TW201422633A - 寡核苷酸 - Google Patents

寡核苷酸 Download PDF

Info

Publication number
TW201422633A
TW201422633A TW102131615A TW102131615A TW201422633A TW 201422633 A TW201422633 A TW 201422633A TW 102131615 A TW102131615 A TW 102131615A TW 102131615 A TW102131615 A TW 102131615A TW 201422633 A TW201422633 A TW 201422633A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
group
substituent
oligonucleotide
hydrogen atom
lower alkyl
Prior art date
Application number
TW102131615A
Other languages
English (en)
Inventor
Fumikazu Shinohara
Asana Makino
Junichiro Yamamoto
Taiji Oashi
Michihiko Suzuki
Junichi Saito
Takahiro Nakajima
Tomoyuki Nishikawa
Masayoshi Nakoji
Yuichi Takahashi
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Publication of TW201422633A publication Critical patent/TW201422633A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本發明提供一種與AGO2之親和性提高之寡核苷酸等，其於寡核苷酸之5'末端具有式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基，且該核苷酸殘基或核苷殘基經由3位之氧原子而與鄰接之核苷酸殘基鍵結，□{式中，X1為氧原子等，R1為下述之式(IIA)、或式(IVA)等，□(式中，R5A為鹵基等，R6A為氫原子等)□(式中，Y3A為氮原子等，Y4A為CH等)，R2為氫原子、羥基、鹵基或可具有取代基之低級烷氧基，R3為氫原子、或□(式中，n2A為1、2或3)}。

Description

寡核苷酸
本發明係關於一種具有對於標靶信使RNA(mRNA，messenger RNA)之減弱表現(knock down)活性(例如RNA干擾活性等)之寡核苷酸等。
短鏈干擾性RNA(small interfering RNA，以下記為siRNA)係與RNA干擾(RNA interference，以下記為RNAi)相關，具有作為用以抑制標靶基因表現之導引之功能的RNA[Nature，第411卷，第6836號，494-498頁]。由於siRNA經由信使RNA(mRNA)之切斷，可選擇性地抑制(減弱表現)該mRNA所表現之蛋白質之表現，故而業界期待應用於醫藥[Nature Reviews Cancer，第11卷，59-67頁(2011年)]。
siRNA通常被取入至稱為RNA誘導沉默複合體(RNA induced silencing complex，RISC)的複合體中，而表現出其功能。並且，RISC之主要構成成分為稱為Argonaute 2(AGO2)之蛋白質，AGO2於RNAi路徑上與siRNA結合而切斷mRNA[Trends in Biochemical Sciences，第35卷，第7號，368-376頁(2010年)]。已知取入至RISC之siRNA於被切斷正義鏈而成為僅有反義鏈之單鏈後，與和反義鏈具有互補性之標靶mRNA結合。標靶mRNA係利用AGO2中之RNAse(Ribonuclease，核糖核酸酶)區而切斷，其結果為抑制蛋白質之表現[Silence，第1卷，3頁(2010年)]。
另一方面，近年來，亦報告有hAGO2MID/AMP(adenosine monophosphate，單磷酸腺苷)複合體、及hAGO2MID/UMP(uridine monophosphate，單磷酸尿苷)複合體之立體結構分析[Nature，第465卷，818-822頁(2010年)]、及關於hAGO2與RNA寡聚複合體之立體結構分析[Science，第336卷，25頁(2012年)]。
又，近年來，尤其盛行使用X射線之蛋白之結構分析，基於所獲得之結構資訊，以原子級闡明蛋白質與以其作為標靶之化合物之結合形式，並大量報告有設計適合於該結構之化合物的嘗試[Journal of Postgraduate Medicine，第55卷，301-304頁(2009年)]。
然而，雖然對於使用含有非天然型核苷酸(nucleotide)之寡核苷酸而避免脫靶效應(專利文獻1)、及藉由提高與AGO2之親和性而使siRNA之活性增強之可能性有所提示(非專利文獻1)，但關於提高與AGO2之親和性、使減弱表現活性增強之具體方法並未揭示。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：國際公開第2011/119674號說明書
[非專利文獻]
非專利文獻1：「Molecular Therapy-Nucleic Acids」,2012年，第1卷，p. e5
本發明之目的在於提供一種與AGO2之親和性提高之寡核苷酸等。
本發明係關於下述(1)至(69)。
(1)一種寡核苷酸，其係於寡核苷酸之5'末端具有式(I)所表示之核 苷酸殘基或核苷殘基，且該核苷酸殘基或核苷殘基經由3位之氧原子而與鄰接之核苷酸殘基鍵結，
{式中，X1為氧原子、硫原子、硒原子或NR4(式中，R4為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳醯基或可具有取代基之芳香族雜環羰基)，R1為下述之式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)，
{式中，Y1為氮原子或CR8[式中，R8為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之 芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、-NR9aR9b(式中，R9a及R9b相同或不同，為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、或-CONR9cR9d(式中，R9c及R9d相同或不同，為氫原子或可具有取代基之低級烷基)]，R5為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述R9a及R9b含義相同)、-CONR10cR10d(式中，R10c及R10d分別與上述R9c及R9d含義相同)、-N=C-R10e(式中，R10e為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R10f(式中，R10f為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、或-N=N-R10g(式中，R10g為氫原子或可具有取代基之低級烷基)，R6為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳香族雜環氧基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、可具有取代基之芳香族雜環羰基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳基磺醯基、可具有取代基之芳香族 雜環基、可具有取代基之芳香族雜環羰基或可具有取代基之芳香族雜環磺醯基)、-CONR11cR11d(式中，R11c及R11d相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCONR11eR11f(式中，R11e及R11f相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCO2R11g(式中，R11g為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-N=C-R11h(式中，R11h為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R11i(式中，R11i為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、或-N=N-R11j(式中，R11j為氫原子或可具有取代基之低級烷基)，R7為氫原子、核酸領域之氫原子之等效體、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳香族雜環氧基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、可具有取代基之芳香族雜環羰基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳基磺醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族 雜環羰基或可具有取代基之芳香族雜環磺醯基)、-CONR11cR11d(式中，R11c及R11d相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCONR11eR11f(式中，R11e及R11f相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、或-NHCO2R11g(式中，R11g為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)，但於Y1為氮原子、R5為氫原子、R6為-NR11aR11b且R7為氫原子之情形時，R11a及R11b不同時為氫原子}
(式中，Y2、R6a及R7a分別與上述Y1、R6及R7含義相同)
[式中，R12為氫原子、核酸領域之氫原子之等效體、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基或可具有取代基之低級烷基磺醯基，---為單鍵或雙鍵，於---為單鍵之情形時，Y3為NR13a(式中，R13a為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基或可具有取代基之低級烷基磺醯基)、或CR14aR14b(式中，R14a及R14b相同或不同，為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基或可具有取代基之芳香族雜環烷基)，Y4為NR13b(式中，R13b與上述R13a含義相同)、或CR14cR14d(式中，R14c及R14d分別與上述R14a及R14b含義相同)，於---為雙鍵之情形時，Y3為氮原子或CR14e(式中，R14e為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可 具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基或可具有取代基之芳香族雜環烷基)，Y4為氮原子或CR14f(式中，R14f為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基或可具有取代基之芳香族雜環烷基)，但於R12為氫原子、Y3為CR14e且Y4為CR14f之情形時，不存在R14e及R14f同時為氫原子、及R14e為甲基且R14f為氫原子之情況]
(式中，R12a與上述R12含義相同，環A為芳香族環，n1為0~4之整數，R16為鹵基、羥基、磺醯基、硝基、氰基、羧基、胺甲醯基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、 可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基或可具有取代基之低級烷基磺醯基，於n1為2~4之整數之情形時，各R16可相同亦可不同)，R2為氫原子、羥基、鹵基或可具有取代基之低級烷氧基，R3為氫原子、或
(式中，n2為1、2或3)}。
(2)如(1)之寡核苷酸，其中X1為氧原子。
(3)如(1)或(2)之寡核苷酸，其中R1為式(II)。
(4)如(3)之寡核苷酸，其中Y1為氮原子。
(5)如(3)或(4)之寡核苷酸，其中R5為氫原子、鹵基、氰基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)、-CONR10cR10d(式中，R10c及R10d分別與上述含義相同)、-N=C-R10e(式中，R10e為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R10f(式中，R10f為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、或-N=N-R10g(式中，R10g為氫原子或可具有取代基之低級烷 基)。
(6)如(3)或(4)之寡核苷酸，其中R5為氫原子、鹵基、可具有取代基之低級烯基或氰基。
(7)如(3)或(4)之寡核苷酸，其中R5為可具有取代基之低級烯基或氰基。
(8)如(3)至(7)中任一項之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)、-N=C-R11h(式中，R11h為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R11i(式中，R11i為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、或-N=N-R11j(式中，R11j為氫原子或可具有取代基之低級烷基)。
(9)如(3)至(7)中任一項之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或-NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
(10)如(3)至(7)中任一項之寡核苷酸，其中R6為-NR11aR11a(式中，R11a及R11b為氫原子、可具有取代基之低級烷基)。
(11)如(3)至(7)中任一項之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之芳基，且取代基存在於芳基之間位或對位。
(12)如(3)至(11)中任一項之寡核苷酸，其中R7為氫原子。
(13)如(1)或(2)之寡核苷酸，其中R1為式(III)。
(14)如(13)之寡核苷酸，其中Y2為氮原子。
(15)如(13)或(14)之寡核苷酸，其中R6a為胺基、甲基胺基或二甲基胺基。
(16)如(13)至(15)中任一項之寡核苷酸，其中R7為氫原子。
(17)如(1)或(2)之寡核苷酸，其中R1為式(IV)。
(18)如(17)之寡核苷酸，其中R12為氫原子或核酸領域之氫原子之等效體。
(19)如(18)之寡核苷酸，其中---為雙鍵，Y3為CR14e(式中，R14e與上述含義相同)，Y4為氮原子或CR14f(式中，R14f與上述含義相同，但為氰基之情況除外)。
(20)如(19)之寡核苷酸，其中R14e為氫原子。
(21)如(19)之寡核苷酸，其中R14e為鹵基、氰基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，R14f為氫原子。
(22)如(19)之寡核苷酸，其中R14e為氫原子，R14f為鹵基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基。
(23)如(1)或(2)之寡核苷酸，其中R1為式(V)。
(24)如(23)之寡核苷酸，其中環A為下述之式(A1)、式(A2)、式(A3)、式(A4)、式(A5)、式(A6)、式(A7)、式(A8)、式(A9)、式(A10)、式(A11)，
(式中，R16及n1分別與上述含義相同)
[化8]
(式中，R16與上述含義相同，n1為0~2之整數，X2為NH、氧原子或硫原子)
(式中，R16及X2與上述含義相同，n1為0~2之整數)
(式中，R16與上述含義相同，n1為0~3之整數)
(式中，R16與上述含義相同，n1為0~3之整數)
(式中，R16與上述含義相同，n1為0~3之整數)
(式中，R16與上述含義相同，n1為0~3之整數)
(式中，R16與上述含義相同，n1為1)
(式中，R16與上述含義相同，n1為1)
(式中，R16與上述含義相同，n1為1)
(式中，R16與上述含義相同，n1為1)。
(25)如(23)或(24)之寡核苷酸，其中R16為鹵基、硝基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烷基胺基或可具有取代基之二低級烷基胺基。
(26)如(25)之寡核苷酸，其中R12a為氫原子或核酸領域之氫原子之等效體。
(27)如(23)至(26)中任一項之寡核苷酸，其中n1為1或2。
(28)如(1)至(27)中任一項之寡核苷酸，其中R3為
(式中，n2與上述含義相同)。
(29)如(28)之寡核苷酸，其中n2為1。
(30)如(1)至(29)中任一項之寡核苷酸，其中R2為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基。
(31)如(1)至(29)中任一項之寡核苷酸，其中R2為羥基。
(32)如(1)之寡核苷酸，其中X1為氧原子，R2為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基。
(33)如(32)之寡核苷酸，其中R1為式(IIA)
(式中，R5A及R6A分別與上述R5及R6含義相同)。
(34)如(33)之寡核苷酸，其中R5A為鹵基、胺甲醯基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基。
(35)如(33)之寡核苷酸，其中R5A為鹵基或氰基。
(36)如(33)至(35)中任一項之寡核苷酸，其中R6A為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基或NR11aR11b(式 中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
(37)如(33)至(35)中任一項之寡核苷酸，其中R6A為NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
(38)如(33)至(35)中任一項之寡核苷酸，其中R6A為胺基、可具有取代基之低級烯基或可具有取代基之芳基。
(39)如(32)之寡核苷酸，其中R1為式(IVA)
(式中，Y3A及Y4A分別與上述Y3及Y4含義相同，但於Y3A及Y4A為CR14e及CR14f且R14e為氫原子之情形時，R14f不為氰基)。
(40)如(39)之寡核苷酸，其中Y3A為CR14e(式中，R14e與上述含義相同)，Y4A為CR14f(式中，R14f與上述含義相同)。
(41)如(40)之寡核苷酸，其中R14e為氫原子。
(42)如(40)之寡核苷酸，其中R14e為鹵基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，R14f為氫原子。
(43)如(40)之寡核苷酸，其中R14e為氫原子、R14f為鹵基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基。
(44)如(32)之寡核苷酸，其中R1為式(VA)[化21]
(式中，環AA、n1A及R16A分別與上述環A、n1、及R16含義相同，於n1A為2~4之整數之情形時，各R16A可相同亦可不同，但於環AA為苯環且n1A為2之情形時，R16A不為低級烷氧基，於環AA為苯環、n1A為1且R16A為氯原子之情形時，為式(A1')
所表示之情況除外)。
(45)如(44)之寡核苷酸，其中環AA為苯環或噻吩環。
(46)如(44)或(45)之寡核苷酸，其中R16A為鹵基、硝基低級烷基、可具有取代基之低級烷基胺基或可具有取代基之二低級烷基胺基。
(47)如(44)至(46)中任一項之寡核苷酸，其中n1A為1或2。
(48)如(32)至(47)中任一項之寡核苷酸，其中R3A為
(式中，n2A與上述含義相同)。
(49)如(48)之寡核苷酸，其中n2A為1。
(50)如(32)至(49)中任一項之寡核苷酸，其中R2A為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基。
(51)如(32)至(49)中任一項之寡核苷酸，其中R2A為羥基。
(52)如(1)至(51)中任一項之寡核苷酸，其具有10~80個之鹼基長度。
(53)如(1)至(51)中任一項之寡核苷酸，其具有20~50個之鹼基長度。
(54)如(1)至(51)中任一項之寡核苷酸，其具有20~30個之鹼基長度。
(55)如(1)至(51)中任一項之寡核苷酸，其具有21~25個之鹼基長度。
(56)如(1)至(55)中任一項之寡核苷酸，其為雙鏈寡核苷酸。
(57)如(1)至(55)中任一項之寡核苷酸，其為單鏈寡核苷酸。
(58)如(1)至(55)中任一項之寡核苷酸寡，其中核苷酸為短鏈干擾性RNA(siRNA)。
(59)一種提高減弱表現活性之方法，其特徵在於：於具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱表現活性的寡核苷酸中，將該寡核苷酸之5'末端之鹼基殘基置換為下述之式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)所表示之鹼基殘基，[化24]
(式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同)
(式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同)
(式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同)
[化27]
(式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)。
(60)一種提高該減弱表現活性之方法，其特徵在於：於具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱表現活性且5'末端之鹼基為鳥嘌呤或胞嘧啶的寡核苷酸中，將於該寡核苷酸之5'末端之鳥嘌呤殘基或胞嘧啶殘基置換為腺嘌呤殘基(6-胺基嘌呤-9-基)、胸腺嘧啶殘基(5-甲基-1,2,3,4四氫嘧啶-2,4二酮-1-基)、尿苷殘基(嘧啶-2,4(1H,3H)二酮-1-基)、或下述之式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)所表示之鹼基殘基，
(式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同)
[化29]
(式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同)
(式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同)
(式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)。
(61)如(59)或(60)之方法，其中寡核苷酸為短鏈干擾性RNA(siRNA)。
(62)一種核酸醫藥，其含有藉由如(59)至(61)中任一項之方法而 提高寡核苷酸對標靶mRNA之減弱表現活性的寡核苷酸。
(63)一種核苷酸或核苷、其羥基、羧基及/或胺基經保護基保護者、或其醯胺化合物、或者其鹽，其以式(Ia)表示，用於置換具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱表現活性的寡核苷酸之5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基，用以提高該寡核苷酸對標靶mRNA之減弱表現活性，
(式中，X1、R1、R2及R3分別與上述含義相同)。
(64)如(63)之核苷酸或核苷、其羥基、羧基及/或胺基經保護基保護者、或其醯胺化合物、或者其鹽，其中寡核苷酸為短鏈干擾性RNA(siRNA)。
(65)一種核苷酸或核苷、其羥基、羧基及/或胺基經保護基保護者、或其醯胺化合物、或者其鹽，其含有下述之式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)所表示之鹼基殘基，用於置換具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱表現活性的寡核苷酸之5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基，用以提高該寡核苷酸對標靶mRNA之減弱表現活性， [化33]
(式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同)
(式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同)
(式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同)
[化36]
(式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)。
(66)如(65)之核苷酸或核苷、其羥基、羧基及/或胺基經保護基保護者、或其醯胺化合物、或者其鹽，其中寡核苷酸為短鏈干擾性RNA(siRNA)。
(67)一種寡核苷酸之用途，其用於製造標靶蛋白質之表現抑制劑，該寡核苷酸係於5'末端具有下述式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基，且具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱表現活性，
(式中，X1、R1、R2及R3分別與上述含義相同)。
(68)一種寡核苷酸之用途，其用於製造標靶蛋白質之表現抑制劑，該寡核苷酸導入有下述之式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)所表示之鹼基殘基作為5'末端之鹼基殘基，且具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱表現活性， [化38]
(式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同)
(式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同)
(式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同)
[化41]
(式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)。
(69)如(67)或(68)之用途，其中寡核苷酸為短鏈干擾性RNA(siRNA)。
根據本發明，可提供一種與AGO2之親和性提高之寡核苷酸等。
圖1係於以螢光素酶(luciferase)作為標靶之siRNA中，將於反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之siRNA與具有單磷酸腺苷之siRNA之螢光素酶發光量進行比較的圖(濃度100pmol/L)。縱軸表示於將陰性對照群之發光量設為1之情形時之各siRNA之發光比率。
圖2係於以螢光素酶作為標靶之siRNA中，將於反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之siRNA(874-BrdA)與具有單磷酸腺苷(874-A)、單磷酸鳥苷(874-G)、單磷酸胞苷(874-C)、或單磷酸尿苷(874-U)之siRNA之螢光素酶發光量進行比較的圖。縱軸表示於將陰性對照群之發光量設為1之情形時之各siRNA之發光比率。橫軸之A意指874-A、G意指874-G、C意指874-C、U意指874-U、BrdA意指874-BrdA。表示分別於3.2pmol/L、16pmol/L、80pmol/L及400pmol/L之濃度下進行試驗之結果。
圖3係於以D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，基因庫(GenBank)許可編號NM_001256799)作為標靶之siRNA中，將於反義鏈之5'末端具有8-Br- dA之siRNA與具有單磷酸腺苷之siRNA之GAPDH mRNA之表現量進行比較的圖。縱軸表示於將陰性對照群之GAPDH之mRNA量設為1之情形時之GAPDH mRNA之相對表現量。橫軸表示各siRNA，左側表示於反義鏈5'末端具有單磷酸腺苷之siRNA(217-A、278-A、516-A、624-A、715-A、816-A、936-A、1096-A、1134-A)，右側表示於反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之siRNA(217-BrdA、278-BrdA、516-BrdA、624-BrdA、715-BrdA、816-BrdA、936-BrdA、1096-BrdA、1134-BrdA)。
圖4係表示於以螢光素酶作為標靶之siRNA中，於反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、單磷酸尿苷(454-U)、8-Br-dA(454-BrdA)、I-37(6-NO2,7-Me-dQu)、I-21(6-napht-2-yl-dPu)、I-34(6-Me-dU)、或I-25(6-napht-1-yl-dPu)之siRNA之減弱表現活性的圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50)。橫軸表示所使用之siRNA。
圖5係表示於以螢光素酶作為標靶之siRNA中，於反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、單磷酸尿苷(454-U)、8-Br-dA(454-BrdA)、I-32(2'-OMe-6-styryl-dA)、或I-19(di-Me-thienyl-dU)之siRNA之減弱表現活性的圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50)。橫軸表示所使用之siRNA。
以下，將式(I)中之X1為氧原子，R2為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基的化合物稱為化合物(Ia)。關於其他式編號之化合物亦相同。
於式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(IIA)、(IIIA)、(IVA)、(VA)、(Ia)及(A1)~(A11)之各基之定義中，
(i)鹵基意指氟、氯、溴、及碘之各原子。
(ii)作為低級烷基、以及低級烷氧基、低級烷氧基羰基、低級烷基胺基、二低級烷基胺基、低級烷基胺甲醯基、二低級烷基胺甲醯 基、低級烷硫基及低級烷基磺醯基中之低級烷基部分，例如可列舉直鏈狀或支鏈狀之碳數1~10之烷基。具體而言，可列舉：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。二低級烷基胺基及二低級烷基胺基胺甲醯基之2個低級烷基部分可分別相同亦可不同。
(iii)芳烷基及芳香族雜環烷基之伸烷基部分與自上述低級烷基(ii)去除一個氫原子而成者之含義相同。
(iv)作為低級烯基，例如可列舉直鏈狀或支鏈狀之碳數2~10之烯基。具體而言，可列舉：乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、甲基丙烯基、丁烯基、巴豆基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等。
(v)作為低級炔基，例如可列舉直鏈狀或支鏈狀之碳數2~10之炔基。具體而言，可列舉：乙炔基、炔丙基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等。
(vi)作為低級烷醯基，例如可列舉碳數1~8之直鏈或支鏈狀之低級烷醯基。具體而言，可列舉：甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、異戊醯基、特戊醯基、己醯基、庚醯基、辛醯基等。
(vii)作為芳基、以及芳烷基、芳醯基、芳氧基、芳硫基及芳基磺醯基之芳基部分，例如可列舉碳數6~14之芳基。具體而言，可列舉：苯基、萘基、茚基、蒽基等，較佳為可列舉苯基、萘基等。
(viii)作為芳香族雜環基、以及芳香族雜環烷基、芳香族雜環羰基、芳香族雜環氧基、芳香族雜環硫基及芳香族雜環磺醯基中之芳香族雜環基部分，例如可列舉：含有選自氮原子、氧原子及硫原子中之至少1個原子之5員或6員之單環性芳香族雜環基、3~8員之環經縮合 而成之二環或三環性之含有選自氮原子、氧原子及硫原子中之至少1個原子的縮環性芳香族雜環基等。具體而言，可列舉：吡啶基、吡基、嘧啶基、嗒基、氧代嗒基、喹啉基、異喹啉基、呔基、喹唑啉基、喹啉基、萘啶基、啉基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三基、三唑基、四唑基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、異噻唑基、唑基、異唑基、二唑基、噻二唑基、吲哚基、異吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并唑基、吡唑并吡啶基、吡唑并嘧啶基、嘌呤基、二苯并呋喃基、二苯并氮呯基等，較佳為可列舉吡啶基、吡咯基、噻吩基、唑基等。
(ix)作為芳香族環，例如可列舉：苯環、萘環、芳香族雜環等。芳香族雜環與對上述芳香族雜環基、以及芳香族雜環烷基、芳香族雜環羰基、芳香族雜環氧基、芳香族雜環硫基及芳香族雜環磺醯基中之芳香族雜環基部分加成氫原子而成者之含義相同。
(x)作為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之低級烷硫基、及可具有取代基之低級烷基磺醯基中之取代基，可相同或不同，例如可列舉取代數1~3之選自由 鹵基、羥基、磺醯基、硝基、氰基、羧基、胺甲醯基、C3-8環烷基、脂肪族雜環基、C1-10烷氧基、C3-8環烷氧基、C6-14芳氧基、C7-16芳烷氧基、C1-8烷醯氧基、C7-15芳醯氧基、C1-10烷基磺醯基、-NRXRY(式中，RX及RY相同或不同，為氫原子、C1-10烷基、C3-8環烷基、C6-14芳基、芳香族雜環基、C7-16芳烷基、C1-8烷醯基、C7-15芳醯 基、C1-10烷氧基羰基或C7-16芳烷氧基羰基)、C1-8烷醯基、C7-15芳醯基、C1-10烷氧基羰基、C6-14芳氧基羰基、C1-10烷基胺甲醯基及二C1-10烷基胺甲醯基
所組成之群中之取代基等。關於可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之低級烷硫基、及可具有取代基之低級烷基磺醯基中之取代基，除上述以外，亦可為選自由C6-14芳基及芳香族雜環基所組成之群中之取代基。
(xi)作為可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳基磺醯基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳香族雜環羰基、可具有取代基之芳香族雜環氧基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、可具有取代基之芳香族雜環磺醯基及可具有取代基之苯乙烯基中之取代基，可相同或不同，例如可列舉：取代數1~3之選自由鹵基、羥基、磺醯基、硝基、氰基、羧基、胺甲醯基、C1-10烷基、三氟甲基、C3-8環烷基、C6-14芳基、脂肪族雜環基、芳香族雜環基、C1-10烷氧基、C3-8環烷氧基、C6-14芳氧基、C7-16芳烷氧基、C1-8烷醯氧基、C7-15芳醯氧基、C1-10烷基磺醯基、-NRXaRYa(式中，RXa及RYa相同或不同，為氫原子、C1-10烷基、C3-8環烷基、C6-14芳基、芳香族雜環基、C7-16芳烷基、C1-8烷醯基、C7-15芳醯基、C1-10烷氧基羰基或C7-16芳烷氧基羰基)、C1-8烷醯基、C7-15芳醯基、C1-10烷氧基羰基、C6-14芳氧基羰基、C1-10烷基胺甲醯基及二C1-10烷基胺甲醯基
所組成之群中之取代基等，較佳為可列舉：取代數1之鹵基、羥基、磺醯基、硝基、氰基、羧基、C1-3烷基、三氟甲基、C1-3烷氧基等。
作為此處所示之C1-10烷基以及C1-10烷氧基、C1-10烷基磺醯基、C1-10烷氧基羰基、C1-10烷基胺甲醯基及二C1-10烷基胺甲醯基之C1-10烷基部分，例如可例示上述低級烷基之例示中所列舉之基。二C1-10烷基胺甲醯基中之2個C1-10烷基部分可相同亦可不同。
作為C1-8烷醯基及C1-8烷醯氧基之C1-8烷醯基部分，例如可例示上述低級烷醯基之例示中所列舉之基。
作為C3-8環烷基及C3-8環烷氧基之C3-8環烷基部分，例如可列舉：環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基等。
作為C6-14芳基以及C6-14芳氧基、C7-15芳醯基、C7-15芳醯氧基及C6-14芳氧基羰基之芳基部分，例如可例示上述芳基之例示中所列舉之基。
作為C7-16芳烷氧基、C7-16芳烷基及C7-16芳烷氧基羰基之芳基部分，例如可例示上述芳基之例示中所列舉之基，作為伸烷基部分，例如可列舉C1-10之伸烷基，更具體可列舉自上述低級烷基之例示中所列舉之基去除一個氫原子而成的基。
作為脂肪族雜環基，例如可列舉：含有選自氮原子、氧原子及硫原子中之至少1個原子之5員或6員之單環性脂肪族雜環基、3~8員之環經縮合而成的二環或三環性且含有選自氮原子、氧原子及硫原子中之至少1個原子之縮環性脂肪族雜環基等。具體而言，可列舉：氮丙啶基、氮雜環丁基、吡咯啶基、哌啶基(piperidino)、哌啶基(piperidinyl)、氮雜基、1,2,5,6-四氫吡啶基、咪唑啶基、吡唑啶基、哌基、高哌基、吡唑啉基、環氧乙烷基、四氫呋喃基、四氫-2H-吡喃基、5,6-二氫-2H-吡喃基、唑啶基、嗎啉基(morpholino)、嗎啉基(morpholinyl)、硫代唑啶基、硫代嗎啉基、 2H-唑基、2H-硫代唑基、二氫吲哚基、二氫異吲哚基、二氫苯并呋喃基、苯并咪唑啶基、二氫苯并唑基、二氫苯并硫代唑基、苯并間二氧雜環戊烯基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、二氫-2H-基、二氫-1H-基、二氫-2H-硫代基、二氫-1H-硫代基、四氫喹啉基、四氫喹唑啉基、二氫苯并二氧雜環己基等。
鹵基及芳香族雜環基分別與上述含義相同。
此處，較佳為上述式(II)中之Y1為氮原子等，R5為氫、鹵基、氰基或可具有取代基之低級烯基等，R6為可具有取代基之芳基、可具有取代基之烯基或-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)等，R7為氫原子、或核酸領域之氫原子之等效體(例如氘原子、胺基、羥基、氟原子等)等。再者，於上述R6為具有取代基之芳基之情形時，取代基較佳為存在於芳基之間位或對位。
又，較佳為上述式(IV)中之R12為氫原子或核酸領域之氫原子之等效體(例如氘原子、胺基、羥基、氟原子等)等，---為雙鍵，Y3為CR14e，Y4為氮原子或CR14f，R14e及R14f為氫原子、鹵基、氰基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基等。
進而較佳為上述式(V)中之R12a為氫或核酸領域之氫原子等效體(例如氘原子、胺基、羥基、氟原子等)等，環A為苯環或噻吩環等，n1為1或2，R16為鹵基、硝基、可具有取代基之烷基、可具有取代基之低級烷基胺基或可具有取代基之二低級烷基胺基。
本發明之寡核苷酸意指包含核苷酸殘基或核苷殘基之聚合物或低聚物。
本發明之寡核苷酸亦包含單鏈寡核苷酸及雙鏈寡核苷酸兩者。於為雙鏈寡核苷酸時，各寡核苷酸鏈之鹼基長度亦可不同。又，於雙鏈寡核苷酸時，亦可含有1個以上之錯配鹼基對。進而，由3條鏈以上 之寡核苷酸所形成之複合體亦包含於本發明之寡核苷酸中。
本發明之寡核苷酸較佳為例如具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱表現活性。此處，本說明書中之所謂“具有減弱表現活性”，意指抑制編碼蛋白質等之基因(標靶基因)之表現，較佳為本發明之寡核苷酸與寡核苷酸之5'末端含有所對應之天然型核苷酸之siRNA相比，具有較佳為2倍、更佳為5倍、進而較佳為10倍之活性。
作為雙鏈寡核苷酸，例如可列舉結構基因等雙鏈DNA、以siRNA、miRNA為首之小分子RNA等雙鏈RNA等，但本發明並不限定於該等。
作為單鏈寡核苷酸，例如可列舉：反義寡核苷酸、微RNA(microRNA)、適體、安塔夠妙(antagomir)、單鏈RNAi劑(具有髮夾(hair pin)結構之siRNA等)等，但本發明並不限定於該等。
本發明之寡核苷酸之長度較佳為10~100個鹼基，更佳為10~80個鹼基，進而較佳為10~50個鹼基，尤佳為20~50個鹼基，最佳為20~30個鹼基。
對於本發明之寡核苷酸，除5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基以外，亦可進而修飾1個以上之核苷酸殘基。該修飾亦可包含於鹼基、糖、磷酸中之任一部位。
作為鹼基修飾核苷酸，只要為對核苷酸之鹼基之化學結構之一部分或全部藉由任意取代基進行修飾而成者、或者藉由任意原子進行取代而成者，則可為任意者，例如可列舉：鹼基內之氧原子被取代為硫原子者、氫原子被取代為碳數1~10之烷基者、甲基被取代為氫或碳數2~10之烷基者、胺基經碳數1~10之烷基、碳數1~8之烷醯基等保護基保護者。
作為糖部修飾核苷酸，只要為對核苷酸之糖之化學結構之一部分或全部藉由任意取代基修飾而成者、或者藉由任意原子取代而成 者，則可為任意者，可較佳地使用2'-修飾核苷酸。
作為2'-修飾核苷酸，例如可列舉：核糖之2'-OH經選自由氫原子、-OR、-R、-R'、-SH、-SR、胺基、-NHR、-NR2、N3、氰基、及鹵基所組成之群(此處，R為低級烷基或芳基，低級烷基、芳基及鹵基分別與上述含義相同)中之取代基取代而成之2'-修飾核苷酸。具體而言，可列舉：2'-OH經選自由氟原子、甲氧基、2-(甲氧基)乙氧基、3-胺基丙氧基、2-[(N,N-二甲基胺基)氧基]乙氧基、3-(N,N-二甲基胺基)丙氧基、2-[2-(N,N-二甲基胺基)乙氧基]乙氧基、2-(甲基胺基)-2-側氧基乙氧基、2-(N-甲基胺甲醯基)乙氧基及2-氰基乙氧基所組成之群中之取代基取代而成之2'-修飾核苷酸等。
作為磷酸修飾核苷酸，只要為對核苷酸之磷酸二酯鍵之化學結構之一部分或全部藉由任意取代基修飾而成者、或者藉由任意原子取代而成者，則可為任意者，例如可列舉將磷酸二酯鍵取代為膦酸烷基酯鍵之核苷酸等。
作為具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱表現活性的寡核苷酸，例如只要為含有與編碼蛋白質等之基因(標靶基因)之mRNA之一部分鹼基序列互補之鹼基序列，並且抑制標靶基因之表現的寡核苷酸，則例如亦可使用siRNA(short interference RNA，短干擾RNA)、miRNA(micro RNA，微RNA)等雙鏈寡核苷酸、shRNA(short hairpin RNA，短髮夾RNA)、反義核酸、核酶等單鏈寡核苷酸等中之任一核酸，較佳為雙鏈寡核苷酸。
含有與標靶基因之mRNA之一部分鹼基序列互補之鹼基序列的寡核苷酸鏈稱為反義鏈，含有與反義鏈之鹼基序列互補之鹼基序列的寡核苷酸稱為正義鏈。正義鏈係指包含標靶基因之一部分鹼基序列之寡核苷酸本身等的可與反義鏈配對而形成雙鏈形成部的寡核苷酸。於含有與標靶基因之mRNA之一部分鹼基序列互補之鹼基序列之雙鏈寡核 苷酸中，所謂寡核苷酸之5'末端係指反義鏈之5'末端。
於本發明之寡核苷酸中，反義鏈與正義鏈的鹼基配對所形成之雙鏈形成部通常為15~27個鹼基對，較佳為15~25個鹼基對，更佳為15~23個鹼基對，進而較佳為15~21個鹼基對，尤佳為15~19個鹼基對。該雙鏈形成部只要反義鏈與正義鏈之各鹼基相對向即可，可形成鹼基對亦可錯配，反義鏈之5'末端之鹼基與和其成對之正義鏈之鹼基較佳為腺苷-尿嘧啶(A-U)之鹼基對或錯配。
構成雙鏈寡核苷酸之反義鏈、正義鏈中之任一者或兩者之寡核苷酸亦可於繼雙鏈形成部之3'側或5'側具有不形成雙鏈之追加之核苷酸。該不形成雙鏈之部分亦稱為突出部(overhang，懸突部)。
作為具有突出部之雙鏈寡核苷酸，例如可使用至少一條鏈之3'末端或5'末端具有包含1~4個鹼基、通常包含1~3個鹼基之突出部者，較佳為使用具有包含2個鹼基之突出部者，更佳為使用具有包含dTdT或UU之突出部者。突出部可僅反義鏈具有，可僅正義鏈具有，及可反義鏈與正義鏈兩者均具有突出部，較佳為使用反義鏈與正義鏈兩者均具有突出部之雙鏈核酸。
又，亦可使用與繼雙鏈形成部後之標靶基因之mRNA之鹼基序列一部分或全部一致之序列、或與繼雙鏈形成部後之標靶基因之mRNA之互補鏈之鹼基序列一部分或全部一致之序列。進而，作為雙鏈寡核苷酸，例如亦可使用藉由切丁酶(Dicer)等核糖核酸酶之作用而生成上述具有突出部之雙鏈寡核苷酸的核酸分子(國際公開第2005/089287號說明書)、或不具有3'末端或5'末端之突出部的雙鏈寡核苷酸等。
又，於上述雙鏈寡核苷酸中，較佳為自反義鏈之5'末端側朝3'末端側至少第2~17位之鹼基(核苷)之序列係與標靶基因之mRNA之連續16個鹼基序列互補之鹼基序列，更佳為該反義鏈之自5'末端側朝3'末端側第2~19位之鹼基序列係與標靶基因之mRNA之連續18個鹼基序 列互補之鹼基序列，或第2~21位之鹼基序列係與標靶基因之mRNA之連續20個鹼基序列互補之鹼基序列，或者第2~25位之鹼基序列係與標靶基因之mRNA之連續24個鹼基序列互補之鹼基序列。
反義鏈之5'末端之鹼基序列可與標靶基因之mRNA之鹼基序列互補亦可錯配。
進而，於本發明所使用之核酸為siRNA之情形時，較佳為該核酸中之糖之10~70%、更佳為15~60%、進而較佳為20~50%為2'-修飾核苷酸。本發明中之2'-修飾核苷酸較佳為2'-氰基、2'-鹵基、2'-O-氰基、2'-烷基、2'-取代烷基、2'-O-烷基、2'-O-取代烷基、2'-O-烯基、2'-O-取代烯基、2'-Se-烷基、2'-Se-取代烷基等，更佳為2'-氰基、2'-氟、2'-氯、2'-溴、2'-三氟甲基、2'-O-甲基、2'-O-乙基、2'-O-異丙基、2'-O-三氟甲基、2'-O-[2-(甲氧基)乙基]、2'-O-(3-胺基丙基)、2'-O-[2-(N,N-二甲基)胺基氧基]乙基、2'-O-[3-(N,N-二甲基胺基)丙基]、2'-O-{2-[2-(N,N-二甲基胺基)乙氧基]乙基}、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基]、2'-Se-甲基、氫原子等，進而較佳為2'-O-甲基、2'-O-乙基、2'-氟、氫原子等，最佳為2'-O-甲基及2'-O-氟。
化合物(Ia)相當於式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基之殘基部成為羥基之核苷酸或核苷，作為化合物(Ia)之較佳形態，可列舉：上述(2)~(51)所示之相當於式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基的核苷酸或核苷，作為更佳之形態，可列舉：上述(32)~(51)所示之相當於式(I)中之X1為氧原子且R2為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基之核苷酸殘基或核苷殘基的核苷酸或核苷。
化合物(Ia)例如亦可以酸加成鹽、金屬鹽、銨鹽、有機胺加成鹽、胺基酸加成鹽等鹽之形式獲得。
作為酸加成鹽，例如可列舉：鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽，乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽 等有機酸鹽；作為金屬鹽，例如可列舉：鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽，鎂鹽、鈣鹽等鹼土金屬鹽，鋁鹽、鋅鹽等；作為銨鹽，例如可列舉：銨、四甲基銨等之鹽；作為有機胺加成鹽，例如可列舉：嗎啉、哌啶等之加成鹽；作為胺基酸加成鹽，例如可列舉：離胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸等之加成鹽。
於化合物(Ia)中，亦具有可能存在幾何異構物、光學異構物等立體異構物、互變異構物等者，本發明可使用包括該等在內之全部可能之異構物及該等之混合物。
又，化合物(Ia)有時亦以與水或各種溶劑之加成物之形式存在，該等加成物亦可用於本發明中。
作為化合物(Ia)之醯胺化合物，例如可列舉下述寡核苷酸之製造法中之化合物(B)等。
繼而，對本發明之寡核苷酸之製造法進行說明。
寡核苷酸之通常之合成法例如包括核苷酸之醯胺化、低聚物化(包括脫保護等步驟)、(視需要)利用退火之雙鏈化等步驟。
本發明之寡核苷酸例如可藉由下述製造法而製造。
(1)低聚物化之一般例
[化32]
[式中，m例如為9~99之整數，Po例如為CPG(controlled pore glass，可控孔徑玻璃)等固相支撐體，Ra例如為三苯甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基等可藉由酸處理而去除之保護基，Rb例如為第三丁基二甲基矽烷基等可利用氟化物離子而去除之保護基，Rc例如為2-氰基乙基等可藉由鹼處理而去除之保護基，Rd為可具有取代基之低級烷基，B為核酸鹼基(該核酸鹼基視需要亦可藉由一個以上之保護基保護，於保護基為兩個以上之情形時，各保護基可相同亦可不同)。於m為2以上之情形時，m+1個B、m+1個Rb及m個Rc可分別相同亦可不同，各階段之Ra可相同亦可不同；此處，低級烷基與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基含義相同]
步驟1
化合物(C)可藉由於溶劑中、反應促進劑存在下，使化合物(A)與化合物(B)在0℃與50℃之間之溫度下反應10秒至30分鐘而製造。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃(THF，tetrahydrofuran)、1,4-二烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF，N,N-dimethylformamide)、N-甲基吡咯啶酮(NMP，N-Methylpyrrolidone)、水等，該等可單獨使用或混合使用。
作為反應促進劑，可列舉：1H-四唑、4,5-二氰基咪唑、5-乙硫基四唑、5-苄硫基四唑等。
化合物(A)例如可以市售品之形式獲得。
化合物(B)例如可藉由下述方法而製造。
(式中，Ra、Rb、Rc、Rd及B分別與上述含義相同，X3為鹵基；該鹵基與上述含義相同)
化合物(B)可藉由於溶劑中、鹼存在下，使化合物(M)與化合物(N)在0℃與100℃之間之溫度下反應10秒至24小時而製造。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二烷、DMF、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉三乙胺、N,N-二異丙基乙胺、吡啶等，該等可單獨使用或混合使用。
又，化合物(B)亦可藉由於溶劑中、反應促進劑存在下，使化合物(M)與化合物(O)在0℃與100℃之間之溫度下反應10秒至24小時而製 造。
作為溶劑，例如可列舉乙腈、THF等，該等可單獨使用或混合使用。
作為反應促進劑，可列舉上述者。
步驟2
步驟1中之未反應之化合物(A)可藉由於溶劑中，使醯化試劑與鹼在0℃與50℃之間之溫度下反應10秒至30分鐘而封端。此時，亦可添加適當之添加物而促進反應。
作為醯化試劑，例如可列舉乙酸酐。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、THF、1,4-二烷、DMF等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：吡啶、2,6-二甲基吡啶等。
作為添加劑，例如可列舉：4-二甲基胺基吡啶、1-甲基咪唑等。
步驟3
化合物(D)可藉由於溶劑中、氧化劑與鹼存在下，使化合物(C)在0℃與50℃之間之溫度下反應10秒至30分鐘而製造。
作為氧化劑，可列舉：碘、過氧化氫水、間氯過苯甲酸、過乙酸、氫過氧化第三丁基等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼及溶劑，分別可列舉上述步驟2中所記載者。
步驟4
化合物(E)可藉由於溶劑中，使化合物(D)與酸在0℃與50℃之間之溫度下反應10秒至30分鐘而製造。
作為酸，可列舉：二氯乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸等。
作為溶劑，可列舉：二氯甲烷、氯仿等。
步驟1~4、及下述步驟5及6亦可使用核酸合成機而進行。
(2)於5'末端導入核苷酸殘基(I)之一般例
(式中，m、X1、R1、R2、Po、Ra、Rb、Rc及Rd分別與上述含義相同)
步驟5
步驟5(化合物(F)之保護基Ra之脫保護)可藉由與上述步驟4相同之方法而進行。
步驟6
步驟5中，Ra經脫保護之化合物(F)(以下記為化合物(Fa))與化合物(G)之偶合例如可藉由下述方法進行。
可藉由於溶劑中、反應促進劑存在下，使化合物(Fa)與1當量~遠過量之化合物G在0℃與50℃之間之溫度下反應10秒至30分鐘而製 造。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二烷、DMF、NMP、水等，該等可單獨使用或混合使用。
作為反應促進劑，可列舉上述者。
化合物G例如可以市售品之形式獲得。
步驟7
藉由與上述步驟3相同之方法(磷原子之氧化)，可獲得化合物(H)。
步驟8
藉由使鹼作用於針對經固相擔載之寡核苷酸，而可自固相切出。即，化合物(J)可藉由於溶劑中，使化合物(H)在-80℃與200℃之間之溫度下利用鹼處理10秒至72小時而製造。
作為鹼，例如可列舉：氨、甲胺、二甲胺、乙胺、二乙胺、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU，1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene)等。
作為溶劑，可列舉：水、甲醇、乙醇等。
再者，於本步驟中，亦可同時進行B(核酸鹼基)所含之氮原子之保護基之脫保護。
步驟9
化合物(K)可藉由於溶劑中，使化合物(J)與氟試劑在-80℃與200℃之間之溫度下反應10秒至72小時而製造。此時，亦可添加鹼。
作為氟試劑，例如可列舉：氟化氫、三乙胺氫氟酸鹽、氟化四丁基銨(TBAF，Tetrabutylaminium．fluoride)等。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、N,N-二異丙基乙胺等。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯、乙酸 乙酯、THF、1,4-二烷、DMF、N,N-二甲基乙醯胺(DMA，Dimethylacetamide)、NMP、二甲基亞碸(DMSO，Dimethyl Sulfoxide)等。
步驟10
化合物(L)可藉由於溶劑中或管柱中，使化合物(K)在0℃與50℃之間之溫度下利用酸處理5分鐘至100小時而製造。
作為酸，可列舉三氟乙酸等。
作為溶劑，可列舉水、甲醇、乙醇、乙腈等，該等可單獨使用或混合使用。
作為管柱，例如可列舉C18逆相卡套式管柱等。
(3)雙鏈寡核苷酸製造之一般例
於溶劑中，使化合物(L)與相對於其為等莫耳量之單鏈寡核苷酸在30℃與120℃之間之溫度下反應10秒至72小時後，需要10分鐘至24小時緩慢冷卻至室溫，藉此可製造雙鏈寡核苷酸。
作為溶劑，例如可列舉：乙酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝液、水等，該等可單獨使用或混合使用。
與化合物(L)反應之單鏈寡核苷酸為與化合物(L)互補之寡核苷酸，亦可含有1個以上之錯配鹼基之組合。又，鹼基長度亦可不同。
於上述流程中，藉由對核酸鹼基、各步驟之反應條件等進行各種變更，可獲得所需之寡核苷酸。
該等例如可依據下述文獻等中所記載之方法進行：(i)Tetrahedron，第48卷，第12號，2223-2311頁(1992)；(ii)Current Protocols in Nucleic Acids Chemistry,John Wiley & Sons(2000)；(iii)用於寡核苷酸及其類似物之方案(Protocols for Oligonucleotides and Analogs),Human Press(1993)；(iv)Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids,Wiley-VCH (2012)；(v)基因組化學 運用人工核酸之科學方法，講談社(2003)；(vi)核酸化學之新動向，化學同人(2011)。
(4)相當於式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基的核苷酸或核苷之通常之製造法
以下，揭示相當於式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基的核苷酸或核苷之通常之製造法，但本發明所使用之核苷酸殘基或核苷殘基之製造法並不限定於該等。
於以下所示之製造法中，所定義之基在該製造法之條件下發生變化或不適合於實施該製造法之情形時，可藉由使用有機合成化學中常用之保護基之導入及去除方法[例如有機合成中之保護基 第4版(Protective Groups in Organic Synthesis,forth edition),T.W.Greene)著、John Wiley & Sons Inc.(2006年)等]等而製造目標化合物。又，視需要亦可改變導入取代基等反應步驟之順序。
製造法4-1
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同)
步驟1
化合物(b)可藉由於溶劑中、鹼存在下，使化合物(a)與所相當之 烷基化劑在0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。亦可藉由適當之活化劑而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二烷、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙胺、2,6-二甲基吡啶等。
作為烷基化劑，例如可列舉：三苯基氯甲烷、4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷等。
作為活化劑，例如可列舉4-二甲基胺基吡啶等。
化合物(a)例如可藉由公知之方法[Journal of Medicinal Chemistry,2004,47(6),1987-1996]而合成。
步驟2
化合物(c)可藉由於溶劑中、銀鹽及鹼存在下，使化合物(b)與矽烷化劑在0℃與80℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：THF、乙二醇二甲醚(DME，ethylene glycol dimethyl ether)等，該等可單獨使用或混合使用。
作為銀鹽，例如可列舉：硝酸銀、過氯酸銀等。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、1,4-二氮雜雙環[2,2,2]辛烷(DABCO，1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)、吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：氯化第三丁基二甲基矽烷等。
製造法4-2
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同，Re例如為乙醯基、苯甲醯基等可藉由鹼而去除之保護基，R11a-1於上述R11a之定義中，為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、或可具有取代基之芳香族雜環基)
步驟1
化合物(e)可藉由於溶劑中或於無溶劑下，使化合物(c)與化合物(d)於鹼存在下或非存在下在0℃與150℃之間之溫度下反應1小時至1週而製造。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、NMP、乙腈等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙胺等。
步驟2
化合物(f)可藉由於溶劑中，使化合物(e)與矽烷化劑在0℃與100℃之間之溫度下反應10分鐘至3小時後，與醯化劑在0℃與100℃之間反應1小時至72小時，進而利用水或醇處理1小時至24小時而製造。亦可藉由使醯化劑與適當之活化劑共存而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：氯化三甲基矽烷、三氟甲磺醯基三甲基矽烷、N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺、1,1,1,3,3,3-六甲基二矽氮烷等。
作為醯化劑，例如可列舉：乙酸酐、乙醯氯、苯甲醯氯等。
作為醇，例如可列舉：甲醇、乙醇、1-丙醇等。
作為活化劑，例如可列舉：4-二甲基胺基吡啶。
製造法4-3
(式中，Ra、Rb及R11a-1分別與上述含義相同，R11b-1為上述R11b之定義中之可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、或可具有取代基之芳香族雜環基)
化合物(h)可藉由於溶劑中或於無溶劑下，使化合物(c)與化合物(g)於鹼存在下或非存在下在0℃與150℃之間之溫度下反應1小時至1週而進行製造。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、NMP、乙腈等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙胺等。
製造法4-4
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同，R6b為可具有取代基之低級 烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，Xa為氧原子或硫原子，M為鹼金屬原子；此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同，可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基與上述可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基含義相同；鹼金屬原子為鋰原子、鈉原子或鉀原子)
化合物(k)可藉由於溶劑中，使化合物(c)與化合物(i)在0℃與100℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造，或者藉由於溶劑中，使化合物(c)與化合物(j)於鹼存在下在0℃與120℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、2-丙醇、THF、DME、DMF、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、氫化鈉、氫化鉀、第三丁醇鉀等。
製造法4-5
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同，Ar為可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，Rf為氫原子或可具有取代基之低級烷基；此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基 中之取代基含義相同，可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基與上述可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基含義相同)
化合物(m)可藉由於溶劑中，使化合物(c)與化合物(l)在鹼、及鈀觸媒存在下，於0℃與120℃之間之溫度下反應30分鐘至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
化合物(l)可以市售品之形式獲得，或者可利用公知之方法[例如「第5版實驗化學講座18有機化合物之合成VI使用金屬之有機合成」，p.97，丸善(2005年)]或依據其之方法而獲得。
作為鹼，例如可列舉：碳酸鉀、磷酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，例如可列舉：乙酸鈀、三(二亞苄基丙酮)二鈀、四(三苯基膦)鈀、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵-二氯化鈀-二氯甲烷1：1加成物等。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP、水等，該等可單獨使用或混合使用。
作為適當之膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、4,5'-雙(二苯基膦基)-9,9'-二甲基(Xantphos)、2,2'-雙(二苯基膦基)-1,1'-聯萘(BINAP，2,2'-Bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl)等。
製造法4-6
[化40]
(式中，Ra、Rb及Rf分別與上述含義相同，R15a、R15b及R15c分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、芳基、或芳香族雜環基；此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同)
化合物(p)可藉由於溶劑中，使化合物(c)與化合物(n)在鹼、及鈀觸媒存在下，於0℃與120℃之間之溫度下反應30分鐘至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
化合物(n)例如可以市售品之形式獲得。
作為鹼，例如可列舉：碳酸鉀、磷酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉上述者。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP、水等，該等可單獨使用或混合使用。
又，化合物(p)亦可藉由於溶劑中，使化合物(c)與化合物(o)在鹼與鈀觸媒之存在下，於0℃與140℃之間之溫度下反應30分鐘至72小時而製造。
作為鹼，例如可列舉：乙酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉上述者。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。
作為適當之膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
製造法4-7
(式中，Ra、Rb及R6b分別與上述含義相同)
化合物(r)可藉由於溶劑中，使化合物(c)與化合物(q)在鈀觸媒存在下，於0℃與150℃之間之溫度下進行反應而製造。亦可藉由適當之添加劑及/或適當之膦而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。
化合物(q)例如可以市售品之形式獲得。
作為鈀觸媒，可列舉上述者。
作為適當之添加劑，例如可列舉：氯化鋰、氟化銫等。
作為適當之膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
製造法4-8
(式中，Ra、Rb、R11c及R11d分別與上述含義相同)
化合物(t)可藉由於溶劑中，於一氧化碳氣體環境下，使化合物(c)與化合物(s)在鹼與鈀觸媒之存在下，於室溫與120℃之間之溫度下反應1小時至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：乙酸鈉、乙酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉上述者。
作為膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
製造法4-9
[化43]
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同，R6c為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基；此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同，可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基與上述可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基含義相同)
步驟1
化合物(w)可藉由於溶劑中，於一氧化碳氣體環境下，使化合物(c)與化合物(u)在鹼與鈀觸媒之存在下，於室溫與120℃之間之溫度下反應1小時至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、第三丁醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：乙酸鈉、乙酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉上述者。
作為膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
步驟2
化合物(y)可藉由於溶劑中、鹼之存在下，使化合物(w)在0℃與100℃之間之溫度下處理5分鐘~72小時而製造。
作為鹼，例如可列舉：碳酸鉀、氫氧化鋰、氫氧化鉀、氫氧化鈉、甲醇鈉等。
作為溶劑，例如可列舉含有水之溶劑，作為該溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP、吡啶等，該等可水進行混合而使用，或者將各自混合並進而添加水而使用。
製造法4-10
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同，R6d為可具有取代基之低級烷基、芳基或芳香族雜環基；此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同)
化合物(aa)可藉由於溶劑中，使化合物(c)與化合物(z)在銅鹽、鹼與鈀觸媒之存在下，於室溫與150℃之間之溫度下反應1小時至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、 DMA、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。
作為銅鹽，例如可列舉碘化銅(I)等。
作為鹼，例如可列舉：乙酸鈉、乙酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉上述者。
作為膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
製造法4-11
可使用藉由下述方法所獲得之化合物ae，依據上述製造法4-2~4-10，而獲得本發明之寡核苷酸製造之原料所使用之核苷。
(式中，Ra、Rb及Rc分別與上述含義相同)
步驟1
化合物(ac)可藉由於溶劑中，使化合物(ab)與矽烷化劑在0℃與100℃之間之溫度下反應10分鐘至3小時後，與醯化劑在0℃與100℃之間下反應1小時至72小時，進而利用水或醇處理1小時至24小時而製 造。
作為溶劑，例如可列舉吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：氯化三甲基矽烷、三氟甲磺醯基三甲基矽烷、N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺、1,1,1,3,3,3-六甲基二矽氮烷等。
作為醯化劑，例如可列舉：乙酸酐、乙醯氯、苯甲醯氯等。
作為醇，例如可列舉：甲醇、乙醇、1-丙醇等。
化合物(ab)例如可藉由公知之方法[Tetrahedron,1970,26,4251-4259]進行合成。
步驟2
化合物(ad)可藉由於溶劑中、鹼存在下，使化合物(ac)與所相當之烷基化劑在0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。亦可藉由適當之活化劑而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二烷、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙胺、2,6-二甲基吡啶等。
作為烷基化劑，例如可列舉：三苯基氯甲烷、4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷等。
作為活化劑，例如可列舉：4-二甲基胺基吡啶等。
步驟3
化合物(ae)可藉由於溶劑中、銀鹽、及鹼存在下，使化合物(ad)與矽烷化劑在0℃與80℃之間反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉THF、DME等，該等可單獨使用或混合使用。
作為銀鹽，例如可列舉：硝酸銀、過氯酸銀等。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、DABCO、吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：氯化第三丁基二甲基矽烷等。
製造法4-12
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同)
步驟1
化合物(ag)可藉由於溶劑中、鹼存在下，使化合物(af)與所相當之烷基化劑在0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。亦可藉由適當之活化劑而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二烷、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙胺、2,6-二甲基吡啶等。
作為烷基化劑，例如可列舉：三苯基氯甲烷、4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷等。
作為活化劑，例如可列舉：4-二甲基胺基吡啶等。
化合物(af)例如可藉由公知之方法[Journal of Medicinal Chemistry,2004,50(5),915-921及WO2011/51733]進行合成。
步驟2
化合物(ah)可藉由於溶劑中、銀鹽、及鹼存在下，使化合物(ag) 與矽烷化劑在0℃與80℃之間反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉THF、DME等，該等可單獨使用或混合使用。
作為銀鹽，例如可列舉：硝酸銀、過氯酸銀等。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、DABCO、吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：氯化第三丁基二甲基矽烷等。
製造法4-13
(式中，Ra、Rb、Rf及Ar分別與上述含義相同)
化合物(ai)可使用化合物(ah)，依據製造法4-5進行製造。
製造法4-14
(式中，Ra、Rb、Rf、R15a、R15b及R15c分別與上述含義相同)
化合物(aj)可使用化合物(ah)，依據製造法4-6而製造。
製造法4-15
(式中，Ra、Rb及R6b分別與上述含義相同)
化合物(ak)可使用化合物(ah)，依據製造法4-7而製造。
製造法4-16
(式中，Ra、Rb及R6d分別與上述含義相同)
化合物(al)可使用化合物(ah)，依據製造法4-10而製造。
製造法4-17
[化51]
(式中，Ra、環A、R16、n1及Rb分別與上述含義相同，Rg例如為二第三丁基矽烷基等可利用氟化物離子而去除之保護基，Xa例如為鹵基、醯氧基等脫離基，R17、R18及R19分別為例如醯基等可利用鹼而脫保護之保護基)
步驟1
化合物(nb)可藉由於溶劑中、矽烷化劑存在下，使化合物(na)與化合物(naa)在0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至1天後，於路易斯酸存在下，在0℃與150℃之間之溫度下處理10分鐘至1天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：乙腈、1,2-二氯乙烷、THF、甲苯等，該等可單獨使用或混合使用。
作為矽烷化劑，例如可列舉：氯化三甲基矽烷、三氟甲磺醯基三甲基矽烷、N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺、1,1,1,3,3,3-六甲基二矽 氮烷等。
作為路易斯酸，例如可列舉：三氟甲磺醯基三甲基矽烷、四氯化錫等。
化合物(na)可以市售品之形式獲得，或者例如利用公知之方法[Tetrahedron,2012年，68卷，8908-8915頁]或依據其之方法而獲得。
步驟2
化合物(nc)可藉由於溶劑中或無溶劑之情況下，使化合物(nb)與鹼在室溫與50℃之間之溫度下反應1小時至4天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、THF、DMF、水等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：氨、甲胺、氫氧化鈉、甲醇鈉等。
步驟3
化合物(nd)可藉由於溶劑中、鹼存在下，使化合物(nc)與例如相當之矽烷化劑在0℃與80℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、DMA、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：咪唑、三乙胺、二異丙基乙胺等。
作為矽烷化劑，例如可列舉雙(三氟甲磺酸)二第三丁基矽烷基酯等。
步驟4
化合物(ne)可藉由於溶劑中、鹼存在下，使化合物(nd)與例如所相當之矽烷化劑在0℃與80℃之間反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、DMF等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：咪唑、三乙胺、二異丙基乙胺等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：氯化第三丁基二甲基矽烷等。
步驟5
化合物(nf)可藉由於溶劑中、鹼存在下，利用脫保護試劑對化合物(ne)在0℃與80℃之間處理10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、二乙醚、THF、DME、二烷等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、二異丙基乙胺、吡啶等。
作為脫保護試劑，例如可列舉氟化氫-吡啶等。
步驟6
化合物(ng)可藉由於溶劑中、鹼存在下，使化合物(nf)與所相當之烷基化劑於0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。亦可藉由適當之活化劑而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、THF、二烷、DMF、吡啶等，該等可單獨使用或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、二異丙基乙胺、吡啶等。
作為烷基化劑，例如可列舉：三苯基氯甲烷、4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷等。
作為活化劑，例如可列舉：4-二甲基胺基吡啶等。
關於上述各製造法中所含之化合物中之各基之轉化，亦可藉由公知之方法[例如有機官能團轉化 第2版(Comprehensive Organic Transformations 2nd edition),R.C.Larock著，Vch Verlagsgesellscaft Mbh(1999年)等]或依據該等之方法而進行。
對上述各製造法之產物藉由公知之方法進行羥基之脫保護、及磷酸化[例如藥物化學雜誌(Journal of Medicinal Chemistry)，第55卷，1478-1489頁(2012年)等]，藉此可獲得所需之核苷酸或核苷。
上述各製造法中之中間物及目標化合物可供於有機合成化學中常用之分離純化法、例如過濾、萃取、清洗、乾燥、濃縮、再結晶、 各種層析法等而單離純化。又，關於中間物亦可不特別進行純化而供於後續之反應。
上述核苷酸或核苷例如亦可以酸加成鹽、金屬鹽、銨鹽、有機胺加成鹽、胺基酸加成鹽等鹽之形式獲得。
作為酸加成鹽，例如可列舉：鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽，乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽等有機酸鹽；作為金屬鹽，例如可列舉：鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽，鎂鹽、鈣鹽等鹼土金屬鹽，鋁鹽、鋅鹽等；作為銨鹽，例如可列舉：銨、四甲基銨等之鹽；作為有機胺加成鹽，例如可列舉：嗎啉、哌啶等之加成鹽；作為胺基酸加成鹽，例如可列舉：離胺酸、甘胺酸、苯基丙胺酸等之加成鹽。
於欲獲取上述核苷酸或核苷之鹽時，只要在以鹽之形式獲得上述核苷酸或核苷時直接進行純化即可，又，於以游離之形式獲得時，只要使上述核苷酸或核苷溶解或懸浮於適當之溶劑中，並加入酸或鹼而單離、純化即可。
於上述核苷酸或核苷中，亦具有可能存在幾何異構物、光學異構物等立體異構物、互變異構物等者，本發明可使用包括該等在內之全部可能之異構物及該等之混合物。
又，上述核苷酸或核苷亦存在以與水或各種溶劑之加成物之形式存在之情況，該等加成物亦可用於本發明。
將化合物(Ia)之具體例示於表1~7。但是，本發明之化合物(Ia)及所相當之式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基並不限定於該等及相當之核苷酸殘基或核苷殘基。
本發明之寡核苷酸可使用轉染(transfection)用之載體、較佳為陽離子性脂質體等陽離子性載體而導入至細胞內。又，亦可藉由磷酸鈣法、電穿孔(electroporation)法或顯微注射(microinjection)法等而直接 導入至細胞內。
例如siRNA可藉由切斷mRNA而選擇性地抑制所有蛋白質之表現，因此期待應用於醫藥。於具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱表現活性的寡核苷酸(例如siRNA)中，藉由將該寡核苷酸之5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基置換為式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基，而期待對於標靶mRNA之減弱表現活性。
又，於具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱表現活性的寡核苷酸(例如siRNA)中，藉由將該寡核苷酸之5'末端之鹼基殘基置換為式(II)~(V)所表示之鹼基殘基，而成為與AGO2之親和性提高之寡核苷酸，成為具有對於標靶mRNA之較高之減弱表現活性之寡核苷酸。又，於5'末端之鹼基為鳥嘌呤或胞嘧啶之寡核苷酸中，將該寡核苷酸之5'末端之鳥嘌呤殘基或胞嘧啶殘基置換為腺嘌呤殘基(6-胺基嘌呤-9-基)、胸腺嘧啶殘基(5-甲基-1,2,3,4四氫嘧啶-2,4二酮-1-基)、尿苷殘基(嘧啶-2,4(1H,3H)二酮-1-基)、或式(II)~(V)所表示之鹼基殘基，而成為與AGO2之親和性提高之寡核苷酸，成為具有對於標靶mRNA之較高之減弱表現活性之寡核苷酸。
關於藉由本發明所獲得之具有對於標靶mRNA之高減弱表現活性之寡核苷酸，其5'末端之磷酸部分或糖部可與式(I)相同亦可不同。
作為本發明中之式(II)~(V)所表示之鹼基殘基之較佳形態，可列舉上述(4)~(12)、(14)~(16)、(18)~(22)、(24)~(27)所示之式(II)~(V)所表示之鹼基殘基，作為更佳之形態，可列舉上述(34)~(38)、(40)~(43)、(45)~(47)所示之式(IIA)~(VA)所表示之鹼基殘基。
本發明之寡核苷酸及藉由本發明之方法而使對於標靶mRNA之減弱表現活性提高之寡核苷酸亦可直接單獨投予，理想為以通常之各種醫藥製劑之形式提供。又，該等醫藥製劑係用於動物及人。
本發明之醫藥製劑可單獨含有本發明之寡核苷酸作為活性成 分，或者可以與任意其他用以治療之有效成分之混合物之形式含有。又，該等醫藥製劑可將活性成分與藥學上容許之一種或其以上之載體一併混合，並藉由製藥學之技術領域中所熟知之任意方法而製造。例如作為本發明之醫藥製劑之製造方法，可列舉：磷酸鈣法、DEAE(diethyl-aminoethyl，二乙基胺基乙基)-葡聚糖法、電穿孔及顯微注射、病毒法、以及使用陽離子脂質體之方法等(Graham,F.L.及van der Eb,A.J.(1973)Virol.52,456；McCutchan,J.H.及Pagano,J.S.(1968)J.Natl.Cancer Inst.41,351；Chu,G.等人(1987)Nucl.Acids Res.15,1311；Fraley,R等人(1980)J.Biol.Chem.255,10431；Capechi,M.R.(1980)Cell 22,479；Felgner,P.L.等人(1987),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413)。又，可列舉使用含有核酸之陽離子脂質微粒或陽離子聚合物、及核酸封入脂質微粒等之方法。進而，通常實施利用聚乙二醇(PEG，polyethylene glycol)等水溶性高分子修飾脂質微粒等之表面，上述含有核酸之陽離子脂質微粒、陽離子聚合物、核酸封入脂質微粒等亦可製成PEG修飾脂質微粒。
作為投予途徑，較理想為使用治療時最有效果者，可列舉經口、或例如靜脈內等非經口。
作為投予形態，例如可列舉錠劑、注射劑等。
適合於經口投予之例如錠劑等可使用乳糖等賦形劑、澱粉等崩散劑、硬脂酸鎂等潤滑劑、羥基丙基纖維素等結合劑等而製造。
適合於非經口投予之例如注射劑可使用鹽溶液、葡萄糖溶液或鹽溶液與葡萄糖溶液之混合液等而製造。
本發明之寡核苷酸之投予量及投予次數根據投予形態、患者之年齡、體重、欲治療之症狀之性質或嚴重度等而不同，通常於靜脈內投予等非經口投予之情形時，成人每人投予0.001~100mg、較佳為0.01~10mg，一天一次或數次。然而，該等投予量及投予次數會根 據上述各種條件而變動。
以下，藉由實施例及參考例對本發明之態樣進行說明。於無特別記載之情形時，所使用之原料及試劑以市售品之形式或依據已知之方法而獲得。再者，本發明並不限定於該等實施例及參考例。
[實施例1]
使用核酸合成裝置(Ultra Fast Parallel Syntheizer，Sigma公司製造，以下記為UFPS)，以0.5μmol尺度合成表8所示之於反義鏈之5'末端具有8-溴-2'-脫氧腺苷單磷酸(8-Br-dA)之螢光素酶標靶siRNA(反義鏈之序列中所含之X意指8-Br-dA)。固相載體係使用CPG 500埃，rA.rG(tac),SAFC-PROLIGO。將DMT-2'-O-TBDMS-rA(tac)Amidite(SAFC-PROLIGO公司)、DMT-2'-O-TBDMS-rG(tac)Amidite(SAFC-PROLIGO公司)、DMT-2'-O-TBDMS-rC(tac)Amidite(SAFC-PROLIGO公司)、及DMT-2'-O-TBDMS-rU Amidite(SAFC-PROLIGO公司)製備成0.1mol/L乙腈溶液，將8-Br-dA-CE亞磷醯胺(Glen Research公司)製備成0.1mol/L乙腈溶液，將化學磷酸化試劑II(Glen Research公司)製備成0.06mol/L乙腈溶液，用於縮合反應。作為亞磷醯胺之活化物，係使用5-苄硫基-1H-四唑(SAFC-PROLIGO公司)，將縮合時間設為各10分鐘。藉由脫三苯甲基(Trityl-off)進行合成後，浸漬於28%氨溶液中，於55℃下放置4小時。於減壓下進行濃縮，添加31%三乙胺三氫氟酸鹽，於65℃下放置3小時，其後加入1-丁醇而使反應停止。使用逆相液相層析(SHISEIDO，CAPSELL PAK C18，SG300，6.0mm×75mm，5%乙腈/0.1%乙酸三乙基銨緩衝液，B液：利用50%乙腈/水之梯度)進行純化，獲得目標寡核苷酸。
將所獲得之單鏈之寡核苷酸溶解於混合緩衝液[100mmol/L之乙酸鉀，30mmol/L之2-[4-(2-羥基乙基)哌-1-基]乙磺酸(HEPES，2-[4- (2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)-KOH(pH值7.4)，2mmol/L之乙酸鎂]中，製成濃度50μmol/L。將正義鏈、反義鏈各自等量混合，於80℃下靜置10分鐘。緩慢降低溫度，於37℃下靜置1小時，獲得雙鏈寡核苷酸。
試驗例1：螢光素酶標靶siRNA之RNAi活性
針對實施例1所獲得之於反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之螢光素酶標靶siRNA之RNAi活性，如下所示以螢光素酶發光抑制等級作為指標進行評估。
於培養皿(Costar公司製造之分析盤，96孔，附帶蓋，型號3917)中，使導入有螢光素酶表現載體(pGL4.50[luc2/CMV/Hygro]Vector，Promega公司)之源自人類子宮頸癌之細胞株Hela細胞(CCL-2，自ATCC(American type culture collection，美國菌種保存中心)購入)懸浮於含有10%胎牛血清之RPMI培養基(Invitrogen Life technologies，11875093)中，以每1孔成為5000細胞數之方式向各孔中接種50μL之細胞懸浮液。
利用OPTI-MEM(Invitrogen Life technologies，31985-070)將siRNA稀釋。利用OPTI-MEM將脂質體RNAi MAX(Invitrogen Life technologies，13778-075)稀釋。將所製備之各稀釋液進行混合，形成siRNA與脂質體RNAi MAX複合體。向含有細胞懸浮液之各孔中添加10μL所製備之siRNA-Pofectamine RNAi MAX(Invitrogen Life technologies，13778-075)複合體溶液，藉此將siRNA導入至Hela細胞中。將siRNA之最終濃度設為100pmol/L之1種、或3.2pmol/L、16pmol/L、80pmol/L及400pmol/L之4種，設為N=6。又，作為陰性對照群，係接種僅添加有脂質體RNAi MAX之細胞。又，為了進行比較，對於各siRNA之相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸腺苷之siRNA(分別稱為239-A、874-A、904-A、1084-A、1203-A及1556-A，表9)亦同樣地進行試驗。進而，對於874-BrdA之相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸鳥苷、單磷酸胞苷或單磷酸尿苷之siRNA(稱為874-G、874-C及874-U，表10)亦同樣地進行試驗。
導入siRNA後之細胞係於37℃、5%CO2條件下培養24小時。
針對培養後之細胞，根據隨附之操作說明，向各孔中添加40μL之作為市售螢光素酶定量試劑之Steady-Glo螢光素酶分析系統(Steady-Glo Luciferase Assay System，Promega，E2520)。培養10分鐘後，根據操作說明，利用ARVO(PerkinElmer)對各孔之每1秒之發光量(cps)進行測定。
於測定螢光素酶標靶siRNA處理群之發光量之同時，亦測定陰性對照群之發光量，藉此以將siRNA未導入群(陰性對照群)之發光量設為1時之相對比率之形式表示siRNA導入檢體之RNAi效果。
將本試驗之結果示於圖1及圖2。圖1係表示最終濃度100pmol/L下之本發明之siRNA與該序列中之相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸腺苷之siRNA之比較的圖。圖2係表示最終濃度3.2pmol/L、16pmol/L、80pmol/L及400pmol/L下之作為本發明之siRNA的874-BrdA與該序列中之相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸腺苷、單磷酸鳥苷、單磷酸胞苷或單磷酸尿苷之874-A、874-G、874-C及874-U之比較的圖(圖1及2中，縱軸為將陰性對照群之發光量設為1之情形時之發光比率)。再者，藉由克拉斯卡-瓦曆斯檢定(Kruskal-Wallis test)判斷有無有意義差。統計分析係使用統計分析軟體SAS(SAS，9.2版，SAS Institute Inc.)。表11中表示將利用239-BrdA、874-BrdA、904-BrdA、1084-BrdA、1203-BrdA及1556-BrdA所得之發光抑制率分別與利用239-A、874-A、904-A、1084-A、1203-A及1556-A所得之發光抑制率進行比較而獲得之有意義差檢定結果。得知均顯示出0.05以下之p值，關於將單磷酸腺苷置換為8-Br-dA之siRNA，發光抑制率顯著提高。
試驗例2：螢光素酶標靶siRNA之RNAi活性
對實施例1所獲得之於反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之螢光素酶標靶siRNA之RNAi活性，以如下所示之方式測定螢光素酶GL4信使RNA(Luciferase GL4 mRNA)(基因庫許可編號EU921840)之表現抑制 效果，並進行評估。
於培養皿(Nunc公司製造之Multidish 24孔，型號142475)中，使源自人類子宮頸癌之細胞株Hela細胞(CCL-2，自ATCC購入)懸浮於含有10%胎牛血清之RPMI培養基(Invitrogen Life technologies，11875093)中，以每1孔成為50000細胞數之方式向各孔中接種500μL之細胞懸浮液。向其中添加100μL之混合於OPTI-MEM(Invitrogen Life technologies，31985-070)中之siRNA-脂質體RNAi MAX(Invitrogen Life technologies，13778-075)複合體溶液，藉此將siRNA導入至Hela細胞中。將siRNA之最終濃度設為10000pmol/L、2000pmol/L、400pmol/L、80pmol/L、16pmol/L、3.2pmol/L、0.64pmol/L之7種。又，作為陰性對照群，係接種僅添加有脂質體RNAi MAX之細胞。
導入siRNA後之細胞係於37℃、5%CO2條件下培養24小時。RNA之回收係使用QIAGEN公司之RNA提取套組(RNeasy，74106)，利用磷酸緩衝液將培養後之細胞清洗1次，其後將細胞溶解於RNeasy套組所隨附之RLT緩衝液(隨附於RNeasy)中並回收，依據套組所隨附之說明書回收總RNA。以1μg之總RNA作為模板，使用轉錄因子第一鏈cDNA合成套組(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche公司4897030001)進行反轉錄反應，製作cDNA。將該cDNA用作PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)反應之模板，藉由使用ABI7900HT Fast(Applied Biosystems(ABI)公司)之Taqman探針(Taqman probe)法，使GL4(基因庫許可編號EU921840)基因及作為對照之D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，基因庫許可編號NM_001256799))進行PCR反應，分別測定mRNA擴增量，將GAPDH之mRNA擴增量作為內部對照，算出GL4之mRNA之準定量值。GAPDH之測定係使用Taqman探針 Hs99999905 m1(Applied Biosystems(ABI)公司)。GL4之測定係使用通用探針基因庫之探針#20(Roche公司04686934001)、及作為擴增引子之具有序列編號63所表示之鹼基序列之DNA(前置引子)、具有序列編號64所表示之鹼基序列之DNA(反置引子)。又，同樣地對陰性對照群之GL4之mRNA量及GAPDH之mRNA擴增量分別進行測定，將GAPDH之mRNA擴增量設為內部對照，算出GL4之mRNA之準定量值。
siRNA導入檢體之標靶mRNA量係以將siRNA未導入群(陰性對照群)中之GL4之mRNA量設為1時之相對比率之形式表示。
IC50值係藉由羅吉特(Logit)法算出。統計分析係使用統計分析軟體SAS(SAS，9.2版，SAS Institute Inc.)進行。
表12中表示作為本發明之siRNA之874-BrdA、與作為比較的於該序列中之相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸腺苷或單磷酸尿苷的874-A及874-U之IC50值。
根據試驗例1及2之結果得知，與反義鏈之5'末端具有對應之天然型核苷酸之siRNA相比，於反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之siRNA(874-BrdA)對螢光素酶表現顯示出更高之減弱表現活性。
[實施例2]
使用市售之8-側氧基-dA-CE亞磷醯胺，藉由與實施例1相同之方式進行合成，而獲得表13所示之於反義鏈之5'末端具有8-側氧基-2'-脫氧腺苷單磷酸之螢光素酶標靶siRNA(稱為874-8-oxo-dA，反義鏈之序列中所含之X意指8-側氧基-2'-脫氧腺苷單磷酸)。
[實施例3]
使用市售之5-Br-dU-CE亞磷醯胺，藉由與實施例1相同之方式進行合成，而獲得表13所示之於反義鏈之5'末端具有5-溴-2'-脫氧尿苷單磷酸之siRNA(稱為874-5-Br-dU，反義鏈之序列中所含之X意指5-溴-2'-脫氧尿苷單磷酸)。
[實施例4]
使用市售之5-F-dU-CE亞磷醯胺，藉由與實施例1相同之方式進行合成，而獲得表13所示之於反義鏈之5'末端具有5-氟-2'-脫氧尿苷單磷酸之siRNA(稱為454-5-F-dU及1556-5-F-dU，反義鏈之序列中所含之X意指5-氟-2'-脫氧尿苷單磷酸)。
MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption Inoization-Time of Flight，基質輔助雷射脫附游離-飛行時間型)/MS
454-5-F-dU(反義鏈) 理論值6668.85(M-H) 實測值6673.35
1556-5-F-dU(反義鏈) 理論值6669.03(M-H) 實測值6671.33
試驗例3：螢光素酶標靶siRNA之RNAi活性
藉由與試驗例2相同之方式對實施例4所獲得之螢光素酶標靶siRNA(表13，於X之位置具有5-F-dU)之RNAi活性進行測定，並進行評估。將其與各反義鏈之5'末端具有對應之天然型核苷酸的siRNA(表14)進行比較。
表15表示各IC50值。
根據試驗例3之結果得知，與各反義鏈之5'末端具有對應之天然型核苷酸之siRNA相比，於反義鏈之5'末端具有5-氟-2'-脫氧尿苷單磷酸之siRNA(454-5-F-dU及1556-5-F-dU)對螢光素酶表現顯示出較高之減弱表現活性。
[實施例5]
藉由與實施例1相同之方式進行合成，而獲得表16所示之於反義鏈之5'末端具有8-側氧基-2'-脫氧單磷酸腺苷的D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標靶siRNA(反義鏈之序列中所含之X意指8-側氧基-2'-脫氧腺苷單磷酸)。
試驗例4：D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標靶siRNA之RNAi活性
針對反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之GAPDH標靶siRNA之RNAi活性，藉由如下所示之方式測定GAPDH mRNA之表現抑制效果，並進行評估。
於培養皿(Nunc公司製造之Multidish 24孔，型號142475)中，使源自人類子宮頸癌之細胞株Hela細胞(CCL-2，自ATCC購入)懸浮於含有10%胎牛血清之RPMI培養基(Invitrogen Life technologies，11875093)中，以每1孔成為50000細胞數之方式向各孔中接種500μL之細胞懸浮液。向其中添加100μL之混合於OPTI-MEM(Invitrogen Life technologies 31985-070)中之siRNA-脂質體RNAi MAX(Lipofectamine RNAiMAX，Invitrogen Life technologies 13778-075)複合體溶液，藉此將siRNA導入至Hela細胞中。將siRNA之最終濃度設為100pmol/L之1種。又，作為陰性對照群，係接種僅添加有脂質體RNAi MAX之細胞。
導入siRNA後之細胞係於37℃、5%CO2條件下培養24小時。RNA之回收係使用QIAGEN公司之RNA提取套組(RNeasy 74106)，利用磷酸緩衝液將培養後之細胞清洗1次，其後使細胞溶解於RNeasy套組所隨附之RLT緩衝液(隨附於RNeasy)中並回收，依據套組所隨附之說明書回收總RNA。以1μg之總RNA作為模板，使用轉錄因子第一鏈cDNA合成套組(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche公司，4897030001)進行反轉錄反應，製作cDNA。將該cDNA用作PCR反應之模板，藉由使用ABI7900HT Fast(ABI公司)之Taqman探針法，使GADPH基因及作為對照之肽基脯胺醯基順反異構酶(PPIB)(pepytidyl-prolyl cis-trans isomerase B)基因(基因庫許可編號NM_000942)進行PCR反應，分別測定mRNA擴增量，將PPIB之mRNA擴增量作為內部對照，算出GAPDH之mRNA之準定量值。GAPDH之 測定係使用Taqman探針Hs99999905 m1(Applied Biosystems(ABI)公司)，PPIB之測定係使用Hs01018502 m1(Applied Biosystems(ABI)公司)。又，同樣地對陰性對照群中之GAPDH之mRNA量及PPIB之mRNA擴增量分別進行測定，將PPIB之mRNA擴增量作為內部對照，算出GAPDH之mRNA之準定量值。
siRNA導入檢體之標靶mRNA量係以將siRNA未導入群(陰性對照群)中之GAPDH之mRNA量設為1時之相對比率之形式表示。
又，為了進行比較，對於在各siRNA之相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸腺苷之siRNA(表17)亦同樣地進行試驗。
將本試驗之結果示於表18及圖3。
根據試驗例4之結果得知，與反義鏈之5'末端具有對應之天然型核苷酸之siRNA相比，於反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之D-甘油醛-3-磷 酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標靶siRNA針對GAPDH之表現顯示出較高之減弱表現活性。
[實施例6]
藉由與實施例1相同之方式進行合成，而獲得表19所示之於反義鏈之5'末端具有5-氟-2'-脫氧尿苷單磷酸之D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標靶siRNA(反義鏈之序列中所含之X意指5-氟-2'-脫氧尿苷單磷酸)。
MALDI-TOF/MS
1096-5-F-dU(反義鏈) 理論值6801.03(M-H) 實測值6797.74
試驗例5 D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標靶siRNA之RNAi活性
藉由與試驗例4相同之方式測定GAPDH mRNA之表現抑制效果，對實施例6所獲得之GAPDDH標靶siRNA之活性進行評估。
siRNA導入檢體之標靶mRNA量係以將siRNA未導入群(陰性對照群)中之GAPDH之mRNA量設為1時之相對比率之形式表示。GAPDH之mRNA量係算出次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1，基因庫許可編號NM_000194)之mRNA擴增量作為內部對照。HPRT1之測定係使用Taqman探針Hs99999909_m1(Applied Biosystems(ABI)公司)。
又，為了進行比較，對於在各siRNA之反義5'末端具有尿嘧啶單 磷酸、單磷酸腺苷或鳥嘌呤單磷酸之siRNA(表19)亦同樣地進行試驗。
將本試驗之結果示於表20。
根據試驗例5之結果得知，與反義鏈之5'末端具有對應之天然型核苷酸之siRNA相比，於反義鏈之5'末端具有5-氟-2'-脫氧尿苷單磷酸之D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標靶siRNA針對GAPDH之表現顯示出較高之減弱表現活性。
參考例1.0：化合物I-5 步驟1
將市售之6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(220mg，0.991mmol)、1-O-乙醯基-2,3,5-三-O-苯甲醯基-β-D-核呋喃糖(500mg，0.991mmol)溶解於乙腈(5mL)中，添加N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(0.735mL，2.97mmol)，於60℃下攪拌20分鐘。將反應液冷卻至室溫後，添加甲磺醯基三甲基矽烷(0.627mL，3.47mmol)，於60℃下攪拌1小時。將反應液冷卻至室溫後加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取。利用水及飽和食鹽水清洗有機層，以硫酸鈉進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯氧基)甲基)-5-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基) 四氫呋喃-3,4-二基酯(599mg，產率91%)。
步驟2
將步驟1所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯氧基)甲基)-5-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(599mg，0.899mmol)溶解於甲醇(9mL)中，加入甲胺/甲醇溶液(4.58mL、44.9mmol)，於室溫下徹夜攪拌。於減壓下蒸餾去除溶劑，向所獲得之殘渣中加入二乙醚，濾取析出物，藉此獲得1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(312mg，產率98%)。
ESI-MS(m/z)：353(M-1)
步驟3
使步驟2所獲得之1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(310mg，0.875mmol)懸浮於丙酮(15mL)中，加入2,2-二甲氧基丙烷(0.536mL，4.37mmol)、4-甲苯磺酸一水合物(183mg，0.962mmol)，於室溫下攪拌2小時。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液後，於減壓下蒸餾去除溶劑直至溶劑量成為約一半，利用氯仿/甲醇系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(315mg，產率91%)。
ESI-MS(m/z)：395(M+1)
步驟4
將步驟3所獲得之1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(310mg，0.786mmol)溶解於二氯甲烷(8mL)中，加入1H-四唑(138mg，1.97mmol)、二第三丁基-二異丙基磷雜環戊二烯 醯胺(0.522mL，1.57mmol)，於室溫下攪拌5小時。將反應液冷卻至0℃，加入間氯過苯甲酸(452mg，1.97mmol)，於0℃下進而攪拌20分鐘。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用氯仿進行萃取，其後以硫酸鈉進行乾燥。藉由於減壓下蒸餾去除溶劑而獲得殘渣，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(259mg，產率56%)。
ESI-MS(m/z)：587(M+1)
步驟5
將步驟4所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(77.5mg，0.132mmol)溶解於三氟乙酸/水(1：1)(2mL)中，於室溫下攪拌2小時。於減壓下蒸餾去除溶劑後，加入乙酸-三乙胺緩衝液(pH值6.5)(2mL)，再次於減壓下蒸餾去除溶劑。將所獲得之殘渣溶解於乙醇中，加入乙酸乙酯，濾取析出物，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-5)三乙基銨鹽(64.9mg，產率92%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.43(s,1H),6.91(s,1H),6.08(d,J=4.0Hz,1H),4.77-4.58(m,1H),4.38(t,J=7.3Hz,1H),4.04-4.02(m,3H),3.90(s,3H),3.81(s,3H),3.08(q,J=7.3Hz,6H),1.16(t,J=7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：435(M+1)
參考例1.1：化合物am-1 步驟1
將參考例1.0之步驟2所獲得之1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(812mg，2.29mmol)溶解於DMF(10.0mL)中，於冰浴冷卻下加入雙(三氟甲磺酸)二第三丁基矽烷基酯(1.00mL，2.75mmol)後，於冰浴冷卻下攪拌6小時。向反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用水及飽和食鹽水清洗有機層，並以無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得1-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-羥基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基]-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(1.08g，95.0%)。
ESI-MS(m/z)：493(M-1)
步驟2
將步驟1所獲得之1-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-羥基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(1.73mg，3.50mmol)溶解於DMF(18.0mL)中，加入咪唑(1.19g，17.5mmol)、氯化第三丁基二甲基矽烷(791mg，5.25mmol)後，於60℃下攪拌3小時。向反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用水及飽和食鹽水清洗有機層，並以無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(1.95g，92.0%)。
ESI-MS(m/z)：607(M-1)
步驟3
將步驟2所獲得之1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁 基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(500mg，0.821mmol)溶解於二氯甲烷(8.00mL)中，於冰浴冷卻下加入吡啶(0.531mL，6.57mmol)、氟化氫-吡啶(0.423mL，3.28mmol)，於冰浴冷卻下攪拌1小時。向反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用水及飽和食鹽水清洗有機層，並以無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得1-((2R,3R,4R,5R)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(336mg，87.0%)。
ESI-MS(m/z)：467(M-1)
步驟4
將步驟3所獲得之1-((2R,3R,4R,5R)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(85.0mg,0.181mmol)溶解於吡啶(2.00mL)中，加入4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷(184mg，0.544mmol)、4-二甲基胺基吡啶(4.43mg，0.0360mmol)，於室溫下攪拌1小時。向反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取後，利用水及飽和食鹽水清洗有機層，並以無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得1-((2R,3R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(138mg，99.0%)。
ESI-MS(m/z)：769(M-1)
步驟5
將步驟4所獲得之1-((2R,3R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基) 甲氧基)甲基)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(74.0mg，0.0960mmol)溶解於THF(2.00mL)中，於冰浴冷卻下加入二異丙胺(0.084mL，0.480mmol)、氯(二異丙基胺基)亞膦酸2-氰基乙酯(0.043mL，0.192mmol)後，於室溫下攪拌3小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用乙酸乙酯/庚烷系之胺基矽膠管柱層析法對殘渣進行純化後，進而利用乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法進行純化，藉此獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-1，63.0mg，67.6%)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ：7.94(1H,brs),7.55(1H,s),7.47-7.39(2H,m),7.38-7.12(7H,m),6.93(1H,s),6.81-6.70(4H,m),5.92(1H,d,J=4.8Hz),5.18-5.08(1H,m),4.53-4.38(1H,m),4.37-4.26(1H,m),3.96-3.48(16H,m),3.46-3.23(1H,m),2.68-2.52(1H,m),2.35-2.27(1H,m),1.20-1.00(1H,m),0.83,0.81(9H,2s),0.05,0.03,-0.10,-0.09(6H,4s).
ESI-MS(m/z)：971(M+1)
[實施例7]
使用參考例1.1所獲得之化合物am-1，藉由與實施例1相同之方式合成下述表24所示之於454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-5之siRNA。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6776.96(M-H) 實測值6776.21
參考例2.0：化合物I-6
使用市售之6-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.0相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑 啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-6)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.88(d,J=1.8Hz,1H),7.64(dd,J=9.2,2.6Hz,1H),7.58(d,J=9.2Hz,1H),6.14(d,J=5.5Hz,1H),4.70-4.68(m,1H),4.37(t,J=5.9Hz,1H),4.09-4.02(m,3H).
ESI-MS(m/z)：409(M+1)
參考例2.1：化合物am-2
使用市售之6-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(6-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-2)。
[實施例8]
使用參考例2.1所獲得之化合物am-2，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-6之siRNA。
參考例3.0：化合物I-7
使用市售之7-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.0相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-7)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.95(d,J=8.4Hz,1H),7.61(s,1H),7.30(d,J=8.4Hz,1H),5.99(d,J=4.4Hz,1H),4.79(t,J=5.3Hz,1H),4.38(t,J=6.4Hz,1H),4.04-3.92(m,3H).
ESI-MS(m/z)：409(M+1)
參考例3.1：化合物am-3
使用市售之7-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(7-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑 啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-3)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：8.11(d,J=8.5Hz,1H),7.67(7.63)(d,J=1.7Hz,1H),7.45-6.76(m,14H),6.02(m,1H),5.12(5.07)(m,1H),4.45(m,1H),4.32(4.28)(m,1H),3.97-3.25(m,12H),2.70-2.23(m,2H),1.21-1.01(m,12H),0.80(0.82)(s,9H),0.03(0.05)(s,3H),-0.12(s,3H).
[實施例9]
使用參考例3.1所獲得之化合物am-3，藉由與實施例1相同之方式合成下述表24所示之於454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-7之siRNA。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6751.35(M-H) 實測值6751.83
參考例4.0：化合物I-8
使用市售之5-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.0相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(5-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-8)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.66(d,J=4.8Hz,2H),7.40(t,J=4.4Hz,1H),6.21(d,J=5.5Hz,1H),4.80(t,J=5.9Hz,1H),4.45(t,J=5.9Hz,1H),4.09(dd,J=14.5,7.1Hz,3H).
ESI-MS(m/z)：409(M+1)
參考例4.1：化合物am-4
使用市售之5-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(5-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物 am-4)。
[實施例10]
使用參考例4.1所獲得之化合物am-4，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-8之siRNA。
參考例5.0：化合物I-9
使用市售之噻吩并[3,2-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.0相同之方式獲得磷酸(2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二側氧基-3,4-二氫噻吩并[3,2-d]嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-9)三乙基銨鹽。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.96(d,J=5.5Hz,1H),7.45(d,J=4.8Hz,1H),6.14(d,J=6.2Hz,1H),4.73-4.56(m,1H),4.35(t,J=5.7Hz,1H),4.09(brs,1H),4.02(t,J=4.8Hz,2H),3.07(q,J=7.3Hz,6H),1.15(t,J=7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：381(M+1)
參考例5.1：化合物am-5
使用市售之噻吩并[3,2-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(2,4-二側氧基-3,4-二氫噻吩并[3,2-d]嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-5)。
[實施例11]
使用參考例5.1所獲得之化合物am-5，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-9之siRNA。
參考例6.0：化合物I-10 步驟1
由利用公知之方法[藥物化學雜誌(Journal of Medicinal Chemistry)(J.Med.Chem.),2012年，55卷，1478-1489頁]中所記載方法而合成之二乙酸(2R,3R,4R,5R)-2-(乙醯氧基甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(10.9g，26.4mmol)，利用公知之方法[有機化學雜誌(Journal of Organic Chemistry)(J.Org.Chem.),2002年，67卷，6788-6796頁]中所記載之方法而獲得(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(5.47g，產率72%)。
使(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(5.48g，19.1mmol)懸浮於丙酮(200mL)中，加入2,2-二甲氧基丙烷(11.7mL，95.5mmol)、4-甲苯磺酸一水合物(9.09g，47.8mmol)，於室溫下攪拌2小時。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液後，於減壓下蒸餾去除溶劑直至溶劑量成為約一半。加入氯仿進行萃取，以硫酸鈉進行乾燥後，於減壓下蒸餾去除溶劑，利用庚烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(5.17g，產率83%)。
ESI-MS(m/z)：327(M+1)
步驟2
向步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(150mg，0.459mmol)、(E)-苯乙烯基硼酸(136mg，0.918mmol)、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵-二氯化鈀(II)-二氯甲烷錯合物(37.5mg，0.031mmol)、碳酸銫(449mg，1.38mmol)中加入1,4-二烷(2mL)、水(1滴)，於氮氣環境下、80℃下攪拌3小時。將反應液冷卻至室溫後加入飽和食鹽水，利用乙酸乙酯進行萃取，並以硫酸鈉進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌 呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(90.1mg，產率50%)。
ESI-MS(m/z)：395(M+1)
步驟3
將步驟2所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-苯乙烯基-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(90mg，0.228mmol)溶解於二氯甲烷(2mL)中，加入1H-四唑(32.0mg，0.456mmol)、二第三丁基-二異丙基磷雜環戊二烯醯胺(0.144mL，0.456mmol)，於0℃下攪拌2小時。向反應液中加入間氯過苯甲酸(141mg，0.612mmol)，於0℃下攪拌15分鐘。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水，利用氯仿進行萃取，並以硫酸鎂進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得磷酸二第三丁基-(((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-苯乙烯基-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(E/Z幾何異構物混合物，73.2mg，產率55%)。
ESI-MS(m/z)：587(M+1)
步驟4
將步驟3所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-苯乙烯基-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(73.0mg，0.124mmol)溶解於三氟乙酸/水(1：1)(2mL)中，於室溫下攪拌2小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，向所獲得之殘渣中加入乙酸-乙酸銨緩衝液(pH值5.7)後，利用製備型HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析)(溶離液為0.01mmol/L之乙酸銨水溶液/甲醇系)進行純化，藉此獲得部分純化物，向所獲得之部分純化物中加入2-丙醇，濾取析出物，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化 合物I-10、21.3mg，產率39%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.50(s,1H),8.42(s,1H),7.58(d,J=15.6Hz,1H),7.19-7.13(m,2H),7.08-6.97(m,4H),5.92(d,J=4.9Hz,1H),4.60-4.55(m,1H),4.38-4.34(m,1H),4.28-4.23(m,1H),4.10-3.97(m,2H).
ESI-MS(m/z)：435(M+1)
參考例6.1：化合物am-6 步驟1
向參考例6.0之步驟2所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧代-4-基)甲醇(100mg)中加入三氟乙酸/水(1：1)(2mL)，於室溫下攪拌2小時，於減壓下蒸餾去除溶劑，藉此獲得(2R,3S,4R,5R)-2-(羥基甲基)-5-(6-((E)苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3,4-二醇三氟乙酸鹽。
步驟2
使用步驟1所獲得之(2R,3S,4R,5R)-2-(羥基甲基)-5-6-((E)苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3,4-二醇三氟乙酸鹽，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(6-((E)苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-6)。
[實施例12]
使用參考例6.1所獲得之化合物am-6，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-10之siRNA。
參考例7.0：化合物I-11 步驟1
將利用公知之方法[藥物化學雜誌(J.Med.Chem.),2012年，55卷，1478-1489頁]中所記載之方法而合成之二乙酸(2R,3R,4R,5R)-2-(乙醯 氧基甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(2.00g，4.85mmol)溶解於THF(15mL)中，加入二甲胺鹽酸鹽(1.19g，14.5mmol)與三乙胺(2.70mL、19.38mL)，於密封管中、60℃下徹夜攪拌。向反應液中加入二甲胺鹽酸鹽(1.19g，14.5mmol)與三乙胺(2.70mL，19.38mL)，於60℃下進而徹夜攪拌。加入水並利用氯仿進行萃取後，進行減壓濃縮，藉此獲得二乙酸(2R,3R,4R,5R)-2-(乙醯氧基甲基)-5-(6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(2.2g，產率108%)。
ESI-MS(m/z)：422(M+1)
步驟2
向步驟1所獲得之二乙酸(2R,3R,4R,5R)-2-(乙醯氧基甲基)-5-(6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(2.00g，4.75mmol)中加入7.0mol/L之氨/甲醇溶液(33.9mL)，於室溫下徹夜攪拌。於減壓下蒸餾去除溶劑，向所獲得之殘渣中加入乙醚/乙酸乙酯混合液，濾取不溶物，藉此獲得(2R,3R,4S,5R)-2-(6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(1.2g，產率86%)。
ESI-MS(m/z)：296(M+1)
步驟3
使步驟2所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(1.2g，4.06mmol)懸浮於0.5M之乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH值4.0)(40mL)中，加入溴水(55.8mL)，於室溫下攪拌4小時。向反應液中加入硫酸氫鈉直至溴之顏色消失，利用碳酸鈉進行中和。於減壓下蒸餾去除溶劑直至溶劑量成為約一半，濾取不溶物，其後依序利用水、丙酮進行清洗，於減壓下乾燥，藉此獲得(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(1.09g，產率72%)。
ESI-MS(m/z)：374(M+1)
步驟4
使步驟3所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(2.90g，7.75mmol)懸浮於丙酮(39mL)中，加入2,2-二甲氧基丙烷(4.75mL，38.8mmol)、4-甲苯磺酸一水合物(1.62g，38.8mmol)，於室溫下徹夜攪拌。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水後，於減壓下蒸餾去除溶劑直至溶劑量成為約一半。加入氯仿進行萃取，以硫酸鈉進行乾燥後利用氯仿進行萃取，並以硫酸鈉進行乾燥。藉由於減壓下蒸餾去除溶劑，獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(1.96g，產率61%)。
ESI-MS(m/z)：414(M+1)
步驟5
將步驟4所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(200mg，0.483mmol)溶解於二氯甲烷(2mL)中，加入1H-四唑(84.6mg，1.21mmol)、二第三丁基-二異丙基磷雜環戊二烯醯胺(0.321mL，0.966mmol)，於室溫下攪拌0.5小時。將反應液冷卻至0℃，加入間氯過苯甲酸(222mg，0.966mmol)，於0℃下進而攪拌15分鐘。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液加入飽和食鹽水，利用氯仿進行萃取，其後以硫酸鈉進行乾燥。藉由於減壓下蒸餾去除溶劑而獲得殘渣，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得磷酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲基-二第三丁酯(209mg，產率71%)。
ESI-MS(m/z)：606(M+1)
步驟6
將步驟5所獲得之磷酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲基-二第三丁酯(50.0mg，0.082mol))溶解於三氟乙酸/水(1：1)(2mL)中，於室溫下攪拌3小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，向所獲得之殘渣中加入乙酸-乙酸銨緩衝液(pH值5.7)後，利用製備型HPLC(溶離液為0.01mmol/L之乙酸銨水溶液/甲醇系)進行純化，藉此獲得部分純化物，向所獲得之部分純化物中加入乙醇，濾取析出物，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-6-(8-溴-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-11，26.2mg，產率70%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.06-7.92(m,1H),5.98-5.93(m,1H),5.15-5.07(m,1H),4.43(dd,J=5.9,5.9Hz,1H),4.09(dd,J=9.8,4.9Hz,1H),3.99-3.91(m,1H),3.90-3.82(m,1H),3.30-3.12(m,6H).
ESI-MS(m/z)：454(M+1)
參考例7.1：化合物am-7
使用參考例7.0之步驟3所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(8-溴-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-7)。
[實施例13]
使用參考例7.1所獲得之化合物am-7，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-11之siRNA。
參考例8.0：化合物I-12 步驟1
將參考例7.0之步驟5所獲得之磷酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲基-二第三丁酯(100mg，0.165mmol))溶解於DMF(1.5mL)中，加入氰化四乙基銨(129mg，0.824mmol)，於100℃下攪拌2小時。將反應液冷卻至室溫後加入飽和食鹽水，利用乙酸乙酯進行萃取，並以硫酸鈉進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得磷酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-氰基-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲基-二第三丁酯(52.6mg，58%)。
ESI-MS(m/z)：558(M+1)
步驟2
將步驟2所獲得之磷酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-氰基-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲基-二第三丁基酯(80.0mg，0.145mmol)溶解於三氟乙酸/水(1：1)(4mL)中，於室溫下攪拌3小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，對所獲得之殘渣利用製備型HPLC(溶離液為0.01mmol/L之三氟乙酸水溶液/乙腈系)進行純化，向所得之部分純化物中加入乙醇，濾取析出物，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-6-(8-氰基-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-12，8.4mg，產率15%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.05(s,1H),5.97(d,J=5.9Hz,1H),4.95-4.53(m,1H),4.37-4.29(m,1H),4.24-4.15(m,1H),4.06-3.93(m,2H),3.66-2.83(m,6H).
ESI-MS(m/z)：401(M+1)
參考例8.1：化合物am-8 步驟1~2
使用參考例7.0之步驟3所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇，藉由與參考例1.1之步驟1~2相同之方式獲得8-溴-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-N,N-二甲基-9H-嘌呤-6-胺。
ESI-MS(m/z)：628(M+1)
步驟3
將步驟2所獲得之8-溴-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-N,N-二甲基-9H-嘌呤-6-胺(10.0mg，0.0160mmol)溶解於DMF(1.00mL)中，加入氰化鈉(7.79mg，0.159mmol)、氟化銫(7.25mg，0.0480mmol)，於100℃下攪拌4小時。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取，並以硫酸鈉進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-8-甲腈(8.00mg，產率44.8%)。
ESI-MS(m/z)：575(M+1)
步驟4~6
使用步驟3所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(二甲基胺基)-9H-嘌呤-8-甲腈，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(8-氰基-6-(二甲基胺基)- 9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-8)。
[實施例14]
使用參考例8.1所獲得之化合物am-8，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-12之siRNA。
參考例9.0：化合物I-13
使用市售之1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(866mg，2.34mmol)，藉由與參考例1.0之步驟3~5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-碘-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯-三乙胺(化合物I-13)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：6.52(S,1H),5.92(d,J=3.3Hz,1H),4.69-4.60(m,1H),4.33(t,J=6.8Hz,1H),4.02-3.86(m,3H),3.07(q,J=7.3Hz,6H),1.15(t,J=7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：451(M+1)
參考例9.1：化合物am-9
使用市售之1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(6-碘-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-9)。
[實施例15]
使用參考例9.1所獲得之化合物am-9，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-13之siRNA。
參考例10.0：化合物I-14 步驟1
使用市售之5-溴-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(3.34g，10.3mmol)，藉由與參考例1.0之步驟3相同之方式獲得5-溴-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(2.58g，產率69%)。
ESI-MS(m/z)：363(M+1)
步驟2
將步驟1所獲得之5-溴-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(200mg，0.551mmol)、四(三苯基膦)鈀(63.6mg，0.055mmol)溶解於1,4-二烷中，加入(2-吡啶基)三丁基錫(0.62mL，1.93mmol)，於110℃下徹夜攪拌。將反應液冷卻至室溫後加入飽和碳酸氫鈉水溶液，通過Presep(註冊商標，矽藻土，顆粒狀M型，4.5g/25mL)進行過濾，於減壓下蒸餾去除溶劑。利用氯仿/甲醇系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-(吡啶-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(45.2mg，產率23%)。
ESI-MS(m/z)：362(M+1)
步驟3~4
使用步驟2所獲得之1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-(吡啶-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.0之步驟4~5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二側氧基-5-(吡啶-2-基)-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-14)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.66(s,1H),8.56(d,J=5.5Hz,1H),8.40(t,J=7.9Hz,1H),8.20(d,J=8.4Hz,1H),7.77(t,J=6.8Hz, 1H),5.92(d,J=4.0Hz,1H),4.35(t,J=4.2Hz,1H),4.27-4.26(m,2H),4.15(dd,J=12.1,2.6Hz,1H),4.04(dd,J=13.0,5.7Hz,1H)
ESI-MS(m/z)：402(M+1)
參考例10.1：化合物am-10 步驟1
使用參考例10.0之步驟2所獲得之1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-(吡啶-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例6.1之步驟1相同之方式獲得1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-5-(吡啶-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
步驟2
使用1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-5-(吡啶-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(2,4-二側氧基-5-(吡啶-2-基)-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-10)。
[實施例16]
使用參考例10.1所獲得之化合物am-10，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-14之siRNA。
參考例11.0：化合物I-15
使用2-(三正丁基錫烷基)唑，藉由與參考例10.0之步驟2~4相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(5-(唑-2-基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-15)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.52(s,1H),7.84(s,1H),7.19(s,1H),5.93(d,J=4.9Hz,1H),4.36(t,J=4.9Hz,1H),4.28-4.24(m, 2H),4.11(dq,J=11.7,2.0Hz,1H),4.03(dq,J=11.7,2.6Hz,1H).
ESI-MS(m/z)：392(M+1)
參考例11.1：化合物am-11
使用2-(三正丁基錫烷基)唑，藉由與參考例10.0之步驟2相同之方式合成1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-(唑-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，使用所得產物，藉由與參考例10.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(5-(唑-2-基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-11)。
[實施例17]
使用參考例11.1所獲得之化合物am-11，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-15之siRNA。
參考例12.0：化合物I-16 步驟1
使用市售之5-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.0之步驟1相同之方式獲得二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯氧基)甲基)-5-(5-碘-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯。
ESI-MS(m/z)：683(M+1)
步驟2
向步驟1所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯氧基)甲基)-5-(5-碘-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(200mg，0.293mmol)、(4-甲氧基苯基)硼酸(134.0mg，0.879mmol)、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵-二氯化鈀(II)-二氯甲烷錯合物(23.9mg，0.029mmol)、2M之碳酸銫水溶液(0.6mL)中加入1,4-二烷(3mL)，於120℃下攪拌1小時。將反應液冷卻至室溫後加入飽和碳 酸氫鈉水溶液，通過Presep(註冊商標，矽藻土，顆粒狀M型，4.5g/25mL)進行過濾，於減壓下蒸餾去除溶劑。利用氯仿/甲醇系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯氧基)甲基)-5-(5-(4-甲氧基苯基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(118mg，產率61%)。
ESI-MS(m/z)：663(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯氧基)甲基)-5-(5-(4-甲氧基苯基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯，藉由與參考例1.0之步驟2~5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(5-(4-甲氧基苯基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-16)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.77(s,1H),7.42(d,J=8.8Hz,2H),7.01(d,J=8.8Hz,2H),5.97(d,J=5.5Hz,1H),4.39(t,J=5.9Hz,1H),4.27(t,J=4.4Hz,1H),4.22-4.21(m,1H),4.04-4.02(m,2H),3.81(s,3H).
ESI-MS(m/z)：431(M+1)
參考例12.1：化合物am-12
使用參考例12.0之步驟2所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯氧基)甲基)-5-(5-(4-甲氧基苯基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(5-(4-甲氧基苯基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-12)。
[實施例18]
使用參考例12.1所獲得之化合物am-12，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-16之siRNA。
參考例13.0：化合物I-17 步驟1
使用參考例10.0之步驟1所獲得之5-溴-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.0之步驟4相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-溴-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯。
ESI-MS(m/z)：555(M+1)
步驟2
將步驟1所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-溴-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(200mg，0.360mmol)溶解於DMF(7mL)中，加入氰化鈉(88.0mg，1.801mmol)，於室溫下徹夜攪拌。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取，並以硫酸鈉進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氰基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(150mg，產率83%)。
ESI-MS(m/z)：502(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氰基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯，藉由與參考例1.0之步驟5相同之方 式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氰基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-17)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：6.51(d,J=0.7Hz,1H),5.81(d,J=4.0Hz,1H),4.28(t,J=6.2Hz,1H),4.01-3.95(m,4H).
ESI-MS(m/z)：350(M+1)
參考例13.1：化合物am-13 步驟1~2
使用市售之5-溴-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1之步驟1~2相同之方式獲得5-溴-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
ESI-MS(m/z)：577(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之5-溴-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例13.0之步驟2相同之方式獲得3-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-2,6-二側氧基-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-甲腈。
ESI-MS(m/z)：524(M+1)
步驟4
使用步驟3所獲得之3-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-2,6-二側氧基-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-甲腈，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯 基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(6-氰基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-13)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：7.47-6.78(m,13H),6.27(6.26)(s,1H),5.84(m,1H),4.95(4.89)(m,1H),4.35-4.19(m,2H),3.96-3.27(m,12H),2.31(2.59)(m,2H),1.19-1.06(m,12H),0.87(0.88)(s,9H),0.06(0.08)(s,3H),0.01(s,3H).
[實施例19]
使用參考例13.1所獲得之化合物am-13，藉由與實施例1相同之方式合成下述表24所示之於454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-17之siRNA。MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6691.86(M-H) 實測值6691.25
參考例14.0：化合物I-18 步驟1
將參考例6.0之步驟2所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(249mg，0.631mmol)溶解於氯仿(6.00mL)中，於冰浴冷卻下加入咪唑(86mg，1.26mmol)、氯化第三丁基二甲基矽烷(105mg，0.694mmol)，於室溫下攪拌3小時。其後，於冰浴冷卻下追加咪唑(86mg，1.26mmol)、氯化第三丁基二甲基矽烷(105mg，0.694mmol)，於室溫下進而攪拌1小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(310mg，97.0%)。
ESI-MS(m/z)：509(M+1)
步驟2
將步驟1所獲得之9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(200mg，0.393mmol)溶解於THF(3.00mL)中，於-78℃下加入二異丙基醯胺鋰(0.393mL，0.786mmol)並攪拌30分鐘，其後於-78℃下加入將1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷(384mg，1.18mmol)溶解於THF(2.00mL)而成之溶液。其後，一面攪拌一面歷時1小時升溫至室溫。向反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取後，以無水硫酸鈉乾燥有機層。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得8-溴-9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(198mg，86.0%)。
ESI-MS(m/z)：587(M+1)
步驟3
將步驟2所獲得之8-溴-9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(198mg，0.337mmol)溶解於三氟乙酸/水(1：1)(2mL)中，於室溫下攪拌2小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(140mg，96.0%)。
ESI-MS(m/z)：433(M+1)
步驟4
使用步驟3所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(140mg，0.323mmol)，藉 由與參考例1.0之步驟3相同之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(66.0mg，43.2%)。
ESI-MS(m/z)：473(M+1)
步驟5~6
使用步驟4所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(65.0mg，0.137mmol)，藉由與參考例6.0之步驟3~4相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-18，68.5mg，75.0%)。
1H-NMR(D2O,400MHz)δ：8.45(1H,s),7.54(1H,d,J=15.6Hz),7.24-7.17(2H,m),7.11-7.00(3H,m),6.95(1H,d,J=15.6Hz),5.96(1H,d,J=4.9Hz),5.18(1H,dd,J=5.4,5.4Hz),4.54(1H,dd,J=5.4,5.4Hz),4.19-4.13(1H,m),4.12-3.95(2H,m).
ESI-MS(m/z)：513(M+1)
參考例14.1：化合物am-14
使用參考例14.0之步驟3所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇，藉由與參考例1.1相同之方式獲得3-(((2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-14)。
[實施例20]
使用參考例14.1所獲得之化合物am-14，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-18之siRNA。
參考例15.0：化合物I-19
使用市售之5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.0相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(5,6-二甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫噻吩并[2,3-d]嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-19)三乙基銨鹽。
((2R,3S,4R,5R)-5-(5,6-dimethyl-2,4-dioxo-3,4-dihydrothieno[2,3-d]pyrimidin-1(2H)-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl dihydrogen phosphate)
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：6.10(d,J=5.5Hz,1H),4.75-4.73(m,1H),4.40(t,J=5.7Hz,1H),4.24-4.14(m,3H),2.32(s,3H),2.31(s,3H).
ESI-MS(m/z)：411(M+1)
參考例15.1：化合物am-15
使用市售之5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(5,6-二甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫噻吩并[2,3-d]嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-15)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：7.62(s,1H),7.50-6.78(m,13H),5.98(m,1H),4.92(m,1H),4.34-4.25(m,2H),4.00-3.34(m,12H),2.29(2.64)(m,2H),2.35(s,3H),2.13(s,3H),1.23-1.03(m,12H),0.83(0.84)(s,9H),0.02(d,J=6.0Hz,3H),-0.10(d,J=5.0Hz,3H).
[實施例21]
使用參考例15.1所獲得之化合物am-15，藉由與實施例1相同之方式合成下述表24所示之於454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-19之siRNA(稱為di-Me-thienyl-dU)。MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6750.99(M-H) 實測值6754.34
參考例16.0：化合物I-20 步驟1
使用參考例6.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg、0.306mmol)及3-異丙基苯基硼酸(100mg，0.612mmol)，藉由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(167mg，133%)。
ESI-MS(m/z)：411(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(126mg，0.307mmol)，藉由與參考例6.0之步驟3相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(96.2mg，52.0%)。
ESI-MS(m/z)：603(M+1)
步驟3
將步驟1所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(96.0mg，0.159mmol)溶解於三氟乙酸/水(1：1)(2mL)中，於室溫下攪拌3小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，對所獲得之殘渣利用製備型HPLC(溶離液為0.01mmol/L之乙酸-三乙胺緩衝液(pH值6.5)/乙腈系)進行純化，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-20)三乙基銨鹽(70.0mg，80.0%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.72(2H,d,J=7.0Hz),7.97(1H,s),7.92-7.83(1H,m),7.43-7.33(2H,m),6.14(1H,d,J=5.5Hz),4.73-4.64(14H,m),4.44-4.38(1H,m),4.32-4.25(1H,m),4.08-3.93(2H,m),3.06(11H,q,J=7.3Hz),2.94-2.81(1H,m),1.20-1.08(22H,m).
ESI-MS(m/z)：451(M+1)
參考例16.1：化合物am-16
使用參考例16.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇，藉由與參考例6.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基-二異丙基亞磷醯胺(化合物am-16)。
[實施例22]
使用參考例16.1所獲得之化合物am-16，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-20之siRNA。
參考例17.0：化合物I-21 步驟1
使用參考例6.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及2-萘硼酸(105mg，0.612mmol)，藉由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(147mg，114%)。
ESI-MS(m/z)：419(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-2-基)- 9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(128mg，0.306mmol)，藉由與參考例6.0之步驟3相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(90.0mg，48.2%)。
ESI-MS(m/z)：611(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(77.0mg，0.126mmol)，藉由與參考例1.0之步驟5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-(萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-21)三乙基銨鹽(20.0mg，29.6%)。
1H-NMR(D2O,400MHz)δ：8.30(1H,s),8.05(1H,s),7.80(1H,s),7.55-7.40(1H,m),7.27-6.92(5H,m),5.73(1H,s),4.52-4.18(3H,m),4.15-3.92(2H,m),3.06-2.96(6H,m),1.16-1.04(9H,m).
ESI-MS(m/z)：459(M+1)
參考例17.1：化合物am-17 步驟1~2
使用市售之(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇，藉由與參考例1.1之步驟1~2相同之方式獲得6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤。
ESI-MS(m/z)：541(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例17.0之步驟1相同之方式獲得 9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(萘-2-基)-9H-嘌呤。
ESI-MS(m/z)：633(M+1)
步驟4~6
使用步驟3所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(萘-2-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-17)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：9.43(m,1H),8.96(m,1H),8.88(m,1H),8.40(m,1H),8.08(m,1H),8.02(m,1H),7.91(m,1H),7.59-7.52(m,2H),7.52-6.81(m,13H),6.19(6.13)(m,1H),5.11(m,1H),4.50-4.38(m,2H),4.02-3.32(m,12H),2.67(2.32)(m,2H),1.23-1.05(m,12H),0.76(0.77)(s,9H),-0.03(0.00)(s,3H),-0.19(-0.17)(s,3H).
[實施例23]
使用參考例17.1所獲得之化合物am-17，藉由與實施例1相同之方式合成下述表24所示之於454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-21之siRNA(稱為6-napht-2-yl-dPu)。MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6801.03(M-H) 實測值6805.40
參考例18.0：化合物I-22 步驟1
使用參考例6.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(200mg，0.612mmol)及3-甲醯基苯基硼酸(184mg，1.22mmol)，藉 由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(216mg，89%)。
ESI-MS(m/z)：397(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(215mg，0.542mmol)，藉由與參考例6.0之步驟3相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(35.0mg，11.0%)。
ESI-MS(m/z)：589(M+1)
步驟3
使用步驟1所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(33.0mg，0.0560mmol)，藉由與參考例1.0之步驟5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-22，20.0mg，29.6%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：9.93(1H,s),8.88(1H,s),8.76(1H,s),8.67-8.60(1H,m),8.47-8.40(1H,m),8.06-7.99(1H,m),7.74-7.66(1H,m),6.20(1H,d,J=5.5Hz),4.76-4.68(2H,m),4.46-4.41(1H,m),4.34-4.29(1H,m),4.12-4.00(2H,m).
ESI-MS(m/z)：437(M+1)
參考例18.1：化合物am-18
使用參考例18.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊 烯-4-基)甲醇，藉由與參考例6.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-18)。
[實施例24]
使用參考例18.1所獲得之化合物am-18，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-22之siRNA。
參考例19.0：化合物I-23
使用市售之6-硝基-1H-喹唑啉-2,4-二酮，藉由與參考例1.0相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-23)三乙基銨鹽。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.82(d,J=2.9Hz,1H),8.49(dd,J=9.3,2.4Hz,1H),7.89(d,J=9.5Hz,1H),6.27(d,J=5.9Hz,1H),4.73(t,J=6.2Hz,1H),4.42(t,J=5.9Hz,1H),4.09-4.04(m,3H),3.08(q,J=7.3Hz,6H),1.16(t,J=7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：420(M+1)
參考例19.1：化合物am-19
使用市售之6-硝基-1H-喹唑啉-2,4-二酮，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-19)。
[實施例25]
使用參考例19.1所獲得之化合物am-19，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-23之siRNA。
參考例20.0：化合物I-24 步驟1~4
使用市售之5,6-二甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1之步驟1~4相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5,6-二甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯。
ESI-MS(m/z)：505(M+1)
步驟5
將步驟4所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5,6-二甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(200mg，0.396mmol)溶解於1,4-二烷(4.00mL)中，加入二氧化硒(440mg，3.96mmol)，於加熱回流下徹夜攪拌。矽藻土過濾反應液，於減壓下蒸餾去除溶劑而獲得殘渣，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(羥基甲基)-5-甲基2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(38.6mg，產率19%)。
ESI-MS(m/z)：521(M+1)
步驟6
將步驟5所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(羥基甲基)-5-甲基2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(38.6mg，0.074mmol)溶解於乙腈(1.00mL)中，加入吡啶(0.06mL，0.742mmol)、戴斯-馬丁過碘烷(62.9mg，0.148mmol)，於60℃下徹夜攪拌。將反應液冷卻至室溫後加入飽和碳酸氫鈉水溶液，通過Presep(註冊商標，矽藻土，顆粒狀M型，4.5g/25mL)進行過濾，於減壓下蒸餾去除溶劑。利用製備 薄層層析法(己烷/乙酸乙酯=20/80)對殘渣進行純化，藉此獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(羥基甲基)-5-甲基2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(32.8mg，產率85%)。
ESI-MS(m/z)：519(M+1)
步驟7
將步驟6所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(羥基甲基)-5-甲基2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(46.0mg，0.089mmol)溶解於THF(1.00mL)中，加入羥胺鹽酸鹽(30.8mg，0.444mmol)，於60℃下攪拌2小時。將反應液冷卻至室溫後加入飽和碳酸氫鈉水溶液，通過Presep(註冊商標，矽藻土，顆粒狀M型，4.5g/25mL)進行過濾，於減壓下蒸餾去除溶劑。利用製備薄層層析法(氯仿/甲醇=90/10)對殘渣進行純化，藉此獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-((E)-(羥基亞胺基)甲基)-5-甲基2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(33.7mg，產率71%)。
ESI-MS(m/z)：534(M+1)
步驟8
將三苯基氧化膦(1.76mg，0.006mmol)溶解於乙酸乙酯(1.00mL)中，加入草醯氯(0.017mL，0.19mmol)，於室溫下攪拌5分鐘而製備反應液。將步驟7所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-((E)-(羥基亞胺基)甲基)-5-甲基2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(33.7mg，0.063mmol)溶解於乙酸乙酯(1.00mL)中，緩慢加入上述反應液，於室溫下徹夜攪拌。蒸餾去除溶劑，將所獲得之殘渣溶解於三氟乙酸/ 水(1：1)(2mL)中，於室溫下攪拌2小時。於減壓下蒸餾去除溶劑後，加入乙酸-三乙胺緩衝液(pH值6.5)(2mL)，再次於減壓下蒸餾去除溶劑。將所獲得之殘渣溶解於乙醇中，加入乙酸乙酯，濾取析出物，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氰基-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-24)三乙基銨鹽(1.6mg(2批次)，產率74%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：5.96(d,J=4.0Hz,1H),4.41(t,J=6.4Hz,1H),4.19-4.06(m,3H),3.21(q,J=7.2Hz,6H),2.19(s,3H),1.28(t,J=7.5Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：404(M+1)
參考例20.1：化合物am-20 步驟1
使用參考例20.0之步驟1所獲得之苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(5,6-二甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯，藉由與參考例20.0之步驟5相同之方式獲得苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(6-(羥基甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯。
ESI-MS(m/z)：601(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(6-羥基甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯，藉由與參考例20.0之步驟6相同之方式獲得苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(6-甲醯基-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯。
ESI-MS(m/z)：599(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(6-甲醯基-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯，藉由與參考例20.0之步驟7相同之方式獲得苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(6-((E)-(羥基亞胺基)甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯。
ESI-MS(m/z)：614(M+1)
步驟4
將三苯基氧化膦(11.0mg，0.039mmol)溶解於乙酸乙酯(5.00mL)中，加入草醯氯(0.104mL，1.183mmol)，於室溫下攪拌5分鐘而製備反應液。將步驟3所獲得之苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(6-((E)-(羥基亞胺基)甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(242mg，0.394mmol)溶解於乙酸乙酯(5.00mL)中，緩慢加入上述反應液，於室溫下攪拌2小時。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(6-氰基-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(207mg，產率88%)。
ESI-MS(m/z)：596(M+1)
步驟5
使用步驟4所獲得之苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(6-氰基-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯，藉由與參考例1.0之步驟2相同之方式獲得3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-5-甲基-2,6-二側氧基-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-甲腈。
ESI-MS(m/z)：284(M+1)
步驟6~10
使用步驟5所獲得之3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-5-甲基-2,6-二側氧基-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-甲腈，藉由與參考例1.1之步驟1~5相同之方式獲得(2R,3R,4S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-氰基-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-20)。
[實施例26]
使用參考例20.1所獲得之化合物am-20，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-24之siRNA。
參考例21.0：化合物I-25 步驟1
使用參考例6.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及萘-1-基-硼酸(105mg，0.612mmol)，藉由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(150mg，117%)。
ESI-MS(m/z)：419(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(128mg，0.306mmol)，藉由與參考例6.0之步驟3相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(70.0mg，37.5%)。
ESI-MS(m/z)：611(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(77.0mg，0.126mmol)，藉由與參考例16.0之步驟3相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-25)三乙基銨鹽(10.8mg，15.3%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.87(1H,s),8.60(1H,s),8.07-7.84(2H,m),7.73-7.60(2H,m),7.58-7.40(2H,m),7.38-7.28(1H,m),6.21(1H,d,J=5.5Hz),4.75-4.66(1H,m),4.45-4.38(1H,m),4.35-4.28(1H,m),4.10-3.98(2H,m),3.05(6H,q,J=7.3Hz),1.13(9H,t,J=7.3Hz).
ESI-MS(m/z)：459(M+1)
參考例21.1：化合物am-21 步驟1
使用參考例17.1之步驟2所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例21.0之步驟1相同之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(萘-1-基)-9H-嘌呤。
ESI-MS(m/z)：633(M+1)
步驟2~4
使用步驟1所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(萘-1-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3- 基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-21)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：9.04(m,1H),8.34(m,1H),8.20(m,1H),8.04-7.91(m,2H),7.93(m,1H),7.64(m,1H),7.54-7.45(m,4H),7.39-6.79(m,11H),6.21(6.15)(m,1H),5.16(m,1H),4.51-4.39(m,2H),4.04-3.32(m,12H),2.68(2.32)(m,2H),1.25-1.06(m,12H),0.76(0.77)(s,9H),-0.01(0.01)(s,3H),-0.16(-0.15)(s,3H).
[實施例27]
使用參考例21.1所獲得之化合物am-21，藉由與實施例1相同之方式合成下述表24所示之於454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-25之siRNA(6-napht-1-yl-dPu)。MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6801.03(M-H) 實測值6800.94
參考例22.0：化合物I-26 步驟1
使用參考例6.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(1,1'-聯苯)-3-基-硼酸(121mg，0.612mmol)，藉由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(130mg，95%)。
ESI-MS(m/z)：445(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(125mg，0.281mmol)，藉由與參考例6.0之步驟3相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(107mg，59.8%)。
ESI-MS(m/z)：637(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(100mg，0.157mmol)，藉由與參考例1.0之步驟5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-26)(47.0mg，61.8%)。
1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ：9.14(1H,s),9.06(1H,s),8.89(1H,s),8.82(1H,d,J=7.7Hz),7.89(1H,d,J=7.7Hz),7.79-7.68(3H,m),7.58-7.50(2H,m),7.47-7.40(1H,m),6.15(1H,d,J=5.5Hz),4.72-4.65(1H,m),4.27-4.22(1H,m),4.20-3.98(3H,m).
ESI-MS(m/z)：485(M+1)
參考例22.1：化合物am-22 步驟1
使用參考例17.1之步驟2所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例22.0之步驟1相同之方式獲得6-(聯苯-3-基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤。
步驟2~4
使用步驟1所獲得之6-(聯苯-3-基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃- 3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-22)。
[實施例28]
使用參考例22.1所獲得之化合物am-22，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-26之siRNA。
參考例23.0：化合物I-27 步驟1
使用參考例6.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(3-胺基苯基)硼酸(84mg，0.612mmol)，藉由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(77.2mg，65.8%)。
ESI-MS(m/z)：384(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(77.0mg，0.201mmol)，藉由與參考例6.0之步驟3相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(38.4mg，33.2%)。
ESI-MS(m/z)：576(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(38.0mg，0.0660mmol)，藉由與參考例1.0之步驟5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4- 二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-27)(13.0mg，43.3%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.82(1H,s),8.73(1H,s),8.22-8.15(2H,m),7.66-7.58(1H,m),7.55-7.48(1H,m),6.16(1H,d,J=5.5Hz),4.72-4.65(1H,m),4.45-4.38(1H,m),4.35-4.26(1H,m),4.14-3.98(2H,m).
ESI-MS(m/z)：424(M+1)
參考例23.1：化合物am-23 步驟1
使用參考例17.1之步驟2所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例23.0之步驟1相同之方式獲得6-(3-胺基苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤。
步驟2~4
使用步驟1所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-23)。
[實施例29]
使用參考例23.1所獲得之化合物am-23，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-27之siRNA。
參考例24.0：化合物I-28 步驟1
使用參考例6.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(3-嗎啉基苯基)硼酸(127mg，0.612mmol)，藉由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(127mg，92%)。
ESI-MS(m/z)：454(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(120mg，0.265mmol)，藉由與參考例6.0之步驟3相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(65.0mg，38.0%)。
ESI-MS(m/z)：646(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(63.0mg，0.0980mmol)，藉由與參考例16.0之步驟3相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-28)三乙基銨鹽(9.00mg，15.5%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.83(1H,s),8.72(1H,s),7.85-7.75(2H,m),7.52-7.44(1H,m),7.28-7.20(1H,m),6.21-6.19(1H,m),4.76-4.68(1H,m),4.45-4.40(1H,m),4.34-4.28(1H,m),4.06(2H,s),3.88-3.80(4H,m),3.23-3.15(4H,m),3.08(6H,q,J=7.3Hz), 1.16(9H,t,J=7.3Hz).
ESI-MS(m/z)：494(M+1)
參考例24.1：化合物am-24 步驟1
使用參考例17.1之步驟2所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例24.0之步驟1相同之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤。
步驟2~4
使用步驟1所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-24)。
[實施例30]
使用參考例24.1所獲得之化合物am-24，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-28之siRNA。
參考例25.0：化合物I-29 步驟1
使用參考例6.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(3-(苄氧基)苯基)硼酸(140mg，0.612mmol)，藉由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6- (6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(180mg，130%)。
ESI-MS(m/z)：475(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(140mg，0.295mmol)，藉由與參考例6.0之步驟3相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(95.0mg，48.3%)。
ESI-MS(m/z)：667(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(95.0mg，0.142mmol)，藉由與參考例16.0之步驟3相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-29)三乙基銨鹽(32.0mg，36.5%)。
1H-NMR(D2O,400MHz)δ：8.63(1H,s),8.59(1H,s),7.67-7.55(2H,m),7.30-7.16(6H,m),6.94-6.88(1H,m),6.06(1H,d,J=5.9Hz),4.88(2H,s),4.71-4.62(1H,m),4.39-4.34(1H,m),4.28-4.22(1H,m),4.06-3.95(2H,m),3.14-2.95(6H,q,J=7.3Hz),1.12(9H,t,J=7.3Hz).
ESI-MS(m/z)：515(M+1)
參考例25.1：化合物am-25 步驟1
使用參考例17.1之步驟2所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例25.0之步驟1相同之方式獲得6-(3-(苄氧基)苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤。
步驟2~4
使用步驟1所獲得之6-(3-(苄氧基)苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(3-(苄氧基)苯基-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-25)。
[實施例31]
使用參考例25.1所獲得之化合物am-25，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-29之siRNA。
參考例26.0：化合物I-30 步驟1
使用參考例6.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(3-(甲氧基羰基)苯基)硼酸(110mg，0.612mmol)，藉由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(160mg，123%)。
ESI-MS(m/z)：427(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(130mg，0.305mmol)，藉由與參考例6.0之步驟3相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(100mg，53.0%)。
ESI-MS(m/z)：619(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(68.7mg，0.111mmol)，藉由與參考例1.0之步驟5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(45.0mg，87.0%)。
ESI-MS(m/z)：467(M+1)
步驟4
將步驟3所獲得之磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(20.0mg，0.0430mmol)溶解於1N之氫氧化鈉水溶液(2mL)中，於室溫下攪拌2小時。加入乙酸-三乙胺緩衝液(pH值6.5)，於減壓下蒸餾去除溶劑而獲得殘渣，利用製備型HPLC(溶離液為0.01mmol/L之乙酸銨水溶液/甲醇系)對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(羧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-30)三乙基銨鹽(10.0mg，42.1%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.88-8.53(3H,m),8.34-8.22(1H,m),8.03-7.92(1H,m),7.60-7.48(1H,m),6.22-6.15(1H,m),4.76-4.65(1H,m),4.47-4.42(1H,m),4.35-4.30(1H,m),4.15-4.00(2H, m),3.09(6H,q,J=7.2Hz),1.16(9H,t,J=7.3Hz).
ESI-MS(m/z)：453(M+1)
參考例26.1：化合物am-26 步驟1
使用參考例17.1之步驟2所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例26.0之步驟1相同之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(3-甲氧基羰基)-9H-嘌呤。
步驟2
使用步驟1所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(3-甲氧基羰基)-9H-嘌呤，藉由與參考例26.0之步驟4相同之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(3-羧基)-9H-嘌呤。
步驟3~5
使用步驟2所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-(3-羧基)-9H-嘌呤，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-羧基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-26)。
[實施例32]
使用參考例26.1所獲得之化合物am-26，藉由與實施例1相同之方 式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-30之siRNA。
參考例27.0：化合物I-31 步驟1
使用參考例10.0之步驟1所獲得之5-溴-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(100mg，0.275mmol)，藉由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-苯乙烯基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(43.8mg，41%)。
ESI-MS(m/z)：385(M-1)
步驟2
將步驟1所獲得之1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-苯乙烯基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(16.3mg，0.042mmol)溶解於二氯甲烷(2mL)中，加入1H-四唑(7.39mg，0.105mmol)、二第三丁基二異丙基磷雜環戊二烯醯胺(0.028mL，0.084mmol)，於室溫下攪拌2小時。將反應液冷卻至0℃，加入(2R,8aS)-(+)-(樟腦磺醯基)氧氮雜環丙烷(19.4mg，0.084mmol)，於0℃下進而攪拌30分鐘。將反應液冷卻至室溫後加入飽和碳酸氫鈉水溶液，通過Presep(註冊商標，矽藻土，顆粒狀M型，4.5g/25mL)進行過濾，於減壓下蒸餾去除溶劑。利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(2,4-二側氧基-5-苯乙烯基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(10.0mg，41%)。
ESI-MS(m/z)：577(M-1)
步驟3
使用步驟2所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(2,4-二 側氧基-5-苯乙烯基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(10.0mg，0.017mmol)，藉由與參考例1.0之步驟5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二側氧基-5-苯乙烯基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-31)三乙基銨鹽(9.30mg，102%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.96(s,1H),7.49(d,J=7.3Hz,2H),7.37-7.19(m,3H),6.88(d,J=16.5Hz,1H),5.91(d,J=5.1Hz,1H),4.32(t,J=5.1Hz,1H),4.26(t,J=4.8Hz,1H),4.21-4.20(m,1H),4.11-3.99(m,2H),3.09(q,J=7.3Hz,6H),1.16(t,J=7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：425(M-1)
參考例27.1：化合物am-27 步驟1
使用參考例13.1之步驟2所獲得之5-溴-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例27.0之步驟1相同之方式獲得1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-5-苯乙烯基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
步驟2
使用步驟1所獲得之1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-5-苯乙烯基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(2,4-二側氧基-5-苯乙烯基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺。
[實施例33]
使用參考例27.1所獲得之化合物am-27，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-31之siRNA。
參考例28.1：化合物am-28 步驟1
將市售之(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(5.00g，17.4mmol)溶解於吡啶(42mL)中，加入1,3-二氯-1,1,3,3-四異丙基二矽氧烷(6.70ml，20.9mmol)，於室溫下攪拌2小時。向反應液中加入水，利用乙酸乙酯進行萃取。利用水及飽和食鹽水清洗有機層，以硫酸鈉進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用己烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得(6aR,8R,9R,9aS)-8-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2,4,4-四異丙基四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽雜辛烯-9-醇(8.64g，產率94%)。
ESI-MS(m/z)：530(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之(6aR,8R,9R,9aS)-8-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2,4,4-四異丙基四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽雜辛烯-9-醇(6.50g,12.3mmol)，藉由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得(6aR,8R,9R,9aS)-2,2,4,4-四異丙基-8-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽雜辛烯-9-醇(4.77g，產率65%)。
ESI-MS(m/z)：598(M+1)
步驟3
將步驟2所獲得之(6aR,8R,9R,9aS)-2,2,4,4-四異丙基-8-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽雜辛烯-9-醇(4.50g，7.54mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(50mL)中， 於0℃下加入60%氫化鈉(302mg，7.54mmol)、碘甲烷(0.471mL，7.54mmol)，於室溫下攪拌2小時。向反應液中加入水，利用乙酸乙酯進行萃取。利用水及飽和食鹽水清洗有機層，以硫酸鈉進行乾燥。於減壓下蒸餾去除溶劑，利用己烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得6-((E)-苯乙烯基)-9-((6aR,8R,9R,9aR)-2,2,4,4-四異丙基-9-甲氧基四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽雜辛烯-8-基)-9H-嘌呤(2.09g，產率45%)。
ESI-MS(m/z)：612(M+1)
步驟4
將步驟3所獲得之6-((E)-苯乙烯基)-9-((6aR,8R,9R,9aR)-2,2,4,4-四異丙基-9-甲氧基四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽雜辛烯-8-基)-9H-嘌呤(569mg,0.931mmol)溶解於四氫呋喃(10mL)中，加入乙酸(0.117mL，2.049mmol)與氟化四丁基銨之四氫呋喃溶液(1mol/L，2.05ml，2.05mmol)，於室溫下攪拌30分鐘。於減壓下濃縮反應液，利用氯仿/甲醇系之管柱層析法進行純化，藉此獲得(2R,3S,4R,5R)-2-(羥基甲基)-4-甲氧基-5-(6-((E)苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(341mg，產率99%)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：8.90(s,1H),8.43(d,J=16.7Hz,1H),8.13(s,1H),7.68-7.75(m,3H),7.37-7.47(m,3H),6.17(dd,J=2.2,11.9Hz,1H),5.95(d,J=7.0Hz,1H),4.77(dd,J=4.7,7.4Hz1H),4.61(d,J=4.4Hz,1H)),4.39-4.41(m,1H),3.99-4.02(m,1H),3.78-3.83(m,1H),3.37(s,3H),2.67(s,1H).
ESI-MS(m/z)：369(M+1)
步驟5
使用步驟4所獲得之((2R,3S,4R,5R)-2-(羥基甲基)-4-甲氧基-5-(6-((E)苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇，藉由與參考例1.1相同之 方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-甲氧基-5-(6-((E)苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-28)。不純化該化合物而使用於下述步驟。
[實施例34]
使用參考例28.1所獲得之化合物am-28，藉由與實施例1相同之方式合成下述表24所示之於454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-32之siRNA(稱為2'-OMe-6-styryl-dA)。ESI-MS(m/z)：理論值6792.04 實測值6792.18
參考例29.0：化合物I-33
使用市售之5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.0相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-33)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.67(s,1H),5.86(d,J=5.5Hz,1H),4.23(dt,J=12.8,4.9Hz,2H),4.13(dt,J=6.0,2.6Hz,1H),4.02-3.89(m,2H),1.80(s,3H).
ESI-MS(m/z)：337(M-1)
參考例29.1：化合物am-29 步驟1
使用市售之5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺。
[實施例35]
使用參考例29.1所獲得之化合物am-29，藉由與實施例1相同之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-33之siRNA。
參考例30.0：化合物I-34
使用市售之6-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.0相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-34)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：5.63(s,1H),5.56(d,J=2.9Hz,1H),4.31(t,J=6.6Hz,1H),4.05-3.90(m,4H),2.27(s,3H),1.95(s,1H).
ESI-MS(m/z)：337(M-1)
參考例30.1：化合物am-30
使用市售之6-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(6-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-30)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：7.80(m,1H),7.48-6.78(m,13H),5.55(s,1H),5.50(m,1H),5.10(m,1H),4.31-4.18(m,2H),3.93-3.22(m,12H),2.66-2.28(m,5H),1.18-1.05(m,12H),0.87(0.86)(s,9H),0.07(0.06)(s,3H),0.00(-0.01)(s,3H).
[實施例36]
使用參考例30.1所獲得之化合物am-30，藉由與實施例1相同之方式合成下述表24所示之於454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-34之siRNA(稱為6-Me-dU)。MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6680.87(M-H) 實測值6681.08
參考例31.0：化合物I-35 步驟1
使用利用公知之方法[Organic Process Research & Development,2001年，5卷，426-433頁]中所記載之方法而合成之7-氯-6-硝基喹唑啉- 2,4(1H,3H)-二酮(0.626g，1.24mmol)，藉由與參考例1.0之步驟1相同之方式獲得二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(0.292g，34%)。
ESI-MS(m/z)：684(M-1)
步驟2
使用步驟1所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(3.00g，4.37mmol)，藉由與參考例7.0之步驟2相同之方式獲得7-氯-1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(1.26g，77%)。
ESI-MS(m/z)：372(M-1)
步驟3
使用步驟2所獲得之7-氯-1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例7.0之步驟3~4相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯。
ESI-MS(m/z)：604(M-1)
步驟4
使用步驟3所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(32.5mg，0.054mmol)，藉由與參考例1.0之步驟5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-35)三乙基銨鹽(20.0mg，67%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.67(s,1H),7.87(s,1H),6.08(d,J=4.8Hz,1H),4.77(dd,J=6.6,4.8Hz,1H),4.42(t,J=6.4Hz,1H),4.08-3.99(m,4H),3.09(q,J=7.3Hz,6H),1.17(t,J=7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：452(M-1)
參考例31.1：化合物am-31 步驟1
使用參考例31.0之步驟2所獲得之7-氯-1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1之步驟1~2相同之方式獲得7-氯-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-硝基喹唑啉)-2,4(1H,3H)-二酮。
步驟2
使用參考例31.1之步驟1所獲得之7-氯-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-6-硝基喹唑啉)-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得((2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-31)。
[實施例37]
使用參考例31.1所獲得之化合物am-31，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-35之siRNA。
參考例32.0：化合物I-36 步驟1
將參考例10.0之步驟3所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)- 基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(20.0mg，0.033mmol)溶解於THF(1mL)中，加入二甲胺/THF溶液(1mL，2.00mmol)，於室溫下攪拌30分鐘。於減壓下蒸餾去除溶劑後，利用製備薄層層析法(庚烷/乙酸乙酯=25/75)對殘渣進行純化，藉此獲得二第三丁基((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-(二甲基胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(14.4mg，71%)。
ESI-MS(m/z)：613(M-1)
步驟2
使用步驟1所獲得之二第三丁基((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-(二甲基胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(22.0mg，0.036mmol)，藉由與參考例1.0之步驟5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-(二甲基胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-36)三乙基銨鹽(12.5mg，62%)。
ESI-MS(m/z)：461(M-1)
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.46(s,1H),6.75(s,1H),6.05(d,J=4.4Hz,1H),4.79(dd,J=6.6,4.0Hz,1H),4.38(t,J=7.0Hz,1H),4.11-3.98(m,4H),3.09(q,J=7.3Hz,6H),2.92(s,6H),1.17(t,J=7.3Hz,9H).
參考例32.1：化合物am-32 步驟1
使用參考例31.1之步驟1所獲得之7-氯-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-硝基喹唑啉)-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例32.0之步驟1相同之方式獲得1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁 基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-7-(二甲基胺基)-6-硝基喹唑啉)-2,4(1H,3H)-二酮。
步驟2
使用步驟1所獲得之1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-7-(二甲基胺基)-6-硝基喹唑啉)-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得((2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(7-(二甲基胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-32)。
[實施例38]
使用參考例32.1所獲得之化合物am-32，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-36之siRNA。
參考例33.0：化合物I-37 步驟1
使用參考例31.0之步驟1所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯氧基甲基)-5-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二基酯(292mg，0.426mmol)，藉由與參考例1.0之步驟2相同之方式獲得1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-7-(甲基胺基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(110mg，71%)。
ESI-MS(m/z)：367(M-1)
步驟2
使用步驟1所獲得之1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-7-(甲基胺基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.0之步驟3~5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5- (7-(甲基胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-37)三乙基銨鹽。
ESI-MS(m/z)：447(M-1)
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.67(s,1H),6.48(s,1H),6.02(d,J=4.0Hz,1H),4.78(dd,J=6.6,4.0Hz,1H),4.37(t,J=7.0Hz,1H),4.12(dt,J=13.9,5.6Hz,1H),4.03-3.97(m,2H),2.97(s,3H).(未發現胺、醯胺之質子)
參考例33.1：化合物am-33
使用參考例33.0之步驟1所獲得之1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-7-(甲基胺基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，藉由與參考例1.1相同之方式獲得((2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(7-(甲基胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-33)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：9.03(s,1H),8.40(m,1H),7.88(m,1H),7.48-6.73(m,13H),6.64(s,1H),5.88(m,1H),5.13(5.16)(m,1H),4.50-4.29(m,2H),3.93-3.25(m,12H),3.00(2.96)(d,J=5.1Hz,3H),2.60(2.32)(m,2H),1.20-1.05(m,12H),0.85(0.82)(s,9H),0.07(0.05)(s,3H),-0.05(-0.06)(s,3H).
[實施例39]
使用參考例33.1所獲得之化合物am-33，藉由與實施例1相同之方式合成下述表24所示之於454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-37之siRNA(稱為6-NO2,7-Me-dQu)。MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6790.94(M-H) 實測值6794.76
參考例34.0：化合物I-38 步驟1
使用參考例6.0之步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(E)-2-(3-氯苯乙烯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷(81.0mg，0.306mmol)，藉由與參考例6.0之步驟2相同之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(118mg，90%)。
ESI-MS(m/z)：429(M+1)
步驟2
使用步驟1所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(115mg，0.268mmol)，藉由與參考例6.0之步驟3相同之方式獲得磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(107mg，59.8%)。
ESI-MS(m/z)：621(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之磷酸二第三丁基-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(120mg，0.193mmol)，藉由與參考例1.0之步驟5相同之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-38)三乙基銨鹽(28.0mg，25.4%)。
1H-NMR(D2O,400MHz)δ：8.45(1H,s),8.34(1H,s),7.32-7.20(1H,m),6.86-6.70(3H,m),6.64-6.50(2H,m),5.92-5.85(1H,m),4.60-4.54(1H,m),4.38-4.32(1H,m),4.28-4.20(1H,m),4.10-3.92 (2H,m),3.04(6H,q,J=7.5Hz),1.11(9H,t,J=127.8Hz).
ESI-MS(m/z)：469(M+1)
參考例34.1：化合物am-34 步驟1
使用參考例17.1之步驟2所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例22.0之步驟1相同之方式獲得6-(3-氯苯乙烯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤。
步驟2~4
使用步驟1所獲得之6-(3-氯苯乙烯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜矽雜環己烯-6-基)-9H-嘌呤，藉由與參考例1.1之步驟3~5相同之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-34)。
[實施例40]
使用參考例34.1所獲得之化合物am-34，藉由與實施例1相同之方式合成於反義鏈之5'末端具有化合物I-38之siRNA。
試驗例6：
對於實施例1~4所獲得之於反義鏈之5'末端導入有非天然型核苷酸殘基之螢光素酶標靶siRNA之與AGO2之親和性，以如下所示之方式使用生物分子相互作用檢測系統(Biacore)T100及T200系統(GE Healthcare Science(GE)公司)，測定與固定於基盤表面之寡DNA之5'末 端之競爭，藉此對siRNA與AGO2-MID區之親和性進行評估。
(1)樣本之製備
藉由利用純水將電泳緩衝液原液(HBS-EP+10X，GE公司，BR-1006-69)稀釋10倍，並進行過濾器過濾，而製成HPS-EP+(10mM之HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羥基乙基)-1-哌乙磺酸)，150mM之NaCl，3mM之EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，0.05%(v/v)之Surfactant P20，pH值7.4)，將其用作電泳緩衝液。
向HBS-EP+中以最終濃度成為2mM之方式加入二硫蘇糖醇(DTT，dithiothreitol)，利用該溶液將siRNA溶液稀釋成200nM、100nM、50nM、25nM，將其與經同樣稀釋之5μg/mL之AGO2-MID區等量混合，藉此，製備含有siRNA各100nM、50nM、25nM、12.5nM之2.5μg/mL之AGO2-MID區溶液。
(2)測定方法 (2-1)生物素化寡之固定化
於晶片(Series S Sensor Chip SA，GE公司BR-1005-31)上實施生物素化單鏈DNA(dT(16)-Biotin)之固定化。流速(Flow rate)固定為10μL/分鐘，利用下述程序將經HBS-EP+稀釋成100nM之生物素化單鏈DNA溶液固定化至Fc2或Fc4。同時對Fc1、Fc3進行空白之固定化操作。
1. 1M之NaCl/50mM之NaOH，60秒(注入(INJECT)指令)，3次
2. 電泳緩衝液(清洗(WASH)指令)
3. 電泳緩衝液，120秒(注入(INJECT)指令)
4. 將目標固定化量(Aim for Immobilized Level)設定為750 RU，進行固定化(注入配體(LIGAND INJECT)指令)
5. 1M之NaCl/50mM之NaOH/50%異丙醇(清洗(WASH)指令)
對於經固定化之細胞，確認到約700 RU之固定量。
(2-2)寡核苷酸(siRNA)之競爭實驗
使用固定化有生物素化單鏈DNA之晶片，實施siRNA之競爭實驗。流速均為30μL/分鐘，1循環係以結合為60秒、背離為5秒、再生為1M之NaCl進行5秒而實施。
為了機械穩定化，最初之10個循環僅添加HBS-EP+，其後對各siRNA依序測定HBS-EP+(空白樣品(BLANK))、2.5μg/mL之AGO2-MID區溶液(對照(CONTROL))、含有siRNA各100nM、50nM、25nM、12.5nM之2.5μg/mL之AGO2-MID區溶液(樣本(Sample))。分析係自經固定化之細胞之圖上的值減去經空白樣品固定之圖上的值所得之圖上之結合量(binding level)，根據([樣本(Sample)]-[空白樣品(BLANK)])/([對照(CONTROL)]-[空白樣品(BLANK)])×100算出殘存結合率(%)，並根據100-(殘存結合率)算出抑制率(%)。
又，為了進行比較，對於在各siRNA之反義鏈之5'末端具有對應之天然型核苷酸之siRNA亦同樣地進行試驗。
表21表示各抑制率(%)。
根據試驗例6之結果明確得知，與各5'末端具有對應之天然型核 苷酸即單磷酸腺苷或單磷酸尿苷之siRNA(874-A及874-U)相比，實施例1~4所獲得之於反義鏈之5'末端導入有非天然型核苷酸殘基之螢光素酶標靶siRNA(874-8-Br-dA、874-8-oxo-dA、874-5-Br-dU、454-5-F-dU及1556-5-F-dU)之抑制率(%)均較高，與AGO2之親和性較高。
試驗例7：核苷酸(單體)之相互作用分析(Biacore)
對於實施例1及4所獲得之siRNA之5'末端為非天然型核苷酸之8-Br-dA(化合物I-1)及5-氟-2'-脫氧尿苷單磷酸(化合物I-4)之與AGO2之親和性，係以如下所示之方式使用Biacore T100及T200系統(GE公司)，測定與固定於基盤表面之寡DNA之5'末端之競爭，藉此對siRNA與AGO2-MID區之親和性進行評估。
(1)樣本之製備
藉由利用純水將HBS-EP+10X稀釋10倍，以最終濃度成為2mM之方式加入DTT，並進行過濾器過濾，而製成HBS-EP+之2mM之DTT水溶液。向該溶液中以最終濃度成為1%之方式加入二甲基亞碸(DMSO，Dimethyl sulfoxide)，而製成電泳緩衝液。
以使溶解於DMSO或蒸餾水中之單體溶液成為200μM、40μM、8μM、1.6μM/(2% DMSO,HBS-EP+,2mM之DTT)之方式進行稀釋，並與經HBS-EP+之2mM之DTT溶液稀釋而成之5μg/mL之AGO2-MID區等量混合，藉此製備於HBS-EP+,2mM之DTT,1%DMSO溶液中含有單體各100μM、20μM、4μM、0.8μM的2.5μg/mL之AGO2-MID區溶液。
(2)核苷酸(單體)之競爭實驗
使用藉由與試驗例6相同之方式固定化有寡dT(16)-Biotin之晶片，實施siRNA之競爭實驗。流速均為30μL/分鐘，1循環係以結合為60秒、背離為5秒、再生為利用1M之NaCl進行5秒而實施。
為了機械穩定化，最初之10個循環係僅添加HBS-EP+，其後對各 單體依序測定HBS-EP+(空白)、2.5μg/mL之AGO2-MID區溶液(對照)、含有單體各100μM、20μM、4μM、0.8μM之2.5μg/mL之AGO2-MID區溶液(樣本)、2.5μg/mL之AGO2-MID區溶液(對照)。
分析係使用自經固定化之細胞之圖上的值減去經空白樣品固定之圖上的值所得之圖上之結合量(binding level)，根據([樣本(Sample)]-[空白樣品(BLANK)])/([對照(CONTROL)]-[空白樣品(BLANK)])×100算出殘存結合率(%)，並根據100-(殘存結合率)算出抑制率(%)。
表22表示8-Br-dA(化合物I-1)及5-氟-2'-脫氧尿苷單磷酸(化合物I-4)及作為各比較之單磷酸腺苷(AMP)及單磷酸尿苷(UMP)之抑制率(%)。
根據試驗例7之結果明確得知，與天然核苷酸之單磷酸腺苷或單磷酸尿苷相比，於本發明之siRNA之反義鏈之5'末端所導入之非天然型核苷酸即8-Br-dA及5-氟-2'-脫氧尿苷單磷酸之抑制率(%)均較高，與AGO2之親和性較高。
試驗例8：單體之相互作用分析(Biacore)
藉由與試驗例7相同之方式，對實施例7~33、及35~40所獲得之siRNA之5'末端為非天然型核苷酸的化合物I-5~I-31、及I-33~I-38之與AGO2之親和性進行評估。
表23表示分別測得之抑制率(%)。
根據試驗例8之結果明確得知，實施例7~33、及35~40所獲得之siRNA之5'末端為非天然型核苷酸的化合物I-5~I-31、及I-33~I-38之抑制率(%)均較高，與AGO2之親和性較高。因此，期待實施例7~33、及35~40所獲得之siRNA成為與AGO2之親和性提高之寡核苷 酸，成為具有對於標靶mRNA之高減弱表現活性之寡核苷酸。
試驗例9：螢光素酶標靶siRNA之減弱表現活性
將每1孔之細胞數設為7500個細胞，將siRNA之最終濃度設為10000pmol/L、1000pmol/L、100pmol/L、10mol/L、1pmol/L之5種，以N=5進行設定，除此以外，藉由與試驗例1相同之方式，對實施例39、23、36或27所獲得之於反義鏈之5'末端具有各化合物之siRNA之活性進行測定，並實施評估。圖4表示於反義鏈之5'末端具有I-37(6-NO2,7-Me-dQu)、I-21(6-napht-2-yl-dPu)、I-34(6-Me-dU)、或I-25(6-napht-1-yl-dPu)之siRNA之減弱表現活性。
再者，使用8-Br-dA，藉由與實施例1相同之方式合成表24中之於454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有8-Br-dA之siRNA(稱為454-BrdA)，測定siRNA之活性，並實施評估。進而，對於在反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷或單磷酸尿苷之具有天然型核苷酸的siRNA(稱為454-A或454-U)亦同樣地測定siRNA之活性，並實施評估。
根據試驗例9之結果得知，與反義5'末端具有天然型核苷酸之siRNA相比，反義鏈之5'末端具有Ago2高親和性鹼基類似物之siRNA顯示出較高之減弱表現活性。
試驗例10：螢光素酶標靶siRNA之減弱表現活性
將每1孔之細胞數設為7500個細胞，將siRNA之最終濃度設為10000pmol/L、1000pmol/L、100pmol/L、10mol/L、1pmol/L之5種，以N=5進行設定，除此以外，藉由與試驗例1相同之方式測定實施例34、及21所獲得之於反義鏈之5'末端具有各化合物之siRNA之活性，並實施評估。圖5表示於反義鏈之5'末端具有I-32(2'-OMe-6-styryl-dA)、或I-19(di-Me-thienyl-dU)之siRNA之減弱表現活性。
根據試驗例10之結果得知，與反義5'末端具有對應之天然型核苷酸之siRNA相比，於反義鏈之5'末端具有Ago2高親和性鹼基類似物之 siRNA顯示出較高之減弱表現活性。
根據上述試驗例9及10之結果，藉由將利用本發明而提高活性之siRNA應用於醫藥，與使用天然型之siRNA之情形相比，可期待抑制投予量。
[產業上之可利用性]
根據本發明，可提供一種與AGO2之親和性提高之寡核苷酸等。
<110> 日商協和醱酵麒麟有限公司
<120> 寡核苷酸
<130> 1000P12280
<150> US61695566
<151> 2012-08-31
<150> JP2013105947
<151> 2013-05-20
<160> 66
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 239-BrdA正義鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 239-BrdA反義鏈
<400> 2
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-BrdA正義鏈
<400> 3
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-BrdA反義鏈
<400> 4
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 904-BrdA正義鏈
<400> 5
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 904-BrdA反義鏈
<400> 6
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1084-BrdA正義鏈
<400> 7
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1084-BrdA反義鏈
<400> 8
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1203-BrdA正義鏈
<400> 9
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1203-BrdA反義鏈
<400> 10
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1556-BrdA正義鏈
<400> 11
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1556-BrdA反義鏈
<400> 12
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 239-A反義鏈
<400> 13
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-A反義鏈
<400> 14
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 904-A反義鏈
<400> 15
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1084-A反義鏈
<400> 16
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1203-A反義鏈
<400> 17
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1556-A反義鏈
<400> 18
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-G正義鏈
<400> 19
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-G反義鏈
<400> 20
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-C正義鏈
<400> 21
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-C反義鏈
<400> 22
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-U正義鏈
<400> 23
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-U反義鏈
<400> 24
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-5-F-dU正義鏈
<400> 25
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-5-F-dU反義鏈
<400> 26
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1556-5-F-dU正義鏈
<400> 27
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-U反義鏈
<400> 28
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1556-U反義鏈
<400> 29
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 217-BrdA正義鏈
<400> 30
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 217-BrdA反義鏈
<400> 31
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 278-BrdA正義鏈
<400> 32
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 278-BrdA反義鏈
<400> 33
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 516-BrdA正義鏈
<400> 34
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 516-BrdA反義鏈
<400> 35
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 624-BrdA正義鏈
<400> 36
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 624-BrdA反義鏈
<400> 37
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 715-BrdA正義鏈
<400> 38
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 715-BrdA反義鏈
<400> 39
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 816-BrdA正義鏈
<400> 40
<210> 41
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 816-BrdA反義鏈
<400> 41
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 936-BrdA正義鏈
<400> 42
<210> 43
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 936-BrdA反義鏈
<400> 43
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-BrdA正義鏈
<400> 44
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-BrdA反義鏈
<400> 45
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1134-BrdA正義鏈
<400> 46
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1134-BrdA反義鏈
<400> 47
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 217-A反義鏈
<400> 48
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 278-A反義鏈
<400> 49
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 516-A反義鏈
<400> 50
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 624-A反義鏈
<400> 51
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 715-A反義鏈
<400> 52
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 816-A反義鏈
<400> 53
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 936-A反義鏈
<400> 54
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-A反義鏈
<400> 55
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1134-A反義鏈
<400> 56
<210> 57
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-5-F-dU正義鏈
<400> 57
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-U反義鏈
<400> 58
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-A正義鏈
<400> 59
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-A反義鏈
<400> 60
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-G正義鏈
<400> 61
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-G反義鏈
<400> 62
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 63
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反置引子
<400> 64
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-A正義鏈
<400> 65
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-A反義鏈
<400> 66

Claims (69)

  1. 一種寡核苷酸，其於寡核苷酸之5'末端具有式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基，且該核苷酸殘基或核苷殘基經由3位之氧原子而與鄰接之核苷酸殘基鍵結， {式中，X1為氧原子、硫原子、硒原子或NR4(式中，R4為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳醯基或可具有取代基之芳香族雜環羰基)，R1為下述之式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)， {式中，Y1為氮原子或CR8[式中，R8為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、 可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、-NR9aR9b(式中，R9a及R9b相同或不同，為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、或-CONR9cR9d(式中，R9c及R9d相同或不同，為氫原子或可具有取代基之低級烷基)]，R5為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述R9a及R9b含義相同)、-CONR10cR10d(式中，R10c及R10d分別與上述R9c及R9d含義相同)、-N=C-R10e(式中，R10e為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R10f(式中，R10f為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、或-N=N-R10g(式中，R10g為氫原子或可具有取代基之低級烷基)，R6為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳香族雜環氧基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、可具有取代基之芳香族雜環羰基、-NR11aR11b(式中，R11a及 R11b相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳基磺醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環羰基或可具有取代基之芳香族雜環磺醯基)、-CONR11cR11d(式中，R11c及R11d相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCONR11eR11f(式中，R11e及R11f相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCO2R11g(式中，R11g為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-N=C-R11h(式中，R11h為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R11i(式中，R11i為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、或-N=N-R11j(式中，R11j為氫原子或可具有取代基之低級烷基)，R7為氫原子、核酸領域之氫原子之等效體、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳香族雜環氧 基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、可具有取代基之芳香族雜環羰基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳基磺醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環羰基或可具有取代基之芳香族雜環磺醯基)、-CONR11cR11d(式中，R11c及R11d相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCONR11eR11f(式中，R11e及R11f相同或不同，為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、或-NHCO2R11g(式中，R11g為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)，但於Y1為氮原子、R5為氫原子、R6為-NR11aR11b且R7為氫原子之情形時，R11a及R11b不同時為氫原子} (式中，Y2、R6a及R7a分別與上述Y1、R6及R7含義相同) [式中，R12為氫原子、核酸領域之氫原子之等效體、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基或可具有取代基之低級烷基磺醯基，---為單鍵或雙鍵，於---為單鍵之情形時，Y3為NR13a(式中，R13a為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基或可具有取代基之低級烷基磺醯基)、或CR14aR14b(式中，R14a及R14b相同或不同，為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基或可具有取代基之芳香族雜環烷基)， Y4為NR13b(式中，R13b與上述R13a含義相同)、或CR14cR14d(式中，R14c及R14d分別與上述R14a及R14b含義相同)，於---為雙鍵之情形時，Y3為氮原子或CR14e(式中，R14e為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基或可具有取代基之芳香族雜環烷基)，Y4為氮原子或CR14f(式中，R14f為氫原子、鹵基、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基或可具有取代基之芳香族雜環烷基)，但於R12為氫原子、Y3為CR14e且Y4為CR14f之情形時，不存在R14e及R14f同時為氫原子、及R14e為甲基且R14f為氫原子之情況] (式中，R12a與上述R12含義相同，環A為芳香族環，n1為0~4之整數，R16為鹵基、羥基、磺醯基、硝基、氰基、羧基、胺甲醯基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基或可具有取代基之低級烷基磺醯基，於n1為2~4之整數之情形時，各R16可相同亦可不同，但於環A為苯環且n1為2之情形時，R16不為低級烷氧基)，R2為氫原子、羥基、鹵基或可具有取代基之低級烷氧基，R3為氫原子、或 (式中，n2為1、2或3)}。
  2. 如請求項1之寡核苷酸，其中X1為氧原子。
  3. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中R1為式(II)。
  4. 如請求項3之寡核苷酸，其中Y1為氮原子。
  5. 如請求項3或4之寡核苷酸，其中R5為氫原子、鹵基、氰基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)、-CONR10cR10d(式中，R10c及R10d分別與上述含義相同)、-N=C-R10e(式中，R10e為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R10f(式中，R10f為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、或-N=N-R10g(式中，R10g為氫原子或可具有取代基之低級烷基)。
  6. 如請求項3或4之寡核苷酸，其中R5為氫原子、鹵基、可具有取代基之低級烯基或氰基。
  7. 如請求項3或4之寡核苷酸，其中R5為可具有取代基之低級烯基或氰基。
  8. 如請求項3至7中任一項之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)、-N=C-R11h(式中，R11h為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R11i(式中，R11i為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、或-N=N-R11j(式中，R11j為氫原子或可具有取代基之低級烷基)。
  9. 如請求項3至7中任一項之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或-NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
  10. 如請求項3至7中任一項之寡核苷酸，其中R6為-NR11aR11b(式中， R11a及R11b為氫原子、可具有取代基之低級烷基)。
  11. 如請求項3至7中任一項之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之芳基，且取代基存在於芳基之間位或對位。
  12. 如請求項3至11中任一項之寡核苷酸，其中R7為氫原子。
  13. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中R1為式(III)。
  14. 如請求項13之寡核苷酸，其中Y2為氮原子。
  15. 如請求項13或14之寡核苷酸，其中R6a為胺基、甲基胺基或二甲基胺基。
  16. 如請求項13至15中任一項之寡核苷酸，其中R7為氫原子。
  17. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中R1為式(IV)。
  18. 如請求項17之寡核苷酸，其中R12為氫原子或核酸領域之氫原子之等效體。
  19. 如請求項18之寡核苷酸，其中---為雙鍵，Y3為CR14e(式中，R14e與上述含義相同)，Y4為氮原子或CR14f(式中，R14f與上述含義相同，但為氰基之情況除外)。
  20. 如請求項19之寡核苷酸，其中R14e為氫原子。
  21. 如請求項19之寡核苷酸，其中R14e為鹵基、氰基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，R14f為氫原子。
  22. 如請求項19之寡核苷酸，其中R14e為氫原子，R14f為鹵基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基。
  23. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中R1為式(V)。
  24. 如請求項23之寡核苷酸，其中環A為下述之式(A1)、式(A2)、或式(A3)， (式中，R16及n1分別與上述含義相同，但為式(A1') 所表示之情況除外) (式中，R16與上述含義相同，n1為0~2之整數，X2為NH、氧原子或硫原子) (式中，R16及X2與上述含義相同，n1為0~2之整數)。
  25. 如請求項23或24之寡核苷酸，其中R16為鹵基、硝基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烷基胺基或可具有取代基之二低級烷基胺基。
  26. 如請求項25之寡核苷酸，其中R12a為氫原子或核酸領域之氫原子之等效體。
  27. 如請求項23至26中任一項之寡核苷酸，其中n1為1或2。
  28. 如請求項1至27中任一項之寡核苷酸，其中R3為 (式中，n2與上述含義相同)。
  29. 如請求項28之寡核苷酸，其中n2為1。
  30. 如請求項1至29中任一項之寡核苷酸，其中R2為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基。
  31. 如請求項1至29中任一項之寡核苷酸，其中R2為羥基。
  32. 如請求項1之寡核苷酸，其中X1為氧原子，R2為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基。
  33. 如請求項32之寡核苷酸，其中R1為式(IIA) (式中，R5A及R6A分別與上述R5及R6含義相同)。
  34. 如請求項33之寡核苷酸，其中R5A為鹵基、胺甲醯基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之 低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基。
  35. 如請求項33之寡核苷酸，其中R5A為鹵基或氰基。
  36. 如請求項33至35中任一項之寡核苷酸，其中R6A為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基或NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
  37. 如請求項33至35中任一項之寡核苷酸，其中R6A為NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
  38. 如請求項33至35中任一項之寡核苷酸，其中R6A為胺基、可具有取代基之低級烯基或可具有取代基之芳基。
  39. 如請求項32之寡核苷酸，其中R1為式(IVA) (式中，Y3A及Y4A分別與上述Y3及Y4含義相同，但於Y3A及Y4A為CR14e及CR14f且R14e為氫原子之情形時，R14f不為氰基)。
  40. 如請求項39之寡核苷酸，其中Y3A為CR14e(式中，R14e與上述含義相同)，Y4A為CR14f(式中，R14f與上述含義相同)。
  41. 如請求項40之寡核苷酸，其中R14e為氫原子。
  42. 如請求項40之寡核苷酸，其中R14e為鹵基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，R14f為氫原子。
  43. 如請求項40之寡核苷酸，其中R14e為氫原子，R14f為鹵基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基。
  44. 如請求項32之寡核苷酸，其中R1為式(VA) (式中，環AA、n1A及R16A分別與上述環A、n1、及R16含義相同，於n1A為2~4之整數之情形時，各R16A可相同亦可不同，但於環AA為苯環且n1A為2之情形時，R16A不為低級烷氧基，於環AA為苯環、n1A為1且R16A為氯原子之情形時，以式(A1') 所表示之情況除外)。
  45. 如請求項44之寡核苷酸，其中環AA為苯環或噻吩環。
  46. 如請求項44或45之寡核苷酸，其中R16A為鹵基、硝基低級烷基、可具有取代基之低級烷基胺基或可具有取代基之二低級烷基胺 基。
  47. 如請求項44至46中任一項之寡核苷酸，其中n1A為1或2。
  48. 如請求項32至47中任一項之寡核苷酸，其中R3A為 (式中，n2A與上述含義相同)。
  49. 如請求項48之寡核苷酸，其中n2A為1。
  50. 如請求項32至49中任一項之寡核苷酸，其中R2A為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基。
  51. 如請求項32至49中任一項之寡核苷酸，其中R2A為羥基。
  52. 如請求項1至51中任一項之寡核苷酸，其具有10~80個之鹼基長度。
  53. 如請求項1至51中任一項之寡核苷酸，其具有20~50個之鹼基長度。
  54. 如請求項1至51中任一項之寡核苷酸，其具有20~30個之鹼基長度。
  55. 如請求項1至51中任一項之寡核苷酸，其具有21~25個之鹼基長度。
  56. 如請求項1至55中任一項之寡核苷酸，其為雙鏈寡核苷酸。
  57. 如請求項1至55中任一項之寡核苷酸，其為單鏈寡核苷酸。
  58. 如請求項1至55中任一項之寡核苷酸，其中寡核苷酸為短鏈干擾性RNA(siRNA)。
  59. 一種提高減弱表現(knock down)活性之方法，其特徵在於：於具 有對於編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱表現活性的寡核苷酸中，將該寡核苷酸之5'末端之鹼基殘基置換為下述之式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)所表示之鹼基殘基， (式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同) (式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同) (式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同) (式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)。
  60. 一種提高減弱表現活性之方法，其特徵在於：於對於編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱表現活性且5'末端之鹼基為鳥嘌呤或胞嘧啶的寡核苷酸中，將於該寡核苷酸之5'末端之鳥嘌呤殘基或胞嘧啶殘基置換為腺嘌呤殘基(6-胺基嘌呤-9-基)、胸腺嘧啶殘基(5-甲基-1,2,3,4-四氫嘧啶-2,4-二酮-1-基)、尿苷殘基(嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮-1-基)、或下述之式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)所表示之鹼基殘基， (式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同) (式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同) (式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同) (式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)。
  61. 如請求項59或60之方法，其中寡核苷酸為短鏈干擾性RNA(siRNA)。
  62. 一種核酸醫藥，其含有藉由如請求項59至61中任一項之方法而提高寡核苷酸對標靶信使RNA(mRNA)之減弱表現活性的寡核苷酸。
  63. 一種核苷酸或核苷、其羥基、羧基及/或胺基經保護基保護者、或其醯胺化合物、或者其鹽，其用於置換具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱表現活性的寡核苷酸之5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基，用以提高該寡核苷酸對標靶mRNA之減弱表現活性，且以式(Ia)表示， (式中，X1、R1、R2及R3分別與上述含義相同)。
  64. 如請求項63之核苷酸或核苷、其羥基、羧基及/或胺基經保護基保護者、或其醯胺化合物、或者其鹽，其中寡核苷酸為短鏈干擾性RNA(siRNA)。
  65. 一種核苷酸或核苷、其羥基、羧基及/或胺基經保護基保護者、或其醯胺化合物、或者其鹽，其含有下述之式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)所表示之鹼基殘基，用於置換具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱表現活性的寡核苷酸之5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基，用以提高該寡核苷酸對標靶mRNA之減弱表現活性， (式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同) (式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同) (式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同) (式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)。
  66. 如請求項65之核苷酸或核苷、其羥基、羧基及/或胺基經保護基保護者、或其醯胺化合物、或者其鹽，其中寡核苷酸為短鏈干擾性RNA(siRNA)。
  67. 一種寡核苷酸之用途，其用於製造標靶蛋白質之表現抑制劑，該寡核苷酸係於5'末端具有下述式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基，且具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱表現活性， (式中，X1、R1、R2及R3分別與上述含義相同)。
  68. 一種寡核苷酸之用途，其用於製造標靶蛋白質之表現抑制劑，該寡核苷酸導入有下述之式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)所表示之鹼基殘基作為5'末端之鹼基殘基，且具有對於編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱表現活性， (式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同) (式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同) (式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同) (式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)。
  69. 如請求項67或68之用途，其中寡核苷酸為短鏈干擾性RNA(siRNA)。
TW102131615A 2012-08-31 2013-09-02 寡核苷酸 TW201422633A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261695566P 2012-08-31 2012-08-31
JP2013105947 2013-05-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201422633A true TW201422633A (zh) 2014-06-16

Family

ID=50183732

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102131615A TW201422633A (zh) 2012-08-31 2013-09-02 寡核苷酸

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10378011B2 (zh)
EP (1) EP2891717B1 (zh)
JP (1) JP6336390B2 (zh)
TW (1) TW201422633A (zh)
WO (1) WO2014034934A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10378011B2 (en) 2012-08-31 2019-08-13 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Oligonucleotide
WO2015133491A1 (ja) * 2014-03-03 2015-09-11 協和発酵キリン株式会社 ５'末端に非天然ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド
JPWO2018047909A1 (ja) * 2016-09-08 2019-06-24 国立大学法人北海道大学 プリンヌクレオシド誘導体、ポリヌクレオチド及びｒｎａ

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5363399A (en) 1976-11-13 1978-06-06 Mitsubishi Chem Ind Ltd Novel deoxyribonucleoside derivatives
JPS59156297A (ja) 1983-02-16 1984-09-05 Kikkoman Corp グアノシン誘導体またはその塩の製造法
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
WO1994019362A1 (en) * 1993-02-23 1994-09-01 City Of Hope 4-ethoxy 5-fluoro 2'deoxyuridine
US5457187A (en) * 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5906918A (en) 1997-02-07 1999-05-25 Health Research Inc. Compositions and methods for measurement of oxidative DNA damage
CA2452310A1 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of modulating pharmacokinetics of oligonucleotides
WO2005026187A1 (ja) 2003-09-10 2005-03-24 Riken 非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用
AU2005222965B8 (en) 2004-03-15 2010-07-01 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
CA2574603C (en) 2004-08-04 2014-11-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
KR100998365B1 (ko) * 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
WO2011032034A2 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 University Of Idaho Nucleobase-functionalized conformationally restricted nucleotides and oligonucleotides for targeting nucleic acids
GB0919070D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Univ East Anglia Compounds and their uses in glycosyltransferase binding assays
US20130102652A1 (en) 2010-03-23 2013-04-25 University Of Utah Research Foundation Methods and compositions related to modified adenosines for controlling off-target effects in rna interference
EP2791159A4 (en) 2011-12-14 2015-10-14 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED NUCLEIC ACIDS, AND SHORT-TERM CARE USES THEREOF
US10378011B2 (en) 2012-08-31 2019-08-13 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Oligonucleotide
US20140330004A1 (en) 2012-08-31 2014-11-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Oligonucleotide
US9506886B1 (en) * 2014-04-30 2016-11-29 Helvetia Wireless Llc Systems and methods for detecting a liquid

Also Published As

Publication number Publication date
EP2891717A1 (en) 2015-07-08
US10378011B2 (en) 2019-08-13
JP6336390B2 (ja) 2018-06-06
JPWO2014034934A1 (ja) 2016-08-08
EP2891717A4 (en) 2016-03-09
EP2891717B1 (en) 2020-04-29
WO2014034934A1 (ja) 2014-03-06
US20150376611A1 (en) 2015-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2681470C1 (ru) Антисмысловые нуклеиновые кислоты
US10662217B2 (en) Antisense nucleic acids
EP3351633B1 (en) Antisense nucleic acid
AU2016340183A1 (en) mRNA cap analogs and methods of mRNA capping
WO2017066781A1 (en) Mrna cap analogs with modified phosphate linkage
EP3052107B1 (en) Organic compounds to treat hepatitis b virus
KR102366490B1 (ko) 5&#39;-캡핑된 rna 합성용 올리고뉴클레오티드
WO2018156056A1 (ru) Модифицированные олигонуклеотиды, активирующие рнказу н
KR20160067901A (ko) ＲＮＡ 간섭에 사용하기 위한 ＲＮＡｉ 작용제를 위한 3&#39;&#39; 말단 캡
TW201422633A (zh) 寡核苷酸
JP6586078B2 (ja) ５’末端に非天然ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド
US20140330004A1 (en) Oligonucleotide
WO2023220428A1 (en) Compositions for editing ass1 transcripts and methods thereof
NZ740562B2 (en) Antisense nucleic acid