JPWO2005026187A1 - 非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用 - Google Patents

Abstract

本発明は、非天然型塩基を有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体を提供することを目的とする。本発明のヌクレオシド等は、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基、ここにおいて、チアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位は置換されていてもよい、を塩基として有することを特徴とする。

Description

本発明は、２００３年９月１０日に提出された日本国特許出願２００３−３１８８０１に基づく優先権を主張する。

本発明は、非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用に関する。

生体高分子である核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）は、生命活動に必要となる膨大な量の遺伝情報を、僅か４種類の塩基の組合せからなる配列として記録している。また、核酸は自分自身を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼにより自己複製し、さらにＲＮＡポリメラーゼによる転写、リボソームによる翻訳というプロセスを介して、ＤＮＡからＤＮＡへ、ＤＮＡからＲＮＡへ、ＲＮＡからタンパク質へと遺伝情報を伝達する。この遺伝情報の複製と伝達を可能としているのは排他的な塩基対形成（Ａ・Ｔ／Ｕ、Ｇ・Ｃ）のルールである。また、核酸は、多様な高次構造を形成して様々な機能を発揮する。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション法によって、アプタマーやリボザイムの機能を有する新規核酸がこれまでに多数見つかってきたこともその一つである。

しかし、２０種類のアミノ酸からなるタンパク質に比べて、天然の核酸には４種類の塩基（２種類の塩基対）しかないという事実は、核酸の化学的・物理的多様性に限界を与えている。たとえば、生体中のｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の機能性ＲＮＡは自分自身の構造を安定化したりＲＮＡ・ＲＮＡ間、ＲＮＡ・タンパク質間相互作用を安定化するために、様々な修飾塩基を利用している。したがって、新規機能性核酸の開発において、新たな塩基（対）のレパートリーを増やすことは大変有益であると考えられる。

核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製への取り組みが行われている。核酸に修飾塩基（もしくは非天然型塩基）を導入する手法として、１）化学合成により直接導入する方法、２）核酸合成酵素により導入する方法が考えられる。１）の場合は、アミダイトユニットの安定性や塩基部分の適当な保護基が存在すること等化学合成上の問題の解決が必要である。また、これらの問題が解決されれば様々な非天然型塩基を位置選択的に導入できるが、その核酸の増幅は困難であり、長鎖長の核酸の合成も難しくなる。２）の場合は、もし、基質が酵素に認識され、人工塩基対間で相補的に複製、転写されれば、その核酸の増幅・調製が可能となるが、そのような基質や塩基対（非天然型ヌクレオチド）も未だ開発途中である。

新たな人工塩基を転写によりＲＮＡ中に部位特異的に導入することができれば、新規機能性核酸の開発が可能になるとともに、人工塩基による遺伝暗号の拡張により、非天然型アミノ酸をタンパク質中に取り込ませた人工タンパク質を作り出すことも可能になる。本発明者らは、天然型塩基対と異なる水素結合様式をもち、かつ立体障害によって天然型塩基との対合を排除できるような塩基対を創出するための研究を行い、これまで種々の人工塩基対を開発してきた。特に、プリンの６位にかさ高い置換基を導入した２−アミノ−６−ジメチルアミノプリン（ｘ）と２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）、そしてそのかさ高い置換基に相補する部位に水素原子をもったピリジン−２−オン（ｙ）をデザインし、このｘ・ｙ、ｓ・ｙ塩基対形成をＫｌｅｎｏｗフラグメントによるＤＮＡ中への取り込み効率およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ中への取り込み効率により調べた。

その結果、立体障害を利用した人工塩基対ｓ−ｙは、転写で非常に高い選択性を示した（図２）。このｓ−ｙ塩基対は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写で、鋳型ＤＮＡ中のｓに相補して、ＲＮＡ中に基質ｙが部位特異的に取り込まれた。そして、このｓ−ｙ塩基対を用いて、遺伝暗号を拡張し、非天然型アミノ酸に対応する新たなコドン−アンチコドンをつくり、ｓ−ｙ塩基対の転写と細胞抽出液からの翻訳系を組み合わせることにより、試験管内で非天然型アミノ酸を部位特異的に含むタンパク質の合成に成功している（図２）。また、光架橋反応基であるヨードや固相担体上のアビジンと結合するビオチンの誘導体を塩基ｙの５位に結合することにより、この修飾されたｙの基質を転写によりＲＮＡ中に導入することにより、新たな機能性ＲＮＡの創製を可能とした（特願２００２−２０８５６８（２００２年７月１７日）、ＰＣＴ／ＪＰ０３／０２３４２（２００３年２月２８日）、未公開）。

このように、ｓ−ｙ塩基対は、転写で高い選択性を示した。しかしながら、鋳型ＤＮＡ中のｓに対する基質ｙの取り込みの転写効率は、天然型塩基対の転写効率と比較すると５０−６０％程度に低下する（図３）。この理由の１つは、ｓの６位に結合するチエニル基の配向が２種類存在し、チエニル基のＣ−Ｈが塩基対を形成する側に位置した場合、これとｙとの間に立体障害が生じ、ｙの取り込みを妨げる可能性があることにある（図４）。高い選択性のみならず、高い取り込み効率を有する非天然型塩基が開発されれば、機能性ＲＮＡやタンパク質の大量供給が可能になり、これらのバイオポリマーを実用化することができる。
米国特許第５，４３２，２７２号 米国特許第６，００１，９８３号 米国特許第６，０３７，１２０号 国際公開第０１／００５８０１号パンフレット Ｐｉｃｅｉｒｉｌｌｉ，Ｊ．Ａ．，Ｋｒａｕｃｈ，Ｔ．，Ｍｏｒｎｅｙ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ａ．（１９９０）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｉｎｔｏ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｐｈａｂｅｔ．Ｎａｔｕｒｅ，３４３，３３−３７． Ｐｉｃｅｉｒｉｌｌｉ，Ｊ．Ａ．，Ｍｏｒｏｎｅｙ，Ｓ．Ｅ．，ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ａ．（１９９１）Ａ Ｃ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒ：ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｍｙｃｉｎ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎｔｏ ＲＮＡ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１０３５０−１０３５６． Ｓｗｉｔｚｅｒ，Ｃ．Ｙ．，Ｍｏｒｎｅｙ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｒ，ＳＡ．（１９９３）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｓｏｃｙｔｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｉｓｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１０４８９−１０４９６． Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．（１９９９）Ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ＤＮＡ：Ｍｏｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｎ Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｓ？Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，２３２３−２３２４． Ｎａｇａｔｓｕｇｉ，Ｆ．，Ｕｅｍｕｒａ，Ｋ．，Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｍａｅｄａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ，Ｓ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，３０３５−３０４４，１９９７ Ｗｕ，Ｙ．，Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｘ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．，ＭｅＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．ａｎｄ Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．（２０００）Ｅｆｆｏｒｔｓ ｔｏｗａｒｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｐｈａｂｅｔ：Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｂａｓｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２，７６２１−７６３２． Ｔａｅ，Ｅ．Ｌ．，Ｗｕ，Ｙ．，Ｘｉａ，Ｇ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．ａｎｄ Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．（２００１）Ｅｆｆｏｒｔｓ ｔｏｗａｒｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｐｈａｂｅｔ：Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３，７４３９−７４４０． Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｈｉｒａｏ，Ｉ．ａｎｄ Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．（２０００）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ３−（２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ−２−ｏｎｅ ａｎｄ ２−ａｍｉｎｏ−６−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−９−（２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）ｐｕｒｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１，３９３１−３９３４． Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，Ｏｈｔｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔ．，Ｍｉｔｓｕｉ，Ｔ．，Ｙｏｋｏｇａｗａ，Ｔ．，Ｏｋｕｎｉ，Ｔ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｈ．，Ｔａｋｉｏ，Ｋ．，Ｙａｂｕｋｉ，Ｔ．，Ｋｉｇａｗａ，Ｔ，，Ｋｏｄａｍａ，Ｋ．，Ｙｏｋｏｇａｗａ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．（２００２）Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０，１７７−１８２． Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔ．，Ｋｉｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｈｉｒａｏ，Ｉ．ａｎｄ Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．（２００１）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ６−（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｅｌｅｏｓｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｔｈａｔ ｆｏｒｍ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ ｗｉｔｈ ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｏｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １１，２２２１−２２２３． Ｏｈｔｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｋｉｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｍｉｔｓｕｉ，Ｔ．，Ｈｉｒａｏ，Ｉ．ａｎｄ Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．（２００１）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，４９２２−４９２５． Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．，Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｓ．，Ｂｌｏｏｍ，Ｌ．Ｂ．，Ｐｅｔｒｕｓｋａ，Ｊ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８，８３−１２６（１９９３）

本発明は、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基、ここにおいて、チアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位は置換されていてもよい、を塩基として有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体（以下、本明細書中、「ヌクレオシド等」と記載する場合がある。）を提供することを目的とする。

本発明のヌクレオチド等は、好ましくはチアゾリル基の４位及び／又は５位は置換されていてもよい、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基を塩基として有する。

本発明はまた、前記ヌクレオチドが組み込まれた核酸を提供することを目的とする。本発明の核酸は、好ましくは、前記ヌクレオチドと、５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している。

本発明はさらに、５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を調製する方法であって、本発明のヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、複製又は逆転写を行い、本発明のヌクレオチドの相補的な位置に、５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを組み込むことを含む方法、を提供することを目的とする。

本発明はさらにまた、本発明のヌクレオチドを含む核酸、並びに、５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含むキット、を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記問題の解決のために、２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）中のチエニル基の代わりにチアゾリル基を用いた新たな塩基２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン（ｖ）をデザインした（図４）。このｖのチアゾリル基もｓのチエニル基の場合と同様に２つの配向性が存在するが、どちらの配向をとっても、塩基対面には硫黄原子又は窒素原子のいずれかが位置する。よって、ｓのチエニルにおけるＣ−Ｈ基のような立体的に突出する置換基がないので、ｙとの塩基対形成に立体障害を及ぼさない。さらに、この塩基ｖのヌクレオシド誘導体を合成し、複製や翻訳におけるｖ−ｙ塩基対の選択性と効率を調べた。その結果、ｖを導入した鋳型ＤＮＡを用いた転写で、ｙが効率よくＲＮＡ中に導入されることを見出し、本発明を想到した（図３）。

２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基、を塩基として有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体
本発明は、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基、を塩基として有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体を提供する。塩基中のチアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位は置換されていてもよい。本発明のヌクレオシド等は、典型的には、図１に記載された構造を有する。本発明のヌクレオシド等は、塩基中のチアゾリル基又はオキサゾリル基には２つの配向性が存在するが、どちらの配向をとっても、ｓのチエニルにおけるＣ−Ｈ基のような立体的に突出する置換基がないので、ｙとの塩基対形成に立体障害を及ぼさない、という利点を有する。

本発明における「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。なお、前記「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、及びこれら塩基の誘導体も含む概念である。前記塩基の「誘導体」の種類は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基に相当する塩基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基に相当する塩基などが挙げられる。「ヌクレオチド」は、前記ヌクレオシドの糖部分が、リン酸とエステルをつくっている化合物をいう。より好ましくは、１ないし３リン酸エステルである。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分はリボフラノシル、２−デオキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を２位に有する２−置換リボフラノシルであってもよく、また、リン酸部分は、チオリン酸であってもよい。つまり、糖部分およびリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、あるいはこれらの誘導体にみられる構成をとっていればよい。糖部分がリボフラノシルであるリボヌクレオチドはＲＮＡの構成成分となり、デオキシリボフラノシルであるデオキシリボヌクレオチドはＤＮＡの構成成分となる。

本発明のヌクレオシド等は典型的には図１に示すような構造を有する。塩基中のチアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位（図１のＲ^１及び又はＲ^２）は水素であるか、あるいは以下の
１）低級アルキル基；
２）ヨウ素、臭素から選択される光反応性基；
３）アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体；
４）ビオチン又はその誘導体；あるいは
５）フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラメチル−６−カルボキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子
からなるグループから選択される置換基によって置換されていてもよい。好ましくは、４位又は５位の片方のみが置換される。好ましくは、置換基は低級アルキル基である。

１）低級アルキル基とは、Ｃ１からＣ４の直鎖または分岐鎖を有するアルキル基で、二つのアルキル基で環を形成することもあり得る。好ましくはメチル基である。

２）ヨウ素、臭素から選択される光反応性基は、光照射することによりラジカルを発生させ、隣接する分子を共有結合する。これにより、本発明のヌクレオチドを含む核酸と他分子（好ましくは生体分子）との多量体を形成させることも可能である。

３）置換基として、アルケニル基、アルキニル基若しくはアミノ基、又はその誘導体を有することも可能である。アルケニル、アルキニル、アミノ基、又はその誘導体は、他分子と疎水的あるいは親水的な相互作用に役立ち、例えば、アプタマーとそのターゲットとなる分子との間の相互作用を強めることができる。また、リボザイムの場合には、新たな活性部位を創製することが出来る。さらに、アミノ基の誘導体は、このものからビオチンや蛍光色素の結合した誘導体の合成中間体にもなる。

アルケニル基又はアルキニル基は、好ましくは、炭素数２ないし５、より好ましくは、炭素数２ないし３である。誘導体としては、例えば、−Ｃ≡ＣＣ_６Ｈ_５、−Ｃ≡ＣＣＨ_２ＮＨ_２、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−ＮＨ_２が含まれる。好ましくは、−Ｃ≡ＣＣ_６Ｈ_５（２−フェニルエチニル基）である。

４）ビオチンは補酵素Ｒとも呼ばれ、ビタミンＢ群の１種である。ビオチンは、卵白中に含まれる糖タンパク質であるアビジンと特異的に結合し、複合体を形成することが知られている。よって、置換基としてビオチンを有するヌクレオシド等は、アビジンタンパク質に特異的に結合する。このため、ビオチンが結合したヌクレオシド等を含む核酸は、アビジンを結合した担体と結合させることができるので、核酸を固定化することができ、特定の分子に結合する核酸（アプタマーなど）を固定化すれば、例えば、特定物質の検出や単離に、また、診断試薬として利用できる。なお、本発明のヌクレオシド等の置換基としてビオチンを導入するためには、ビオチンを直接導入してもよいが、アミノアルキル基、アミノアルケニル基、アミノアルキニル基等から選択されるリンカーを介することが好ましい。本明細書において「ビオチン誘導体」とは、このようにヌクレオシド又はヌクレオチドに導入するために、リンカーを結合させたビオチンを含む。

５）置換基として、フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラメチル−６−カルボキシローダミン、及びそれらの誘導体から選択される蛍光分子を有する場合、蛍光分子の種類に応じて、本発明のヌクレオチドを含む核酸の検出を行うことが可能である。よって、蛍光分子を有する本発明のヌクレオチドを含む核酸は、標識核酸として当該核酸と相互作用する物質検出のプローブとして使用されうる。限定されるわけではないが、例えば、フルオレセインの吸収極大波長は５１３ｎｍ、蛍光極大波長は５３２ｎｍである。また、６−カルボキシフルオレセインの吸収極大波長は４９５ｎｍ、蛍光極大波長は５２１ｎｍ、テトラメチル−６−カルボキシローダミンの吸収極大波長は５５５ｎｍ、蛍光極大波長は５８０ｎｍである。それぞれの物質によって蛍光色が異なるため、多重染色に使用することも可能である。
本明細書において、「２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基」及び「２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基」とは、特に明記しない限り、塩基中のチアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位は置換されている態様を含みうる。

本発明のヌクレオシド等は、好ましくは、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）プリン−９−イル基又は２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）プリン−９−イル基を塩基として有する。

具体的には、以下の
ｉ）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
ｉｉ）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
ｉｉｉ）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル；
ｉｖ）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル；
ｖ）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
ｖｉ）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
ｖｉｉ）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル；
ｖｉｉｉ）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル；
ｉｘ）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
ｘ）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
ｘｉ）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル；及び
ｘｉｉ）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル
を含む。本明細書において、「２−アミノ−６−（２−チアゾリル）」と記載した場合、「２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）」及び「２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）」に関する説明も包含しうる。

本発明の２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基又は２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基を有するヌクレオシド等は、特に限定されることなく公知の方法を用いて合成することができる。例えば、非限定的に、本明細書中の実施例１では、先ず、チアゾール基として２−トリブチルスズチアゾール（図５の化合物３ａ）を合成し、これを公知の２−アミノ−６−トシルオキシ−９−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（図５の化合物４）（Ｎａｇａｔｓｕｇｉ，Ｆ．，Ｕｅｍｕｒａ，Ｋ．，Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｍａｅｄａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ，Ｓ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，３０３５−３０４４，１９９７）に導入した。次いで、デオキシリボース基上の保護基ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を遊離させることによって、本発明のヌクレオシドが得られた。

本発明のヌクレオシド等の合成経路としては、その他、２−アミノ−６−トシルオキシ−９−（２−デオキシ−３、５−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（図５の化合物４）の６位トシルオキシ基の代わりにアルキルスルホニルオキシ基または他のアリールスルホニルオキシ基を用いることが可能である。また２−アミノ−６−トシルオキシプリンより２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリンを合成し、デオキシリボース誘導体またはリボース誘導体と反応させることにより目的化合物を合成することも可能である。

本発明のヌクレオシド等は、ヌクレオシド又はヌクレオチドの「誘導体」も含む。これらの誘導体には、例えば、ホスホロアミダイト誘導体、Ｈ−ホスホナート誘導体が含まれる。

ホスホロアミダイト誘導体は、核酸の化学合成に使用するためにヌクレオシド中の１またはそれより多くの箇所において置換基が保護基で修飾されている態様である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（２００１）、１０．４２−１０．４６）。具体的には、（デオキシ）リボース残基の５’−水酸基は、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル基、レブリニル基などの核酸合成に用いられる５’位保護基で保護されうる。これは、５’−水酸基が核酸の化学合成の際に投入されるホスホロアミダイトヌクレオシドと反応するのを防止するためである。また、投入されるホスホロアミダイトヌクレオシド上の（デオキシ）リボース残基に結合した三価のリン酸基は、ジイソプロピルアミノ基等で保護されうる。これは、結合の際に、テトラゾール等によって活性化されるためである。この三価のリン酸基はまた、シアノエチル、メトキシ等も結合する。これは、側鎖の反応を抑制するためである。さらに、塩基のプリン環のアミノ基は、フェノキシアセチル基、イソブチリル基等で保護されうる。これは、環外アミノ基の求核機能を保護するためである。本発明のホスホロアミダイト誘導体は、これらの保護基が１またはそれより多くの箇所において導入されている。好ましくは、上述した全ての箇所において保護基が導入されている。本発明のホスホロアミダイト誘導体の例として、２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２−チアゾリル）−９−［２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスフォルアミジル）−β−Ｄ−リボフラノシル］プリン（図６の化合物９ａ）、２−フェノキシアセチルアミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−［２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスフォルアミジル）−β−Ｄ−リボフラノシル］プリン（図６の化合物９ｂ）、及び、２−フェノキシアセチルアミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−［２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスフォルアミジル）−β−Ｄ−リボフラノシル］プリン（図６の化合物９ｃ）が含まれる。

本発明のヌクレオチが組み込まれた核酸
本発明はまた、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基、ここにおいて、チアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位は置換されていてもよい、を塩基として有するヌクレオチドが、１又はそれより多く組み込まれた核酸を提供する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡを含む。二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡであってもよい。また、ＤＮＡには、ＲＮＡを鋳型として逆転写してなるｃＤＮＡも含まれる。あるいは、核酸は３本鎖、４本鎖等も形成しうる。

本発明のヌクレオシド等は、５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドと塩基対を形成することが可能である。本発明の２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基は、図４に例示したように、２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）と同様に、５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イルと、２箇所で水素結合を生じる。

本発明の２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基、ここにおいて、チアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位は置換されていてもよい、を塩基として有するヌクレオチドは、転写、複製又は逆転写反応により、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸に取り込むことが可能である。あるいは、天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドと同様に、化学合成によってＤＮＡ又はＲＮＡに取り込んでもよい。

転写、複製又は逆転写反応は公知の方法に従って行うことが可能である。限定されるわけではないが、例えば、転写反応はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ等）、複製反応は、クレノウフラグメント（ＫＦ）、逆転写反応はＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ−ＲＴ）（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用することが可能である。複製反応は、反応中に６位置換された２−アミノ−プリン−９−イル基を有するヌクレオチドが除去されてしまうのを防ぐために、例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をもたないＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ^ＴＭ）を用いてｖを含むプライマーによる鋳型ＤＮＡのＰＣＲ増幅も可能である。
本発明のヌクレオシド等は、塩基中のチアゾリル基又はオキサゾリル基には２つの配向性が存在するが、どちらの配向をとっても、ｓのチエニルにおけるＣ−Ｈ基のような立体的に突出する置換基がないので、ｙとの塩基対形成に立体障害を及ぼさない、という利点を有する。そのため、表１及び図９に示されたように、本発明のヌクレオチドｖに対するｙの１塩基取り込み効率は、Ｖｍａｘ／Ｋｍ＝１．４ｘ１０^５であり、天然塩基のＡ／Ｔ間の取り込み効率と同程度の高さであった。また、ｓに対するｙの取り込み効率よりも、約４倍高かった。よって、本発明のヌクレオシドは効率よくｙと塩基対を形成することが示されている。また、選択性に関しては、ｖに対するｙの取り込み効率は、Ｃの取り込みの約３倍、Ｔの取り込みの２０倍以上であった。

また、伸長反応中のｙの選択的導入についても、ｓ−ｙ塩基対よりもｖ−ｙ塩基対の方が、複製の効率が高いことが示さされた（図１２）。さらに、非天然型塩基が鋳型中に２個またはそれより多く連続する場合も、本発明のヌクレオチドを含む核酸は有用である。図１３に示されたように、対照のｓを２つ並べて導入した鋳型ＤＮＡを用いた場合、ｙはほとんど取り込まれず伸長産物は実質的に得られない。これに対し本発明のヌクレオチドｖは２つ並んでいても複製が進行し、２つの基質ｙが相補鎖ＤＮＡ中に取り込まれた産物が得られる。

さらに、本発明のヌクレオチドは転写反応においても有用である。具体的には図１５に示されたように、対照のｓを含む鋳型に対する基質ｙのＲＮＡ中への取り込み効率は、天然型塩基対（ＡＴ）の場合に比べて５０−６０％程度であった。これに対し、本発明のｖを含む鋳型に対する基質ｙの取り込み効率は９６％であり、天然型塩基対とほぼ同程度の高さである。また、複製の場合と同様に転写においても、鋳型に非天然型塩基が鋳型中に２またはそれより多く連続する場合も本発明のヌクレオチドを含む核酸は有用である。鋳型中に対象ｓを２つ並べた場合（ＮＮ＝ｓｓ）、２つのｙが取り込まれたＲＮＡは得られなかった。これに対し、鋳型中にｖが２つ並んでいる場合（ＮＮ＝ｖｖ）は転写が進行し、その効率は３０％程度であったが、２つの基質ｙがＲＮＡ中に取り込まれた（図１６）。

このように、塩基ｓの代わりにｖを利用することにより、期待されたとおりに、複製、転写ともに基質ｙの取り込み効率を向上させることができる。さらに、従来不可能であった、非天然型塩基ｙが２つ又はそれより多く連続して配置されるＤＮＡ及びＲＮＡの作成も可能である。これは、人工塩基対を介して、機能性コンポーネントをＲＮＡ中に導入した新規機能性ＲＮＡやタンパク質の開発とそれらの大量調製を初めて可能とし、これらの新規バイオポリマーの商業化に大きく貢献する。

本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸は、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム又はアプタマーとして使用されうる。アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡとは、ある特定の遺伝子の発現を抑えるＤＮＡ又はＲＮＡである。標的とする遺伝子配列（センス鎖）の全長又は部分配列に対して相補的という意味で名付けられた。人為的に遺伝子発現を調節する手法として使用されうる。本発明のヌクレオチドが組み込まれたアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは、非天然型塩基を含むため標的に対する相補性が天然型塩基のみを使用した場合と比較して異なるものを創製しうる。リボザイムは、ＲＮＡを構成成分とする触媒の総称である。アプタマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション法によって得られた、タンパク質等の特定の分子に結合する機能を有する核酸である
また、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれたＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、合成ＲＮＡ）は、タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。本発明の核酸は遺伝子断片やプローブなどとして使用されうる。天然の遺伝子の一部又は全部を本発明の核酸で置換した態様、天然の遺伝子に本発明のヌクレオチドを１個又はそれより多く付加したもの、又はこれらを組み合わせたものも本発明に包含される。このような本発明の核酸（ヌクレオチド）を含む非天然型の遺伝子は、従来の天然型の遺伝子の改変と同様な方法又は従来の方法に準じた方法により行うことができる。従って、従来の天然型の遺伝子と同様に、本発明の核酸を含む非天然型の遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞を形質転換することによって、発現させることが可能である。

また、本発明のヌクレオチドを含む新たなコドンを設計することが可能である。本発明のヌクレオチドの一態様として、塩基２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリンを含むヌクレオチド（ｖ）を例に説明する。前述したように、鋳型中に本発明のヌクレオチドが２つまたはそれ以上連続して存在する場合でも、複製反応及び転写反応は進行し、相補的な位置に５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチド（ｙ）が取り込まれる。よって、本発明の方法により従来不可能であった、非天然型塩基ｙが２つ又はそれより多く隣接して配置されるＤＮＡ及びＲＮＡの作成が可能である。よって、ｙを３つ含むコドン（ｙｙｙ）、ｙを２つ含むコドン（例えば、ｙｙＡ、Ｇｙｙ、ｙＧｙ）、ｙを１つ含むコドン（例えば、ｙＡＧ、ＣｙＴ、ＡＧｙ）を設計することができる。またｖを含むコドンの作成も可能である。新たなコドンは、天然型のアミノ酸をコードさせることもできるし、また、非天然型のアミノ酸をコードさせることもできる。さらに、転写や輸送などの機能をコードさせることもできる。このように、本発明は新規な非天然型人工塩基を提供するのみならず、本発明のヌクレオチドを含む新たなコドンの設計による、全く新しい遺伝暗号の設計を可能とするものであり、新たな遺伝暗号の世界を提供するものである。

さらに、本発明の新たなコドンに応じたｔＲＮＡ系を設計することにより、非常に多くのアミノ酸を利用可能とする新たなタンパク質合成システムを設計することができる。利用可能なアミノ酸はリボソームにおけるタンパク質合成酵素系で利用できるものであればよい。従って、本発明は前記本発明のコドンを用いた新たなタンパク質合成システムを提供する。本発明のタンパク質合成システムによれば、所望の位置のコドンの核酸を本発明の核酸に効率よく置換又は導入することにより、所望の非天然型のアミノ酸を含有するタンパク質の製造が可能となる。

さらにまた、本発明の非天然型塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）においても利用可能である。ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によってその配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象である。ＲＮＡ干渉の典型的な例としては、ｄｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーに属するダイサー（Ｄｉｃｅｒ）により、３’末端の側に２塩基程度のオーバーハングを有する約２１塩基−２３塩基のｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）にプロセッシングされる。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣと呼ばれるｓｉＲＮＡ−蛋白質複合体に取り込まれ、配列特異的にｍＲＮＡを分解する。ＲＮＡ干渉は、哺乳動物（ヒト、マウス等）、線虫、植物、ショウジョウバエ、菌類などの広範な生物種間で保存されている現象であることが示されている。本発明の非天然型塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、ＲＮＡ干渉におけるｓｉＲＮＡとして、または分解を受けるｍＲＮＡの一部として利用可能である。

非天然型塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を調製する方法
本発明はさらに、５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を調製する方法を提供する。本発明の方法は、本発明のヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、複製又は逆転写を行い、本発明のヌクレオチドの相補的な位置に、５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを組み込むことを含む。

前述したように、鋳型中に本発明のヌクレオチドが２つまたはそれ以上連続して存在する場合でも、複製反応及び転写反応は進行し、相補的な位置に５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドが取り込まれる。よって、本発明の方法により従来不可能であった、非天然型塩基ｙが２つ又はそれより多く隣接して配置されるＤＮＡ及びＲＮＡの作成も可能となった。

本発明はさらにまた、前記方法に使用するためのキットも提供する。本発明のキットは、本発明のヌクレオチドを含む核酸、並びに、５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチド、を含む。キット中の本発明のヌクレオチドを含む核酸は、本発明の方法の転写、複製又は逆転写反応における鋳型として利用されうる。

図１は、本発明のヌクレオシド及びヌクレオチドの態様の構造を示す。 図２は、２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）とピリジン−２−オン（ｙ）の人工塩基対、並びにそれを利用したタンパク質合成のスキームを示す。 図３は、２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）とピリジン−２−オン（ｙ）の人工塩基対、並びに、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン（ｖ）とｙの人工塩基対を利用した転写反応の選択性及び効率を示す。 図４は、２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）とピリジン−２−オン（ｙ）の人工塩基対、並びに、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン（ｖ）とｙの人工塩基対の配向と立体障害を示す。 図５は、本発明のヌクレオシド、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリンの合成スキームを示す。

図５中、Ｒ＝ｔ−ブチル−ジメチリシリル；Ｔｓ＝トシルである。ａシリーズは、Ｒ^１＝Ｒ^２＝Ｈ；ｂシリーズは、Ｒ^１＝ＣＨ_３，Ｒ^２＝Ｈ；ｃシリーズは、Ｒ^１＝Ｈ，Ｒ^２＝ＣＨ_３である。図６は、本発明のヌクレオシド誘導体、２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２−チアゾリル）−９−［２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスフォルアミジル）−β−Ｄ−リボフラノシル］プリンの合成スキームを示す。

図６中、Ｐａｃ＝フェノキシアセチル；ＤＭＴ＝４，４’−ジメトキシトリチルである。ａシリーズは、Ｒ^１＝Ｒ^２＝Ｈ；ｂシリーズは、Ｒ^１＝ＣＨ_３，Ｒ^２＝Ｈ；ｃシリーズは、Ｒ^１＝Ｈ，Ｒ^２＝ＣＨ_３である。図７は、本発明のヌクレオチド、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン ５’−三リン酸の合成スキームを示す。

図７中、ＰＰＰ＝トリホスフェートである。ａシリーズは、Ｒ^１＝Ｒ^２＝Ｈ；ｂシリーズは、Ｒ^１＝ＣＨ_３，Ｒ^２＝Ｈ；ｃシリーズは、Ｒ^１＝Ｈ，Ｒ^２＝ＣＨ_３である。図８は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによる１ヌクレオチド挿入反応に使用したプライマー及び鋳型の塩基配列、並びに、反応産物のポリアクリルアミド電気泳動図を示す。 図９は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによる１ヌクレオチド挿入反応における反応速度の解析結果を示す。 図１０は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによる１ヌクレオチド挿入反応における反応速度の解析に使用したプライマー及び鋳型の塩基配列を示す。 図１１は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによる伸長反応に使用したプライマー及び鋳型の塩基配列を示す。 図１２は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによる伸長反応の反応産物のポリアクリルアミド電気泳動図を示す。 図１３は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによる伸長反応の反応産物のポリアクリルアミド電気泳動図を示す。 図１４は、転写反応のスキームを示す。 図１５は、ｔｅｍｐ３５ Ｎ−１を用いた転写反応の反応産物のポリアクリルアミド電気泳動図を示す。転写効率はレーン５を１００％とすると、レーン１、２、３及び４は、各々２３％、９６％、２４％及び６０％であった。 図１６は、ｔｅｍｐ３５ Ｎ−２を用いた転写反応の反応産物のポリアクリルアミド電気泳動図を示す。転写効率はレーン５を１００％とすると、レーン１、２、３及び４は、各々２％、３５％、１％及び６％であった。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

実施例１ ２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン誘導体の合成（図５−７）
１） ２−トリブチルスズチアゾール（化合物３ａ）の合成（図５）
アルゴン雰囲気下、７８℃に冷却したジエチルエーテル（２５ｍｌ）にｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中、１．５７Ｍ，３．２ｍｌ，５．０ｍｍｏｌ）を加え、続いて２−ブロモチアゾール（化合物１）（４５０μｌ，５．０ｍｍｏｌ）を滴下し−７８℃で３０分撹拌した。この溶液に塩化トリブチルスズ（１．５ｍｌ，５．５ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下し、液温が室温になるまで撹拌しながら自然に昇温した（３０分）。

この反応溶液を飽和食塩水で３回洗浄した後、有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧下で留去して２−トリブチルスズチアゾール（化合物３ａ）（２．１ｇ，黄色の液体）を得た。２−トリブチルスズチアゾールは、さらなる精製を行わずに、そのまま次の反応に用いた。

２） ２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物６ａ）の合成（図５）
２−アミノ−６−トシルオキシ−９−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物４）を、Ｎａｇａｔｓｕｇｉら（Ｎａｇａｔｓｕｇｉ，Ｆ．，Ｕｅｍｕｒａ，Ｋ．，Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｍａｅｄａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ，Ｓ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，３０３５−３０４４，１９９７）に従って合成した。化合物４（４９０ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）とＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（４４ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）とＬｉＣｌ（６４ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）にジオキサン（９．４ｍｌ）を加え、１５分間撹拌しながらアルゴンでバブリングした。この溶液に、１）で合成した２−トリブチルスズチアゾール（化合物３ａ）（１．４ｇ，３．８ｍｍｏｌ）を加え、さらに１５分間、アルゴンでバブリングを行った後、オイルバス上で３時間環流した。反応溶液を濃縮した後、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ、ＣＨ_２Ｃｌ_２中で溶出）で精製した。得られた２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物５ａ）（４３０ｍｇ，粗精製物）をＴＨＦ（７．５ｍｌ）に溶解し、ＴＢＡＦ（１Ｍ ＴＨＦ溶液，２．３ｍｌ）を加えて室温で１５分撹拌した。反応溶液を濃縮した後、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ、ＣＨ_２Ｃｌ_２中で溶出）で精製した。

最終的に、ＲＰ−ＨＰＬＣ（１９ｘ１５０ｍｍ，水 μ ｂｏｎｄ ｓｐｈｅｒｅ ５μ Ｃ１８ １００μ，流速：１０ｍｌ／分，Ｈ_２Ｏ中、１０％−５０％ ＣＨ_３ＣＮ，１５分，直線勾配）で精製し、目的とする２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物６ａ）（１５５ｍｇ，６４％，２工程の収率，黄色固体）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ２．２６（ｍ，１Ｈ），２．６５（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｍ，１Ｈ），４．３８（ｍ，１Ｈ），４．９６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．２９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），６．７４（ｓ，２Ｈ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），８．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２），８．４１（ｓ，１Ｈ）；
^１３Ｃ−ＮＭＲ（６８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ３９．３２，６１．５５，７０．５８，８２．５２，８７．５７，１２２．６６，１２３．９３，１４１．６８，１４４．６６，１４７．３６，１５４．７８，１５９．６８，１６４．０３；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_１３Ｈ_１５Ｎ_６Ｏ_３Ｓ（Ｍ＋１）として、計算値３３５．０９２６，測定値３３５．０９２２；ＵＶ−ｖｉｓ（ＥｔＯＨ中）λｍａｘ＝３６０ｎｍ（ε＝８０３０），２９８ｎｍ（ε＝８６２０），２３１ｎｍ（ε＝１８０８０），λｍｉｎ＝３２６ｎｍ（ε＝４２４０），２６５ｎｍ（ε＝３４５０），２１５ｎｍ（ε＝９６６０）；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．１２（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝９：１，ｖ／ｖ）。

３） ２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物７ａ）の合成（図６）
２）で合成した２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物６ａ）（１５０ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）をピリジン（２．２ｍｌ）に溶解し、塩化トリメチルシリル（ＴＭＳ−Ｃｌ）（４２３μｌ，３．３ｍｍｏｌ）を加えて室温で２５分撹拌した（溶液Ａ）。これとは別に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（１０８ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ）にピリジン（２２１μｌ）とアセトニトリル（２２１μｌ）を０℃で冷却し、この溶液に塩化フェノキシアセチル（Ｐａｃ−Ｃｌ）（９２μｌ，０．６７ｍｍｏｌ）を加えて０℃で５分撹拌した（溶液Ｂ）。

溶液Ｂに０℃に冷却した溶液Ａを氷冷下で加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を０℃に氷冷した後、濃アンモニア水（２２０μｌ）とＨ_２Ｏ（２２０μｌ）を加えて０℃で１０分間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルと水を加えて分液し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧下で留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ、ＣＨ_２Ｃｌ_２中で溶出）で精製し、目的とする２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物７ａ）（２００ｍｇ，９５％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ２．３４（ｍ，１Ｈ），２．７８（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｍ，２Ｈ），３．８８（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｍ，１Ｈ），４．９３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），５．１２（ｓ，２Ｈ），５．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．４２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），６．９５（ｍ，３Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５），８．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．１Ｈｚ），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．１），８．７９（ｓ，１Ｈ），１０．９６（ｓ，１Ｈ）；
^１３Ｃ−ＮＭＲ（６８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ４５．６７，６１．４６，６７．３３，７０．４９，８３．２８，８７．９１，１１４．３４，１２０．７１，１２５．１４，１２６．０１，１２９．３０，１４５．１３，１４５．２８，１４６．８５，１５１．８９，１５３．７７，１５７．７５，１６２．７５，１６７．５５；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_２１Ｈ_２１Ｎ_６Ｏ_５Ｓ（Ｍ＋１）として、計算値４６９．１２９４，測定値４６９．１３００；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．２５（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝９：１，ｖ／ｖ）。

４） ２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物８ａ）の合成（図６）
３）で合成した２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物７ａ）（９４ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）をピリジンで３回共沸乾燥した。次いで、４，４’−ジメトキシトリチル塩化物（７５ｍｇ，１．１モル等量）とピリジン（２．０ｍｌ）を加えて室温で２０時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルと５％ ＮａＨＣＯ_３を加え分液した後、有機層を飽和食塩水で２回洗浄した。有機層はＮａ_２ＳＯ_４で乾燥、濃縮した後、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＥｔＯＡｃ＝１：１，ｖ／ｖで溶出）で精製し、目的とする２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（１３３ｍｇ，８６％）（化合物８ａ）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ２．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８），２．６４（ｍ，１Ｈ），２．８９（ｍ，１Ｈ），３．３３−３．４８（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），４．１７（ｍ，１Ｈ），４．４３（ｂｓ，２Ｈ），４．８８（ｍ，１Ｈ），６．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），６．７４（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ＝２．４，９．０），７．０３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７），７．０８−７．３７（ｍ，１２Ｈ），７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．１Ｈｚ），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．１），８．２９（ｓ，１Ｈ）；
^１３Ｃ−ＮＭＲ（６８ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ４１．０８，５５．１６，６４．０６，６７．７６，７２．５８，８４．２７，８６．３８，８６．９１，１１３．０１，１１４．８３，１２２．３３，１２３．６０，１２６．７５，１２７．１７，１２７．７３，１２７．９８，１２９．７１，１２９．８５，１２９．８９，１３３．５３，１３５．６１，１４４．３９，１４４．６６，１４５．７１，１４８．０３，１５１．１９，１５３．７１，１５６．７４，１５８．２６，１６３．４２，１６６．３０；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_４２Ｈ_２３９Ｎ_６Ｏ_７Ｓ（Ｍ＋１）として、計算値７７１．２６０１，測定値７７１．２６３３；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．２２（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝２０：１，ｖ／ｖ）。

５） ２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２−チアゾリル）−９−［２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスフォルアミジル）−β−Ｄ−リボフラノシル］プリン（化合物９ａ）の合成（図６）
４）で合成した２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物８ａ）（１３０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）をピリジンで３回、ＴＨＦで３回共沸乾燥した。次いで、ＴＨＦ（８５０μｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（４４μｌ，１．５モル等量）を加えた。この溶液に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフルアミダイト（４１μｌ，１．１モル等量）を室温で撹拌しながら加えた。

反応溶液は、室温で１．５時間撹拌した後、メタノール（５０μｌ）を加えた。この溶液に酢酸エチル・トリエチルアミンの混合溶液（ＥｔＯＡｃ：ＴＥＡ＝２０：１，ｖ／ｖ，１０ｍｌ）と５％ ＮａＨＣＯ_３（１０ｍｌ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水で３回洗浄した。有機層はＮａ_２ＳＯ_４で乾燥、濃縮した後、残査をシリカゲルカラム クロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ヘキサン＝２：３，ｖ／ｖ，２％ ＴＥＡで溶出）で精製し、目的とする２−フェノキシアセチルアミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスフォルアミジル）−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物９ａ）（１３３ｍｇ，８１％，白色泡状物）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１．０９−１．１８（ｍ，１２Ｈ），２．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），２．６２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），２．７５（ｍ，１Ｈ），２．８９（ｍ，１Ｈ），３．３５−３．８５（ｍ，１２Ｈ），４．３０（ｍ，１Ｈ），４．８２（ｍ，３Ｈ），６．５２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４），６．７４（ｍ，４Ｈ），７．０３−７．３７（ｍ，１４Ｈ），７．６４（ｄ，ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．１），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．１），８．３３，８．３４（ｓ，ｓ，１Ｈ）；
^３１Ｐ−ＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１４９．５７；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_５１Ｈ_５６Ｎ_８Ｏ_８ＳＰ（Ｍ＋１）として、計算値９７１．３６７９，測定値９７１．３６９６；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．２０及び０．２６（ジアステレオ異性体）（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ヘキサン＝３：２，ｖ／ｖ，２％ ＴＥＡ）。

６）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン ５’−三リン酸エステル（化合物１０ａ）の合成（図７）
２）で合成した２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物６ａ）（３３ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）をトルエンで３回共沸乾燥した。次いで、これにプロトンスポンジ（３２ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）とトリメチルリン酸（５００μｌ）を加えた。この溶液を氷冷下で撹拌し、ＰＯＣｌ_３（１２μｌ，０．１３ｍｍｏｌ）を滴下しながら加えた。

０℃で２時間撹拌した後、トリ−ｎ−ブチルアミン（Ｂｕ_３Ｎ）（１２０μｌ，０．５ｍｍｏｌ）とビス−トリブチルアンモニウム ピロリン酸（（Ｂｕ_３ＮＨ）_２ＨＰ_２Ｏ_７）（ＤＭＦ溶液中０．５Ｍ，１．０ｍｌ，０．５ｍｍｏｌ）を加え、０°Ｃで１０分間撹拌した。この溶液に重炭酸トリエチルアンモニウム（０．５Ｍ溶液，５００μｌ）を加えた後、５ｍｌのＨ_２Ｏを加えてＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，５０ｍＭ−１．５Ｍ ＴＥＡＢ，直線勾配）で精製した（粗精製物３２ｍｇ）。最終的に、ＲＰ−ＨＰＬＣ（４．６ｘ２５０ｍｍ，ＭＩＣＲＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ ＲＰＰ，流速：１ｍｌ／ｍｉｎ，０％−３０％ ＣＨ_３ＣＮ １００ｍＭ ＴＥＡＡ中，１０分間，直線勾配）で精製し、目的とする２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン ５’−三リン酸エステル（化合物１０ａ）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）δ１．１１（ｔ，２７Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．４２（ｍ，１Ｈ），２．７７（ｍ，１Ｈ），３．０３（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．０９（ｍ，３Ｈ），４．２８（ｍ，１Ｈ），６．３４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），７．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），７．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５），８．３６（ｓ，１Ｈ）；
^３１Ｐ−ＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）δ−２２．５２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１９．８Ｈｚ），−１０．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２０．７Ｈｚ），−９．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１８．３Ｈｚ）；
ＥＳＩ−ＭＳ Ｃ_１３Ｈ_１６Ｎ_６Ｏ_１２Ｐ_３Ｓ（Ｍ−１）として、計算値５７２．９８，測定値５７２．９４。

実施例２ 複製における非天然型塩基の位置選択的導入−Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによる１ヌクレオチド挿入実験（図８）
本実施例では、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損した大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ ｅｘｏ⁻）を用い、複製（２−オキソ−（１Ｈ）ピリジン（ｙ）のＤＮＡ中への取り込み）におけるｖ−ｙ塩基対（本発明）による１ヌクレオチド取り込み効率を、ｓ−ｙ塩基対（対照）のそれと比較した。

具体的には、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＵＳＢ社のＬａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（Ｃｌｏｎｅｄ）と添付の１０×反応緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ，０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を使用した。ＫＦ ｅｘｏ⁻の酵素濃度は，購入したロット毎にＢｉｏＲａｄ社のＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットにより決定した。

また，反応に用いたプライマーとしては、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを使用した。

５’−ａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇｇａａｇａ−３’（配列番号１、図８）
反応用プライマーはＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ）と［α−^３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、予め５’末端を標識し、ゲル電気泳動により精製した。

また、鋳型ＤＮＡとしては、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを使用した。

５’−ｔｔｃｔｃｔｎｔｃｔｔｃｃｔｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａｔ−３’ （ｎ＝ａ又はｖ）（配列番号２、図８）
あるいは、
５’−ａｇｃｔｃｔｎｔｃｔｔｃｃｔｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａｔ−３’ （ｎ＝ｓ）（配列番号３、図８）
反応条件：鋳型鎖ＤＮＡ（２０μＭ）１μｌ、５’末端が^３２Ｐで標識されたプライマー（５μＭ）４μｌ、および１０×反応緩衝液 １μｌを混合した溶液を、９５℃で３分加温後、急冷してアニーリングを行い、鋳型ＤＮＡとプライマーの二本鎖を形成させた。酵素希釈用緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７、５０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）で希釈したＫｌｅｎｏｗフラグメント溶液（１μＭ）を２μｌ加えて３７℃で２分間インキュベーションした後、ｄＮＴＰ溶液（図７に示したＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はｙのうちの１種）（１００μＭ）を２μｌ加えて反応を開始した。３７℃で２分間インキュベーションした後、１０μｌの１０Ｍ尿素を含むＴＢＥ溶液を加え、７５℃で３分間加温することで反応を終了した。反応条件はまとめると以下の通りである：鋳型／プライマー２μＭ；ＫＦ ｅｘｏ⁻ ２００ｎＭ；ｄＮＴＰ ２０μＭ；反応 ３７℃ ２分間。

反応溶液の一部を２０％ポリアクリルアミド−７ Ｍ尿素ゲルで電気泳動し、バイオイメージングアナライザー（ＢＡＳ２５００，富士フィルム）で反応産物を解析した。結果を図７に示す。本発明のヌクレオチドｖを含む核酸を鋳型とした場合の、相補鎖ＤＮＡ中のｖに対応する位置への１塩基取り込み実験において、ｙが選択的に取り込まれた。ただし、Ｃもわずかに取り込まれた。本発明のｖのｙの取り込み選択性は、ｓの選択性と同様であった。

実施例３ 複製における非天然型塩基の位置選択的導入−Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによる１ヌクレオチド挿入反応の反応速度定数の解析（図９−１０）
本実施例では、実施例２と同様のＫｌｅｎｏｗフラグメントによる１ヌクレオチド挿入反応における、反応速度定数を解析した。

具体的には、反応プライマーとしては、５’末端が６−ＦＡＭで蛍光標識されたプライマー（配列番号１、図１０）を用いた。５’末端が蛍光標識されたプライマーは、ＧｅｎｅＳｃａｎ用カスタム蛍光プライマーとしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているものを購入し、ゲル電気泳動で精製した。反応産物の解析はＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｍｏｄｅｌ ＡＢＩ３７７）で行った。

反応条件：２×反応緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，２ｍＭ ＤＴＴ，１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に溶かした鋳型鎖ＤＮＡ（配列番号２又は３）（１０μＭ）と蛍光標識されたプライマー（１０μＭ）を９５℃で３分加温後急冷してアニーリングし、鋳型鎖とプライマーの二本鎖を形成させた。この二本鎖ＤＮＡ溶液を５μｌずつ分注した後，酵素希釈用緩衝液で希釈したＫＦ ｅｘｏ⁻溶液（１５−２５０ｎＭ）を２μｌ加えて、３７℃で２分間インキュベートし、ＤＮＡ・酵素複合体を形成させた。その溶液に３μｌのｄＮＴＰ溶液（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はｙのうち１種）（１００μＭ−７ｍＭ）を加えて、３７℃で酵素反応（１．５−２０分間）を行った。反応の終了は、１０μｌの２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む９５％ホルムアミド溶液（停止溶液）を加えて７５℃で３分加温することで行った。

反応条件をまとめると以下の通りである。溶液（１０μｌ）中、５μＭ鋳型−プライマー二本鎖、３−５０ｎＭ 酵素及び３０−２１００μＭ ｄＮＴＰを使用。溶液（１０μｌ）は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ及び０．０５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む。反応は、３７℃で１．５−２０分間。

反応溶液の一部を停止溶液で希釈した５０倍希釈した後、その希釈反応液０．５μｌをローディング溶液（脱イオンホルムアミド：２５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍｇ／ｍＬブルーデキストラン溶液＝５：１）３μｌと混合し、９０℃で２分加熱し、氷上に置いて急冷した。そのうちの約０．５μｌを１レーンおきにシークエンスゲルにロードし電気泳動を行った。シークエンスゲル（３６ｃｍ ＷＴＲ）の組成は、６Ｍ 尿素、８％ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１）、０．５×ＴＢＥである。泳動用緩衝液は，０．５×ＴＢＥを用いた。Ｒｕｎ Ｍｏｄｕｌｅは、ＧＳ Ｒｕｎ ３６Ｃ−２４００である。泳動時間は約１時間とし、反応産物のピークパターンの解析及び定量は、ＧｅｎｅＳｃａｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０）を用いて行われた。

未反応のプライマー断片，および一ヌクレオチド挿入されたＤＮＡ断片のピークの高さを用いて、１ヌクレオチド伸長されたプライマーの割合を定量し、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆ ｐｌｏｔ（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．，Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｓ．，Ｂｌｏｏｍ，Ｌ．Ｂ．，Ｐｅｔｒｕｓｋａ，Ｊ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８，８３−１２６（１９９３））により酵素学的パラメーターＫ_ｍ，Ｖ_ｍａｘを算出した。結果を表１及び図９に示す。

ａ＝標準偏差を括弧内に示した。

ｂ＝測定されなかった。反応は非常に非効率的であり正確な測定値は得られなかった。

ｃ＝この値は、使用された種々の酵素濃度に対して酵素濃度（２０ｎＭ）に標準化された。

ｄ＝この用語の単位は、％ ｍｉｎ^−１Ｍ^−１である。

表１及び図９に示されたように、ｖに対するｙの取り込み効率は、Ｖｍａｘ／Ｋｍ＝１．４ｘ１０^５であった。これは、天然塩基のＡ／Ｔ間の取り込み効率と同程度である。また、ｓに対するｙの取り込み効率（Ｖｍａｘ／Ｋｍ＝３．６ｘ１０^４）よりも、約４倍高かった。また、選択性に関しては、ｖに対するｙの取り込み効率は、ｃの取り込み（Ｖｍａｘ／Ｋｍ＝４．１×１０^４）の約３倍、ｔの取り込み（Ｖｍａｘ／Ｋｍ＝５．１×１０^３）の２０倍以上であった。

実施例４ 複製における非天然型塩基の位置選択的導入−Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによる伸長反応（図１１−１３）
本実施例では、１塩基取り込みではなく、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント伸長反応中における相補鎖ＤＮＡ中のｖ対応位置へのｙの選択的導入について調べた。反応プライマーＤＮＡ及び鋳型ＤＮＡとしては下記のものを使用した。

プライマー
５’−ａｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇ−３’ （配列番号４、図１１）
鋳型ＤＮＡ
５’−ｔｔｃｔｃｎｎｔｃｔｔｃｃｔｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａｔ−３’ （ｎｎ＝ｔａ、ｔｖ、ｔｓ，ｖｖ又はｓｓ）（配列番号５、図１１）
プライマーは、実施例２と同様に［α−^３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、予め５’末端を標識し、ゲル電気泳動により精製した。実験２および３ではプライマーからの伸長の１塩基目としてｙ塩基が取り込まれる。これに対し、本実験では、プライマーから伸長した数塩基先の対応する部分に鋳型のｖが存在するため、伸長反応中における相補鎖ＤＮＡ中のｖ対応位置へｙの導入が調べられる。

２×反応緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５，１４ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．２ｍＭ ＤＴＴ）中に溶かした鋳型鎖ＤＮＡ（４００ｎＭ）と５’末端が^３２Ｐで標識されたプライマー（図１１）（４００ｎＭ）を９５℃で３分加温後急冷してアニーリングを行い、二本鎖を形成させた。この二本鎖ＤＮＡ溶液を５μｌずつ分注した後、ｄＮＴＰ溶液（図１２又は１３の各レーン中に示した組み合わせ）（５０μＭ）２μｌと水で希釈したＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ ｅｘｏ^＋；ＴａＫａＲａから購入したシークエンス用Ｃｌｏｎｅｄ Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ）３μｌ（０．１５単位）を加えて、３７℃で酵素反応を開始した。３分間インキュベートした後、１０μｌの１０ Ｍ尿素を含むＴＢＥ溶液を加えて７５℃で３分加温して酵素反応を終了させた。反応条件をまとめると以下の通りである：鋳型／プライマー ２００ｎＭ；ＫＦ ｅｘｏ⁻ ０．０１５Ｕ／μｌ；ｄＮＴＰｓ １０μＭ；反応 ３７℃ ３分間。

反応溶液の一部を１５％ポリアクリルアミド−７ Ｍ尿素ゲルで電気泳動して、バイオイメージングアナライザー（ＢＡＳ２５００，富士フィルム）で反応産物を解析した。結果を図１２及び１３に示す。図１２において、ＮＮ＝ｖＴにおける基質Ａ，Ｇ，ｙのレーンと、ＮＮ＝ｓＴにおける基質Ａ，Ｇ，ｙのレーンを比較すると、３５−ｍｅｒのバンドの濃さから、複製の伸長反応でも、ｓ−ｙ塩基対よりもｖ−ｙ塩基対の方が、複製の効率が高いことがわかる。さらに、本発明のｖまたは対照のｓを２つ並べた場合の複製効率を調べた（図１３）。図１３に示されたように、ｓを２つ並べて導入した鋳型ＤＮＡを用いた場合、その部分で２つの基質ｙが取り込まれる効率は著しく低下し、３５−ｍｅｒの産物はほとんど得られなかった（ＮＮ＝ｓｓ、Ａ，Ｇ，ｙのレーン）。これに対し、ｖの場合は、これが２つ並んでいても複製は進行し、２つの基質ｙが相補鎖ＤＮＡ中に取り込まれた産物が得られることがわかった（ＮＮ＝ｖｖ、Ａ，Ｇ，ｙのレーン）。

実施例５ 転写によるＲＮＡ中へのｒｙＴＰの位置選択的導入（図１４−１６）
本実施例では、ＲＮＡへの転写反応によるｒｙＴＰの位置選択的導入を調べた。具体的には、ｖおよびｓを含むＤＮＡ（ｔｅｍｐ３５Ｎ−１とｔｅｍｐ３５Ｎ−２；各３５−ｍｅｒ）（各々、配列番号２及び５）を鋳型に用いてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を行った。転写反応に必要なＤＮＡプライマーは以下の配列のものを使用した。

Ｔ７ｐｒｉｍ２１；２１−マー
５’−ａｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’ （配列番号６ 図１４）
鋳型鎖とＴ７ｐｒｉｍ２１を１０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中で混合し，アニーリング操作により二本鎖とし，転写反応に用いた（図１４）。Ｔ７転写反応は、ＴＡＫＡＲＡ ＳＨＵＺＯ ＣＯ．，ＬＴＤの酵素を用いて、２０μｌのスケールで行った［Ｔ．Ｏｈｔｓｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，４９２２−４９２５（２００１）］。具体的には、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０，５ｍＭ ＤＴＴ，２４ｍＭ ＭｇＣｌ_２，２ｍＭ スペルミジン，０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭ ＧＭＰ，１ｍＭ ＮＴＰｓ（図１５及び１６に示されたように、Ｎ＝Ｇ，Ｃ，Ｕ，これにｒｙＴＰを含むまたは含まない），２μＣｉ［α−^３２Ｐ］ＡＴＰ，２μＭ 二本鎖ＤＮＡ（鋳型鎖とＴ７ｐｒｉｍ２１），２．５Ｕ／μｌ Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を含む反応液中で、３７℃で３時間インキュベーションし、転写反応を行った。転写反応が完全に進行すれば、以下の全長配列を有するＲＮＡ産物が得られる。

５’−ｇｇｇａｇｇａａｇａｎｎｇａｇａａ−３’ （ｎｎ＝ｕａ、ｙａ又はｙｙ）（配列番号７ 図１４）
反応液に等量の１０Ｍ尿素を含むＢＰＢｄｙｅ溶液を添加し、７５℃で３分加温して反応を終了させた後、２０％ポリアクリルアミド−７ Ｍ尿素ゲルで電気泳動を行い、転写反応生成物の確認をした。［α−^３２Ｐ］ＡＴＰによりラベルされた反応産物をバイオイメージングアナライザー（ＢＡＳ２５００，富士フィルム）で解析した。結果を、図１５及び１６に示す。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写（図１４）でのｓＴを含む鋳型に対する基質ｙのＲＮＡ中への取り込み効率は、天然型塩基対（ＡＴ）の場合に比べて５０−６０％程度であった。これに対しｖＴを含む鋳型に対する基質ｙの取り込み効率は９６％であり、天然型塩基対とほぼ同程度の高い転写効率を示した（図１５）。

また、鋳型中にｓを２つ並べた場合（ＮＮ＝ｓｓ）、２つのｙが取り込まれたＲＮＡ中は得れなかった。これに対し、鋳型中にｖが２つ並んでいる場合（ＮＮ＝ｖｖ）は転写が進行し、その効率は３０％程度であったが、２つの基質ｙがＲＮＡ中に取り込まれた（図１６）。

実施例６ ２−アミノ−６（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン誘導体の合成（図５−７）
１） ２−トリブチルスズ−４−メチルチアゾール（化合物３ｂ）の合成（図５）
アルゴン雰囲気中−７８℃に冷却したジエチルエーテル（２５ｍｌ）に４−メチルチアゾール（化合物２ｂ）（４５５μｌ，５．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．５８Ｍ，３．２ｍｌ，５．０ｍｍｏｌ）を滴下し−７８℃で３０分撹拌した。この溶液に塩化トリブチルスズ（１．５ｍｌ，５．５ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下し室温まで撹拌しながら自然に昇温した（３０分）。この反応溶液を飽和食塩水で３回洗浄した後、有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥後、溶媒を除去して２−トリブチルスズ−４−メチルチアゾール（化合物３ｂ）（黄色の液体）を得た。化合物３ｂは、さらなる精製は行わずに、そのまま次の反応に用いた。

２） ２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物６ｂ）の合成（図５）
１）で合成した２−トリブチルスズ−４−メチルチアゾール（化合物３ｂ）と２−アミノ−６−トシルオキシ−９−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物４）から実施例１の化合物６ａの合成と同様にして目的物６ｂを得た。２工程の収率７８％。

^１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ２．２７（ｍ，１Ｈ），２．４９（ｓ，３Ｈ），２．６５（ｍ，１Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），４．３９（ｍ，１Ｈ），４．９６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．３０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．３０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），６．７３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），７．５７（ｓ，１Ｈ），８．４０（ｓ，１Ｈ）；
^１３Ｃ−ＮＭＲ（６８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１７．０８，６１．５５，７０．５８，８２．５６，８７．５７，１１８．７６，１２２．６４，１４１．５１，１４７．３１，１５４．０２，１５４．６９，１５９．７０，１６２．７９；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_１４Ｈ_１７Ｎ_６Ｏ_３Ｓ（Ｍ＋１）として、計算値３４９．１０８３，測定値３４９．１０６３；
ＵＶ−ｖｉｓ（ＥｔＯＨ中）λｍａｘ＝２３２ｎｍ（ε＝１７６００），３１１ｎｍ（ε＝８２６０），３６１ｎｍ（ε＝９０２０），λｍｉｎ＝２６７ｎｍ（ε＝２７５０），３３４ｎｍ（ε＝６７４０）；
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．２０（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝９：１，ｖ／ｖ）。

３） ２−フェノキシアセチルアミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物７ｂ）の合成（図６）
２）で合成した２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物６ｂ）から実施例１の化合物７ａの合成と同様にして目的物７ｂを得た。収率９５％。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ２．３５（ｍ，１Ｈ），２．５１（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｍ，１Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），３．８９（ｍ，１Ｈ），４．４７（ｍ，１Ｈ），４．９２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．１２（ｓ，２Ｈ），５．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），６．４３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），６．９７（ｍ，３Ｈ），７．３１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．７０（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），１０．９６（ｓ，１Ｈ）；
^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１７．０１，６１．４９，６７．３３，７０．５４，８３．３８，８７．９９，１１４．４６，１２０．１３，１２０．８５，１２６．１３，１２９．４４，１４５．３１，１４７．０３，１５２．０９，１５３．８４，１５４．７５，１５７．９５，１６１．７７，１６７．６５；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_２２Ｈ_２３Ｎ_６Ｏ_５Ｓ（Ｍ＋１）として、計算値４８３．１４５１，測定値４８３．１４１４；
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．２３（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝９：１，ｖ／ｖ）。

４） ２−フェノキシアセチルアミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物８ｂ）の合成（図６）
３）で合成した２−フェノキシアセチルアミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物７ｂ）から実施例１の化合物８ａの合成と同様にして目的物８ｂを得た。収率９９％。

^１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ２．６５（ｓ，ｍ，３Ｈ，１Ｈ），２．８６（ｍ，１Ｈ），３．３４−３．４７（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），４．１８（ｍ，１Ｈ），４．６９（ｂｒ ｓ，２Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ），６．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），６．７４（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ＝２．０，８．９Ｈｚ），７．００−７．３８（ｍ，１５Ｈ），８．２８（ｓ，１Ｈ），９．１２（ｂｒ ｓ，１Ｈ）；
^１３Ｃ−ＮＭＲ（６８ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１７．７３，４０．４９，５５．２１，６０．４１，６３．９８，６７．９０，７２．４７，８４．４３，８６．３５，８６．４９，１１３．０７，１１４．８６，１１９．２７，１２２．２６，１２３．６３，１２６．７９，１２７．３１，１２７．７４，１２７．９９，１２９．７２，１２９．８９，１３５．５７，１３５．６１，１４４．４１，１４８．２７，１４９．７２，１５１．３９，１５３．４０，１５５．９０，１５６．９２，１５８．３５，１６２．０２，１６６．１１；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_４３Ｈ_４１Ｎ_６Ｏ_７Ｓ（Ｍ＋１）として、計算値７８５．２７５７，測定値７８５．２７１５；
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．４８（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝９：１，ｖ／ｖ）。

５） ２−フェノキシアセチルアミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−［２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスフォルアミジル）−β−Ｄ−リボフラノシル］プリン（化合物９ｂ）の合成（図６）
４）で合成した２−フェノキシアセチルアミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物８ｂ）から実施例１の化合物９ａの合成と同様にして目的物９ｂを得た。収率８１％。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１．０９−１．１３（ｍ，１２Ｈ），２．３８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．５７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．７０（ｍ，１Ｈ），２．８１（ｍ，１Ｈ），３．３４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．１，１３．６Ｈｚ），３．６８（ｓ，６Ｈ），３．４９−３．８３（ｍ，４Ｈ），４．２４（ｍ，１Ｈ），４．６９（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｂｒ ｓ，２Ｈ），６．４６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），６．６９（ｍ，４Ｈ），６．９６−７．３３（ｍ，１５Ｈ），８．２５，８．２７（ｓ，ｓ，１Ｈ），８．９４（ｂｒ ｓ，１Ｈ）；
^３１Ｐ−ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１４９．０９；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_５２Ｈ_５８Ｎ_８Ｏ_８ＰＳ（Ｍ＋１）として、計算値９８５．３８３６，測定値９８５．３９７３；
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．３８及び０．２５（ジアステレオ異性体）（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ｈｅｘａｎｅ＝３：２，ｖ／ｖ，２％ＴＥＡ）。

実施例７ ２−アミノ−６（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン誘導体の合成（図５−７）
１） ２−トリブチルスズ−５−メチルチアゾール（化合物３ｃ）の合成（図５）
５−メチルチアゾール（化合物２ｃ）から実施例６の化合物３ｂの合成と同様にして目的物３ｃを得、さらなる精製は行わずに、そのまま次の反応に用いた。

２） ２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物６ｃ）の合成（図５）
１）で合成した２−トリブチルスズ−５−メチルチアゾール（化合物３ｃ）と２−アミノ−６−トシルオキシ−９−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物４）から実施例１の化合物６ａの合成と同様にして目的物６ｃを得た。２工程の収率８１％。

^１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ２．２６（ｍ，１Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），２．６４（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｍ，１Ｈ），４．３８（ｍ，１Ｈ），４．９６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），５．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），６．２９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），６．６８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），８．３８（ｓ，１Ｈ）；
^１３Ｃ−ＮＭＲ（６８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１１．７８，６１．５７，７０．６１，８２．５２，８７．５７，１２２．５２，１３８．００，１４１．４４，１４２．８８，１４７．５７，１５４．６１，１５９．６５，１６２．０３；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_１４Ｈ_１７Ｎ_６Ｏ_３Ｓ（Ｍ＋１）として、計算値３４９．１０８３，測定値３４９．１１２５；
ＵＶ−ｖｉｓ（ＥｔＯＨ中）λｍａｘ＝２３２ｎｍ（ε＝１７０４０），３０７ｎｍ（ε＝１１１００），３６１ｎｍ（ε＝１０４３０），λｍｉｎ＝２６７ｎｍ（ε＝３９８０），３３３ｎｍ（ε＝７４２０）；
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．１５（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝９：１，ｖ／ｖ）。

３） ２−フェノキシアセチルアミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物７ｃ）の合成（図６）
２）で合成した２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物６ｃ）から実施例１の化合物７ａの合成と同様にして目的物７ｃを得た。収率９５％。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ２．３５（ｍ，１Ｈ），２．５９（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｍ，１Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），３．８９（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｍ，１Ｈ），４．９３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．１４（ｓ，２Ｈ），５．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），６．４３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），６．９７（ｍ，３Ｈ），７．３１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．９２（ｓ，１Ｈ），８．７７（ｓ，１Ｈ），１０．９１（ｓ，１Ｈ）；
^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１１．７６，６１．４９，６７．４０，７０．５５，８３．３２，８７．９８，１１４．４８，１２０．８３，１２５．９３，１２９．４３，１３９．５２，１４３．６１，１４５．２０，１４７．１７，１５２．０５，１５３．８１，１５７．９５，１６０．９５，１６７．８０；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_２２Ｈ_２３Ｎ_６Ｏ_５Ｓ（Ｍ＋１）として、計算値４８３．１４５１，測定値４８３．１４８９；
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．１８（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝９：１，ｖ／ｖ）。

４） ２−フェノキシアセチルアミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物８ｃ）の合成（図６）
３）で合成した２−フェノキシアセチルアミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物７ｃ）から実施例１の化合物８ａの合成と同様にして目的物８ｃを得た。収率９４％。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ２．５４（ｓ，３Ｈ），２．５８（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｍ，１Ｈ），３．２８−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｓ，６Ｈ），４．１２（ｍ，１Ｈ），４．６８（ｂｓ，２Ｈ），４．８２（ｍ，１Ｈ），６．５２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），６．６９（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ＝２．５，８．８Ｈｚ），６．９６−７．３２（ｍ，１４Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．９６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）；
^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ １２．２８，４０．４３，５５．１８，６０．３９，６４．００，６７．９８，７２．５６，８４．４０，８６．３９，８６．５４，１１３．１５，１１４．９８，１２２．３６，１２３．７２，１２６．９０，１２７．１０，１２７．８５，１２８．１０，１２９．８３，１２９．９８，１３０．００，１３５．６９，１３５．７３，１３５．９４，１３９．３９，１４４．１７，１４４．４５，１４４．５３，１４８．５９，１４９．８６，１５１．４４，１５３．５４，１５７．１５，１５８．５１，１６１．７１；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_４３Ｈ_４１Ｎ_６Ｏ_７Ｓ（Ｍ＋１）として、計算値７８５．２７５７，測定値７８５．２７９４；
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．３５（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝９：１，ｖ／ｖ）。

５） ２−フェノキシアセチルアミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−［２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスフォルアミジル）−β−Ｄ−リボフラノシル］プリン（化合物９ｃ）の合成（図６）
４）で合成した２−フェノキシアセチルアミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（化合物８ｃ）から実施例１の化合物９ａの合成と同様にして目的物９ｃを得た。収率７４％。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１．１０−１．１２（ｍ，１２Ｈ），２．３８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．５４（ｓ，３Ｈ），２．５６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．６８（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｍ，１Ｈ），３．３２（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｓ，６Ｈ），３．４７−３．８３（ｍ，４Ｈ），４．２４（ｍ，１Ｈ），４．７０（ｍ，１Ｈ），４．７６（ｂｒ ｓ，２Ｈ），６．４５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），６．６９（ｍ，４Ｈ），６．９６−７．３３（ｍ，１４Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），８．２４，８．２５（ｓ，ｓ，１Ｈ），８．８３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）；
^３１Ｐ−ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１４９．０３；
ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，３−ＮＢＡ ｍａｔｒｉｘ）Ｃ_５２Ｈ_５８Ｎ_８Ｏ_８ＰＳ（Ｍ＋１）として、計算値９８５．３８３６，測定値９８５．３９７２；
ＴＬＣ Ｒｆ＝０．１９及び０．１２（ジアステレオ異性体）（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ｈｅｘａｎｅ＝３：２，ｖ／ｖ，２％ＴＥＡ）．

Claims (13)

1. ２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基、ここにおいて、チアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位は置換されていてもよい、を塩基として有するヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
2. チアゾリル基の４位及び／又は５位は置換されていてもよい、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基を塩基として有する、請求項１に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
3. チアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位が低級アルキル基で置換されている、請求項１又は２に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
4. ２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）プリン−９−イル基又は−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）プリン−９−イル基を塩基として有する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
5. 以下の
   ｉ）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
   ｉｉ）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
   ｉｉｉ）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル；
   ｉｖ）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル；
   ｖ）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
   ｖｉ）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
   ｖｉｉ）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル；
   ｖｉｉｉ）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル；
   ｉｘ）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
   ｘ）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン；
   ｘｉ）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル；及び
   ｘｉｉ）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン リン酸エステル
   からなるグループから選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
6. ホスホロアミダイト誘導体である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチド又はそれらの誘導体。
7. 請求項１ないし６のいずれか１項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸。
8. 請求項１ないし６のいずれか１項に記載のヌクレオチドと、５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、請求項７に記載の核酸。
9. ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム又はアプタマーとして使用される、請求項７に記載の核酸。
10. タンパク質、ペプチド全体又は一部をコードする、請求項７に記載の核酸。
11. ５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を調製する方法であって、
    ２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基、ここにおいて、チアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位は置換されていてもよい、を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、複製又は逆転写を行い、前記２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基、を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを組み込む
    ことを含む、前記方法。
12. 鋳型において、前記２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基を有するヌクレオチドが、２又はそれより多く隣接して配置される、請求項１１に記載の方法。
13. ２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基、又は、２−アミノ−６−（２−オキサゾリル）プリン−９−イル基、ここにおいて、チアゾリル基又はオキサゾリル基の４位及び／又は５位は置換されていてもよい、を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、並びに
    ５位置換若しくは非置換−２−オキソ（１Ｈ）−ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチド
    を含む、請求項１１又は１２の方法に使用するためのキット。

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