JP3452584B2 - 置換核酸膜倣体 - Google Patents

置換核酸膜倣体

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JP3452584B2 JP53196097A JP53196097A JP3452584B2 JP 3452584 B2 JP3452584 B2 JP 3452584B2 JP 53196097 A JP53196097 A JP 53196097A JP 53196097 A JP53196097 A JP 53196097A JP 3452584 B2 JP3452584 B2 JP 3452584B2
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ペーター・エー・ニールセン
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

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Description

【発明の詳細な説明】
発明の分野 本発明は三重鎖形成を少なくするまたは防止するため
に化学基で置換された一つまたはそれ以上のヘテロ環式
塩基残基を含む核酸模倣体の合成および使用に関する。
この効果は三重鎖形成を避けるアンチセンスまたはプロ
ーブ試薬の設計に使用できる。 背景技術 本分野において、核酸模倣体の塩基配列に相補的な核
酸塩基配列を含み、核酸に結合する能力を持つ、天然に
存在するリボ核酸またはデオキシリボ核酸主鎖以外の主
鎖に結合した核酸塩基を含んでいるいくつかの核酸模倣
体が知られている。これらの内、例えばWO92/20702に記
載されているようなペプチド核酸（PNA）のみが、治療
および診断試薬としての使用の可能性が示されている。
このことは相補的核酸塩基配列の核酸（NA）へ、対応す
る野生型核酸により示されるよりも高い親和性で結合す
るそれらの能力によるものであろう。 PNAの独特の特性の一つは対応するPNA−NA二重鎖より
も安定なPNA2−NA三重鎖を形成する能力である。この能
力はPCRクランピング（WO93/25706）を含む種々の目的
には利点として使用できる。しかしながら、配列選択は
三重鎖形成配列に偏らせるであろうので、そのような選
択を必要とする応用においてはいくつかの欠点が存在す
る。 発明の目的 核酸と三重鎖を優先的に形成しない置換核酸模倣体を
提供するのが本発明の目的である。 核酸の配列選択的決定のための方法を提供するのも本
発明の更なる目的である。 疾患状態の存在を起こすまたは示すと疑われるタンパ
ク質をコードしている核酸の発現を調節できる治療、診
断および研究試薬を提供するのも本発明のまた更なる目
的である。 発明の簡単な説明 本発明に従うと、主鎖に結合されている塩基原子から
１、２または３原子離れている位置が立体的にかさばっ
た置換基により置換されている一つまたはそれ以上のヘ
テロ環式塩基を含む核酸模倣体が提供される。 核酸鎖および核酸鎖に相補的な塩基配列を持つ核酸模
倣体の二つの鎖からなる三重鎖構造の形成を避けるため
の方法もさらに提供される。そのような方法は、核酸／
核酸模倣体二重鎖の形成に適した条件下、核酸および核
酸模倣体の混合物をインキュベートすることを含んでい
る。もし三重鎖で核酸へ結合されたならばお互いにきわ
めて接近した場所に位置する、立体的にかさばった置換
基を核酸模倣体上に提供することにより三重鎖の形成が
避けられる。 本発明に従うと、主鎖に結合されている塩基原子から
１、２または３原子離れている位置が置換されている核
酸模倣体を提供することにより核酸の決定のための方法
が提供される。該核酸模倣体は、核酸模倣体および核酸
間の二重鎖の形成に適した条件下、核酸とインキュベー
トされる。二重鎖の発生は核酸の同一性または存在に関
連している。 哺乳類において疾患状態を引き起こすことが疑われる
タンパク質をコードしている核酸の発現を調節するため
の核酸模倣体を本発明は提供する。本発明の核酸模倣体
は治療用、診断用および研究用試薬として使用できる。 本発明の一つの好ましい特色は、本明細書に記載した
ように置換された核酸模倣体が対応する非置換核酸模倣
体に比較して良好な効率および識別力を持ちながら二重
鎖を形成する能力を実質的に保持していることである。 図の簡単な説明 図１はN4位が置換されたシトシンを含むPNA単量体の
代表的な合成の概要図である。 図２はPNAのN4置換シトシンおよびDNAのグアノシン間
のワトソン−クリック塩基対生成の概要図である。 発明の詳細な説明 本発明に従うと、核酸との三重鎖形成を避けるのに有
用な新規化合物が提供される。本発明に従った核酸模倣
体は天然には存在しない主鎖に結合された修飾ヘテロ環
式塩基（好適には天然に存在する塩基、例えば、“野生
型”核酸に見出されるもの）の配列を持つ分子である。
核酸模倣体は相補的塩基配列を持つ核酸を塩基対により
結合する。 好適な核酸模倣体は、塩基残基が主鎖のアミン窒素原
子を通して主鎖へ結合されている分子である。核酸模倣
体に好適な主鎖構造はWO92/20702、1993年４月26日に出
願された米国特許出願番号第08/054,363号、1994年12月
28日に出願された米国特許出願番号第08/366,231号に記
載されている。上に参照した開示は本明細書において援
用される。 本発明の核酸模倣体のヘテロ環式塩基は水素結合によ
り核酸の核酸塩基と塩基対を形成できるヘテロ環式基で
ある。三重鎖形成の場合においては、２種類の相互作用
が含まれている：ワトソン−クリック結合およびフーグ
スティーン結合。PNAおよびNA間の三重鎖形成はWO95/01
370に記載されている。 用語“ヘテロ環式基”または“ヘテロ環式塩基”には
天然に存在するプリンおよびピリミジン核酸塩基が含ま
れる。本発明の目的には、用語“ピリミジン”はその置
換基に関わりなく任意の1,3−ジアジンを示している。
天然に存在するピリミジン核酸塩基はシトシン、チミン
およびウラシルである。天然に存在するプリン核酸塩基
はアデニンおよびグアニンを含んでいる。用語“ヘテロ
環式基”または“ヘテロ環式塩基”はまた天然には存在
しない核酸塩基も含んでいる。天然には存在しない塩基
の例は、核酸塩基の任意の環原子が別の原子で置き換え
られている塩基である。例えば、CHはＮで置き換えられ
ていてもよく、逆もまた同様である。天然には存在しな
い塩基の別の例は、天然に存在する塩基の２−および４
−置換基が逆になっている塩基である。天然に存在する
および天然には存在しないピリミジン塩基の構造が以下
に示されている（左から三番目の構造はプソイド−イソ
シトシンとして知られている天然には存在しないピリミ
ジン塩基の構造である）： 本発明において、ヘテロ環式基はヘテロ環の特定の環
位置で主鎖に結合されている。置換された天然に存在す
る核酸塩基の場合、この位置は好適には窒素原子により
占められている。本発明に従うと、主鎖へのヘテロ環式
基の結合位置から１、２または３原子離れている位置
で、ヘテロ環式基へ立体的にかさばった置換基を結合で
きる。ピリミジン塩基の場合、環位置４、５および６と
通常番号付けがなされている位置が好適である。かさば
った置換基の結合には４−位が最も好適である。置換基
が５−および６−位に結合されている場合、三重鎖形成
にいくらかの影響も生じるであろうが、この場合、置換
基は４位に位置している置換基よりも立体的によりかさ
ばっていなければならない。天然には存在しない塩基の
場合、空間的配向においてピリミジン４、５および６位
に対応する位置がまた好適である。天然には存在しない
塩基の５位での置換の場合、シトシンのような天然に存
在する塩基と同じように三重鎖形成はpH依存性である。
二重鎖形成はどの場合もpHにより影響されないようであ
る。 上に示したのはＲで示された置換基を持つヘテロ環式塩
基の構造である。各々のＲは独立してＨ、−NO、−N
O2、−SO3、−CN、−OH、−SH、−PO3 2-、−COOH、−
R'、−Ｆ、−Cl、−Br、−Ｉ、−Ｏ−R'、−Ｓ−R'、−
Ｎ（R'）２、−Ｃ（R'）３、Ｃ（＝Ｘ）（R'）、−Ｃ
（＝Ｘ）（−Ｙ−R'）、Ｓ（＝Ｚ）1-2（−Ｙ−R'）で
あり、式中、ＺはＯであり、ＸはＯ、ＳまたはNHであ
り、およびＹはＯ、ＳまたはNHであり、少なくとも一つ
のＲは立体的にかさばった基である。好適なかさばった
基は３つの非水素原子またはそれ以上を含んでおり、最
も好適なかさばった基は６つの非水素原子またはそれ以
上を含んでおり、好適には環式および／または芳香族基
である。これらの好適の定義は少なくとも一つの置換基
が水素と異なっている場合に適用されることが本発明の
説明から明らかになるであろう。２またはそれ以上のＲ
基がかさばっている場合、阻害を達成するための空間的
要求性は減少するであろう（例えば、６原子から３原子
へ）。 Ｒ基はアシル基、特に芳香族アシル基であるのが望ま
しい。アシル基がピリミジン塩基の４位の窒素原子に結
合されていることが特に望ましい。特に好適なアシル基
はベンゾイル基である。 R'は好適にはH;アルキル、アルケニルまたはアルキニ
ル（各々１−50のＣ原子を持っている）；アリール、ナ
フチル、ビフェニルまたはトリル（各々６−50のＣ原子
を持っている）から選択される。これらの基は直鎖また
は分岐鎖、対称または非対称、キラルまたはアキラルで
もよく、およびＮ、NH、Ｓ、およびＯから選択される一
つまたはそれ以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、お
よび縮合芳香環系でもよい。R'はピリジル、イミダゾリ
ル、ピリミジニル、ピリダジニル、キノリル、アクリジ
ニル、イミダゾリル、ピロリル、フラニル、チエニル、
イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリルまたはビ
オチニルから選択されるヘテロ環式基であり、任意の利
用可能な位置に結合または融合されているであろう。 R'は、三重鎖阻害効果を促進するまたはそれに有用で
ある一つまたはそれ以上の低級有機残基（10炭素原子ま
で）またはその誘導体で好適には置換されているであろ
う。これらはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリ
ール、ナフチル、ビフェニル、トリル、ベンジルのよう
な基、および−NO−、−NO2、−SO3、−CN、−OH、−S
H、−PO3 2-、−COOH、−Ｆ、−Cl、−Brおよび−Ｉのよ
うな基である。 本発明の化合物はWO92/20702に記載されている方法に
従って都合よく製造できる。特に好適な合成法は、第一
工程において、立体的にかさばった置換基（好適には結
合された反応性基および／または単量体主鎖ユニットへ
の修飾塩基の結合のためのリンカー基、例えば保護Ｎ−
アミノエチルグリシン、も持っている）により置換され
た塩基の合成を使用する。第二工程において、前もって
形成されたおよび保護された単量体主鎖ユニットの窒素
原子へリンカー基を通して塩基が結合される。第三工程
において、塩基含有単量体が他の塩基含有単量体主鎖ユ
ニットとのオリゴマー化のために準備される、例えば、
主鎖ユニットの一つの末端での保護基の切断および／ま
たはオリゴマー化のためのこの末端の活性化。第四工程
において、塩基含有単量体は、相補的核酸との二重鎖形
成の相補性のための配列要求性に依存してオリゴマー化
される。 単量体主鎖の合成の間、活性基に適した保護基で保護
されるであろう好適な単量体主鎖ユニットは下記の一般
式の化合物である： 式中： R1は−COOP1、−NHP1、−OP1またはSP1（式中、P1は
水素または保護基である）で置換されたC1−C4アルキル
であり； R2は−COOP2、−NHP2、−OP2またはSP2（式中、P2は
水素または保護基である）で置換されたC1−C4アルキル
であり； Ｍはリンカーにより窒素に結合されている、天然に存
在するまたは天然には存在しないヘテロ環式基であり、
該リンカーは１−３原子の長さである；および R3は少なくとも３またはそれ以上の非水素原子を含む
立体的にかさばった置換基である。 R3で置換されていない単量体はWO92/20702に記載され
ている。好適な場合、R1は基−COOP1を含んでおり、お
よびR2は基−NHP2を含んでおり、ここで保護基（P1およ
びP2）はお互いに異なった反応条件下で切断可能であ
る。 例えば、ある好適な態様において、ペプチド核酸主鎖
が用いられる。そのような主鎖は一般式（Ｉ）を持って
いる： 式中： ｎは少なくとも２であり、 L1−Lnの各々は独立して水素、ヒドロキシ、（C1−
C4）アルカノイル、天然に存在する核酸塩基、天然には
存在しない核酸塩基、芳香族残基、DNAインターカレー
ター、核酸塩基結合基、ヘテロ環式塩基およびレポータ
ーリガンドから成る群より選択され、L1−Lnの少なくと
も一つは本明細書で説明したような立体的にかさばった
置換基で置換された天然に存在するまたは天然には存在
しない核酸塩基であり； C1−Cnの各々は（CR6R7）ｙであり、式中、R6は水素
でありおよびR7は天然に存在するアルファアミノ酸の側
鎖から成る群より選択され、またはR6およびR7は独立し
て水素、（C2−C6）アルキル、アリール、アラルキル、
ヘテロアリール、ヒドロキシ、（C1−C6）アルコキシ、
（C1−C6）アルキルチオ、NR3R4およびSR5から成る群よ
り選択され（式中、R3およびR4は前に定義した通りであ
り、R5は水素、（C1−C6）アルキル、ヒドロキシ−、ア
ルコキシ−またはアルキルチオ−置換（C1−C6）アルキ
ルである）、またはR6およびR7は一緒になって脂環式ま
たはヘテロ環式系を完成し； D1−Dnの各々は（CR6R7）ｚであり、式中、R6およびR
7は前に定義した通りである； ｙおよびｚの各々はゼロまたは１から10までの整数で
あり、ｙ＋ｚの合計は２より大きいが10より大きくはな
く； G1−Gn-1は−NR3CO−、−NR3CS−、−NR3SO−または
−NR3SO2−であり（両方の配向で）、式中R3は前に定義
した通りである； A1−AnおよびB1−Bnの各々の対は： （ａ）Ａは式（II a）、（II b）または（II c）の群で
あり、およびＢはＮまたはR3N+である；または （ｂ）Ａは式（II d）の群であり、およびＢはCHである
ように選択され； 式中： ＸはＯ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
り； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑの各々はゼロまたは１から５までの整数で
あり、ｐ＋ｑの合計は10を超えない； ｒおよびｓの各々はゼロまたは１から５までの整数で
あり、ｒ＋ｓの合計は10を超えない； R1およびR2の各々は独立して水素、ヒドロキシ−また
はアルコキシ−またはアルキルチオ−で置換されている
（C1−C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキ
ルチオ、アミノおよびハロゲンから成る群より選択さ
れ； G1−Gn-1の各々は−NR3CO−、−NR3CS−、−NR3SO−
または−NR3SO2−であり（両方の配向で）、式中R3は前
に定義した通りである； Ｑは−CO2H、−CONR'R"、−SO3Hまたは−SO2NR'R"、
または−CO2Hまたは−SO3Hの活性化誘導体であり；およ
び Ｉは−NHR'''R''''または−NR'''C（Ｏ）R''''であ
り、式中、R'、R"、R'''およびR''''は独立して水素、
アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、インタ
ーカレーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭
化水素、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオチドおよび
可溶性および不溶性ポリマーから成る群より選択され
る。 ある態様において、少なくとも一つのＡは式（II c）
の基であり、およびＢはＮまたはR3N+である。別の態様
において、Ａは式（II a）または（II b）の基であり、
ＢはＮまたはR3N+であり、およびｙまたはｚの少なくと
も一つは１または２ではない。 いくつかの好適なペプチド核酸は一般式（III a）ま
たは（III b）を持っている： 式中： 各々のＬは独立して、水素、フェニル、立体的にかさ
ばった置換基で置換されたものを含むヘテロ環式塩基残
基、または天然に存在する核酸塩基および天然には存在
しない核酸塩基の群からなる群より選択され； 各々の7'は水素および天然に存在するアルファアミノ
酸の側鎖から成る群より選択され； ｎは１から60の整数であり； ｋ、ｌおよびｍの各々は独立してゼロまたは１から５
までの整数であり； ｐはゼロまたは１であり、 RhはOH、NH2または−NHLysNH2であり；および RiはＨまたはCOCH3である。 特に好適であるのは式（III a）または（III b）を持
つ化合物であり、式中、各々のＬは独立して核酸塩基チ
ミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニ
ン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）から成る群より選択さ
れ、特にその一つまたはそれ以上は本発明に従って立体
的にかさばった置換基で修飾されており、ｋおよびｍは
ゼロまたは１であり、およびｎは１から30、特に４から
20までの整数である。 本発明のペプチド核酸は、液相または固相の両方で標
準ペプチド合成法を適用することにより合成できる。使
用されたシントンは特に標準保護基で保護された単量体
アミノ酸またはそれらの活性化誘導体である。オリゴヌ
クレオチド類似体もまた対応する二酸および二アミンを
用いることにより合成できる 従って、前記の式のPNA内へ取り込むために有用な単
量体シントンには、下記の一般式を持つアミノ酸、二酸
および二アミンから成る群より選択されるシントンが含
まれる： 式中、Ｌ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは前に定義したとおりで
あるが、ただしそれらの中のアミノ基はアミノ保護基に
より保護されているであろう;EはCOOH、CSOH、SOOH、SO
2OHまたはそれらの活性化誘導体であり；およびＦはNHR
3またはNPgR3であり、式中R3は前に定義したとおりであ
り、およびPgはアミノ保護基である。 本発明に従った好適な単量体シントンは式（VIII a）
−（VIII c）： を持つもの、またはそれらのアミノ保護および／または
酸末端活性化誘導体を含んでおり、式中Ｌは水素、フェ
ニル、ヘテロ環式基、天然に存在する核酸塩基および天
然には存在しない核酸塩基から成る群より選択され；お
よび7'は水素および天然に存在するアルファアミノ酸の
側鎖から成る群より選択される。 キラルなPNA主鎖もまた本発明で有用である。そのよ
うな主鎖は好適には二つまたはそれ以上の単量体（少な
くともその一つは脂肪族環式構造を含んでいる）から誘
導される。そのような単量体の代表的なものは下記の式
を持っている： 式中： Ｂは本発明に従って立体的にかさばった置換基で置換
されている天然に存在するまたは天然には存在しない核
酸塩基であり； ＣαおよびＣβの少なくとも一つはＳ立体配置であ
り；および ｎは０、１、２または３である。 好適な態様において、ＣαおよびＣβはＳ立体配置で
ある。本発明のさらに好適な態様において、Ｂはアデニ
ン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルであ
る。より好適な態様において、ｎは２である。 さらに好適な態様において、ペプチド核酸オリゴマー
は、主鎖のエチル部分のキラル中心を含む（２−アミノ
エチル）グリシン主鎖を持つ少なくとも一つのペプチド
核酸単量体を含んでいる。単量体はペプチド核酸オリゴ
マー内の標的分子中の変異性の領域に対応する位置に取
り込まれる。一つの核酸模倣体は、一つまたはそれ以上
の前記のように修飾された核酸塩基を含むことができ
る。一つの核酸模倣体内の立体的にかさばった置換基を
含む核酸塩基の数を増加させると、二重鎖形成能力を保
持したまま三重鎖形成を阻害することが観察された。 三重鎖形成の阻害を達成するために、立体的にかさば
った置換基が結合されるヘテロ環式塩基が核酸に結合さ
れた場合に（三重鎖の形成）を互いに近接して位置され
るように核酸模倣体および立体的にかさばった置換基の
結合位置が選択される。好適には核酸模倣体上の置換塩
基は、仮定の三重鎖において同じ側に位置していなけれ
ばならない、すなわち、核酸鎖の同じ核酸塩基との塩基
対形成。模倣体の置換塩基が核酸鎖上の同一の塩基と塩
基対形成する場合は“妨害した”と呼ばれるであろう。
立体的にかさばった置換基の使用により阻害される様式
でのみ三重鎖形成を起こすことができるように模倣体の
塩基配列および配向を選ぶことにより、置換された塩基
は核酸鎖上の前もって決められた塩基との塩基対生成を
達成できる。 本発明の化合物は核酸決定のための方法に使用でき、
主鎖に結合されている塩基の原子から１、２または３原
子離れている位置が置換されている核酸模倣体を含み、
該核酸模倣体および該核酸間の二重鎖形成に適した条件
下で該核酸模倣体および該核酸をインキュベートし、該
核酸の存在の尺度として該二重鎖の存在を決定する。こ
れらの方法は従来の技術で使用された化合物を本明細書
に記載した化合物に置き換えることによりWO92/20703
（本明細書において援用される）に記載された原理に従
って機能すると信じられる。核酸模倣体の末端の一つ
が、または主鎖または塩基部分の任意の位置がレポータ
ー基で標識されている核酸模倣体を使用するのが特に好
適である。合致するレポーター基は検出可能な基（例え
ば、フルオレセインのような蛍光基）、または続いての
工程でレポーター基に結合されるさらに別の化合物によ
り検出可能な基である。例えば、もし立体的にかさばっ
た置換基がビオチン基またはビオチン基を含む基である
ならば、核酸模倣体およびそれにより核酸が、ハイブリ
ッドに検出可能なストレプタビジンを加えることにより
決定できる。このインキュベーションに先だって、過剰
のビオチン標識核酸模倣体を除去しておくことが望まれ
る。続いてレポーター基は当業者には知られた手段によ
り検出される。 本発明は、疾患状態を持つ患者からの細胞または組織
試料中の疾患の原因となるタンパク質発現の検出に適し
ている。本発明を用いたタンパク質発現の阻害に多くの
アッセイが処方されるであろうが、そのようなアッセイ
は一般に、そのような阻害の検出、および通常は定量を
可能にするように選択された条件下、細胞または組織試
料と本発明の核酸模倣体を接触させることを含んでいる
であろう。以下に記載するように、フルオレセイン標識
核酸模倣体を製造し、疾患の原因となるタンパク質の発
現が疑われる細胞または組織試料と接触させる。次に試
料を洗浄して非結合核酸模倣体を除去する。試料中に残
存する蛍光は（蛍光定量法により検出および定量され
る）結合した核酸模倣体を示している（それは順に疾患
の原因となるタンパク質をコードしている核酸の存在を
示している）。 本発明の化合物は標的分子への結合に有用である。本
発明の標的分子は種々の生物学的に重要な分子を含むこ
とができる。そのような標的分子は、哺乳類における疾
患状態の原因となるおよび／または維持するのに関係す
るであろうタンパク質をコードしているDNAまたはRNAの
重要な領域のような核酸鎖であろう。そのような別の標
的分子は転写因子である。標的分子は炭化水素、糖タン
パク質または他のタンパク質でもよい。いくつかの好適
な態様において、標的分子は免疫グロブリン、受容体、
受容体結合リガンド、抗原または酵素のようなタンパク
質であろうし、より明確にはホスホリパーゼ、腫瘍壊死
因子、内毒素、インターロイキン、プラスミノーゲンア
クチベーター、プロテインキナーゼ、細胞接着分子、リ
ポキシゲナーゼ、加水分解酵素またはアシル基転移酵素
であろう。本発明の別の態様において、標的分子はヒト
免疫不全ウイルス、カンジダ、ヘルペスウイルス、パピ
ローマウイルス、サイトメガロウイルス、リノウイル
ス、肝炎ウイルスまたはインフルエンザウイルスの重要
な部分であろう。本発明のさらに別の態様において、標
的分子は癌遺伝子の領域であろう。 以下の実施例は本発明をさらに例示しているが、それ
らに制限されることを意図しているものではない。 実施例 実施例１ A.典型的な一般合成 ホスホロアミデートはCruachem（UK）から購入され、
DNAオリゴマーはMilliGen/Biosearch 8700 DNA合成機
で組み立てられた。Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ PNA単量体はB
iosearch（USA）から購入された。N'−Boc−アミノエチ
ルグリシンはBiosearch（USA）から購入された。すべて
のPNAオリゴマーは改良メリーフィールド法（Christens
en,L.,Fitzpatrick,R.,Gildea,B.,Warren,B.and Coul
l,J.（1994）,Innovations and Perspectives in S
olid Phase Synthesis,R.Epton,Ed.,SPCC（UK）Ltd.,
Oxford,England;Christensen et al.,（1995）,J.Pe
p.Sci.,3,175）により、注文製作されたPNA合成機（Bio
search,USA）で合成され、逆相HPLCにより精製された。
PNAオリゴマーはFAB+MSにより確認された。 B. Tm測定 Guilford Response分光光度計を用い、260nmで温度に
対する吸光度が測定された。加熱速度は５−90℃で0.5
℃／分であった。PNAオリゴマーは100mM NaCl、10mMリ
ン酸ナトリウムおよび0.1mM EDTAを含み、必要に応じ
て５、７または９にpHを調節した媒質塩緩衝液中で相補
的DNA配列とハイブリダイズされた。試料はTm測定に先
立って90℃に５分間加熱され、徐々に20℃まで冷却さ
れ、４℃で30分放置された。 C.修飾シトシン単量体の合成 （ｉ）ベンゾイル シトシン−１−イルアセテート
（１） 図１を参照し、400mLのDMFに溶解したシトシン（20g,
0.18mol）に7.2g（0.18mmol）のNaH（油分散液、60％）
が加えられた。混合物は50℃に加熱し、窒素雰囲気下で
２時間攪拌した。室温まで冷却後、２時間以上かけて29
mL（1.1当量）のブロモ酢酸ベンジルを加えた。一夜攪
拌後、黒ずんだ懸濁液を濾過し、濾液を冷DMFおよび0.2
M炭酸水素ナトリウムで洗浄した。生成物（１）はエタ
ノールから結晶化させた。収量:37g（79％）。1H NMR
（d6−DMSO）：δ 4.56（s,2H,CH2O）,5.24（s,2H,CH2
O）,5.77（d,1H,H5）,7.20（dd,2H,NH2）,7.45（m,5H,
芳香族）,7.65（d,1H,H6）。MS（FAB）m/z260（Ｍ＋
Ｈ）＋（計算値260）。 （ii）（N4−（ベンゾイル）シトシン−１ イル）酢酸
（２） （１）のピリジン（10mL）溶液に6.6g（47mmol）のベ
ンゾイルクロリドを加え、室温で一夜攪拌した。減圧下
で溶液を蒸発させた。残渣は1M KOHに溶解して３時間
攪拌した後、濃HClでpHを２に調整した。目的化合物
（２）が沈澱した。収量:9.3g（90％）。1H NMR（d6−
DMSO）：δ 4.59（s,2H,CH2O）,7.31（d,1H,H5）,7.5
−8.2（7H,芳香族,NH,H6）。MS（FAB）m/z273（Ｍ＋
Ｈ）＋（計算値273）。 （iii）Ｎ−（N4−（ベンゾイル）シトシン−１−イ
ル）アセチル）−Ｎ−（２−Bocアミノエチル）グリシ
ン（３） 4.8g（22mmol）のメチル Ｎ−（２−Boc−アミノエ
チル）グリシネート（２）、2.4g（14.7mmol）のベンジ
ルオキシカルボニル クロリド、2.9g（14.9mmol）のDC
Cおよび2.4g（14.7mmol）のDhBtOHを50mLのDMFに溶解
し、室温で４時間攪拌した。ジクロロメタン（100mL）
を加え、混合物は3x0.2M炭酸水素ナトリウム、2x1M硫酸
水素ナトリウムおよび食塩水で抽出した。有機相は硫酸
マグネシウムで乾燥させ、減圧下で蒸発乾固させた。残
渣を2M KOHに溶解し、１時間攪拌した後、1M HClでpH
を２に調整すると目的化合物が沈澱した。生成物（３）
はメタノール：酢酸エチル：ヘキサン（1:2:2）から結
晶化した。収量:4.2g（60％）。1H NMR（d6−DMSO）：
δ 1.45および1.47（d,9H,Boc）,3.28−3.53（m,4H,CH
2）,4.08および4.31（s,2H,CH2CO）,4.75および4.95
（s,2H,CH2CO）,6.83および7.03（m,1H,BocNH）,7.38
（m,1H,H5）,7.57−8.10（m,6H,芳香族およびH6）。MS
（FAB）m/z474（Ｍ＋Ｈ）＋（計算値474）。 実施例２ 三重鎖阻害 ホモピリミジン ペプチド核酸のハイブリダイゼーシ
ョン特性に対するベンゾイル化シトシン（CBz）の効果
が研究された。PNA1、Ｈ−TTTTCCTCTC−LysNH2が合成さ
れ、６位にCBz（PNA2）または６および８位（PNA3）ま
たは５および６位（PNA4）の二つのCBz基を含んでい
る。これらのPNAは相補的オリゴヌクレオチドと平行（O
DN1）または逆平行（ODN2）コンフィギュレーションで
ハイブリダイズされ、生じた複合体の熱安定性（Tm）が
pH5、７および９で決定された。結果は表１に示されて
いる。温度に対する吸光度の曲線は100mM NaCl、10mM
リン酸ナトリウムおよび0.1mM EDTA中、260nmで測定さ
れた。加熱速度:5−90℃で0.5℃／分。括弧内のTmは260
nmでの吸光度を測定しながら90℃から10℃へ冷却するこ
とにより得られた。 非修飾PNA1は期待された挙動を示した。第一に、シト
シンプロトン化を必要とするPNA2−DNA三重鎖形成と一
致する明白なpH依存性が観察された。第二に平行複合体
はpH5および７で最も高い安定性を示したが、pH9では示
さなかった。これらの結果は、pH5および７では三重鎖
が最も安定な複合体であるが、一方、pH9では（逆平
行）二重鎖がより安定であることを示唆している。pH7
での三重鎖形成は、このpHで観察された明白なヒステレ
シス（〜27℃）とも一致している。 一つのCBz残基を含んでいるPNA2はヒステレシスによ
り判断されるようにpH5では明らかにまた三重鎖を形成
するが、TmはPNA1複合体よりも低かった（〜30℃）。従
って、ベンゾイル基は本当に効率がいい三重鎖形成を妨
害しているように思われる。この効果は特にpH7で明白
である。わずかなヒステレシスのみしか観察されず、特
に逆平行複合体はより高い安定性を示し、それはよりア
ルカリ性条件（pH9）でも減少しなかった。これらの結
果は、このPNAに対してはpH7で最も安定な複合体である
二重鎖が有利であることを強く主張している。 PNA1およびPNA2との複合体はpH9で等しい熱安定性を
示し（即ち二重鎖に対して）、従って、CBz残基はPNA−
DNA二重鎖中のワトソン−クリック塩基対形成を妨害し
ないことを示している。この結論はPNAオリゴマーＨ−A
GT CAC CTA Ｃ−LysNH2（PNA5）およびＨ−AGT CBz
CTA Ｃ−LysNH2（PNA6）を用いる混合プリン／ピリ
ミジン配列を含むCBzによる実験により支持され、それ
は表２に示されている。温度に対する吸光度の曲線は10
0mM NaCl、10mMリン酸ナトリウムおよび0.1mM EDTA、
pH7中で、260nmにて測定された。加熱速度:5−90℃で0.
5℃／分。括弧内のTmは260nmでの吸光度を測定しながら
90℃から10℃へ冷却することにより得られた。系のヒス
テレシスはTm（10−90゜）およびTm（90−10゜）間の相
違である。 これらの両方のオリゴマーともそれらの逆平行オリゴ
ヌクレオチド標的と高度に安定な二重鎖を形成する。こ
れらの複合体の化学量論はジョブ−プロットにより両方
の場合とも1:1複合体であることが決定された。PNA5お
よびPNA6とODN3間の複合体のTmにおける有意ではない相
違は実験誤差範囲内であり、図２に示された構造の証拠
として解釈でき、それによるとベンゾイル基はワトソン
−クリック塩基対形成を妨害しない主グループ内に位置
している。このことはDNA鎖中のシトシンの反対側に位
置している（Ｇ→Ａ）不適正がPNA5およびPNA6両方に対
してTmの15−16゜の低下を生じさせることとも完全に一
致している。実験条件下、三重鎖と二重鎖を区別する重
要な特色は、高い温度から低い温度へ行く場合に二重鎖
で得られた非常に小さなヒステレシス（２゜未満）であ
り、それに対しPNA:DNA三重鎖は明白なヒステレシスを
典型的には20−30゜の範囲で示した（表２）。このこと
はPNA6とODN3またはODN4間の複合体についても明らかで
あり、１−２℃のヒステレシスが観察された。PNA6で得
られた小さなヒステレシスはまた、ベンゾイル基は結合
速度論を有意に妨害しないことも示している。 実施例３ フルオレセインへの核酸模倣体の結合 遊離アミノ残基を持つ核酸模倣体をTHF:H2Oに溶解し
て0.1Mの核酸模倣体の溶液を調製する。核酸模倣体溶液
にフルオレセイン イソチオシアネートを加えて、0.1
−1.0Mのフルオレセイン イソチオシアネート溶液とす
る。得られた反応混合物は0.1−２時間攪拌し、減圧下
で濃縮する。残渣は分取用HPLCにより精製する。 実施例４ 突然変異体β−アミロイド前駆体タンパク質遺伝子発現
（βAPP）の検出 β−アミロイドをコードする遺伝子の点突然変異は家
族性アルツハイマー病（FAD）に関係するとされてい
る。核酸模倣体は前記実施例３に例示したように、フル
オレセインまたは他の蛍光性標識で標識される。蛍光性
標識核酸模倣体は、異常βAPPをコードする核酸に対す
る核酸模倣体の特異的ハイブリダイゼーションに適した
条件下、異常βAPP発現が疑われる細胞または組織試料
と接触させる。次に試料を洗浄して非結合核酸模倣体を
除去する。試料中に残存する標識は結合核酸を示してお
り、それは蛍光光度計、蛍光顕微鏡または他の通常の手
段により定量される。 βAPP遺伝子中の点突然変異を発現していると疑われ
る細胞または組織の第一の試料は、βAPP mRNAの突然
変異体コドン717、コドン670またはコドン671を標的と
するフルオレセイン標識核酸模倣体とインキュベートさ
れる。細胞または組織の第二の同一の試料は、特異的ハ
イブリダイゼーションが起こりうる条件下、正常βAPP
mRNAの同一の領域を標的とする第二の標識核酸模倣体
とインキュベートする。次に試料を洗浄して非結合核酸
模倣体を除去する。試料中に残存する標識は結合核酸を
示しており、それは蛍光光度計または他の通常の手段を
用いて定量される。もし第一の試料が標識核酸模倣体を
保持し、第二の試料が標識核酸模倣体を保持しないなら
ば、突然変異体βAPPの存在が示される。 実施例５ 突然変異体Ｈ−ras遺伝子発現の検出 Ｈ−ras遺伝子中の点突然変異はras経路の多くの異常
に関係するとされている。核酸模倣体は前記実施例３に
例示したように、フルオレセインまたは他の蛍光性標識
で標識される。標識核酸模倣体は、特異的ハイブリダイ
ゼーションが起こりうる条件下、異常ras発現が疑われ
る細胞または組織資料と接触させる。次に試料を洗浄し
て非結合核酸模倣体を除去する。試料中に残存する標識
は結合核酸（すなわち、突然変異体rasをコードしてい
るもの）を示しており、それは蛍光光度計、蛍光顕微鏡
または他の通常の手段により定量される。 Ｈ−ras遺伝子中の点突然変異を発現していると疑わ
れる第一の細胞または組織試料は、突然変異体Ｈ−ras
mRNAのコドン12、コドン13またはコドン61を標的とす
るフルオレセイン標識核酸模倣体とインキュベートされ
る。細胞または組織の第二の同一の試料は、特異的ハイ
ブリダイゼーションが起こりうる条件下、正常Ｈ−ras
mRNAの同一の領域を標的とする第二の蛍光性標識核酸
模倣体とインキュベートする。次に試料を洗浄して非結
合核酸模倣体を除去する。試料中に残存する標識は結合
核酸を示しており、それは蛍光光度計または他の通常の
手段を用いて定量される。もし第一の試料が蛍光を示
し、第二の試料が蛍光を示さないならば、突然変異体Ｈ
−rasの存在が示される。 実施例６ 核酸模倣体による遺伝子発現の阻害 パピローマウイルスのE2 mRNAの発現を阻害する核酸
模倣体の能力を試験する好適なアッセイはよく知られて
いるE2のトランス活性化特性に基づいている。Spalholt
z et al.,J.Virol.,61,2128（1987）。レポータープ
ラスミド（E2RE1CAT）は、E2依存性エンハンサーとして
機能するE2応答性要素を含むように構築される。E2RE1C
ATはまたSV40初期プロモーター、初期ポリアデニル化シ
グナルおよびクロラムフェニコール アセチル トラン
スフェラーゼ（CAT）遺伝子も含んでいる。このプラス
ミドの文脈において、CAT発現はE2の発現に依存してい
る。E2の存在に依存するCAT発現の依存は、BPV−１で形
質転換したC127細胞、非感染C127細胞およびE2RE1CATお
よびE2発現ベクターで同時トランスフェクトした細胞内
へのこのプラスミドのトランスフェクションにより試験
された。 A. BPV−１ E2発現の阻害:BPV−２形質転換C127細胞
を12ウェルプレートに播種する。E2RE1CATでのトランス
フェクションに先だつ24時間前に、細胞を最終濃度５、
15および30mMになるように増殖培地に相補的核酸模倣体
を加えることにより前処理する。次の日、細胞をリン酸
カルシウム沈澱により10μｇのE2RE1CATでトランスフェ
クトする。E2RE1CAT（10μｇ）および坦体DNA（PUC19、
10μｇ）を62μＬの2M CaCl2と混合して最終容量を250
μＬのH2Oとし、続いて250μＬの2xHBSP（1.5mM Na2PO
4、10mM KCl、280mM NaCl、12mMグルコースおよび50m
M HEPES、pH7.0）を加え、室温で30分間インキュベー
トする。この溶液（100μＬ）を各々の試験ウェルに加
え、37℃で４時間インキュベートする。インキュベーシ
ョン後、室温で１分間、15％グリセロールを含む0.75mM
Na2PO4、5mM KCl、140mM NaCl、6mMグルコースおよ
び25mM HEPES、pH7.0、で細胞にグリセロールショック
を与える。ショックを与えた後、細胞は無血清DMEMで２
回洗浄し、10％ウシ胎児血清および本来の濃度の核酸模
倣体を含有DMEMで再給餌した。トランスフェクションし
て48時間後、細胞を採取し、CAT活性をアッセイする。 CAT活性の決定のため、細胞をリン酸緩衝化塩溶液で
２回洗浄し、かき取りにより集める。細胞は100μＬの2
50mMトリス−HCl（pH8.0）に懸濁し、３回凍結−融解さ
せて破壊する。この細胞抽出液（25μＬ）を各々のアッ
セイに使用する。 各々のアッセイのため、下記のものを1.5mLエッペン
ドルフチューブ内で一緒に混合し、１時間37℃でインキ
ュベートする:25μＬの細胞抽出液、５μＬの4mMアセチ
ル補酵素Ａ、18μＬのH2Oおよび１μＬの14C−クロラム
フェニコール、40−60mCi/mM。インキュベーション後、
クロラムフェニコール（アセチル化および非アセチル化
型）を酢酸エチルで抽出し、蒸発乾固する。試料は25μ
Ｌの酢酸エチルに再懸濁し、tlcプレートにスポットし
てクロロホルム：メタノール（19:1）でクロマトグラフ
ィーを行う。クロマトグラムはオートラジオグラフィー
により分析する。アセチル化および非アセチル化14C−
クロラムフェニコールに対応するスポットをtlcプレー
トから切り出し、CAT活性の定量のため液体シンチレー
ションにより計数する。核酸模倣体は用量応答様式でCA
T活性を低下させ、陽性の効果を持っていると考えられ
る。 B. HPV E2発現の阻害：核酸模倣体によるヒトパピ
ローマウイルス（HPV）E2阻害のためのアッセイは本質
的にBPV−１ E2のためのアッセイと同じである。HPVア
ッセイのためには、適当なHPVを前記のようなリン酸カ
ルシウム法を用いてPSV2NEOとともにCV−１かまたはA43
1細胞内へ同時トランスフェクトする。DNAを取り込んだ
細胞は、抗生物質G418を含む培地中での培養により選択
する。G418耐性細胞は次にHPV DNAおよびRNAを分析す
る。E2を発現している細胞が相補性研究の標的細胞とし
て使用される。各々の核酸模倣体に対し、細胞は前記の
ように調製され、E2RE1CATでトランスフェクトされて前
記のようにCAT活性が分析される。核酸模倣体は、もし
それらが用量応答様式でCAT活性を低下できるなら陽性
効果を持つと考えられる。
【配列表】
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平７−258222（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−115094（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−509063（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−506945（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08G 69/00 C07H 21/04 C12N 15/09 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】核酸、転写因子、炭水化物およびタンパク
    質からなる群より選択される少なくとも一つの標的分子
    との混合物中の核酸模倣体であって、前記模倣体は複数
    のヘテロ環式塩基が結合された天然には存在しない主鎖
    構造を含み、前記塩基の少なくとも一つは、前記塩基の
    主鎖への結合の位置から１、２または３原子離れた位置
    において少なくとも一つの立体的にかさばった置換基で
    置換されていることを特徴とし、式（Ｉ）： 【化１】 〔式中、 ｎは少なくとも２であり、 L1〜Lnの各々は、独立して、水素、ヒドロキシ、（C1〜
    C4）アルカノイル、天然に存在する核酸塩基、天然には
    存在しない核酸塩基、芳香族残基、DNAインターカレー
    ター、核酸塩基結合基、ヘテロ環式塩基、およびレポー
    ターリガンドからなる群より選択され、L1〜Lnの少なく
    とも一つは、少なくとも一つの立体的にかさばった置換
    基で置換された前記塩基であり； C1〜Cnの各々は、（CR6R7）ｙ（ここで、R6は水素であ
    り、R7は、天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖から
    なる群より選択され、またはR6およびR7は、独立して、
    水素、（C2〜C6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘ
    テロアリール、ヒドロキシ、（C1〜C6）アルコキシ、
    （C1〜C6）アルキルチオおよびSR5からなる群より選択
    され、R5は、水素、（C1〜C6）アルキル、ヒドロキシも
    しくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換された
    （C1〜C6）アルキルであり、あるいはR6およびR7は、一
    緒になって脂環式系またはヘテロ環式系を完成する）で
    あり； D1〜Dnの各々は、（CR6R7）Ｚ（ここで、R6およびR7は
    上で定義したとおりである）であり； ｙおよびｚの各々は０または１から10までの整数であ
    り、ｙ＋ｚの合計は２より大きいが10より大きくはな
    く； G1〜Gn-1の各々は、いずれの向きでもよい、−NHCO−、
    −NHCS−、−NHSO−または−NHSO2−であり； A1〜AnおよびB1〜Bnの各々の対は、 （ａ）Ａは式（II a）、（II b）または（II c）の基で
    あり、かつＢはＮまたはHN+であり；または （ｂ）Ａは式（II d）の基でありかつＢはCHである； であるように選択され： 【化２】 Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NH、CH2またはＣ（CH3）２であり； Ｙは、単結合、ＯまたはＳであり； ｐおよびｑの各々は、０または１から５までの整数であ
    り； ｒおよびｓの各々は０または１から５までの整数であ
    り； R1およびR2の各々は、独立して、水素、ヒドロキシもし
    くはアルコキシもしくはアルキルチオで置換されていて
    もよい（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、
    アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より選
    択され； Ｑは、−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hまたは−SO2NR′
    Ｒ″、または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性化誘導体であ
    り；そして Ｉは、−NHRＲ′または−NRＣ（Ｏ）Ｒ′、こ
    こで、Ｒ′、Ｒ″、ＲおよびＲ′は、独立して、水
    素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、イ
    ンターカレーター、キレーター、ペプチド、タンパク
    質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオチド
    および可溶性および不溶性ポリマーからなる群より選択
    される］ を有し、前記立体的にかさばった置換基が、−Ｒ′、−
    OR′、−SR′、−Ｎ（Ｒ′）２、−Ｃ（Ｒ′）３、−Ｃ
    （＝Ｘ）（Ｒ′）、−Ｃ（＝Ｘ）（−Ｙ−Ｒ′）または
    Ｓ（＝Ｏ）1-2（−Ｙ−Ｒ′）： 〔式中、 Ｘは、Ｏ、ＳまたはNHであり； Ｙは、Ｏ、ＳまたはNHであり；そして Ｒ′は、C1〜C50−アルキル、C2〜C50−アルケニル、C7
    〜C50−アルキルーアリール、C6〜C50−アリール、C10
    〜C50−ナフチル、C12〜C50−ビフェニル、C7〜C50アリ
    ールーアルキル、ピリジル、イミダゾリル、ピリミジニ
    ル、ビリダジニル、キノリル、アクリジニル、ピロリ
    ル、フラニル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾ
    リル、チアゾリルまたはビオチニルであり、ここで、
    Ｒ′は、一つまたはそれ以上の、−NO、−NO2、−SO
    3−、−CN、−OH、−NH2、−SH、−PO3 2-、−COOH、−
    Ｆ、−Cl、−Brおよび−Ｉで置換されていてもよい〕 である核酸模倣体。
  2. 【請求項２】前記標的分子が核酸である、請求項１記載
    の核酸模倣体。
  3. 【請求項３】前記塩基が天然に存在するまたは天然には
    存在しないピリミジン塩基である、請求項１記載の核酸
    模倣体。
  4. 【請求項４】前記立体的にかさばった置換基が、前記天
    然に存在するピリミジン塩基のＣ−６、Ｃ−５またはＮ
    −４に結合されている、請求項３記載の核酸模倣体。
  5. 【請求項５】前記立体的にかさばった置換基が、前記天
    然に存在するピリミジン塩基のＮ−４に結合されてい
    る、請求項４記載の核酸模倣体。
  6. 【請求項６】前記天然に存在するピリミジン塩基がシト
    シンである、請求項５記載の核酸模倣体。
  7. 【請求項７】前記立体的にかさばった置換基が（Ｃ＝
    Ｏ）−Ｒ″（式中Ｒ″はC1〜C20−アルキルまたはC6〜C
    18−アリールである）である、請求項５記載の核酸模倣
    体。
  8. 【請求項８】前記立体的にかさばった置換基が（Ｃ＝
    Ｏ）−C6H5である、請求項７記載の核酸模倣体。
  9. 【請求項９】式（III a）： 【化３】 〔式中、 各々のＬは、独立して、立体的にかさばった一つまたは
    それ以上の基で置換されているものを含む、水素、フェ
    ニルおよびヘテロ環式塩基残基、ならびに、天然に存在
    する核酸塩基および天然には存在しない核酸塩基からな
    る群より選択され、少なくとも一つのＬは、少なくとも
    一つの立体的にかさばった置換基で置換されている前記
    塩基であり； 各々のR7′は、独立して、水素および天然に存在するア
    ルファアミノ酸の側鎖からなる群より選択され； ｎは、１から60までの整数であり； ｋ、ｌおよびｍの各々は、独立して、０または１から５
    までの整数であり； ｐは、０または１であり； Rhは、OH、NH2または−NHLysNH2であり；そして Riは、ＨまたはCOCH3である〕 を有する、請求項１記載の核酸模倣体。
  10. 【請求項１０】式（III b）： 【化４】 〔式中、 各々のＬは、独立して、立体的にかさばった一つまたは
    それ以上の基により置換されているものを含む水素、フ
    ェニルおよびヘテロ環式塩基残基、ならびに天然に存在
    する核酸塩基および天然には存在しない核酸塩基からな
    る群より選択され、少なくとも一つのＬは、少なくとも
    一つの立体的にかさばった置換基で置換されている前記
    塩基であり； 各々のR7′は、独立して、水素および天然に二存在する
    アルファアミノ酸の側鎖からなる群より選択され； ｎは１から60までの整数であり； ｋ、ｌおよびｍの各々は、独立して、０または１から５
    までの整数であり； ｐは０または１であり； Rhは、OH、NH2または−NHLysNH2であり；そして RiはＨまたはCOCH3である〕 を有する、請求項１記載の核酸模倣体。
  11. 【請求項１１】核酸の決定のための方法であって、 核酸模倣体を提供し； 前記核酸模倣体および前記核酸を、前記核酸模倣体と前
    記核酸との間の二重鎖の形成に適した条件下でインキュ
    ベートし；そして 前記核酸の存在の指標として前記二重鎖の存在を決定す
    る； の各工程を含み、 前記核酸模倣体は、複数のヘテロ環式塩基が結合された
    天然には存在しない主鎖構造を含み、前記塩基の少なく
    とも一つは、主鎖への前記塩基の結合位置から１、２ま
    たは３原子離れた位置が少なくとも一つの立体的にかき
    ばった置換基で置換されていることを特徴とし、式
    （Ｉ）： 【化５】 〔式中、 ｎは少なくとも２であり、 L1〜Lnの各々は、独立して、水素、ヒドロキシ、（C1〜
    C4）アルカノイル、天然に存在する核酸塩基、天然には
    存在しない核酸塩基、芳香族残基、DNAインターカレー
    ター、核酸塩基結合基、ヘテロ環式塩基、およびレポー
    ターリガンドからなる群より選択され、L1〜Lnの少なく
    とも一つは、少なくとも一つの立体的にかさばった置換
    基で置換された前記塩基であり； C1〜Cnの各々は、（CR6R7）ｙ（ここで、R6は水素であ
    り、R7は、天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖から
    なる群より選択され、またはR6およびR7は、独立して、
    水素、（C2〜C6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘ
    テロアリール、ヒドロキシ、（C1〜C6）アルコキシ、
    （C1〜C6）アルキルチオおよびSR5からなる群より選択
    され、R5は、水素、（C1〜C6）アルキル、ヒドロキシも
    しくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換された
    （C1〜C6）アルキルであり、あるいはR6およびR7は、一
    緒になって脂環式系またはヘテロ環式系を完成する）で
    あり； D1〜Dnの各々は、（CR6R7）Ｚ（ここで、R6およびR7は
    上で定義したとおりである）であり； ｙおよびｚの各々は０または１から10までの整数であ
    り、ｙ＋ｚの合計は２より大きいが10より大きくはな
    く； G1〜Gn-1の各々は、いずれの向きでもよい、−NHCO−、
    −NHCS−、−NHSO−または−NHSO2−であり； A1〜AnおよびB1〜Bnの各々の対は、 （ａ）Ａは式（II a）、（II b）または（II c）の基で
    あり、かつＢはＮまたはHN+であり；または （ｂ）Ａは式（II d）の基でありかつＢはCHである； であるように選択され： 【化６】 Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NH、CH2またはＣ（CH3）２であり； Ｙは、単結合、ＯまたはＳであり； ｐおよびｑの各々は、０または１から５までの整数であ
    り； ｒおよびｓの各々は０または１から５までの整数であ
    り； R1およびR2の各々は、独立して、水素、ヒドロキシもし
    くはアルコキシもしくはアルキルチオで置換されていて
    もよい（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、
    アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より選
    択され； Ｑは、−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hまたは−SO2NR′
    Ｒ″、または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性化誘導体であ
    り；そして Ｉは、−NHRＲ′または−NRＣ（Ｏ）Ｒ′、こ
    こで、Ｒ′、Ｒ″、ＲおよびＲ′は、独立して、水
    素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、イ
    ンターカレーター、キレーター、ペプチド、タンパク
    質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオチド
    および可溶性および不溶性ポリマーからなる群より選択
    される］ を有し、前記立体的にかさばった置換基が、−Ｒ′、−
    OR′、−SR′、−Ｎ（Ｒ′）２、−Ｃ（Ｒ′）３、−Ｃ
    （＝Ｘ）（Ｒ′）、−Ｃ（＝Ｘ）（−Ｙ−Ｒ′）または
    Ｓ（＝Ｏ）1-2（−Ｙ−Ｒ′）： 〔式中、 Ｘは、Ｏ、ＳまたはNHであり； Ｙは、Ｏ、ＳまたはNHであり；そして Ｒ′は、C1〜C50−アルキル、C2〜C50−アルケニル、C7
    〜C50−アルキルーアリール、C6〜C50−アリール、C10
    〜C50−ナフチル、C12〜C50−ビフェニル、C7〜C50アリ
    ールーアルキル、ピリジル、イミダゾリル、ピリミジニ
    ル、ビリダジニル、キノリル、アクリジニル、ピロリ
    ル、フラニル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾ
    リル、チアゾリルまたはビオチニルであり、ここで、
    Ｒ′は、一つまたはそれ以上の、−NO、−NO2、−SO
    3−、−CN、−OH、−NH2、−SH、−PO3 2-、−COOH、−
    Ｆ、−Cl、−Brおよび−Ｉで置換されていてもよい〕 である方法。
  12. 【請求項１２】一般式： 【化７】 〔式中、 R1は、少なくとも一つの−COOP1または−NHP1を有するC
    1〜C4−アルキルであり； P1は水素または保護基であり； R2は、−COOP2または−NHP2で置換されたC1〜C4アルキ
    ルであり、ここで、P2は水素または保護基であり； Ｍは、炭素数１〜３個のリンカーによりＮに結合されて
    いる、天然に存在するまたは天然には存在しないヘテロ
    環式塩基であり；そして R3は、３個またはそれ以上の非水素原子を含む立体的に
    かさばった置換基であって、C1〜C50−アルキル、C2〜C
    50アルケニル、C7〜C50−アルキルアリール、C6〜C50−
    アリール、C10〜C50−ナフチル、C12〜C50−ビフェニ
    ル、C7〜C50−アリールアルキル、ピリジル、イミダゾ
    リル、ピリミジニル、ビリダジニル、キノリル、アクリ
    ジニル、ピロリル、フラニル、チエニル、イソオキサゾ
    リル、オキサゾリル、チアゾリルまたはビオチニルから
    選択され、ここで、R3は、一つまたはそれ以上の−NO、
    −NO2、−SO3−、−CN、−OH、−NH2、−SH、−PO3 2-、
    −COOH、−Ｆ、−Cl、−Brおよび−Ｉで置換されていて
    もよい〕 を有する、核酸模倣体を製造するための化合物。
  13. 【請求項１３】請求項１の混合物中に含まれる核酸模倣
    体を製造する方法であって、一般式： 【化８】 〔式中、 R1は、少なくとも一つの−COOP1または−NHP1を有するC
    1〜C4−アルキルであり； P1は水素または保護基であり； R2は、−COOP2または−NHP2で置換されたC1〜C4アルキ
    ルであり、ここで、P2は水素または保護基であり； Ｍは、炭素数１〜３個のリンカーによりＮに結合されて
    いる、天然に存在するまたは天然には存在しないヘテロ
    環式塩基であり；そして R3は、３個またはそれ以上の非水素原子を含む立体的に
    かさばった置換基であって、C1〜C50−アルキル、C2〜C
    50アルケニル、C7〜C50−アルキルアリール、C6〜C50−
    アリール、C10〜C50−ナフチル、C12〜C50−ビフェニ
    ル、C7〜C50−アリールアルキル、ピリジル、イミダゾ
    リル、ピリミジニル、ビリダジニル、キノリル、アクリ
    ジニル、ピロリル、フラニル、チエニル、イソオキサゾ
    リル、オキサゾリル、チアゾリルまたはビオチニルから
    選択され、ここで、R3は、一つまたはそれ以上の−NO、
    −NO2、−SO3−、−CN、−OH、−NH2、−SH、−PO3 2-、
    −COOH、−Ｆ、−Cl、−Brおよび−Ｉで置換されていて
    もよい〕 を有する複数の化合物のR1又はR2のいずれか一方の末端
    で保護基の切断および／または活性化を行い；そして 該保護基の切断および／または活性化が行なわれた複数
    の化合物をオリゴマー化させる ことを含んでなる方法。
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