
次いで０℃の冷蔵庫内に24時間入れておいた。結晶を濾
過して集め、そして少量の冷クロロホルムで洗浄した。
簡単な減圧排気によってクロロホルムを除去した後、結
晶を最少量の沸騰アセトンに溶解し、そして数日間かけ
て結晶化させた。結晶を濾過して集め、そして少量の冷
アセトンで洗浄した。減圧乾燥後の収量は7.15g（理論
量の48％）であった。融点は179.5〜181.5℃であった。
例２ ７−ヒドロキシメチルクマリンの調製 アセトン及び水の1:1混合物（560ml）に７−ブロモメチ
ルクマリン（7.0g、29.3mmol）を加えた。生じた懸濁液
を48時間還流し、その時点で反応混合物は透明溶液にな
った。次いでこの溶液を冷却し、重炭酸ナトリウム（2.
4g、29.3mmol）で中和し、そして減圧で濃縮して約65ml
にした。厚い塊の結晶が得られた。結晶を濾過して集め
て、減圧乾燥すると生成物5.27gが得られた（理論量の1
00％）。融点は116〜117℃であった。
例３ ７−ヒドロキシメチルクマリン及び２−デオキシ
−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフラノ
シルクロリドの合併（ヒドロキシメチルクマリンの２′
−デオキシリボシドの生成） 減圧適用側管を有する直径25mmの試験管に、７−ヒドロ
キシメチルクマリン（300mg、1.70mmol）及び２−デオ
キシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフ
ラノシルクロリド（600mg、1.54mmol）を入れた。試験
管をきつく密栓し、そして側管を通して試験管に約1mm
の減圧を適用した。次いで減圧排気した試験管を、110
℃の油浴中で５分間加熱した。加熱当初の２分間は、HC
1ガスが激しく発生した。次いで反応混合物を室温に冷
却し、そして残留物を、アセトン及びヘキサンの1:1混
合物３〜4mlに吸収した。次いでこの溶液を、溶離液と
してアセトン／ヘキサン1:1を用いた50mm×150mmシリカ
ゲルカラムのクロマトグラフィーにかけた。生成物を含
有する画分をTLCによって同定し、そしてプールしてガ
ラス状に濃縮した。このガラスを酢酸エチル10ml中に吸
収した。50ml三角フラスコ中の酢酸エチル溶液を、ペン
タン20mlを含有するジャーに入れた。次いでジャーを封
止し、そして結晶化を進行させた。収量は白色結晶330m
g（理論量の41％）であり、融点は92〜106℃であった。
アセトン／ヘキサン1:1中においてRf＝0.48であった。N
MR測定は、この物質がα−及びβ−アノマーのおよそ1:
1の混合物であることを示した。
例４ ７−ヒドロキシメチルクマリンのアルコキシド及
び２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−
Ｄ−リボフラノシルクロリドの反応（７−ヒドロキシメ
チルクマリンの２′−デオキシリボシドの生成） ７−ヒドロキシメチルクマリン（2.49g,14.15mmol）及
び油中の50％水素化ナトリウム（747mg,15.57mmol）
を、1,2−ジメトキシエタン125mlに加えた。懸濁液が生
じた。次いで２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−ｐ−トルオ
イル−α−Ｄ−リボフラノシルクロリド（5.50g,14.15m
mol）を、迅速に撹はんした懸濁液にゆっくりと少しず
つ加えた。５分後、氷酢酸1mlを加えて反応混合物を中
和した。次いで反応混合物を濾過し、そして減圧濃縮し
て油にした。次いでこの油を、溶離液として酢酸エチル
／ヘキサン（EtOAc/Hex）1:1を用いたシリカゲルクロマ
トグラフィーによって精製した。生成物を含有する画分
をTLCにより同定し、そしてプールして減圧下で油に濃
縮した。生成物はTLCにより均質であった。NMR測定は、
生成物がα−及びβ−アノマーをおよそ1:1の比率で含
有する混合物であることを示した。収量:3.77g（理論量
の50％） 例５ ７−ヒドロキシメチルクマリンの3,5−ジ−Ｏ−
ｐ−トルオイル−２′−デオキシリボシドからのｐ−ト
ルオイル基の除去 例４由来の７−ヒドロキシメチルクマリンの３′,5′−
ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２′−デオキシリボシド（2.
6g,4.92mmol）を、ピリジン／メタノール／水（65:30:
5）25mlに溶解し、そして氷水で簡単に冷却した。次い
でピリジン／メタノール／水（65:30:5）中の2M NaOH2
5mlを氷浴中で撹はんしながら加えた。20分後、NH4Cl3.
2gを添加して反応を停止させた。沈澱物を濾過して取り
去り、次いで減圧で濃縮して乾燥させた。残留物をEtOA
c/アセトン（9:1,10ml）に吸収させ、そしてその溶液を
幅50mm高さ152mmのシリカゲルカラムに適用して、EtOAc
/アセトン（9:1）で溶出した。画分をTLCによって同定
した。溶出液中の生成物のRfは約0.42であった。生成物
（α−及びβ−アノマー混合物）を含有する画分を減圧
で濃縮すると、生成物600mg（収率42％）が得られた。
例６ ７−ヒドロキシメチルクマリンの２′−デオキシ
リボシドの５′−位における4,4′−ジメトキシトリチ
ル誘導体の調製 例５由来の７−クマリニル−メチル−β−Ｄ−２′−デ
オキシリボシド（580mg,1.98mmol）、４−N,N−ジメチ
ルアミノピリジン（12mg）、及びトリエチルアミン（38
5μl,2.77mmol）をピリジン20mlに加えた。得られた溶
液に、4,4′−ジメトキシトリチルクロリド（812mg,2.4
0mmol）を加えた。次いで反応混合物を３時間撹はんし
た。次いで混合物を水25mlで処理し、そして得られた混
合物をエチルエーテル２×120mlで抽出した。混合した
エーテル抽出物を減圧で濃縮し、アセトン／塩化メチレ
ン（0.5:9.5）2.5mlに溶解し、そして同じ溶剤（２％ト
リエチルアミン含有）を用いたシリカゲルカラムのクロ
マトグラフィーによって精製した。二つの画分（同じ溶
出系におけるシリカゲル薄層クロマトグラフィーによる
rf0.30及び0.40）が得られた。これらの画分は、分離さ
れたα−及びβ−アノマーである。rf0.40画分の収量:3
65mg。
例７ ７−ヒドロキシメチルクマリンの２′−デオキシ
リボシドの５′−位における4,4′−ジメトキシトリチ
ル誘導体のＨ−ホスホネートの調製 三塩化リン（257.4μl,29.5mmol）及びＮ−メチルモル
フォリン（3.24ml,29.5mmol）を塩化メチレン30mlに溶
解した。次いでその溶液にトリアゾール（678mg,9.82mm
ol）を加えた。30分後、反応混合物を０℃に冷却し、そ
して乾燥塩化メチレン8ml中の例６のDMT誘導体（350mg,
0.589mmol;CH3CNから共蒸発により乾燥した）を撹はん
しながら20分間かけて滴下して添加した。添加開始から
30分後、反応混合物をpH8.5の1M重炭酸トリエチルアン
モニウム24mlに注ぎ込み、そして分液漏斗中で振った。
有機相を分離した。水相を塩化メチレン8mlで抽出し、
そして混合した有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。次
いで乾燥した有機相を濃縮してフォーム（foam）にし、
塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミン（500:4
0:6）1.5mlに溶解し、そして同じ溶剤のシリカゲルクロ
マトグラフィーによって精製した。収量：ガラス状の50
0mg。
例８ 本発明のヌクレオシド類似体を含有するオリゴデ
オキシヌクレオチドの調製 FroehlerらのＨ−ホスホネート法（Nucleic Acids Rese
arch（1986）14:5399）を用いて、以下のオリゴヌクレ
オチドを作製した。
５′−CAGCCTTXA−３′ 上記式中、Ｘは（７−クマリニル）メチル−β−Ｄ−
２′−デオキシリボシドであり、そしてA,C,G、及びＴ
はヌクレオチドにおける通常の意味を有する。
作製後、オリゴヌクレオチド（10mg）を有する固体支持
体を1M Na2CO3（200ml）を用いて50℃で２時間処理し、
次いで濃アンモニア2mlを添加し、そして55℃で18時間
加熱した。次いでオリゴヌクレオチドをポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製した。
オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドとの特異
的ハイブリダイジング及び（光活性化後の）架橋におい
て有効であることが示された。
例９ ７−ヒドロキシメチルクマリンの２′−デオキシ
リボシドの５′−位における4,4′−ジメトキシトリチ
ル誘導体の３′−Ｏ−（Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−
ホスホラミダイト誘導体の調製 例６の手順由来の乾燥DMT誘導体（827μg,1.39mmol）
を、ジイソプロピルエチルアミン（1.21ml,5.56mmol）
及びジクロロメタン（3ml）で処理する。この懸濁液
を、それが透明溶液になるまで撹はんする。次いでクロ
ロ−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィン（4
00μl,2.09mmol）を加える。反応混合物を15分間撹はん
し、その後無水メタノール（20μｌ）を添加して反応を
停止させる。次いで反応混合物を酢酸エチル（30ml）及
びトリエチルアミン（1.5ml）で希釈し、そして10％炭
酸ナトリウム水溶液（２×20ml）、次いで飽和塩化ナト
リウム水溶液（２×20ml）で抽出する。次いで有機相を
減圧で濃縮する。生成物を、展開溶剤として酢酸エチル
／ジクロロメタン／トリエチルアミン（45:45:10）を用
いたシリカゲルのクロマトグラフィーによって精製す
る。生成物を含有する画分を減圧濃縮すると、白色粉末
が得られる。収量は約１グラムである。メチルホスホラ
ミダイトの代わりにシアノエチルホラミダイトを作製す
るためには、クロロ−N,N−ジイソプロピルアミノメト
キシホスフィンの代わりにクロロ−N,N−ジイソプロピ
ルアミノシアノエトキシホスフィン（479μl,2.09mmo
l）を使用する。
本明細書中に述べたすべての文献及び特許出願は、本発
明が関する当業者の技術レベルを表示する。すべての文
献及び特許出願は、あたかも各個別の文献または特許出
願が詳細にそして個別に参照として取り込まれているこ
とが示されているかのように、同程度で参照としてここ
で取り込まれる。
本発明はここで完全に記述されており、添付の請求の範
囲または精神から逸脱することなく、多くの変化または
改変を行うことができることは、通常の当業者には明ら
かである。

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】結合基Ｘによって糖部分に結合されている
    クマリン部分を含んで成る光活性化可能な化合物におい
    て、前記化合物が、以下の化学式、 （式中、ｎは０、１、２または３であり； 各Ｗは、独立的に、ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボ
    ニル、カルボキシル、ヒドロキシ、もしくはアミノ置換
    基；前記置換基の水素１個が、炭素原子15個未満を含有
    するヒドロカルビル基によって置換されている前記置換
    基の一つ；炭素原子15個未満を含有する未置換ヒドロカ
    ルビル基；または炭素原子15個未満を含有し且つ前記置
    換基の少なくとも一つで置換されているヒドロカルビル
    基を表し； Ｙ及びＺは、独立的に、Ｈまたは低級アルキルを表し； Ｘは、炭素原子１〜５個;O、Ｓ及びＮから成る群より選
    択されたヘテロ原子０〜４個；及びハロゲン原子０〜2m
    個（ｍはＸ中の炭素原子数である）を含有する有機結合
    基であり、そしてＸは、前記クマリン部分を前記糖部分
    に結合させている原子１〜４個の１本の結合鎖を含有
    し； ＲはＨまたは−OR1であり；そして R1、R2及びR3は、独立的に、Ｈ、ヒドロキシル保護基ま
    たは前記化合物をヌクレオシド、ヌクレオシド誘導体、
    ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドに結合させるこ
    とができるヒドロキシルカップリング有機基を表す） で示される前記光活性化可能な化合物。
  2. 【請求項２】前記結合基がクマリン部分の７−位に共有
    結合している、請求の範囲１記載の化合物。
  3. 【請求項３】R1、R2及びR3が、独立的に、Ｈ、オリゴヌ
    クレオチドのinvitro合成に用いられるヒドロキシル保
    護基または前記化合物をヌクレオシド、ヌクレオシド誘
    導体、ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドに結合さ
    せることができるヒドロキシルカップリング有機基を表
    す、請求の範囲１記載の化合物。
  4. 【請求項４】ＲがＨまたは−OHであり、そしてR2及びR3
    が、独立的に、Ｈを表す、請求の範囲１記載の化合物。
  5. 【請求項５】ＸがX2、OX2、SX2、またはNHX2（式中、X2
    はC1〜C5ヒドロカルビル基または０〜２個のカルボニル
    酸素で置換されたC1〜C5ヒドロカルビルオキシ基であ
    り、但し、Ｏ、ＳまたはNHがＸの一部として存在する場
    合は、X2の炭素原子が前記Ｏ、Ｓ若しくはNHと結合し、
    且つ前記Ｏ、ＳまたはNHが前記化学式のフラノース環の
    １′−位に結合している）である、請求の範囲１記載の
    化合物。
  6. 【請求項６】ＸがX2またはOX2である、請求の範囲５記
    載の化合物。
  7. 【請求項７】Ｘが、 （式中、ｍは２〜４の整数であり、そしてX3は−NH−、
    −Ｏ−、または−Ｓ−である）である、請求の範囲５記
    載の化合物。
  8. 【請求項８】R1がＨである、請求の範囲５記載の化合
    物。
  9. 【請求項９】R1が４−メトキシテトラヒドロピラン−４
    −イルである、請求の範囲５記載の化合物。
  10. 【請求項１０】R2が、H;ベンゾイル；（C1〜C4アルキ
    ル、C1〜C4アルコキシル、シアノ、ニトロ若しくはハロ
    ゲンで置換された）ベンゾイル；トリチル；または（C1
    〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシル、シアノ、ニトロ、
    若しくはハロゲンで置換された）トリチルである、請求
    の範囲５記載の化合物。
  11. 【請求項１１】R3が、H;ベンゾイル；（C1〜C4アルキ
    ル、C1〜C4アルコキシル、シアノ、ニトロ若しくはハロ
    ゲンで置換された）ベンゾイル；トリチル；または（C1
    〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシル、シアノ、ニトロ、
    若しくはハロゲンで置換された）トリチルである、請求
    の範囲５記載の化合物。
  12. 【請求項１２】結合基Ｘによって糖部分に結合されてい
    るクマリン部分を含んで成る光活性化可能な化合物にお
    いて、前記化合物が、以下の化学式、 （式中、ｎは０、１、２または３であり； 各Ｗは、独立的に、ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボ
    ニル、カルボキシル、ヒドロキシ、もしくはアミノ置換
    基；前記置換基の水素１個が、炭素原子15個未満を含有
    するヒドロカルビル基によって置換されている前記置換
    基の一つ；炭素原子15個未満を含有する未置換ヒドロカ
    ルビル基；または炭素原子15個未満を含有し且つ前記置
    換基の少なくとも一つで置換されているヒドロカルビル
    基を表し； Ｙ及びＺは、独立的に、Ｈまたは低級アルキルを表し； Ｘは、炭素原子１〜５個;O、Ｓ及びＮから成る群より選
    択されたヘテロ原子０〜４個；及びハロゲン原子０〜2m
    個（ｍはＸ中の炭素原子数である）を含有する有機結合
    基であり、そしてＸは、前記クマリン部分を前記糖部分
    に結合させている原子１〜４個の１本の結合鎖を含有
    し； ＲはＨまたは−OR1であり；そして R1、R2及びR3は、独立的に、Ｈ、ヒドロキシル保護基ま
    たは前記化合物をヌクレオシド、ヌクレオシド誘導体、
    ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドに結合させるこ
    とができるヒドロキシルカップリング有機基を表すが、
    但し、R2及びR3の少なくとも一方は、３′,5′−リン酸
    ジエステル結合によって前記化合物に結合したヌクレオ
    チドまたはポリヌクレオチドを表す） で示される前記光活性化可能な化合物。
  13. 【請求項１３】前記結合基がクマリン部分の７−位に共
    有結合している、請求の範囲12記載の化合物。
  14. 【請求項１４】R1、R2及びR3が、独立的に、Ｈ、オリゴ
    ヌクレオチドのinvitro合成に用いられるヒドロキシル
    保護基または前記化合物をヌクレオシド、ヌクレオシド
    誘導体、ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドに結合
    させることができるヒドロキシルカップリング有機基を
    表すが、但し、R2及びR3の少なくとも一方は、３′,5′
    −リン酸ジエステル結合によって前記化合物に結合した
    ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを表す、請求の範
    囲12記載の化合物。
  15. 【請求項１５】ＲがＨまたは−OHであり、そしてR2及び
    R3が、独立的に、Ｈを表すが、但し、R2及びR3の少なく
    とも一方は、３′,5′−リン酸ジエステル結合によって
    前記化合物に結合したヌクレオチドまたはポリヌクレオ
    チドを表す、請求の範囲12記載の化合物。
  16. 【請求項１６】ＸがX2、OX2、SX2、またはNHX2（式中、
    X2はC1〜C5ヒドロカルビル基または０〜２個のカルボニ
    ル酸素で置換されたC1〜C5ヒドロカルビルオキシ基であ
    り、但し、Ｏ、ＳまたはNHがＸの一部として存在する場
    合は、X2の炭素原子が前記Ｏ、Ｓ若しくはNHと結合し、
    且つ前記Ｏ、ＳまたはNHが前記化学式のフラノース環の
    １′−位に結合している）である、請求の範囲12記載の
    化合物。
  17. 【請求項１７】ＸがX2またはOX2である、請求の範囲16
    記載の化合物。
  18. 【請求項１８】Ｘが、 （式中、ｍは２〜４の整数であり、そしてX3は−NH−、
    −Ｏ−、または−Ｓ−である）である、請求の範囲16記
    載の化合物。
  19. 【請求項１９】R1がＨである、請求の範囲16記載の化合
    物。
  20. 【請求項２０】R1が４−メトキシテトラヒドロピラン−
    ４−イルである、請求の範囲16記載の化合物。
  21. 【請求項２１】R2が、H;ベンゾイル；（C1〜C4アルキ
    ル、C1〜C4アルコキシル、シアノ、ニトロ若しくはハロ
    ゲンで置換された）ベンゾイル；トリチル；または（C1
    〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシル、シアノ、ニトロ若
    しくはハロゲンで置換された）トリチルである、請求の
    範囲16記載の化合物。
  22. 【請求項２２】R3が、H;ベンゾイル；（C1〜C4アルキ
    ル、C1〜C4アルコキシル、シアノ、ニトロ若しくはハロ
    ゲンで置換された）ベンゾイル；トリチル；または（C1
    〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシル、シアノ、ニトロ若
    しくはハロゲンで置換された）トリチルである、請求の
    範囲16記載の化合物。
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